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Biochemistry

उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर विवो में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन डायनामिक्स की निगरानी

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61027
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 4, 3, 1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

ERRATUM NOTICE

Summary

काइनेटिक क्रॉस-लिंकिंग और सीडीएनए का विश्लेषण एक ऐसी विधि है जो उच्च अस्थायी संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन की गतिशीलता की जांच की अनुमति देती है। यहां प्रोटोकॉल को विस्तार से वर्णित किया गया है, जिसमें खमीर कोशिकाओं की वृद्धि, यूवी क्रॉस-लिंकिंग, कटाई, प्रोटीन शुद्धिकरण और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी चरण शामिल हैं।

Abstract

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) और उनके आरएनए सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत तरलता और जटिलता प्रदर्शित करती है। अपने जीवनकाल के भीतर, एक एकल आरएनए को कई अलग-अलग आरबीपी से बांधा जा सकता है जो इसके उत्पादन, स्थिरता, गतिविधि और गिरावट को नियंत्रित करेगा। इस प्रकार, इन दो प्रकार के अणुओं के बीच मौजूद गतिशीलता को समझने के लिए बहुत कुछ किया गया है। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण सफलता 'सी रॉस-एलइंकिंग और आईएममुनोपीरेसिपिटेशन' (सीएलआईपी) के उद्भव के साथ आई। इस तकनीक ने कठोर जांच की अनुमति दी जिसमें आरएनए एक विशेष आरबीपी से बंधे हैं। संक्षेप में, रुचि का प्रोटीन यूवी को विवो में अपने आरएनए सब्सट्रेट्स से क्रॉस-लिंक किया जाता है, अत्यधिक कठोर परिस्थितियों में शुद्ध किया जाता है, और फिर प्रोटीन से सहसंयोजक रूप से क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है। इसकी अवधारणा के बाद से, सीएलआईपी को अध्ययन के विशेष क्षेत्रों के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए कई व्युत्पन्न तकनीकों को विकसित किया गया है। हालांकि, पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करके क्रॉस-लिंकिंग कुख्यात रूप से अक्षम है। इसके परिणामस्वरूप विस्तारित एक्सपोजर समय होता है जो आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के अस्थायी अध्ययन को असंभव बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में बहुत बेहतर यूवी विकिरण और सेल कटाई उपकरणों को डिजाइन और बनाया है। इन नए उपकरणों का उपयोग करते हुए, हमने उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर जीवित कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के समय-समाधान विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया: काइनेटिक सीआरऑस-लिंकिंग और सीडीएनए का एकनैलिसिस (3सीआरसी)। हमने हाल ही में पोषक तत्व तनाव अनुकूलन में खमीर आरबीपी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया। यह पांडुलिपि 34सी विधि का विस्तृत अवलोकन प्रदान करती है और एनआरडी 1 आरबीपी के साथ प्राप्त हाल के परिणामों को प्रस्तुत करती है।

Introduction

आरएनए अक्सर अपने कार्य को बढ़ाने के लिए आरबीपी पर भरोसा करते हैं, जिससे इन अणुओं के बीच गतिशीलता को समझने में बहुत रुचि पैदा हुई है। कई आरबीपी की पहचान विभिन्न प्रकार के जीवों में की गई है। हालांकि, विवो में आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन का अध्ययन करना हमेशा मुश्किल रहा है। इस तरह की बातचीत का अध्ययन करने में एक बड़ी सफलता CLIP1 के उद्भव के साथ आई। यह विधि आरबीपी और उनके सीधे बंधे आरएनए (यानी, शून्य-दूरी क्रॉस-लिंकिंग) के बीच सहसंयोजक बंधन को प्रेरित करने के लिए पराबैंगनी (यूवी, 254 एनएम) विकिरण का उपयोग करती है। इसके बाद, रुचि के आरबीपी को कड़ी शर्तों के तहत इम्यूनोप्यूरिफाइड किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रोटीन से जुड़े केवल आरएनए की पहचान की जाती है। बाध्य आरएनए को तब आंशिक रूप से आरएनएस के साथ पचाया जाता है और बाद में अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जाता है। उच्च शुद्धि स्ट्रिंगेंसी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रोटीन और आरएनए रिकवरी की विशिष्टता को बहुत बढ़ाता है, जिसे क्रॉस-लिंक्ड राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स के एसडीएस-पेज शुद्धिकरण के माध्यम से भी बढ़ाया जाता है। क्लिप और संबंधित विधियां प्रोटीन बाइंडिंग साइट में न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन अंतर्दृष्टि भी प्रदान करती हैं, क्योंकि अनुक्रमण लाइब्रेरी की तैयारी के दौरान, आरएनए से क्रॉस-लिंक्ड अमीनो एसिड अक्सर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस को समाप्त करते हैं या एंजाइम को इस साइट 1,2,3 पर उत्परिवर्तन पेश करने का कारण बनते हैं।

इसकी शुरूआत के बाद से, मूल CLIP प्रोटोकॉल ने व्युत्पन्न पद्धतियों की एक उल्लेखनीय विविधता का उत्पादन किया है। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण सफलता HITS-CLIP (या CLIP-seq) के विकास के साथ आई, जो CLIP दृष्टिकोण3 के साथ उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का विलय करता है। यह तब से सभी CLIP-आधारित पद्धतियों द्वारा अपनाया गया है। iCLIP ने RNase-मध्यस्थता ट्रिमिंग और एडाप्टर लिगेशन तकनीकों में सुधार पेश किया जो RBP बाइंडिंग साइटों के अधिक सटीक मानचित्रण की सुविधा प्रदान करतेहैं। PAR-CLIP ने 365 nm पर क्रॉस-लिंकिंग के साथ 4thio-uridine/Uracil लेबलिंग को जोड़ा, जिससे T-C प्रतिस्थापन 5 का विश्लेषण करके क्रॉस-लिंकिंग साइटों को मैप करना संभव होगया। सीआरएसी, यूरिया-आईसीएलआईपी, डीसीएलआईपी और यूवीसीएलएपी ने विकृत स्थितियों और दोहरे आत्मीयता शुद्धिकरण चरणों की शुरुआत की जो आत्मीयता राल के लिए पृष्ठभूमि बंधन को कम करते हैं और प्रोटीन कैप्चर 2,6,7,8,9 की विशिष्टता को और बढ़ाते हैं। इसके अतिरिक्त, सीआरएसी, यूवीसीएलएपी और डीसीएलआईपी ने रुचि के आरबीपी को आत्मीयता टैग के साथ टैग करना शुरू किया, इस प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पन्न करने की आवश्यकता पर काबू पाया।

CLIP पद्धति में तेजी लाने के लिए कई अनुकूलन भी किए गए हैं। मूल क्लिप प्रोटोकॉल ने एसडीएस-पेज के बाद आरबीपी-आरएनए कॉम्प्लेक्स की कल्पना करने के लिए कैप्चर किए गए आरएनए के रेडियोलेबलिंग का उपयोग किया। हालांकि, रेडियोधर्मिता का उपयोग उन प्रयोगशालाओं के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जो इस तरह के काम के लिए स्थापित नहीं हैं। आईआरसीएलआईपी में एक फ्लोरोफोरे-युग्मित एडाप्टर शामिल है जो इन्फ्रारेड इमेजिंग10 के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है और एससीलिप कैप्चर किए गए आरएनए के बायोटिनाइलेशन का उपयोग करता है ताकि उन्हें स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित एचआरपी11 के माध्यम से कल्पना की जा सके। इसके अलावा, ईसीएलआईपी पूरी तरह से आरएनए लेबलिंग को छोड़ देता है; इसके बजाय प्रोटीन को केवल इसके ज्ञात आकार12 के आधार पर उत्पादित किया जाता है। स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित शुद्धिकरण का उपयोग फास्ट-आईसीएलआईपी में पुस्तकालय तैयार करने की प्रक्रिया को तेज करने के लिए भी किया गया है, जहां आरएनए पर एक बायोटिनाइलेटेड 3 'एडाप्टर लगाया जाता है और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और सर्कुलराइजेशन13 के बाद शुद्धिकरण को सक्षम करने के लिए उपयोग किया जाता है। आईसीएलआईपी प्रोटोकॉल में अतिरिक्त वृद्धिने पुस्तकालयों की जटिलता को भी बहुत बढ़ा दिया।

अंत में, क्लिप को विभिन्न सेलुलर उपकम्पार्टमेंट14,15 से आरबीपी को कैप्चर करने में सक्षम बनाने के लिए संशोधित किया गया है, फोटोएक्टिवेबल राइबोन्यूक्लिओसाइड्स 5,16,17 के स्पंदित प्रेरण का उपयोग करके नए स्थानांतरित आरएनए की कल्पना करने के लिए, मिथाइलेटेड आरएनए 18,19,20 को पकड़ने के लिए, आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन 21,22 की जांच करने के लिए, और 3 ' सिरों 23,24 को मैप करने के लिए।.

आरबीपी और आरएनए के बीच बातचीत की हमारी समझ में सहायता करने में क्लिप-आधारित तकनीकों के महान योगदान के बावजूद, यह यूवी क्रॉस-लिंकिंग की अक्षमता से सीमित हो गया है। यद्यपि एक मोनोलेयर में उगाई गई संस्कृति कोशिकाएं आम तौर पर क्रॉस-लिंक करने के लिए अपेक्षाकृत आसान होती हैं, यह समाधान में ऊतकों या कोशिकाओं में काफी अधिक चुनौतीपूर्ण है। ऊतकों को आवश्यक सेल परतों में प्रवेश करने के लिए यूवी एक्सपोजर के कई राउंड की आवश्यकता हो सकती है, जबकि माइक्रोबियल कोशिकाओं को अक्सर समृद्ध माध्यमों में उगाया जाता है जिसमें सुगंधित, यूवी-अवशोषितयौगिक होते हैं। दरअसल, 30 मिनट तक के यूवी विकिरण समय का उपयोग ऐसे नमूनों26,27,28 के लिए आरबीपी और उनके बाध्य आरएनए के बीच पर्याप्त क्रॉस-लिंकिंग उत्पन्न करने के लिए किया गया है। यह विस्तारित यूवी एक्सपोजर सेल के भीतर तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है, जैसे यूवी-प्रेरित डीएनए क्षति, जो कुछ अनुप्रयोगों में अंतिम डेटा को दूषित कर सकती है।

अधिकांश CLIP अध्ययनों ने एक सेल में विशिष्ट प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन के एकल "स्नैपशॉट" उत्पन्न करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन स्वाभाविक रूप से गतिशील होते हैं, खासकर जब कोशिकाएं अपने पर्यावरण में परिवर्तन के अधीन होती हैं। इसमें आवश्यक पोषक तत्वों की उपलब्धता में अचानक कमी या तापमान में तेजी से बदलाव शामिल हो सकते हैं। जैसे, तनाव के दौरान आरबीपी की भूमिका को वास्तव में समझने के लिए, समय-समाधान विश्लेषण करना सबसे अच्छा है क्योंकि वे तनाव के दौरान आरबीपी लक्ष्यों के पूर्ण स्पेक्ट्रम को पकड़ सकते हैं और यह निर्धारित कर सकते हैं कि तनाव प्रतिक्रिया के किस चरण में चुना गया आरबीपी सक्रिय है। विशेष रूप से, खमीर में अध्ययन से पता चला है कि अनुकूलन के पहले कुछ मिनट जीवित रहने के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण हैं और बैक्टीरिया में आरएनए अर्ध-जीवन मिनट से सेकंड 29,30,31,32,33 तक भिन्न हो सकता है। इसलिए, इस तरह के समय-हल किए गए विश्लेषण आदर्श रूप से उच्च अस्थायी संकल्प पर किए जाने चाहिए। हालांकि, लंबे समय तक क्रॉस-लिंकिंग समय प्रारंभिक चरण अनुकूली प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाते हैं।

इन मुद्दों को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में एक बेहतर विधि विकसित की है जो मिनट-लंबे टाइमस्केल पर कोशिकाओं को क्रॉस-लिंक करने और कटाई करने में सक्षम है। हमारी 3सीआरसी विधि पहले से ही अस्पष्ट संकल्प पर आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन में गतिशील परिवर्तनों के मात्रात्मक माप की अनुमति देती है। इस विधि के लिए महत्वपूर्ण एक नए यूवी विकिरण उपकरण32 का विकास था जो समाधान में खमीर और बैक्टीरिया में आवश्यक क्रॉस-लिंकिंग समय को लगभग 10 गुना कम करता है, प्रभावी रूप से आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन को तुरंत फ्रीज करता है। इसके अलावा, यूवी विकिरण के बाद कोशिकाओं को तेजी से काटने के लिए, हमने एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण विकसित किया जो लगभग 30 एस32 में 0.5 एल संस्कृति में तेजी से बढ़ते खमीर की कटाई कर सकता है। ये तकनीकी नवाचार मिनट-स्केल रिज़ॉल्यूशन पर आरबीपी-आरएनए गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, हमने इसकी व्यावहारिकता बढ़ाने के लिए मूल सीआरएसी प्रोटोकॉल2 में कई अनुकूलन भी पेश किए।

3सीआरसी का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में ग्लूकोज की कमी के जवाब में एक खमीर परमाणु आरबीपी, एनएबी 3 के लक्ष्य का अध्ययन किया। सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में, एनएबी 3 एनएनएस कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए एनआरडी 1, एक आरबीपी और आरएनए हेलिकेस सेन 1 के साथ एक कॉम्प्लेक्स बना सकता है। आरएनए पोलीमरेज़ और नवजात प्रतिलेख के लिए एनएनएस बाइंडिंग ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेशन34 को ट्रिगर कर सकती है। यह कॉम्प्लेक्स ज्यादातर क्रिप्टिक नॉनकोडिंग आरएनए ट्रांस्क्रिप्ट को हटाने में शामिल है, लेकिन प्रोटीन-कोडिंग जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है। अध्ययन में केवल एक मिनट के तनाव32 के बाद नॉनकोडिंग और कोडिंग टेप के लिए एनएबी 3 के अंतर लक्ष्यीकरण को दिखाया गया। हमने दिखाया कि एनएबी 3 द्वारा सह-ट्रांसक्रिप्शनल समाप्ति के परिणामस्वरूप रेट्रोट्रांसपोसन जीन की एक बहुत ही क्षणिक, पल्स जैसी अभिव्यक्ति होती है, जिसे पारंपरिक क्लिप-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके पता लगाना मुश्किल होता। इसके अतिरिक्त, हमारे यूवी क्रॉस-लिंकर में छोटे यूवी विकिरण समय ने अल्पकालिक नॉनकोडिंग आरएनए32 की वसूली में भी काफी वृद्धि की। CRAC संभवतः यह स्पष्ट करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा कि आरबीपी तत्काल टाइमस्केल पर तनाव की प्रतिक्रिया को कैसे आकार देते हैं, बल्कि प्रतिक्रिया के पूरे जीवनचक्र के दौरान उनकी बदलती भूमिकाएं भी हैं। यह पांडुलिपि 3सीआरसी प्रोटोकॉल में सभी चरणों का विस्तृत अवलोकन प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, विधि का उपयोग खमीर एनआरडी 1 प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जो ट्रांसक्रिप्शनल समाप्ति और आरएनए क्षय35,36 में शामिल है, और इसके आरएनए टारगेटोम ने कई टाइमपॉइंट्स में ग्लूकोज की कमी के जवाब में। अंत में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि हमारी यूवी विकिरण इकाई तेजी से आरबीपी को हेला कोशिकाओं में आरएनए से क्रॉस-लिंक कर सकती है, जिससे अनुयायी कोशिकाओं में उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-समाधान विश्लेषण करना भी संभव हो जाता है।

Protocol

TN150
50 mM Tris pH 7.8
150 mM NaCl
0.1% एनपी -40
1 एक्स प्रोटीज अवरोधक
TN1000
50 mM Tris pH 7.8
1 M NaCl
0.1% एनपी -40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7.8
10 mM MgCl2
0.1% एनपी -40
5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7.8
50 mM MgCl2
50 mM बीटा-mercaptoethanol
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7.8
300 mM NaCl
10 mM imidazole
6 M guanidine-HCl
0.1% एनपी -40
5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल
WB II
50 mM Tris-HCl pH 7.8
50 mM NaCl
10 mM imidazole
0.1% एनपी -40
5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल
क्षालन बफर
50 mM Tris pH 7.8
50 mM NaCl
250 mM imidazole
0.1% एनपी -40
5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल
प्रोटीज के बफर
50 mM Tris
0.1% एनपी -40
5 mM β-mercaptoethanol
1% एसडीएस
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
स्तनधारी लाइसिस बफर
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0.5% v/v Triton X-100
0.25% w/v Na-deoxycholate
0.1% w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM DTT (ताजा जोड़ा गया)
1 एक्स प्रोटीज अवरोधक

तालिका 1: 3सीआरसी और उनकी रचनाओं के लिए आवश्यक बफर।

1. यूवी क्रॉस-लिंकिंग और लाइसेट उत्पादन

  1. घोल में सूक्ष्मजीव
    1. वांछित माध्यम के 3.5 एल को रात भर की संस्कृति से खमीर के साथ0.05 के शुरुआती ओडी 600 तक टीका लगाएं। 180 आरपीएम पर लगातार झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
    2. विकास के दौरान, अन्य आवश्यक सामग्री तैयार करें।
      1. तरल नाइट्रोजन का एक कंटेनर तैयार करें।
      2. 3 एल तनाव-उत्प्रेरण माध्यम तैयार करें और पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      3. फ़िल्टर उपकरण सेट करें, क्रॉस-लिंकर (चित्रा 2 ए) चालू करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को लेबल करें, प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए एक।
    3. एक बार जब कोशिकाएं आपके वांछित ओडी600 तक पहुंच जाती हैं, तो 500 एमएल कोशिकाओं को सीधे क्रॉस-लिंकर में डालें और यूवी 254 एनएम यूवी के 250 एमजे के साथ विकिरणित करें। क्रॉसलिंकर का उपयोग करने के विवरण के लिए चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए देखें।
      नोट: यूवी विकिरण ऊर्जा को रुचि के प्रत्येक प्रोटीन के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
    4. क्रॉस-लिंकिंग के बाद, वैक्यूम निस्पंदन उपकरणों (चित्रा 2 बी, सी) में से एक का उपयोग करके कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। फ़िल्टर की गई कोशिकाओं के साथ झिल्ली को रोल अप करें, टी = 0 (समय शून्य) 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें, और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें।
    5. शेष कोशिकाओं को छह अलग-अलग फ़िल्टर पर फ़िल्टर करें। पहले गर्म तनाव-उत्प्रेरण माध्यम के 3 एल में एकत्रित कोशिकाओं को माध्यम में झिल्ली को गिराकर और 50 सेकंड के लिए एक पट्टी के साथ सख्ती से मिलाकर पुन: निलंबित करें। 50 सेकंड के बाद, टी = 1 नमूना लेने के लिए तैयार रहें।
    6. 1 मिनट के बाद, 500 एमएल कोशिकाओं को क्रॉसलिंक करें और चरण 1.1.3-1.1.4 में निस्पंदन के माध्यम से फसल लें। 2, 4, 8, 14, और 20 मिनट के बाद दोहराएं, या आवश्यकतानुसार अलग-अलग समय बिंदु।
    7. शंक्वाकार ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) सेट करें।
    8. अगले दिन, एक क्रॉसलिंक्ड नमूना युक्त प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब लें और कोशिकाओं को जोर से हिलाते हुए 25 एमएल ठंडे पीबीएस में फिर से निलंबित करें।
    9. सेल सस्पेंशन को नए शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4,600 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट पर स्पिन करें।
    10. पीबीएस को डालें, अवशिष्ट पीबीएस इकट्ठा करने के लिए जल्दी से फिर से स्पिन करें और फिर शेष तरल को पिपेट के साथ डीकेंट करें।
    11. एक खाली ट्यूब से तुलना करके ट्यूब में गोली के वजन की गणना करें।
    12. बर्फ-ठंडा टीएन 150 के दो छर्रों की मात्रा जोड़ें, DNase 1 के 60 μL, और RNase अवरोधक के 10 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      1. उदाहरण के लिए, 400 मिलीग्राम कोशिकाओं के लिए, बर्फ-ठंडा TN150 के 800 μL जोड़ें।
      2. अधिकांश घुलनशील प्रोटीन के लिए डीनेस का अतिरिक्त आवश्यक नहीं है, लेकिन आरएनए पोलीमरेज़ जैसे क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन का अध्ययन करते समय बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह बैक्टीरियल लाइसेट की चिपचिपाहट को कम करता है। लाइसिस बफर के ठीक दो गोली संस्करणों का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है, या लाइसिस दक्षता कम हो सकती है।
    13. सेल निलंबन में ज़िरकोनिया मोतियों के तीन पेलेट वॉल्यूम (एमएल में) जोड़ें। खमीर के लिए, 0.5 मिमी व्यास के मोतियों का उपयोग करें और बैक्टीरिया के लिए 0.1 मिमी का उपयोग करें।
      1. उदाहरण के लिए, 400 मिलीग्राम कोशिकाओं के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब में 1.2 एमएल ज़िरकोनिया मोतियों को मापें और उन्हें लाइसिस बफर में पुन: निलंबित कोशिकाओं में जोड़ें।
    14. भंवर सेल 1 मिनट के लिए निलंबन करता है, फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। कुल 5x के लिए दोहराएं।
    15. मिश्रण करने के लिए टीएन 150 बफर और भंवर के दो पेलेट वॉल्यूम जोड़ें।
    16. शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन को 20 मिनट के लिए 4,600 ग्राम पर एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      1. सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, पूरे सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए भविष्य के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरने वाले का 50 μL नमूना लें।
    17. सुपरनैटेंट को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और एक माइक्रोफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 x g पर 20 मिनट के लिए लाइसेट को घुमाएं।
      1. वैकल्पिक रूप से, यदि 5 एमएल ट्यूबों का उपयोग कर रहे हैं, तो 20 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
      2. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रोटीन की घुलनशील अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए भविष्य के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरने वाले का 50 μL नमूना लें।
    18. आरबीपी कैप्चर (धारा 2) के लिए आगे बढ़ें।
  2. सुसंस्कृत अनुगामी कोशिकाएं
    1. यूवी क्रॉस-लिंकिंग से 24 घंटे पहले पेट्री डिश में पर्याप्त अनुयायी कोशिकाओं को बीज दें ताकि वे अगले दिन 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच सकें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वांछित माध्यम में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर बढ़ें।
      नोट: यदि क्वार्ट्ज पेट्री व्यंजनों का उपयोग कर रहे हैं, तो बीज बोने से 2.5 घंटे पहले पॉली-डी-लाइसिन (70,000-140,000 डब्ल्यूटी) और भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस) के साथ कल्चरवेयर के उपचार के माध्यम से सेल आसंजन को बढ़ावा देना फायदेमंद है। पूरी विकास सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त पॉली-डी-लाइसिन जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, क्वार्ट्ज पेट्री डिश को पानी से अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए और सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए या पूरी तरह से सूखने तक सुखाया जाना चाहिए। बाद में, विकास की सतह को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त एफसीएस जोड़ें और कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को सीड करने से पहले एफसीएस को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए।
    2. एक बार जब कोशिकाएं 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो मीडिया को हटा दें और 15 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ धो लें। इसके बाद, सभी शेष तरल को पूरी तरह से हटा दें और अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    3. पेट्री डिश को अनुगामी कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के लिए ट्रे में स्थानांतरित करें और यूवी 254 एनएम यूवी के 300 एमजे के साथ विकिरणित करें। क्रॉसलिंकर का उपयोग करने के विवरण के लिए चित्रा 2 ए और चित्रा 3 बी देखें।
      नोट: यूवी विकिरण ऊर्जा को रुचि के प्रत्येक प्रोटीन के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
    4. क्रॉस-लिंकिंग के तुरंत बाद, पेट्री डिश को बर्फ पर रखें और 10 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें। स्क्रैपिंग द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से पेलेट 300 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
    5. पीबीएस को हटा दें और सेल पेलेट को 1 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस में फिर से निलंबित करें, और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पेलेट कोशिकाओं को फिर से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 5 मिनट के लिए 300 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. पीबीएस को हटा दें और सूखी बर्फ पर सेल छर्रों को स्नैप-फ्रीज करें। सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि आवश्यक न हो।
    7. प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए चरण 1.2.3–1.2.6 दोहराएँ।
    8. सेल छर्रों को 1 एमएल लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में, कुल 2 एमएल के लिए 1 एमएल लाइसिस बफर जोड़ें।
    9. स्तनधारी RNase अवरोधक के 5 μL जोड़ें।
    10. 10 पर बर्फ पर 10 सेकंड के लिए सोनिकेट 5x. सोनिकेशन राउंड के बीच 30 सेकंड प्रतीक्षा करें।
    11. प्रत्येक नमूने की प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें और सबसे कम एकाग्रता को सामान्य करें।
    12. लाइसेट के 1.98 एमएल को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    13. DNase I का 10 μL जोड़ें और 1,200 आरपीएम पर झटकों के साथ 5 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    14. लाइसेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      1. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रोटीन की घुलनशील अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए भविष्य के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरने वाले का 50 μL नमूना लें।
    15. आरबीपी कैप्चर (धारा 2) के लिए आगे बढ़ें।

2. आरबीपी कैप्चर

  1. चुंबकीय एंटी-फ्लैग (प्रति नमूना घोल का 75 μL) या IgG Agarose (प्रति नमूना 500 μL घोल) मोती को TN150 के 5 mL के साथ 3x धोएं। TN150 के 700 μL की अंतिम मात्रा में पुन: निलंबित करें और सात 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 100 μL धुले हुए मोती जोड़ें।
    1. आवश्यकता होने तक बर्फ पर स्टोर करें।
  2. एक बार लाइसेट स्पष्ट हो जाने के बाद, एंटी-फ्लैग / आईजीजी मोती युक्त ट्यूब में सतह पर तैरने वाला जोड़ें।
  3. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर न्यूटेट करें।
    नोट: कुछ प्रोटोकॉल मोतियों के साथ रात भर ऊष्मायन का वर्णन करते हैं, लेकिन इसकी सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि लंबे इनक्यूबेशन समय नाटकीय रूप से क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली को कम कर सकते हैं।

3. टैग के मोतियों और टीईवी क्लीवेज को धोना

  1. मोतियों को काट लें और लाइसेट को हटा दें।
    1. अप्रयुक्त प्रोटीन की जांच करने के लिए भविष्य के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरने वाले के नमूने का 50 μL लें।
  2. बर्फ-ठंडे टीएन 1000 में मोतियों को पुन: निलंबित करें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए धो लें, अखरोट के साथ। कुल तीन बार धोने के लिए दोहराएं।
    1. यदि आईजीजी अगारोस मोती का उपयोग कर रहे हैं, तो टीएन 1000 के 5 एमएल से धो लें। यदि एंटी-फ्लैग मोतियों का उपयोग कर रहे हैं, तो 2 एमएल का उपयोग करें।
  3. इसके बाद, मोतियों को टीएन 150 के साथ 3x धोएं, ऊपर के समान मात्रा के साथ।
  4. तीसरे धोने के बाद, मोतियों को TN150 के 600 μL में फिर से निलंबित करें।
  5. बीड सस्पेंशन में होममेड जीएसटी-टीईवी प्रोटीज का 30 यू जोड़ें और आरटी पर 2 घंटे के लिए घुमाएं।
    नोट: पुनः संयोजक जीएसटी-टीईवी प्रोटीज अब व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के साथ इसका परीक्षण नहीं किया गया है।
    1. पाचन के दौरान, प्रत्येक नमूने के लिए तीन 1.5 एमएल ट्यूबों के कॉलम स्थापित करके अगले चरणों के लिए तैयार करें (यानी सात नमूनों के लिए, सात कॉलम की तीन पंक्तियां हों)।
    2. ट्यूबों की अंतिम पंक्ति में, 0.4 ग्राम गुआनिडियम हाइड्रोक्लोराइड, 5 एम सोडियम क्लोराइड का 27 μL और 2.5 M इमिडाज़ोल (पीएच = 8) का 3 μL जोड़ें। ध्यान दें कि इमिडाज़ोल का पीएच 8 होना चाहिए। यह आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. इसके अतिरिक्त, डब्ल्यूबी आई 3 एक्स में निकल मोतियों की आवश्यक मात्रा धोएं। प्रति नमूना 100 μL घोल का उपयोग करें। अंतिम धोने के बाद, डब्ल्यूबी आई के समान मूल मात्रा में मोतियों को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर स्टोर करें।
  6. एक बार टीईवी पाचन पूरा हो जाने के बाद, एंटी-फ्लैग बीड्स के लिए चुंबकीय रैक का उपयोग करके सुपरनैटेंट एकत्र करें या आईजीजी मोतियों के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन करें, और पहले से स्थापित ट्यूबों की पहली पंक्ति में स्थानांतरित करें।
    1. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए टीईवी एलुएट का 50 μL नमूना लें।
  7. थर्मोब्लॉक इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। ट्यूबों की दूसरी पंक्ति में, RNase कॉकटेल (1:50 कमजोर पड़ने) का 1 μL जोड़ें।
  8. ट्यूबों की पहली पंक्ति से 550 μL TEV एलुएट लें और दूसरी पंक्ति में जोड़ें (RNase कॉकटेल युक्त)। मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पिपेट को सख्ती से।
  9. पहले नमूने के लिए इसे पूरा करने के बाद, तुरंत ट्यूब को थर्मोब्लॉक में रखें और टाइमर शुरू करें। बाद के नमूनों पर जाएं, जैसे कि प्रत्येक क्रमबद्ध है।
  10. ठीक 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक बार पूरा होने के बाद, थर्मोब्लॉक से पहला नमूना निकालें और समाधान को ट्यूबों की तीसरी पंक्ति (गुआनिडियम हाइड्रोक्लोराइड पाउडर युक्त) में स्थानांतरित करें।
    नोट: आरएनएस कॉकटेल के 1:50 कमजोर पड़ने के साथ 5 मिनट का इनक्यूबेशन आमतौर पर अधिकांश प्रोटीनों के लिए उपयुक्त होता है, लेकिन इस चरण को प्रत्येक प्रोटीन के लिए अलग-अलग इनक्यूबेशन समय या सांद्रता के साथ सावधानीपूर्वक अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि क्रॉस-लिंक्ड आरएनए सही आकार (30-100 एनटी) के हैं।
  11. गुआनिडियम पाउडर को भंग करने के लिए पूर्ण गति से कुछ सेकंड के लिए तुरंत भंवर और फिर अगले नमूने पर जाएं।
  12. सभी नमूनों को गुआनिडियम पाउडर में स्थानांतरित करने के बाद, भंवर फिर से यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी पाउडर पूरी तरह से घुल गए हैं।
  13. धुले हुए निकल मोतियों के 100 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घुमाएं। इस इनक्यूबेशन को 2 घंटे तक छोटा किया जा सकता है।

4. ऑन-बीड क्षारीय फॉस्फेट उपचार

  1. थर्मोब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए एक 2 एमएल ट्यूब में एक शुद्धिकरण स्पिन कॉलम रखें। निकल मोतियों को स्तंभों में स्थानांतरित करें और सतह पर तैरने वाले को बाहर निकलने दें। बाद में, सुनिश्चित करें कि डब्ल्यूबी आई के साथ कुल्ला करके और कॉलम पर लागू करके 1.5 एमएल ट्यूब से सभी निकल मोतियों को हटा दिया गया था।
  3. 2 एमएल ट्यूब सेट करें, प्रति नमूना छह (प्रत्येक धोने को इकट्ठा करने के लिए एक)। प्रवाह बनाए रखने के लिए स्तंभों के बाहर को सूखा रखें। 3x को WB I के 500 μL के साथ धोएं और फिर NP-PNK के 500 μL के साथ 3x धोएं।
  4. स्पिन कॉलम के ढक्कन को बंद करें और अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए संक्षेप में मोतियों को स्पिन करें।
  5. कॉलम पर स्टॉपर रखें, कॉलम को 1.5 एमएल ट्यूबों में डालें और तालिका 2 में देखे गए प्रतिक्रिया मिश्रण का 60 μL जोड़ें।
घटक 1x 7.5x
5 x PNK बफर 12 90
क्षारीय फॉस्फेट 4 30
RNase अवरोधक 2 15
H2O 42 315
अंतिम मात्रा 60 μL 450 μL

तालिका 2: क्षारीय फॉस्फेट प्रतिक्रिया मिश्रण।

  1. मोतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. क्षारीय फॉस्फेट को निष्क्रिय करने के लिए 500 μL WB I के साथ मोतियों को 1x धोएं और फिर एनपी-पीएनके बफर के 500 μL के साथ 3x धोएं। गुआनिडियम के किसी भी निशान को हटाने के लिए एनपी-पीएनके बफर के साथ कॉलम के अंदर को अच्छी तरह से कुल्ला करना सुनिश्चित करें।

5. आरएनए के 3 'छोर पर ऐप-पीई लिंकर का ऑन-बीड लिगेशन

  1. शेष बफर को स्पिन करें और कॉलम में तालिका 3 में निर्दिष्ट मिश्रण के 60 μL जोड़ें (ऐप-पीई अनुक्रम के लिए तालिका 4 देखें)। प्रतिक्रिया को 25 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
घटक 1x 7.5x
5 x PNK बफर 12 90
App-PE एडाप्टर (100 μM) 0.6 4.5
T4 RNA लिगेज 2 कटा हुआ K227Q 3 22.5
RNase अवरोधक 1.5 11.25
50% PEG 8000 12 90
H2O 30.9 231.75
अंतिम मात्रा 60 μL 450 μL

तालिका 3: ऐप-पीई लिंकर लिगेशन प्रतिक्रिया मिश्रण।

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का नाम अनुक्रम (5'-3')
L5Aa invddT-ACACrGrCrUrUrCrRRRRRRGrCrN-OH
L5Ab invddT-ACACrGrCrUrUrCrUrCrCrRRURRNNRNRNRUrUrUrCrCRN-OH
L5Ac invddT-ACACrGrCrUrCrUrCrRRCrRNRNRGrCrCrN-OH
L5Ad invddT-ACACrGrCrUrCrUrUrCrRCrRRRNNRNRCRCRCRURURGRCRN-OH
L5Ba invddT-ACACrGrCrUrUrCrRRRRNNRNRRRGrCrN-OH
L5BB invddT-ACACrGrCrUrUrCrRCrRRRNNRNRNRGrGrCrN-OH
L5Bc invddT-ACACrGrCrUrUrCrRNNRNRCrCrUrGrCrN-OH
L5Bd invddT-ACACrGrGrCrCrUrCrUrUrCrUrCrRCrUrCrRRRRN-OH
L5Ca invddT-ACACrGrCrUrUrCrRRRNNRNRNRCrUrCrCrN-OH
L5Cb invddT-ACACrGrCrUrUrCrRRRRNNRNRNRNRGrGrCrN-OH
L5Cc invddT-ACACrGrCrUrUrCrRCrRRRRRRN-OH
L5Cd invddT-ACACrGrCrUrCrUrUrCrUrCrCrRRNRNRGrCrURURGRCRN-OH
L5Da invddT-ACACrGrCrUrCrUrCrRRRNNRNRNRCrGrUrUrN-OH
L5Db invddT-ACACrGrCrUrCrRRRNNRNRGrCrUrN-OH
L5Dc invddT-ACACrGrCrUrUrCrRRRRNNRNRNRUrGrCrN-OH
L5DD invddT-ACACrGrGrCrUrUrCrCrUrCrRRRRN-OH
L5Ea invddT-ACACrGrCrUrCrUrCrUrCrRRNNRNRCrCrUrN-OH
L5Eb invddT-ACACrGrCrUrUrCrUrCrRRRRNRNRNRGrGrArRn-OH
L5Ec invddT-ACACrGrCrUrUrCrCrUrCrCrRRRRRNRNRNRNRUrUrCrCrN-OH
L5Ed invddT-ACACrGrGrCrUrUrCrRRRNNRNRRCrUrGrN-OH
App_PE ऐप-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

तालिका 4: कैप्चर किए गए आरएनए के 5 ' और 3 ' सिरों पर बंधाव के लिए आवश्यक डीएनए और आरएनए एडाप्टर के अनुक्रम। इन्हें RNase-मुक्त HPLC के माध्यम से शुद्ध किया गया था।

  1. 1x को WB I के 500 μL के साथ और 3x को NP-PNK बफर के 500 μL के साथ धोएं। कॉलम को एक नई ट्यूब में डालें और शेष बफर को स्पिन करें।

6. आरएनए के 5 ' सिरों का ऑन-बीड फॉस्फोराइलेशन

  1. तालिका 5 में निर्दिष्ट मिश्रण का 80 μL स्तंभों में जोड़ें। प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: नमूने अब अत्यधिक रेडियोधर्मी होंगे। इस प्रकार, बाद के सभी काम एक सुरक्षात्मक स्क्रीन के पीछे किए जाने चाहिए और अपशिष्ट को स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।
घटक 1x 7.5x
5 x PNK बफर 16 120
32P-ɣATP (10 μCi/μL) 3 22.5
T4 PNK 3 22.5
H2O 58 435
अंतिम मात्रा 80 μL 600 μL

तालिका 5: फॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया मिश्रण।

  1. 100 mM ATP का 1 μL जोड़ें और प्रतिक्रिया को एक और 20 मिनट के लिए आगे बढ़ने दें। यह सुनिश्चित करेगा कि लगभग सभी 5 'सिरों में 5' लिंकर के बंधाव की सुविधा के लिए फॉस्फेट हैं।
  2. 2 एमएल ट्यूब सेट करें, प्रति नमूना पांच।
  3. 1x को WB I के 500 μL के साथ और 3x को NP-PNK बफर के 500 μL के साथ धोएं। ध्यान दें कि ये इल्यूशन बहुत रेडियोधर्मी होंगे और इसलिए उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए।
  4. कॉलम को अंतिम ट्यूब में ले जाएं और शेष बफर को स्पिन करें।

7. 5'लिंकर का ऑन-बीड लिगेशन

नोट: 5 'लिंकर में एक आरएनए बारकोड होता है जिसका उपयोग अनुक्रमण के बाद प्रत्येक नमूने की पहचान के लिए किया जाता है। इस प्रकार, यह ध्यान रखना बिल्कुल महत्वपूर्ण है कि किस नमूने के लिए कौन सा लिंकर उपयोग किया जाता है।

  1. तालिका 6 में वर्णित मिश्रण का 78 μL स्तंभों में जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में 5' एडाप्टर (100 μM; तालिका 4 देखें) का 2 μL जोड़ें और 18 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
घटक 1x 7.5x
5 x PNK बफर 16 120
एटीपी (10 mM) 8 60
RNase अवरोधक 2 15
टी 4 आरएनए लिगेज 4 30
H2O 48 360
अंतिम मात्रा 78 μL 585 μL

तालिका 6: 5 'लिंकर बंधाव प्रतिक्रिया मिश्रण।

  1. अगले दिन, 1x को WB I के 500 μL के साथ और 3x को WB II के 500 μL के साथ धोएं और स्तंभों को एक नई 2 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।

8. क्षालन, एसडीएस-पेज, और आरएनए निष्कर्षण

  1. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। क्षालन के लिए प्रति नमूना 1.5 एमएल ट्यूबों की दो पंक्तियां तैयार करें।
  2. एक त्वरित स्पिन के साथ निकल मोतियों के साथ स्तंभों की शून्य मात्रा को स्पिन करें। स्तंभों को क्षालन ट्यूबों की पहली पंक्ति में रखें और 200 μL क्षालन बफर जोड़ें। 2 मिनट प्रतीक्षा करें, फिर बफर को एक त्वरित स्पिन के साथ कॉलम के माध्यम से मजबूर करें।
  3. स्तंभों को ट्यूबों की दूसरी पंक्ति में ले जाएं और चरण 8.2 दोहराएँ। प्रत्येक नमूने में अब कुल मिलाकर 400 μL एलुएट होगा, जो दो 1.5 एमएल ट्यूबों में विभाजित होगा।
    1. सभी एलुएट्स लें और उन्हें एक साथ 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ग्लाइकोजन के 20 मिलीग्राम / एमएल के 2 μL जोड़ें। इस प्रकार, यदि सात नमूनों का उपयोग किया जाता है, तो अब 5 एमएल ट्यूब में 2.8 एमएल पूल किए गए एलुएट होंगे।
  4. 5 एमएल ट्यूब में प्रति नमूना 100 μL ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (TCA) जोड़ें [उदाहरण के लिए 7 नमूने के लिए TCA का 700 μL (पूल किए गए एलुएट का 2.8 एमएल)] और 30 सेकंड के लिए भंवर अच्छी तरह से।
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  6. एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 17,000 x g, 4 °C पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  7. शंक्वाकार ट्यूब से सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोली गलती से नहीं हटाई गई है, गीगर काउंटर के साथ पिपेट की जांच करें। यदि ऐसा है, तो सतह पर तैरने वाले को ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए वापस लाएं।
    नोट: सतह पर तैरने वाला अभी भी अत्यधिक रेडियोधर्मी हो सकता है। उचित परिरक्षण का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  8. 2 एमएल बर्फ-ठंडे एसीटोन में गोली को पूरी तरह से पुन: निलंबित करें।
  9. 17,000 x g, 4 °C पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  10. जितना संभव हो उतना एसीटोन को पी 1000 पिपेट के साथ हटा दें। बाद में, एसीटोन की छोटी बूंदों को इकट्ठा करने के लिए ट्यूब को संक्षेप में घुमाएं, और फिर पी 10 पिपेट के साथ हटा दें। 2 मिनट के लिए एक फ्यूम हुड में सुखाएं।
    नोट: एसीटोन सुपरनैटेंट अभी भी रेडियोधर्मी हो सकता है। उचित परिरक्षण का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  11. नमूने को 1x प्रोटीन लोडिंग बफर के 30 μL में पुन: निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोली ठीक से पुन: निलंबित है, जांचें कि रेडियोधर्मिता का विशाल बहुमत अब लोडिंग बफर में मौजूद है और पी 200 पिपेट में समाधान को हटाकर और गीगर काउंटर का उपयोग करके 1.5 एमएल ट्यूब में छोड़ी गई गतिविधि को मापकर 1.5 एमएल ट्यूब में नहीं छोड़ा गया है।
  12. 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को गर्म करें। 1 मिमी, 4-12% प्रीकास्ट बिस-ट्रिस जेल पर लोड करें और एमओपीएस बफर में 125 वी पर 1.5 घंटे तक चलाएं।
  13. जेल के चलने के बाद, जेल कैसेट खोलें। जेल को नीचे की प्लेट पर बनाए रखा जाना चाहिए। शीर्ष का निपटान करें।
  14. जेल को क्लिंग फिल्म में लपेटें और फिर इसे हल्के-तंग कैसेट के अंदर टेप का उपयोग करके सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि सिग्नल को बेहतर बनाने के लिए कैसेट में एक एम्प्लीफाइंग स्क्रीन है।
  15. जेल में एक ऑटोरेडियोग्राफिक फिल्म को उजागर करें और एक्सपोज़र के दौरान कैसेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक्सपोजर का समय विभिन्न क्रॉस-लिंकिंग क्षमता वाले प्रोटीन के बीच भिन्न होगा।
    1. फिल्म को रखते समय, अगले चरण में रुचि के बैंड को काटने के लिए इसे कैसेट में फिर से संरेखित करने का एक तरीका होना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट शासक का उपयोग करें और यह भी सुनिश्चित करें कि जेल कैसेट के एक कोने में है, जिसे तब फिल्म द्वारा कवर किया जाता है और इसे भी अत्यंत कोने में रखा जाता है।
      नोट: अंगूठे के एक नियम के रूप में, लोडिंग बफर में एलुएट्स जो गीगर काउंटर पर प्रदर्शित होने पर कम से कम ~ 250 सीपीएस की रीडिंग देता है, 3 घंटे के एक्सपोजर के लिए पर्याप्त संकेत देता है। अन्यथा, रात भर एक्सपोजर किया जाता है।
  16. फिल्म का विकास करें। जेल को कवर करने वाली क्लिंग फिल्म को काट लें लेकिन जेल को न हिलाएं। अन्यथा, छवि जेल से ऑफसेट हो जाएगी।
    नोट: जेल संभवतः अत्यधिक रेडियोधर्मी होगा। जेल स्लाइस काटते समय उचित परिरक्षण का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  17. जेल के ऊपर फिल्म रखें और रुचि के बैंड का उत्पादन करें। जेल स्लाइस को 2 एमएल ट्यूब में डालें।
  18. पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके जेल स्लाइस को तोड़ें और 600 μL प्रोटीन के बफर प्लस 200 μg प्रोटीन के जोड़ें (यह प्रोटोकॉल 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के घोल के 10 μL का उपयोग करता है)। जोरदार झटकों के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  19. बाद में, एक पी 1000 टिप के अंत को एक साफ स्केलपेल के साथ काट लें और सतह पर तैरने वाले और जेल के टुकड़ों को 2 एमएल ट्यूब में रखे स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें।
  20. आरटी में 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए 17,000 x g पर स्तंभ को घुमाएं। प्रवाह-माध्यम को इकट्ठा करें, जिसमें रेडियोधर्मी, पृथक आरएनए शामिल हैं।
  21. फिनोल: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण करें।
    1. 3 एम सोडियम एसीटेट का 50 μL, pH = 5.2, और फिनोल: क्लोरोफॉर्म और भंवर के 500 μL अच्छी तरह से जोड़ें। 17,000 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। जलीय शीर्ष परत को हटा दें और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
    2. 10-15 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर के 500 μL को जोर से जोड़ें। RT पर 17,000 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। जलीय परत को हटा दें और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
    3. 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन का 1 μL और बर्फ-ठंडा, 96% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अवक्षेपित करें या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस, 17,000 x g पर 30 मिनट के लिए। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, 500 μL 70% इथेनॉल जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 17,000 x g पर जोड़ें। सभी इथेनॉल को हटा दें, अवशेषों को इकट्ठा करने के लिए एक त्वरित स्पिन करें और पी 10 पिपेट के साथ अतिरिक्त को हटा दें।
    5. पेलेट को ~ 3 मिनट के लिए फ्यूम हुड में सुखाएं। डीईपीसी-उपचारित पानी के 20 μL में पुन: निलंबन।
  22. रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर करें या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण पर तुरंत आगे बढ़ें।

9. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. आरएनए के 20 μL में 10 μM RT Oligo (PE_reverse; तालिका 7 देखें) और 5 mM dNTPs के 4 μL को RNA के 20°L में जोड़ें।
ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का नाम अनुक्रम (5'-3')
P5 आगे AATGATACGGCGACCCCGAGATACACTACCTCTCTCTACACGACGCTCCCCTTCCCTCT
BC1 CAAGCAGAGAGAGACGCATACGAGTGTGACTGAGTTCAGACGTGTGTGCTCCGATCT
BC3 CAAGCAGAGAGAGAGCCTAAGTGACTGAGTTCAGAGTGTGTGCTCCCTCT
BC4 CAAGCAGAGAGAGAGACCATACGATGGTCAGTGACTGAGTTCAGACGTGTGTGCTCCGATCT
BC5 CAAGCAGAGAGAGACCTACACTGTGTGACTGAGTTCAGACGTGTGTGCTCCGATCT
BC7 CAAGCAGAGAGAGACGACATACGAGATCGTGACTGAGTTCAGACGTGTGTGCTCCGATCT
BC8 CAAGCAGAGAGAGAGACTAGTTGCTGGTTCAGACGTGTGTGCTCCGATCT
BC9 CAAGCAGAGAGAGAGACTAGAGATCAGTGTGCTGTTCCCT
BC10 CAAGCAGAGAGAGACGGCATACGAGATCACGTGTGCTCTGGTGCTCCCT
PE_reverse CAGACGTGTGCTCTCCGATCT

तालिका 7: पीसीआर प्राइमर (बारकोड अनुक्रमों सहित) और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर।

  1. 3 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रीहीट थर्मोब्लॉक में स्थानांतरित करें, फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर स्नैप-चिल करें। संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ट्यूब की सामग्री एकत्र करें और फिर 5x रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस बफर के 8 μL, 100 mM DTT के 2 μL, और RNase अवरोधक के 2 μL जोड़ें।
  2. मिश्रण को 3 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के 2 μL जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस को 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन से निष्क्रिय करें।
  4. ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रीहीट थर्मोब्लॉक में स्थानांतरित करें और अनुकूलन के लिए 3 मिनट के लिए छोड़ दें।
  5. RNase H का 2 μL जोड़ें और 37 °C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. एसपीआरआई मोतियों का उपयोग करके सीडीएनए को अलग करें।
    1. मोतियों के 84 μL के दो खंड जोड़ें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। मोतियों को एक चुंबकीय रैक पर रखें और मोतियों की कटाई के लिए 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
    2. सतह पर तैरने वाले को निकालें और उसका निपटान करें और 70% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें। चुंबकीय रैक से मोतियों को न हटाएं। मोतियों को इथेनॉल के साथ 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इथेनॉल को हटा दें और वॉश स्टेप को दोहराएं। पी 10 टिप का उपयोग करके सभी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें।
    4. मोतियों को सुखाने के लिए 2 मिनट के लिए फ्यूम हुड में रखें। रैक से मोतियों को हटा दें, उन्हें 12 μL पानी में फिर से निलंबित करें, और फिर मोतियों को रैक पर वापस रखें। 11 μL सुपरनैटेंट निकालें।
  7. सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें या पीसीआर चरण पर तुरंत आगे बढ़ें।

10. क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया

  1. सीडीएनए के प्रवर्धन के लिए अंतिम पीसीआर से पहले, लाइब्रेरी के अतिप्रवर्धन को रोकने के लिए सीडीएनए को बढ़ाने के लिए चक्रों की इष्टतम संख्या की पहचान करने के लिए एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) किया जाता है।
  2. तालिका 8 के अनुसार बर्फ पर एक QPCR प्रतिक्रिया सेट करें। सभी प्राइमरों के लिए तालिका 7 देखें।
घटक 1x
2x qPCR प्रतिक्रिया मास्टरमिक्स 5
0.1 μM P5 प्राइमर (आगे) 0.8
0.1 μM BC प्राइमर (रिवर्स) 0.8
सीडीएनए (या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी) 1
H2O 2.4
अंतिम मात्रा 10 μL

तालिका 8: क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण।

  1. प्रवर्धन के लिए आवश्यक चक्रों की उचित मात्रा का निर्धारण करने के लिए, सीडीएनए के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियों और तीन नकारात्मक (यानी पानी) नियंत्रणों का उपयोग करें।
  2. प्लेटों को ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें और किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूपीसीआर चलाएं।
  3. चक्रों (एन) की संख्या की पहचान करने के लिए एक पूर्ण परिमाणीकरण विधि के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण करें, जिस पर घातीय वृद्धि के घुटने तक पहुंच गया है (उदाहरण के लिए चित्रा 4 सी देखें)। चक्रों की इस संख्या का उपयोग तब बाकी सीडीएनए के अंतिम प्रवर्धन के लिए किया जाता है।

11. पीसीआर प्रतिक्रिया और जेल निष्कर्षण

  1. तालिका 9 के अनुसार बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें। सभी प्राइमरों के लिए तालिका 7 देखें।
    नोट: सीडीएनए लाइब्रेरी के केवल 5 μL का उपयोग किया जाता है।
घटक 1x
10 x प्रूफ-रीडिंग पोलीमरेज़ बफर 5
10 μM P5 प्राइमर (आगे) 1
10 μM BC प्राइमर (रिवर्स) 1
5 mM dNTPs 2.5
पोलीमरेज़ एंजाइम पढ़ने का सबूत 1
सीडीएनए 5
H2O 34.5
अंतिम मात्रा 50 μL

तालिका 9: पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण।

  1. पीसीआर को निम्नानुसार चलाएं: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 20 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 52 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का चक्र; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। 3सीआरसी लाइब्रेरी को बढ़ाने के लिए चक्रों की संख्या (एन) खंड 10 में वर्णित क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित की जाती है।
  2. एक्सोन्यूक्लिज़ I का 1 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
  3. एसपीआरआई मोतियों का उपयोग करके प्रवर्धित सीडीएनए को साफ करें जैसा कि ऊपर वर्णित है, मोतियों के दो खंडों (यानी 100 μL) का उपयोग करके। 11 μL में Elute.
  4. 6x लोडिंग डाई का 3 μL जोड़ें और 1x TBE बफर में 1 घंटे के लिए 100 V पर प्रीकास्ट 6% टीबीई जेल पर चलाएं। छोटे डीएनए टुकड़ों के परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त सीढ़ी का उपयोग करें।
  5. एक बार समाप्त होने के बाद, जेल को कैसेट से निकालें और जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त 1x TBE के साथ एक उपयुक्त, तरल-तंग कंटेनर में रखें (जैसे ~ 50 एमएल)। SYBR सुरक्षित डाई की उचित मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए 50 mL के लिए, 10,000x डाई के 5 μL का उपयोग करें)
  6. जेल को आरटी में 15 मिनट के लिए कोमल मिश्रण के माध्यम से दाग लगाने दें। SYBR युक्त 1x TBE को छान लें और साफ 1x TBE के साथ बदलें। जेल को आरटी पर कोमल झटकों के साथ 10 मिनट के लिए धो लें।
  7. 1x TBE को छान लें और जेल को एक पारदर्शी फ़ोल्डर में रखें। फ़ोल्डर को उपयुक्त आकार में काटें.
  8. एक फॉस्फोरइमेजर जैसे उपयुक्त साधनों के माध्यम से जेल को चित्रित करें। ~ 175 बीपी और ~ 400 बीपी के बीच उत्पाद शुल्क डीएनए टुकड़े। जेल स्लाइस को 1.5 एमएल ट्यूब में डालें।
  9. पी 1000 टिप का उपयोग करके जेल स्लाइस को अच्छी तरह से तोड़ें और 400 μL H2O जोड़ें। थर्मोब्लॉक में 1 घंटे के लिए हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. नमूने को सूखी बर्फ पर 10 मिनट के लिए फ्रीज करें, फिर 1 घंटे के लिए हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोब्लॉक में वापस रखें।
  11. फ़िल्टर स्तंभ लेकर और अंदर दो ग्लास माइक्रोफाइबर फ़िल्टर डालकर एक फ़िल्टर इकाई बनाएँ. इकाई को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
  12. एक साफ स्केलपेल के साथ पी 1000 टिप के अंत को काट लें और टूटे हुए टीबीई जेल निलंबन को उठाएं, फिर चरण 11.12 में बनाई गई फ़िल्टर यूनिट में वितरित करें। 30 सेकंड के लिए 17,000 x g पर स्पिन करें।
  13. सुपरनैटेंट में ग्लाइकोजन का 1 μL जोड़ें, साथ ही सोडियम एसीटेट के 40 μL, pH = 5.2, और 96% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  14. 17,000 x g, 4 °C पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 70% इथेनॉल के 500 μL से धो लें।
  15. 5 मिनट के लिए स्पिन करें, इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें और फिर 3 मिनट के लिए फ्यूम हुड में गोली को सुखाएं।
  16. H2Oके 10 μL में पुन: निलंबन करें और डीएनए एकाग्रता को मापें।

Representative Results

3.सी.सी.आर.सी. विधि की प्रभावकारिता को प्रदर्शित करने के लिए, एचटीपी-टैग किए गए एनआरडी 1 प्रोटीन को व्यक्त करने वाले खमीर उपभेदों के साथ एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग किया गया था। विधि कैसे काम करती है, इसका वर्णन करने वाला एक विस्तृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में प्रदान किया गया है। एनएबी 3 की तरह, एनआरडी 1 विभिन्न प्रकार के आरएनए प्रतिलेख37 के परमाणु आरएनए क्षय में शामिल है। कॉर्डन लैब के पिछले काम ने सुझाव दिया कि एनआरडी 1 अपने आरएनए लक्ष्यों के लिए बाध्यकारी काफी बदल जाता है जब कोशिकाओं को ग्लूकोज भुखमरी28,38 के अधीन किया जाता है। इस प्रकार, ग्लूकोज युक्त माध्यम (एसडी-टीआरपी) में तेजी से बढ़ने वाली कोशिकाओं को एनआरडी 1-आरएनए इंटरैक्शन में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए समय-समय पर ग्लूकोज (एस-टीआरपी) के बिना एक ही माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया था। शिफ्ट से पहले और फिर 1, 2, 4, 8, 14 और 20 मिनट के बाद वैरी-एक्स-लिंकर चैंबर (चित्रा 3 ए) में नमूने लिए गए और क्रॉस-लिंक किए गए। सेल के विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम में इस सुगंधित अमीनो एसिड द्वारा यूवी अवशोषण को कम करने के लिए ट्रिप्टोफैन में जानबूझकर कमी थी। ध्यान दें कि सिंथेटिक माध्यम का उपयोग करना सबसे अच्छा है जिसे फ़िल्टर किया जाता है क्योंकि माध्यम को ऑटोक्लेव करने से शर्करा का कारमेलाइजेशन हो सकता है। यह तब क्रॉस-लिंकिंग दक्षता को कम करता है।

चित्र 4A एक χCRAC प्रयोग से एक प्रतिनिधि ऑटोरेडियोग्राफ दिखाता है। ध्यान दें कि इस उदाहरण में, नमूने एक साथ पूल नहीं किए गए थे। इसके बजाय, प्रत्येक को जेल पर व्यक्तिगत रूप से चलाया गया था। यह प्रारंभिक प्रयोगात्मक परीक्षणों के लिए अनुशंसित है ताकि यह दिखाया जा सके कि प्रोटीन सभी परीक्षण किए गए समय बिंदुओं पर आरएनए से प्रभावी ढंग से लिंक करता है। आरबीपी के अपेक्षित आणविक भार पर एक विशेष रूप से तीव्र संकेत देखा गया था, जो बहुत कम, रेडियोलेबल आरएनए से बंधे प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है जो अनुक्रमण के लिए उत्तरदायी नहीं है। इसलिए, इस बैंड के ऊपर स्मीयर सिग्नल, जो लंबे आरएनए टुकड़ों से क्रॉसलिंक किया गया प्रोटीन है, को अलग किया गया था। टुकड़ा प्रोटीन बैंड के ठीक ऊपर से काटा गया था और लगभग 30 केडीए था। चित्रा 4 बी एक्सिशन के बाद एक ऑटोरेडियोग्राम दिखाता है, जिसमें प्रोटीन जेल में बचे छोटे आरएनए से क्रॉस-लिंक्ड होता है और पहले स्मीयर सिग्नल अब एक्साइज होता है।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद, सीडीएनए लाइब्रेरी को पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धित किया जाना चाहिए। हालांकि, पुस्तकालय के अतिवर्धन से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह पोलीमरेज़ द्वारा अधिमानतः प्रवर्धित अनुक्रमों के प्रति पूर्वाग्रह पेश कर सकता है और पीसीआर कलाकृतियों को उत्पन्न कर सकता है। ओवरएम्प्लीफाइड लाइब्रेरी में बड़ी संख्या में डुप्लिकेट अनुक्रम भी होते हैं जो अनुक्रमक पर पढ़ते हैं। अंतिम पुस्तकालय के प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्रों की आदर्श संख्या की गणना करने के लिए, सीडीएनए के एक एलिकोट को पी 5 और बीसी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके क्यूपीसीआर के माध्यम से प्रवर्धित किया गया था। पहला चक्र जिस पर पुस्तकालय चरम प्रतिदीप्ति तक पहुंच गया था, पीसीआर चक्र गणना के रूप में चुना गया था। चित्रा 4 सी एक विशिष्ट सीडीएनए लाइब्रेरी से एक क्यूपीसीआर का एक उदाहरण देता है, जिसने 16 की पीक चक्र गणना प्राप्त की। इस मान का उपयोग तब अंतिम 3सीआरसी पीसीआर के लिए किया गया था। अनुक्रमित डेटा को संसाधित करने के लिए, हमने अपनी प्रयोगशाला (pyCRAC) में पहले विकसित सॉफ्टवेयर और गतिज CRAC डेटा के विश्लेषण के लिए संबंधित पाइपलाइन का उपयोग किया (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/)। ये ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर टूल डेटा के डिमल्टीप्लेक्सिंग और ट्रिमिंग, पीसीआर डुप्लिकेट को हटाने, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण चोटियों की पहचान करने, क्लस्टर को सन्निहित अनुक्रमों में पढ़ने और बाध्यकारीरूपांकनों की पहचान करने में सक्षम बनाते हैं। इन उपकरणों के संचालन के बारे में अधिक विवरण उनके संबंधित वेबपृष्ठों पर पाए जाते हैं।

हमने स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक 3सीआरसी प्रोटोकॉल विकसित करना भी शुरू कर दिया। स्तनधारी सेल लाइनों के बहुमत को मोनोलेयर के रूप में उगाया जाता है और यूवी-पारगम्य बैग के साथ हमारे क्रॉसलिंकर में ट्रे अनुयायी कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एक चरण विकसित किया जहां उपयोगकर्ता यूवी 1-2 पेट्री व्यंजन (150 मिमी व्यास और गहराई में 25 मिमी) को अनुयायी कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के साथ विकिरणित कर सकते हैं। पहले परीक्षण के रूप में, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए क्रॉस-लिंकर की दक्षता को एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी और पारंपरिक क्लिप-आधारित शुद्धिकरण का उपयोग करके स्थिर रूप से टैग किए गए जीएफपी-आरबीएम 7 के क्रॉस-लिंकिंग और कैप्चर के माध्यम से मापा गया था। जैसा कि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, क्रॉस-लिंकर व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले यूवी विकिरण उपकरण की तुलना में क्षमता पर 254 एनएम यूवी विकिरण का उपयोग करके एक मोनोलेयर के रूप में विकसित स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स को पुनर्प्राप्त करने में सक्षम था। हालांकि, मानक सेल कल्चर प्लास्टिकवेयर आमतौर पर यूवी क्रॉस-लिंकिंग प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है जो 254 एनएम यूवी के लिए अभेद्य है। इसलिए, हमारे क्रॉस-लिंकर में कोशिकाओं को केवल यूवी लैंप के ऊपरी किनारे से विकिरण प्राप्त होगा। इसे दूर करने के लिए, हमने सेल विकास और क्रॉस-लिंकिंग के लिए एक यूवी-पारगम्य क्वार्ट्ज पेट्री डिश विकसित की। क्वार्ट्ज कल्चरवेयर के उपयोग ने यूवी विकिरण के कम से कम 2 एस के साथ प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स की मजबूत वसूली प्रदर्शित की (चित्रा 5 बी)। जब स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आरबीपी कैप्चर विधियों जैसे कि क्लिप प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जाता है, तो ये लघु क्रॉस-लिंकिंग समय जीनोटॉक्सिक तनाव या प्रोटीन कारकों की तेजी से कमी के जवाब में आरबीपी के स्थानिक आरएनए-बाइंडिंग प्रोफाइल को पुनर्प्राप्त करने के लिए टाइमकोर्स के साथ उपयुक्त होते हैं, या ट्रांसक्रिप्शनल या सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन के समानांतर।

चित्रा 6 एनआरडी 1 डेटा के कई उदाहरण दिखाता है जिसे 3सीआरसी पाइपलाइन द्वारा संसाधित किया जाता है। यह आंकड़ा पाइपलाइन और पायथन जीनोमब्राउज़र पैकेज (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) द्वारा उत्पन्न बेडग्राफ फ़ाइलों का उपयोग करके तैयार किया गया था, जिसे हमने डेटा के प्रकाशन-गुणवत्ता वाले जीनोम ब्राउज़र छवियों को सरल बनाने के लिए डिज़ाइन किया था। ग्रे आयताकार जीनोमिक क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो नॉनकोडिंग आरएनए को व्यक्त करते हैं, जैसे कि क्रिप्टिक अस्थिर प्रतिलेख (सीयूटी), स्थिर अस्पष्ट प्रतिलेख (एसयूटी) 40, और एक्सआरएन 1-संवेदनशील अस्थिर प्रतिलेख (एक्सयूटी)41। चित्रा 6 में डेटा से पता चलता है कि एनआरडी 1 इनमें से कई नॉनकोडिंग आरएनए टेप को बांधता है, इस विचार के अनुरूप है कि यह प्रोटीन प्रतिलेख42 के इस वर्ग के क्षरण में शामिल है। चित्रा 6 ए क्रोमोसोम IV पर ~ 15 केबी क्षेत्र दिखाता है। यहां उच्च-आत्मीयता ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों एचएक्सटी 6 और एचएक्सटी 7 को एन्कोडिंग करने वाले प्रतिलेख के लिए एनआरडी 1 के बंधन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जो दोनों ग्लूकोज भुखमरी के दौरान अनियमित हैं। यह संभावना है कि एनएनएस कॉम्प्लेक्स द्वारा प्रतिलेखन समाप्ति ग्लूकोज भुखमरी के दौरान इन जीनों के प्रेरण कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकती है। चित्रा 6 बी आईएमडी 3 प्रतिलेख के लिए एनआरडी 1 क्रॉस-लिंकिंग का एक उदाहरण दिखाता है, जिसे एनएबी 343 द्वारा विनियमित किया जाता है। इस मामले में डेटा ने ग्लूकोज भुखमरी पर बंधन में महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया। पिछले काम से पता चला है कि ग्लूकोज भुखमरी44 के दौरान टाई 7 प्रतिलेख के लिए एनएबी 3 के बंधन में कमी आई है। इस अवलोकन के अनुरूप, 3सीआरसी डेटा से पता चलता है कि ग्लूकोज भुखमरी के दौरान एनआरडी 1 का बंधन कम हो गया और टी 7 के लिए एनआरडी 1 क्रॉस-लिंकिंग 8 मिनट के तनाव के बाद अपने सबसे निचले स्तर पर था (चित्रा 4 सी)। हालांकि, ऐसा प्रतीत होता है कि यह प्रभाव केवल क्षणिक था, क्योंकि ग्लूकोज भुखमरी के 14 मिनट के बाद, एनआरडी 1 बाइंडिंग शुरुआती स्तरों पर वापस चला गया।

Figure 1
चित्र 1: 3सीआरसी प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। वांछित घनत्व तक टैग किए गए उपभेदों को उगाया गया था। आरबीपी आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को इंगित करता है। बाद में, एक संदर्भ नमूना लिया गया और 254 एनएम यूवी प्रकाश के साथ क्रॉस-लिंक किया गया। शेष कोशिकाओं को निस्पंदन द्वारा काटा गया और फिर तेजी से तनाव-उत्प्रेरण माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया। यहां वर्णित 1, 2, 4, 8, 14, और 20 मिनट के बाद नमूने लिए गए और क्रॉस-लिंक किए गए (1). रुचि के आरबीपी को तब अत्यधिक कठोर दो-चरणीय आत्मीयता शुद्धिकरण का उपयोग करके शुद्ध किया गया था (2). इसके बाद, कैप्चर किए गए क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को आंशिक रूप से आरएनएस के साथ पचाया गया, 5 'अंत में रेडियोलेबल किया गया और एडाप्टर को उन पर लगाया गया (3). 5 'एडेप्टर में अद्वितीय "इन-रीड" बारकोड अनुक्रम होते हैं ताकि अनुक्रमण के बाद व्यक्तिगत नमूनों को जैव सूचना विज्ञान से अलग किया जा सके। आरबीपी-आरएनए परिसरों को तब एक साथ जोड़ा, पूल किया गया और अवक्षेपित किया गया (4), एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया और ऑटोरेडियोग्राफी (5) के माध्यम से कल्पना की गई। इसके बाद, मुख्य बैंड के ठीक ऊपर रेडियोधर्मी संकेत वाला एक एकल जेल टुकड़ा, जिसे ऑटोरेडियोग्राफी छवि में डैश्ड लाल बॉक्स के साथ चित्रित किया गया था, जेल से काट दिया गया था (5). जेल स्लाइस को प्रोटीज के के साथ इलाज किया गया था और आरएनए को बाद में निकाला गया (6), सीडीएनए में परिवर्तित किया गया, और पीसीआर (7) के माध्यम से प्रवर्धित किया गया। पीसीआर चरण ने अतिरिक्त बारकोड (पी 7 ऑलिगो द्वारा पेश किया गया पीला ब्लॉक) पेश किया ताकि कई पुस्तकालयों को एक ही लेन में मल्टीप्लेक्स किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रॉस-लिंकिंग और वैक्यूम निस्पंदन। (ए) क्रॉस-लिंकर। सेल सस्पेंशन को मशीन के शीर्ष दाईं ओर स्थित एक फ़नल में डाला जाता है (क्लोज-अप के लिए चित्रा 3 ए भी देखें) और मध्य ट्रे में स्थित यूवी-पारदर्शी बैग में रखा जाता है। यह बैग दो शटर से घिरा हुआ है जो तब तक बंद रहता है जब तक कि उपयोगकर्ता मशीन को विकिरण चरण शुरू करने का निर्देश नहीं देता है। कोशिकाओं को ऊपर और नीचे दोनों ट्रे से यूवी प्रकाश के साथ विकिरणित किया जाता है। मशीन 254 और 365 एनएम यूवी लैंप के साथ आपूर्ति की जाती है, बाद में पीएआर-क्लिप प्रयोगों के लिए लागू होती है। मशीन को शीर्ष दाईं ओर स्थित टचस्क्रीन पैनल के माध्यम से संचालित किया जाता है जो यूवी खुराक या एक्सपोज़र समय को नियंत्रित करने की अनुमति देता है। (बी) क्रॉस-लिंकिंग के बाद, कोशिकाओं को मशीन के बाईं ओर से सूखा दिया जाता है। सेल सस्पेंशन को वैक्यूम के माध्यम से पुनर्प्राप्त किया जाता है और एक ग्लास फ्लास्क में सूखा जाता है जहां उन्हें बाद में कटाई के लिए वैक्यूम निस्पंदन उपकरण में डाला जा सकता है। (सी) वैक्यूम निस्पंदन उपकरण। इन्हें एक क्लिप के माध्यम से खोला और बंद किया जाता है और इसके बीच एक फ़िल्टर डाला जाता है। फिल्टर बदलने के परिणामस्वरूप कोई समय न खोने के लिए बहुत कम समय श्रृंखला के लिए समानांतर में चार निस्पंदन उपकरणों का उपयोग किया गया था। (डी) निस्पंदन के बाद, मीडिया सुपरनैटेंट को बाद के निपटान के लिए फ्लास्क में निकाल दिया गया था। फ़िल्टर हटाए जाने पर सिस्टम में वैक्यूम को बनाए रखने के लिए वैक्यूम निस्पंदन उपकरणों के नीचे वाल्व स्थापित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्रॉस-लिंकिंग निलंबित बनाम अनुयायी कोशिकाएं। (ए) निलंबन कोशिकाओं के लिए वैरी-एक्स-लिंकर कक्ष के साथ क्रॉस-लिंकर। सेल कल्चर को ट्रे के ऊपरी दाईं ओर स्थित नमूना इनलेट (फ़नल) में डाला जाता है। (बी) ट्रे जो अनुयायी कोशिकाओं या निलंबन कोशिकाओं की छोटी मात्रा को क्रॉस-लिंक करने के लिए प्लास्टिक या क्वार्ट्ज पेट्री व्यंजन रख सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पुस्तकालय की तैयारी। (ए) एनआरडी 1-एचटीपी 3सीआरसी प्रयोग से ऑटोरेडियोग्राम का उदाहरण। मजबूत, केंद्रित संकेत बहुत छोटे आरएनए से क्रॉसलिंक किए गए प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ऊपर दिया गया स्मीयर अनुक्रमण के लिए पर्याप्त लंबाई के आरएनए से जुड़े प्रोटीन क्रॉस-लिंक्ड का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) स्मीयर को एक्साइज किया गया था जैसा कि जेल एक्सिशन के बाद लिए गए ऑटोरेडियोग्राम में दिखाया गया है। (सी) एक 3सीआरसी सीडीएनए लाइब्रेरी से एक प्रतिनिधि क्यूपीसीआर। इस उदाहरण में, सीडीएनए का अधिकतम प्रवर्धन 16 चक्रों तक पहुंच गया था। इस प्रकार, अंतिम प्रवर्धन के लिए 16 चक्रों का उपयोग किया गया था। त्रुटि पट्टी तीन तकनीकी QPCR प्रतिकृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती है। (डी) 6% टीबीई जेल पर सीडीएनए लाइब्रेरी से फॉस्फोरइमेज का उदाहरण। (ई) चिप-आधारित केशिका वैद्युतकणसंचलन से सीडीएनए लंबाई और गुणवत्ता विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: स्तनधारी कोशिकाओं में क्रॉसलिंकिंग का परीक्षण करने के लिए उच्च आरएनएस परीक्षण आईसीएलआईपी प्रयोग। जीएफपी-आरबीएम 7 आईसीएलआईपी प्रयोगों से ऑटोरेडियोग्राम दिखाए गए हैं जिन्होंने विभिन्न क्रॉस-लिंकिंग ऊर्जाओं में आरएनपी वसूली की दक्षता का परीक्षण किया। क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं पर चुंबकीय मोतियों के साथ युग्मित एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोप्रेसिटेशन किया गया था, जो स्थिर रूप से जीएफपी-आरबीएम 7 को व्यक्त करते थे। इम्यूनोप्रेसिपिटेट्स को आरएनएस आई की उच्च सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि संबंधित आरएनए को कम, समान लंबाई में ट्रिम किया जा सके। आरएनपी को 32पी लेबलिंग और एसडीएस-पेज द्वारा कल्पना की गई थी और गैर-क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन के माइग्रेशन के करीब एक परिभाषित बैंड के रूप में माइग्रेट किया गया था। परिमाणीकरण एंटी-जीएफपी वेस्टर्न ब्लॉट सिग्नल के लिए सामान्यीकृत रेडियोलेबल आरबीएम 7-आरएनए सिग्नल के डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण के परिणामों को इंगित करता है। (ए) आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले यूवीपी क्रॉस-लिंकर बनाम हमारे क्रॉस-लिंकर (वैरी-एक्स-लिंकर) का क्रॉस-लिंकिंग टाइम-कोर्स; (बी) क्वार्ट्ज (बाएं) और प्लास्टिक (दाएं) कल्चरवेयर पर हमारे क्रॉस-लिंकिंग टाइम-कोर्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: उदाहरण जीनोम ब्राउज़र प्लॉट अपने लक्ष्यों के लिए एनआरडी 1 के अंतर, अस्थायी बंधन को दिखाने के लिए 3सीआरसी की शक्ति दिखाते हैं। प्रत्येक बॉक्स अलग-अलग जीनोमिक क्षेत्रों के लिए प्लॉट दिखाता है। तीर इंगित करते हैं कि जीन किस स्ट्रैंड पर एन्कोड किए गए हैं (बाएं इशारा तीर = माइनस स्ट्रैंड; दाएं इशारा तीर = प्लस स्ट्रैंड)। टाइमपॉइंट (मिनट) प्रत्येक उप-प्लॉट के वाई-अक्षों पर टी 0, टी 1, टी 2, आदि द्वारा इंगित किए जाते हैं। क्रोमोसोम और निर्देशांक को इंगित करने वाले रोमन अंक दिखाए गए हैं। (ए) ग्लूकोज की कमी पर, एनआरडी 1 दो उच्च-आत्मीयता ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों, एचएक्सटी 6 और एचएक्सटी 7 को बांधता है, जो दोनों इस स्थिति में अनियमित हैं। (ख) एनआरडी1 को आईएमडी3 से बांधते हुए देखा गया है, जो कि एनएबी344 का पहले से मान्य लक्ष्य है और ग्लूकोज भुखमरी के बाद तीव्रता कम हो जाती है। (C) Tye7 का Nrd1 बाइंडिंग एक गतिशील और क्षणिक प्रकृति को प्रदर्शित करता है, जो ग्लूकोज भुखमरी के बाद 8 मिनट के तनाव के बाद न्यूनतम तक कम हो जाता है। हालांकि, बंधन बाद में 14 मिनट के बाद बेसल स्तरों पर लौट आता है। रीड को "प्रति मिलियन पढ़ने" (आरपीएम; वाई-अक्ष) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। ग्रे बॉक्स नॉनकोडिंग आरएनए को एन्कोडिंग करने वाले क्षेत्रों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

नए क्रॉस-लिंकिंग और सेल हार्वेस्टिंग उपकरणों के साथ संयुक्त 3सीआरसी विधि में बड़ी क्षमता है क्योंकि यह मॉडल जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है और इसलिए आरएनए क्षेत्र के लिए सामान्य रुचि होनी चाहिए। ऐसे कई क्षेत्र हैं जिनमें 3CC का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विधि का उपयोग प्रोटीन की पदानुक्रमित असेंबली को बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स में मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि स्प्लिसोसोम और राइबोसोम, जिसमें अक्सर प्रोटीन और आरएनए अणुओं के बीच गतिशील बातचीत शामिल होती है। अब हम नियमित रूप से आरएनए क्षय कारकों और उनके सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत की निगरानी के लिए इसका उपयोग करते हैं जब कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के तनावों के अधीन होती हैं। यह हमें यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि अनुकूली प्रतिक्रिया के किस चरण में ये कारक सबसे सक्रिय हैं, वे किस सब्सट्रेट से बंधते हैं, और ये इंटरैक्शन कितने गतिशील हैं। इस तरह के डेटा को शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूलन में प्रत्येक कारक के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने में सक्षम बनाना चाहिए।

अत्यधिक कठोर और विकृत परिस्थितियों में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए 3सीआरसी दोहरे आत्मीयता शुद्धिकरण टैग (एचटीएफ या एचटीपी) का उपयोग करता है। यह सुनिश्चित करता है कि कोप्यूरिफाइड आरएनए आरएनए के लिए अत्यधिक समृद्ध है जो सहसंयोजक रूप से रुचि के प्रोटीन से जुड़े थे। हालांकि, आत्मीयता टैग पर भरोसा करने के नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, टैग प्रोटीन फ़ंक्शन में हस्तक्षेप कर सकता है, जो इसके आरएनए-बाइंडिंग इंटरएक्टोम का विकृत रीडआउट दे सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ मॉडल जीवों के लिए टैग का उपयोग करना हमेशा संभव नहीं हो सकता है क्योंकि जीनोम में डीएनए टुकड़ों को एकीकृत करने या अभिव्यक्ति प्लास्मिड को बदलने के लिए आनुवंशिक उपकरण अभी तक उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, आरबीपी के शुद्धिकरण के लिए एंटीबॉडी पर भरोसा करने वाले क्लिप-आधारित प्रोटोकॉल के साथ संगत बनाने के लिए 3सीआरसी प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को बदलना आसान है। दरअसल, इस अध्ययन से पता चला है कि हमारे क्रॉसलिंकर के साथ आईसीएलआईपी-आधारित शुद्धिकरण को जोड़ना संभव है। अब हम नवजात आरएनए प्रतिलेख के साथ मानव आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के अस्थायी संबंध का अध्ययन करने के लिए क्लिप प्रोटोकॉल विकसित करने की प्रक्रिया में हैं।

एक नए प्रोटीन पर 3सीआरसी का प्रदर्शन करते समय, अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग को प्रेरित करने के लिए यूवी एक्सपोजर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च यूवी एक्सपोजर शुद्धिकरण चरण के दौरान आरएनए की वसूली को कम कर सकते हैं। पुनः संयोजक आरबीपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को विभिन्न यूवी खुराक, 100 एमजे / सेमी2, 250 एमजे / सेमी2, 500 एमजे / सेमी2, और 1 जे / सेमी2 के संपर्क में लाया गया था। आरएनपी पर कब्जा कर लिया गया और आरएनए को खंडित और रेडियोलेबल किया गया। बाद में, आरएनपी को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया था और यह पता लगाने के लिए एक ऑटोरेडियोग्राम लिया गया था कि कौन सा एक्सपोजर सबसे तीव्र संकेत देता है (यानी अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग)।

एक बार प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के बाद, कई नियंत्रण प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, शुद्धि करण मोतियों के लिए पृष्ठभूमि बंधन की निगरानी के लिए एक यूवी विकिरणित, अनटैग्ड नमूने का उपयोग किया जा सकता है। दूसरा, एक शिफ्ट प्रयोग के दौरान 3सीआरसी लागू करते समय, दूसरी बार की श्रृंखला जहां कोशिकाओं को मूल माध्यम में वापस स्थानांतरित किया जाता है, जांच को सक्षम बनाता है कि क्या कोशिकाओं का निस्पंदन स्वयं आरएनए स्तर या प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन में परिवर्तन लाता है।

जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, हाल ही में प्रकाशित कई पेपर क्लिप प्रोटोकॉल के लिए कई अनुकूलन का सुझाव देते हैं। इसमें इन्फ्रारेड स्कैनिंग10 के माध्यम से प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एडाप्टर का उपयोग शामिल है और साथ ही परिणामस्वरूप पुस्तकालयोंकी जटिलता को बढ़ाने के लिए दिखाए गए विभिन्न न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण और आकार चयन चरणों के अनुकूलन शामिल हैं। हम वर्तमान में इनमें से कुछ सुधारों को लागू कर रहे हैं ताकि 3सीआरसी प्रोटोकॉल को और परिष्कृत किया जा सके। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में पहले से ही मूल सीआरएसी और एसीआरसी प्रोटोकॉल में कई सुधार शामिल हैं जो डेटा की जटिलता को बढ़ाते हैं। उदाहरण के लिए, पहले, एसडीएस-पेज जैल पर क्रॉस-लिंक्ड, रेडियोधर्मी प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स को हल करने के बाद, उन्हें नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था और क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को धब्बा से अलग किया गया था। हालांकि, आरएनपी और बाद में आरएनए निष्कर्षण का हस्तांतरण बहुत अक्षम हो सकता है, खासकर जब आरएनए पोलीमरेज़ सबयूनिट्स जैसे बड़े आरबीपी से निपटते हैं। इसके परिणामस्वरूप क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में महत्वपूर्ण कमी हो सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीधे एसडीएस-पेज जेल स्लाइस से निकाला जाता है जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इससे क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, सीडीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के बाद उत्पाद को मूल रूप से 3%, कम पिघलने वाले तापमान अगारोस जैल पर हल किया गया था, और फिर जेल से 175-300 बीपी पीसीआर उत्पादों को निकाला गया था। हालांकि, इन जैल को आसानी से ओवरलोड किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए का बहुत खराब पृथक्करण होता है। प्रीकास्ट टीबीई जैल के साथ अगारोस जैल को बदलने के परिणामस्वरूप अधिक सुसंगत आकार पृथक्करण और पीसीआर उत्पादों की बेहतर वसूली हुई।

Disclosures

लैंगफोर्ड और डब्ल्यू वोरबॉय एक वाणिज्यिक कंपनी यूवीओ 3 से संबद्ध हैं। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने के निर्णय में उनकी कोई भूमिका नहीं थी।

Acknowledgments

इस काम को वेलकम ट्रस्ट (एसजी को 091549 और 109093/जेड/15/ए से एसएम), वेलकम ट्रस्ट सेंटर फॉर सेल बायोलॉजी कोर ग्रांट (092076) और मेडिकल रिसर्च काउंसिल नॉन-क्लिनिकल सीनियर रिसर्च फैलोशिप (एमआर/आर008205/1 से एसजी), यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान संगठन से दीर्घकालिक पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (एएलटीएफ 1070-2017 से आर.ए.सी.) के तहत अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। और स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (टी.एच.जे.)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 159 सीआरएसी सीएलआईपी आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन यूवी क्रॉस-लिंकिंग इंजीनियरिंग तनाव प्रतिक्रिया समय-समाधान

Erratum

Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 02/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर विवो में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन डायनामिक्स की निगरानी
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McKellar, S. W., Ivanova, I., van… More

McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).

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