Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61027
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 4, 3, 1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

ERRATUM NOTICE

Summary

Kinetisk kryssbinding og analyse av cDNA er en metode som tillater undersøkelse av dynamikken i protein-RNA-interaksjoner i levende celler ved høy temporal oppløsning. Her er protokollen beskrevet i detalj, inkludert vekst av gjærceller, UV-kryssbinding, høsting, proteinrensing og neste generasjons sekvenseringsbibliotekforberedelsestrinn.

Abstract

Samspillet mellom RNA-bindende proteiner (RBP) og deres RNA-substrater utviser fluiditet og kompleksitet. I løpet av levetiden kan et enkelt RNA bindes av mange forskjellige RBP-er som vil regulere produksjon, stabilitet, aktivitet og nedbrytning. Som sådan har mye blitt gjort for å forstå dynamikken som eksisterer mellom disse to typer molekyler. Et spesielt viktig gjennombrudd kom med fremveksten av 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Denne teknikken tillot streng undersøkelse av hvilke RNA som er bundet av en bestemt RBP. Kort sagt, proteinet av interesse er UV kryssbundet til dets RNA-substrater in vivo, renset under svært strenge forhold, og deretter blir RNAene kovalent kryssbundet til proteinet omdannet til cDNA-biblioteker og sekvensert. Siden unnfangelsen har mange avledede teknikker blitt utviklet for å gjøre CLIP mottagelig for bestemte fagområder. Imidlertid er tverrbinding ved hjelp av ultrafiolett lys notorisk ineffektiv. Dette resulterer i utvidede eksponeringstider som gjør den tidsmessige studien av RBP-RNA-interaksjoner umulig. For å løse dette problemet har vi nylig designet og bygget mye forbedrede UV-bestrålings- og cellehøstingsenheter. Ved hjelp av disse nye verktøyene utviklet vi en protokoll for tidsoppløste analyser av RBP-RNA-interaksjoner i levende celler ved høy temporal oppløsning: Kinetisk CR-oss-kobling og A-nalyseav c-DNA(χCRAC). Vi har nylig brukt denne teknikken til å studere rollen som gjær-RBP i næringsstresstilpasning. Dette manuskriptet gir en detaljert oversikt over χCRAC-metoden og presenterer nyere resultater oppnådd med Nrd1 RBP.

Introduction

RNA er ofte avhengige av RBP for å utøve sin funksjon, noe som har ført til stor interesse for å forstå dynamikken mellom disse molekylene. Mange RBP har blitt identifisert i et bredt spekter av organismer. Imidlertid har det alltid vært notorisk vanskelig å studere RBP-RNA-interaksjoner in vivo. Et stort gjennombrudd i å studere slike interaksjoner kom med fremveksten av CLIP1. Denne metoden benytter ultrafiolett (UV, 254 nm) bestråling for å indusere kovalente bindinger mellom RBP og deres direkte bundne RNA (dvs. nulldistanse tverrbinding). Deretter blir RBP av interesse immunorenset under strenge forhold for å sikre at bare RNA kovalent kryssbundet til proteinene identifiseres. Bundne RNA blir deretter delvis fordøyd med RNaser og deretter omdannet til cDNA-biblioteker for sekvensering. Den høye rensingsstrengheten er viktig, da den øker spesifisiteten til protein- og RNA-utvinning, som også forbedres ytterligere gjennom SDS-PAGE-rensing av det tverrbundne ribonukleoprotein (RNP) -komplekset. CLIP og relaterte metoder gir også innsikt i nukleotidoppløsning i proteinbindingsstedet, fordi aminosyrer som krysser båndet til RNA ofte avslutter revers transkriptase under forberedelsen av sekvenseringsbiblioteket eller forårsaker at enzymet introduserer mutasjoner på dette stedet 1,2,3.

Siden introduksjonen har den opprinnelige CLIP-protokollen produsert et bemerkelsesverdig utvalg av avledede metoder. Et spesielt viktig gjennombrudd kom med utviklingen av HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som fusjonerer høykapasitetssekvensering med CLIP-tilnærmingen3. Dette har siden blitt tatt i bruk av alle CLIP-baserte metoder. iCLIP introduserte forbedringer i RNase-medierte trimmings- og adapterligeringsteknikker som muliggjør mer nøyaktig kartlegging av RBP-bindingsstedene4. PAR-CLIP kombinerte 4thio-uridin/uracil-merking med kryssbinding ved 365 nm, noe som gjør det mulig å kartlegge kryssbindingssteder ved å analysere T-C-substitusjoner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP og uvCLAP introduserte denatureringsbetingelser og doble affinitetsrensetrinn som ytterligere reduserer bakgrunnsbindingen til affinitetsharpiksen og ytterligere øker spesifisiteten til proteinfangst 2,6,7,8,9. I tillegg introduserte CRAC, uvCLAP og dCLIP merking av RBP av interesse med en affinitetskode, og overvant dermed behovet for å generere spesifikke antistoffer.

Det er også gjort flere optimaliseringer for å fremskynde CLIP-metodikken. Den opprinnelige CLIP-protokollen benyttet radiomerking av de fangede RNAene for å visualisere RBP-RNA-kompleksene etter SDS-PAGE. Bruk av radioaktivitet kan imidlertid være problematisk for laboratorier som ikke er satt opp for slikt arbeid. irCLIP inkorporerer en fluoroforkoblet adapter som muliggjør visualisering gjennom infrarød avbildning10 og sCLIP benytter biotinylering av fangede RNA for å visualisere dem gjennom streptapavidin-konjugert HRP11. Videre gir eCLIP fullstendig avkall på RNA-merking; I stedet blir proteinet skåret ut basert utelukkende på sin kjente størrelse12. Streptavidinbasert rensing har også blitt brukt til å fremskynde prosessen med bibliotekforberedelse i FAST-iCLIP, hvor en biotinylert 3'-adapter ligeres på RNA-ene og brukes til å muliggjøre rensing etter revers transkripsjon og sirkularisering13. Ytterligere forbedringer i iCLIP-protokollen økte også kompleksiteten til bibliotekene4.

Endelig har CLIP blitt modifisert for å muliggjøre fangst av RBP fra forskjellige cellulære underrom 14,15, for å visualisere nylig transkriberte RNA ved hjelp av pulserende induksjon av fotoaktiverbare ribonukleosider 5,16,17, for å fange metylerte RNA18,19,20, for å undersøke RNA-RNA-interaksjoner 21,22, og for å kartlegge 3' ender 23,24.

Til tross for de store bidragene fra CLIP-baserte teknikker for å hjelpe vår forståelse av samspillet mellom RBP og RNA, har det blitt begrenset av ineffektiviteten til UV-tverrbinding. Selv om kulturceller dyrket i et monolag generelt er relativt enkle å kryssbinde, er dette betydelig mer utfordrende i vev eller celler i løsning. Vev kan kreve flere runder med UV-eksponering for å trenge inn i de nødvendige cellelagene, mens mikrobielle celler ofte dyrkes i rike medier som inneholder aromatiske, UV-absorberende forbindelser25. Faktisk har UV-bestrålingstider på opptil 30 minutter blitt brukt til å generere tilstrekkelig tverrbinding mellom RBP og deres bundne RNA for slike prøver26,27,28. Denne utvidede UV-eksponeringen induserer stressresponser i cellen, slik UV-indusert DNA-skade, som kan forurense de endelige dataene i enkelte applikasjoner.

Flertallet av CLIP-studier har fokusert på å generere enkle "øyeblikksbilder" av spesifikke protein-RNA-interaksjoner i en celle. Imidlertid er protein-RNA-interaksjoner iboende dynamiske, spesielt når celler er utsatt for endringer i miljøet. Dette kan inkludere en plutselig reduksjon i tilgjengeligheten av essensielle næringsstoffer eller raske temperaturendringer. Som sådan, for å virkelig forstå rollen til en RBP under stress, er det best å utføre tidsoppløste analyser fordi de kan fange hele spekteret av RBP-mål under stress og bestemme på hvilket stadium av stressresponsen den valgte RBP er aktiv. Spesielt viste studier i gjær at de første minuttene av tilpasningen er helt avgjørende for overlevelse og RNA-halveringstider i bakterier kan variere fra minutter til sekunder 29,30,31,32,33. Slike tidsoppløste analyser bør derfor ideelt sett utføres med høy tidsoppløsning. De lange kryssbindingstidene gjør imidlertid studiet av adaptive responser i tidlig stadium spesielt utfordrende.

For å overvinne disse problemene har vi nylig utviklet en forbedret metode som er i stand til å kryssbinde og høste celler på minuttlange tidsskalaer. Vår χCRAC-metode tillater kvantitativ måling av dynamiske endringer i RBP-RNA-interaksjoner ved tidligere uvitnet oppløsning. Avgjørende for denne metoden var utviklingen av en ny UV-bestrålingsenhet32 som reduserer den nødvendige tverrbindingstiden i gjær og bakterier i oppløsning rundt 10 ganger, og effektivt fryser RBP-RNA-interaksjoner øyeblikkelig. I tillegg, for å raskt høste cellene etter UV-bestråling, utviklet vi en vakuumfiltreringsenhet som kan høste eksponentielt voksende gjær i en 0,5 L kultur på rundt 30 s32. Disse teknologiske innovasjonene tillater studier av RBP-RNA-dynamikk ved minuttskalaoppløsning. I tillegg introduserte vi også flere optimaliseringer til den opprinnelige CRAC-protokollen2 for å øke dens praktiske egenskaper.

Ved hjelp av χCRAC studerte vi nylig målomet til en gjærkjernefysisk RBP, Nab3, som svar på glukosemangel. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 danne et kompleks med Nrd1, en RBP og RNA-helikasen Sen1 for å danne NNS-komplekset. NNS-binding til RNA-polymerasen og det gryende transkriptet kan utløse transkripsjonell avslutning34. Dette komplekset er for det meste involvert i å fjerne kryptiske ikke-kodende RNA-transkripter, men har også vist seg å regulere ekspresjon av proteinkodende gener. Studien viste differensiell målretting av Nab3 til ikke-koding og koding av transkripsjoner etter bare ett minutts stress32. Vi demonstrerte at co-transkripsjonell avslutning av Nab3 resulterer i et svært forbigående, pulslignende uttrykk av retrotransposongener, som ville vært vanskelig å oppdage ved bruk av tradisjonelle CLIP-baserte tilnærminger. I tillegg økte de korte UV-bestrålingstidene i vår UV-tverrbinder også betydelig utvinning av kortvarige ikke-kodende RNA32. χCRAC vil sannsynligvis være et avgjørende verktøy for å belyse ikke bare hvordan RBP-er former responsen på stress på umiddelbare tidsskalaer, men også deres endrede roller gjennom hele livssyklusen til en respons. Dette manuskriptet gir en detaljert oversikt over alle trinnene i χCRAC-protokollen. For illustrative formål ble metoden brukt til å studere gjær Nrd1-proteinet, som er involvert i transkripsjonell avslutning og RNA-henfall35,36, og dets RNA-målom som svar på glukosemangel over en rekke tidspunkter. Til slutt demonstrerer vi også at vår UV-bestrålingsenhet raskt kan krysskoble RBP til RNA i HeLa-celler, noe som gjør det mulig å også utføre høyoppløselige tidsoppløste analyser i adherente celler.

Protocol

TN150
50 mM Tris pH 7,8
150 mM NaCl
0,1% NP-40
1X proteasehemmer
TN1000
50 mM Tris pH 7,8
1M NaCl
0,1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7,8
10 mM MgCl2
0,1% NP-40
5 ml beta-merkaptoetanol
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM MgCl2
50 mM beta-merkaptoetanol
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7,8
300 mM NaCl
10 ml imidazol
6M guanidin-HCl
0,1% NP-40
5 ml beta-merkaptoetanol
WB II
50 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM NaCl
10 ml imidazol
0,1% NP-40
5 ml beta-merkaptoetanol
Eluering buffer
50 mM Tris pH 7,8
50 mM NaCl
250 ml imidazol
0,1% NP-40
5 ml beta-merkaptoetanol
Protease K-buffer
50 mM Tris
0,1% NP-40
5 mM β-merkaptoetanol
1% SDS
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
Pattedyrs lysis buffer
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0.5% v / v Triton X-100
0,25 % w/v Na-deoksykolat
0,1 % w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM DTT (tilsatt fersk)
1X proteasehemmer

Tabell 1: Bufferne som kreves for χCRAC og deres komposisjoner.

1. UV-tverrbinding og lysatproduksjon

  1. Mikroorganismer i oppløsning
    1. Inokuler 3,5 l av ønsket medium med gjær fra en overnattingskultur til en start-OD600 på 0,05. Vokse ved 30 °C med kontinuerlig risting ved 180 o / min.
    2. Under veksten, lag andre nødvendige materialer.
      1. Forbered en beholder med flytende nitrogen.
      2. Tilbered 3 l stressfremkallende medium og varm til 30 °C i vannbad.
      3. Sett opp filterapparatet, slå på tverrbinderen (figur 2A) og merk 50 ml koniske rør, ett for hvert tidspunkt.
    3. Når cellene når ønsket OD 600, hell500 ml celler rett inn i tverrbinderen og UV-bestråle med 250 mJ av 254 nm UV. Se figur 2A og figur 3A for detaljer om bruk av krysslinkeren.
      MERK: UV-bestrålingsenergien må optimaliseres nøye for hvert protein av interesse. Se diskusjonen for ytterligere detaljer.
    4. Etter kryssbinding, filtrer cellene ved hjelp av en av vakuumfiltreringsenhetene (figur 2B,C). Rull opp membranen med de filtrerte cellene, plasser i t = 0 (tid null) 50 ml konisk rør, og flashfrys i flytende nitrogen.
    5. Filtrer de gjenværende cellene over seks forskjellige filtre. Resuspender de oppsamlede cellene i 3 l av tidligere oppvarmet stressinduserende medium ved å slippe membranene i mediet og blande kraftig med en stripett i 50 s. Etter 50-tallet, forbered deg på å ta t = 1-prøven.
    6. Etter 1 min, kryssbind 500 ml celler og høst gjennom filtrering som i trinn 1.1.3–1.1.4. Gjenta etter 2, 4, 8, 14 og 20 min, eller forskjellige tidspunkter etter behov.
    7. Oppbevar de koniske rørene som inneholder cellene ved -80 °C. Sett fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 °C over natten.
    8. Neste dag, ta hvert konisk rør som inneholder en tverrbundet prøve og resuspender cellene i 25 ml kald PBS ved å riste kraftig.
    9. Overfør cellesuspensjonene til nye kjegleformede rør og spinn ved 4 600 x g, 5 minutter ved 4 °C.
    10. Hell av PBS, spinn raskt igjen for å samle gjenværende PBS og dekanter deretter den gjenværende væsken med en pipette.
    11. Beregn vekten av pelleten i røret ved å sammenligne den med et tomt rør.
    12. Tilsett to pelletsvolumer iskald TN150, 60 μL DNase 1 og 10 μL RNase-hemmer. Inkuber på is i 30 min.
      1. For eksempel, for 400 mg celler, tilsett 800 μL iskald TN150.
      2. Tilsetningen av DNase er ikke essensiell for de fleste løselige proteiner, men er svært viktig når man studerer kromatinbundne proteiner som RNA-polymerase. I tillegg reduserer det viskositeten til bakterielle lysater. Det er svært viktig å bruke nøyaktig to pelletsvolumer av lysisbufferen, ellers kan lysiseffektiviteten reduseres.
    13. Tilsett tre pelletsvolumer (i ml) zirkoniumperler til cellesuspensjonen. For gjær, bruk 0,5 mm diameter perler og for bakterier bruk 0,1 mm.
      1. For eksempel, for 400 mg celler, måle ut 1, 2 ml zirkoniumperler i et 1, 5 ml rør og legg dem til cellene resuspendert i lysisbuffer.
    14. Virv cellesuspensjonene i 1 min, og legg deretter på is i 1 min. Gjenta for totalt 5x.
    15. Tilsett to pelletsvolumer TN150 buffer og virvel kraftig for å blande.
    16. Sentrifuger suspensjonen i det koniske røret ved 4 600 g i 20 minutter ved 4 °C i en stasjonær sentrifuge.
      1. Etter sentrifugering, ta en 50 μL-prøve av supernatanten for fremtidig Western blot-analyse for å undersøke hele celleproteinuttrykket.
    17. Overfør supernatantene til 1,5 ml rør og roter lysatet i 20 minutter ved 20 000 x g ved 4 °C, i en mikrofuge.
      1. Alternativt, hvis du bruker 5 ml rør, sentrifuger ved 13 000 x g i 20 minutter.
      2. Etter sentrifugering, ta en 50 μL prøve av supernatanten for fremtidig Western blot-analyse for å undersøke det løselige uttrykket av proteinet.
    18. Fortsett til RBP-fangst (seksjon 2).
  2. Kultiverte adherente celler
    1. Frø nok adherente celler i en petriskål 24 timer før UV-kryssbinding slik at de kan nå 80% sammenløp neste dag. Vokse over natten i ønsket medium i en cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
      MERK: Hvis du bruker kvarts petriskåler, er det fordelaktig å fremme celleadhesjon gjennom behandling av kulturvarer med poly-D-lysin (70.000-140.000 vekt) og føtalkalveserum (FCS) 2,5 timer før såing. Tilsett nok poly-D-lysin til å dekke hele vekstflaten og inkuber ved romtemperatur (RT) i 5 minutter. Deretter skal kvarts petriskålen skylles grundig med vann og tørkes i cellekulturinkubatoren i 2 timer eller til den er helt tørr. Etterpå legger du til nok FCS til å dekke vekstflaten helt og plassere i inkubatoren i minst 30 minutter. FCS bør fjernes helt før såing av celler.
    2. Når cellene har nådd 80% konfluens, fjern mediet og vask med 15 ml iskald PBS. Fjern deretter all gjenværende væske helt og fortsett umiddelbart til neste trinn.
    3. Overfør petriskålen til brettet for adherente celler (figur 3B) og UV-bestråle med 300 mJ av 254 nm UV. Se figur 2A og figur 3B for detaljer om bruk av krysslinkeren.
      MERK: UV-bestrålingsenergien må optimaliseres nøye for hvert protein av interesse. Se diskusjonen for ytterligere detaljer.
    4. Umiddelbart etter tverrbinding, legg petriskålen på is og tilsett 10 ml iskald PBS. Samle celler ved å skrape og overføre til et 15 ml konisk rør. Pellet gjennom sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
    5. Fjern PBS og resuspender cellepelleten i 1 ml iskald PBS, og overfør til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pelletsceller igjen ved sentrifugering i 5 min ved 300 x g ved 4 °C.
    6. Fjern PBS og snap-frys cellepellets på tørris. Oppbevar cellepellets ved -80 °C til det er nødvendig.
    7. Gjenta trinn 1.2.3–1.2.6 for hvert tidspunkt.
    8. Resuspender cellepellets i 1 ml lysisbuffer og overfør til et 15 ml konisk rør. Deretter tilsettes 1 ml lysisbuffer for totalt 2 ml.
    9. Legg til 5 μL pattedyrs RNase-hemmer.
    10. Sonikere 5x i 10 s på is ved 10 amp. Vent 30 s mellom sonikeringsrunder.
    11. Beregn proteinkonsentrasjonen av hver prøve og normaliser til laveste konsentrasjon.
    12. Overfør 1,98 ml lysat til et 2 ml rør.
    13. Tilsett 10 μL DNase I og inkuber ved 37 °C i 5 minutter med risting ved 1 200 o / min.
    14. Sentrifuger lysatet ved 16 000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
      1. Etter sentrifugering, ta en 50 μL prøve av supernatanten for fremtidig Western blot-analyse for å undersøke løselig ekspresjon av proteinet.
    15. Fortsett til RBP-fangst (seksjon 2).

2. RBP-fangst

  1. Vask magnetisk anti-FLAG (75 μL slurry per prøve) eller IgG agarose (500 μL slurry per prøve) perler 3x med 5 ml TN150. Resuspender i et endelig volum på 700 μL TN150 og tilsett 100 μL vasket perler til syv 15 ml koniske rør.
    1. Oppbevares på is til det er nødvendig.
  2. Når lysatene er avklart, tilsett supernatanten til røret som inneholder anti-FLAG / IgG-perlene.
  3. Nuter ved 4 °C i 2 timer.
    MERK: Noen protokoller beskriver inkubasjoner over natten med perlene, men dette anbefales ikke, fordi lange inkubasjonstider kan dramatisk redusere utvinningen av tverrbundne RNAer.

3. Vask perlene og TEV-spaltning av taggene

  1. Høst perlene og fjern lysatet.
    1. Ta en 50 μL prøve av supernatanten for fremtidig Western blot-analyse for å undersøke det ufangede proteinet.
  2. Heng opp perlene i iskald TN1000 og overfør til et 1,5 ml rør. Vask i 10 min, 4 °C, med nøtte. Gjenta i totalt tre vasker.
    1. Hvis du bruker IgG agaroseperler, vask med 5 ml TN1000. Hvis du bruker anti-FLAG-perler, bruk 2 ml.
  3. Deretter vasker du perlene 3x med TN150, med samme volum som ovenfor.
  4. Etter den tredje vasken, heng opp perlene i 600 μL TN150.
  5. Tilsett 30 U hjemmelaget GST-TEV-protease til perleopphenget og roter i 2 timer ved RT.
    MERK: Rekombinant GST-TEV-protease er nå også kommersielt tilgjengelig, men det har ikke blitt testet med denne protokollen.
    1. Under fordøyelsen, forbered deg på de neste trinnene ved å sette opp kolonner med tre 1,5 ml rør for hver prøve (dvs. for syv prøver, ha tre rader med syv kolonner).
    2. Til den siste raden av rør, tilsett 0,4 g guanidiumhydroklorid, 27 μL 5M natriumklorid og 3 μL 2,5 M imidazol (pH = 8). Merk at pH i imidazol må være 8. Dette er avgjørende for å opprettholde RNA-integritet.
    3. I tillegg vasker du det nødvendige volumet av nikkelperler i WB I 3x. Bruk 100 μL slam per prøve. Etter den siste vasken, resuspender perlene i samme originale volum av WB I og oppbevar på is.
  6. Når TEV-fordøyelsen er fullført, samler du supernatanten ved hjelp av et magnetisk stativ for anti-FLAG-perler eller sentrifugering for IgG-perler, og overfører til den første raden av rørene som tidligere er satt opp.
    1. Ta en 50 μL prøve av TEV-eluatet for Western blot-analyse.
  7. Sett en termoblok-inkubator til 37 °C. Til den andre raden med rør, tilsett 1 μL RNase-cocktail (1:50 fortynning).
  8. Ta 550 μL TEV-eluat fra den første raden av rør og legg til den andre raden (som inneholder RNase-cocktailen). Pipett kraftig for å sikre blanding.
  9. Etter å ha fullført dette for den første prøven, plasser røret umiddelbart i termoblokken og start en timer. Gå videre til de påfølgende prøvene, slik at hver er forskjøvet.
  10. Inkuber i nøyaktig 5 min. Når den er fullført, fjern den første prøven fra termoblokken og overfør løsningen til den tredje raden med rør (som inneholder guanidiumhydrokloridpulveret).
    MERK: En 5 minutters inkubasjon med en 1:50 fortynning av RNase-cocktailen er vanligvis egnet for de fleste proteiner, men dette trinnet må optimaliseres nøye med forskjellige inkubasjonstider eller konsentrasjoner for hvert protein for å sikre at de tverrbundne RNAene har riktig størrelse (30-100 nt).
  11. Virvel umiddelbart i et par sekunder ved full hastighet for å oppløse guanidiumpulveret og gå videre til neste prøve.
  12. Etter at alle prøvene er overført til guanidiumpulveret, virvel igjen for å sikre at alt pulveret er fullstendig oppløst.
  13. Tilsett 100 μL vasket nikkelperler og roter over natten ved 4 °C. Denne inkubasjonen kan forkortes til 2 timer.

4. On-bead alkalisk fosfatase behandling

  1. Sett en termoblokk på 37 °C.
  2. Plasser en renselsesspinnkolonne i et 2 ml rør, en for hver prøve. Overfør nikkelkulene til kolonnene og la supernatanten renne gjennom. Etterpå må du sørge for at alle nikkelkulene ble fjernet fra 1,5 ml røret ved å skylle med WB I og påføre kolonnen.
  3. Sett opp 2 ml rør, seks per prøve (en for å samle hver vask). Hold utsiden av kolonnene tørre for å opprettholde flyten. Vask perlene 3x med 500 μL WB I og deretter 3x med 500 μL NP-PNK.
  4. Lukk lokket på spinnkolonnen og spinn perlene kort for å fjerne overflødig buffer.
  5. Sett proppen på kolonnen, sett kolonnene i rør på 1,5 ml og tilsett 60 μl av reaksjonsblandingen sett i tabell 2.
Komponent 1x 7,5 ganger
5 x PNK-buffer 12 90
Alkalisk fosfatase 4 30
RNase-hemmer 2 15
H2O 42 315
Siste bind 60 μL 450 μL

Tabell 2: Alkalisk fosfatasereaksjonsblanding.

  1. Inkuber kulene i 1 time ved 37 °C.
  2. Vask perlene 1x med 500 μL WB I for å inaktivere alkalisk fosfatase og deretter 3x med 500 μL NP-PNK-buffer. Sørg for å skylle innsiden av kolonnen grundig med NP-PNK-bufferen for å fjerne spor av guanidium.

5. On-bead ligering av App-PE-linkeren til 3'-enden av RNA

  1. Spinn ut den gjenværende bufferen og tilsett 60 μL av blandingen spesifisert i tabell 3 (se tabell 4 for App-PE-sekvensen) til kolonnene. Inkuber reaksjonen i 6 timer ved 25 °C.
Komponent 1x 7,5 ganger
5 x PNK-buffer 12 90
App-PE-adapter (100 μM) 0.6 4.5
T4 RNA ligase 2 avkortet K227Q 3 22.5
RNase-hemmer 1.5 11.25
50% PEG 8000 12 90
H2O 30.9 231.75
Siste bind 60 μL 450 μL

Tabell 3: App-PE-linker-ligeringsreaksjonsblanding.

Oligonukleotid navn Sekvens (5'-3')
L5Aa invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5Ab invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrArGrCrN-OH
L5Ac invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrGrCrArGrCrN-OH
L5Ad invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrCrUrUrArGrCrN-OH
L5Ba invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5Bb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArGrCrN-OH
L5Bc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrCrUrArGrCrN-OH
L5Bd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH
L5Ca invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5Cb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH
L5Cc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrCrCrCrGrCrN-OH
L5Cd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH
L5Da invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrUrGrArUrN-OH
L5Db invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrCrCrUrArN-OH
L5Dc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArGrUrGrCrN-OH
L5Dd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrArCrGrN-OH
L5Ea invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5Eb invddT-ACACrGrArCrGrCrCrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5Ec invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5Ed invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrCrGrArCrCrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PE App-NAGATCGGAAGAGCACGTCTG-ddC

Tabell 4: Sekvensene av DNA- og RNA-adapterne som kreves for ligering på 5' og 3' endene av fangede RNAer. Disse ble renset gjennom RNase-fri HPLC.

  1. Vask perler 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL NP-PNK-buffer. Sett kolonnen i et nytt rør og spinn ut den gjenværende bufferen.

6. Fosforylering på perle av 5' endene av RNA

  1. Tilsett 80 μL av blandingen spesifisert i tabell 5 til kolonnene. Inkuber reaksjonen i 40 minutter ved 37 °C.
    MERK: Prøvene vil nå være svært radioaktive. Derfor bør alt etterfølgende arbeid utføres bak en beskyttende skjerm, og avfall skal kastes i henhold til lokale helse- og sikkerhetsregler.
Komponent 1x 7,5 ganger
5 x PNK-buffer 16 120
32P-ɣATP (10 μCi/μL) 3 22.5
T4 PNK 3 22.5
H2O 58 435
Siste bind 80 μL 600 μL

Tabell 5: Fosforyleringsreaksjonsblanding.

  1. Tilsett 1 μL 100 mM ATP og la reaksjonen fortsette i ytterligere 20 minutter. Dette vil sørge for at nesten alle 5'-endene har fosfater for å lette ligering av 5'-linkeren.
  2. Sett opp 2 ml rør, fem per prøve.
  3. Vask perler 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL NP-PNK-buffer. Merk at disse elueringene vil være svært radioaktive og derfor bør kastes på riktig måte.
  4. Flytt kolonnen til det siste røret og spinn ut den gjenværende bufferen.

7. On-bead ligering av 5 'linker

MERK: 5'-linkerne inneholder en RNA-strekkode som brukes til identifisering av hver prøve etter sekvensering. Det er derfor helt avgjørende å merke seg hvilken linker som brukes til hvilken prøve.

  1. Tilsett 78 μL av blandingen beskrevet i tabell 6 til kolonnene. Tilsett 2 μL 5' adapter (100 μM; se tabell 4) i hver tube og inkuber over natten ved 18 °C.
Komponent 1x 7,5 ganger
5 x PNK-buffer 16 120
ATP (10 mM) 8 60
RNase-hemmer 2 15
T4 RNA ligase 4 30
H2O 48 360
Siste bind 78 μL 585 μL

Tabell 6: 5' linkerligeringsreaksjonsblanding.

  1. Dagen etter vasker du perlene 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL WB II og overfører kolonnene til et nytt 2 ml rør.

8. Elution, SDS-PAGE og RNA-ekstraksjon

  1. Sett sentrifugen til 4 °C. Forbered to rader med 1,5 ml rør per prøve for eluering.
  2. Spinn ut tomromsvolumet på kolonnene med nikkelperler med et raskt spinn. Plasser kolonnene i den første raden med elueringsrør og tilsett 200 μL elueringsbuffer. Vent 2 min, og tving deretter bufferen gjennom kolonnen med et raskt spinn.
  3. Flytt kolonnene til den andre rørraden, og gjenta trinn 8.2. Hver prøve vil nå ha 400 μL eluat totalt, fordelt på to 1,5 ml rør.
    1. Ta alle eluatene og overfør dem sammen til et 5 ml rør. Tilsett 2 μL 20 mg/ml glykogen. Hvis du bruker syv prøver, vil det nå være 2,8 ml samlet eluat i 5 ml røret.
  4. Tilsett 100 μL trikloreddiksyre (TCA) per prøve [f.eks. 700 μl TCA for 7 prøver (2,8 ml samlet eluat)] til 5 ml røret, og virvelbrønn i 30 s.
  5. Inkuber på is i 20 min.
  6. Sentrifuge i 30 minutter ved 17 000 x g, 4 °C, i en stasjonær sentrifuge.
  7. Fjern forsiktig supernatanten fra det koniske røret, kontroller pipetten med en geigerteller for å sikre at pelleten ikke har blitt fjernet ved et uhell. Hvis det har det, returner supernatanten til røret og sentrifugen i ytterligere 10 minutter.
    MERK: Supernatanten kan fortsatt være svært radioaktiv. Sørg for å bruke riktig skjerming.
  8. Bryt pelleten helt i 2 ml iskald aceton.
  9. Sentrifuge i 15 min ved 17 000 x g, 4 °C.
  10. Fjern så mye aceton med en P1000-pipette som mulig. Etterpå spinner du røret kort for å samle små dråper aceton, og fjern deretter med en P10-pipette. Tørk i 2 min i en avtrekkshette.
    MERK: Acetonsupernatanten kan fortsatt være radioaktiv. Sørg for å bruke riktig skjerming.
  11. Resuspender prøven i 30 μL med 1x proteinbelastningsbuffer. For å sikre at pelleten er riktig resuspendert, sjekk at det aller meste av radioaktiviteten nå er tilstede i lastbufferen og ikke igjen i 1,5 ml røret ved å fjerne løsningen i en P200-pipette og måle aktiviteten som er igjen i 1,5 ml røret ved hjelp av en geigerteller.
  12. Varm prøven i 10 min ved 65 °C. Legg på en 1 mm, 4–12 % prefabrikkert Bis-Tris gel og kjør i 1,5 timer ved 125 V i MOPS-buffer.
  13. Etter at gelen er ferdig med å kjøre, åpner du gelkassetten. Gelen skal holdes på bunnplaten. Kast toppen.
  14. Pakk gelen inn i klamfilm og fest den deretter med tape på innsiden av en lystett kassett. Forsikre deg om at kassetten har en forsterkningsskjerm for å forbedre signalet.
  15. Utsett en autoradiografisk film på gelen og oppbevar kassetten ved -80 °C under eksponeringen. Eksponeringstiden vil variere mellom proteiner med ulik kryssbindingseffekt.
    1. Når du plasserer filmen, må det være en måte å justere den til kassetten for å kutte ut båndet av interesse i det påfølgende trinnet. For å sikre dette, bruk en fluorescerende linjal og sørg også for at gelen er i et hjørne av kassetten, som deretter dekkes av filmen som også er plassert i det ytterste hjørnet.
      MERK: Som en tommelfingerregel, eluates i lasting buffer som gir en avlesning på minst ~ 250 cps når den vises til en geigerteller gi tilstrekkelig signal for en eksponering på 3 timer. Ellers utføres eksponering over natten.
  16. Utvikle filmen. Skjær bort klamfilmen som dekker gelen, men ikke beveg gelen. Ellers blir bildet forskjøvet fra gelen.
    MERK: Gelen vil sannsynligvis være svært radioaktiv. Sørg for å bruke riktig skjerming når du skjærer ut gelskiven.
  17. Plasser filmen over gelen og skjær ut båndet av interesse. Sett gelskiven i et 2 ml rør.
  18. Knus gelskiven med en P1000-pipettespiss og tilsett 600 μL proteinase K-buffer pluss 200 μg proteinase K (denne protokollen bruker 10 μL av en 20 mg / ml proteinase K-løsning). Inkuber i 2 timer ved 55 °C med kraftig risting.
  19. Etterpå kutter du enden av en P1000-spiss med en ren skalpell og overfører supernatant- og gelbitene til en spinnkolonne plassert i et 2 ml rør.
  20. Spinn kolonnen i 1 min ved 17.000 x g ved RT. Samle gjennomstrømningen, som inneholder de radioaktive, isolerte RNAene.
  21. Utfør en fenol: kloroformekstraksjon.
    1. Tilsett 50 μL 3 M natriumacetat, pH = 5,2 og 500 μL fenol:kloroform og hvirvelbrønn. Spinn i 5 min ved 17 000 x g. Fjern det vandige topplaget og sett i et nytt 1,5 ml rør.
    2. Tilsett 500 μL kloroform og virvel kraftig i 10-15 s. Spinn i 5 min ved 17 000 x g ved RT. Fjern det vandige laget og legg i et nytt 1,5 ml rør.
    3. Tilsett 1 μL 20 mg/ml glykogen og 1 ml iskald, 96 % etanol. Bunnfall i 30 minutter ved -80 °C eller over natten ved -20 °C.
    4. Sentrifuge i 30 minutter ved 4 °C, 17 000 x g. Fjern supernatanten, tilsett 500 μL 70 % etanol og sentrifuge i 5 minutter, 4 °C ved 17 000 x g. Fjern all etanol, utfør et raskt spinn for å samle rester og fjern overflødig med en P10-pipette.
    5. Tørk pelleten i ~3 min i en avtrekkshette. Resuspender i 20 μL DEPC-behandlet vann.
  22. Oppbevar RNA ved -80 °C over natten eller fortsett umiddelbart til omvendt transkripsjonstrinn.

9. Omvendt transkripsjon

  1. Legg til 2 μL av 10 μM RT oligo (PE_reverse; se tabell 7) og 4 μL av 5 mM dNTP til 20 μL RNA.
Oligonukleotid navn Sekvens (5'-3')
P5 fremover AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACGACGCTCTTCCGATCT
BC1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
4. kvartal CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
PE_reverse CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabell 7: PCR-primerne (inkludert strekkodesekvensene) og omvendt transkripsjonsprimer.

  1. Overfør til en forvarmet termoblokk ved 85 °C i 3 minutter, og avkjøl deretter på is i 5 minutter. Samle innholdet i røret ved kort sentrifugering og tilsett deretter 8 μL 5x revers transkriptasebuffer, 2 μL 100 mM DTT og 2 μL RNase-hemmer.
  2. Inkuber blandingen ved 50 °C i 3 minutter og tilsett deretter 2 μl revers transkriptase og inkuber i 1 time ved 50 °C.
  3. Inaktiver revers transkriptase ved inkubasjon ved 65 °C i 15 minutter.
  4. Overfør slangene til en forvarmet termoblokk ved 37 °C og la stå i 3 minutter for å akklimatisere deg.
  5. Tilsett 2 μL RNase H og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  6. Isoler cDNA ved hjelp av SPRI-perler.
    1. Tilsett to volumer på 84 μL perler. Inkuber i 15 min. Sett perlene på et magnetisk stativ og la stå i 1 min for å høste perlene.
    2. Fjern og kast supernatanten og tilsett 200 μL 70% etanol. Ikke fjern perlene fra magnetstativet. Inkuber perlene med etanol i 30 s.
    3. Fjern etanolen og gjenta vasketrinnet. Fjern all gjenværende etanol ved hjelp av en P10-spiss.
    4. Legg perlene i en avtrekkshette i 2 minutter for å tørke dem. Fjern perlene fra stativet, heng dem opp igjen i 12 μL vann, og legg deretter perlene tilbake på stativet. Fjern 11 mikrol supernatant.
  7. Frys cDNA ved -20 °C eller fortsett umiddelbart til PCR-trinnet.

10. qPCR-reaksjon

  1. Før den endelige PCR for amplifisering av cDNAene, utføres en kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) for å identifisere det optimale antall sykluser for å amplifisere cDNAene for å forhindre overamplifisering av biblioteket.
  2. Sett opp en qPCR-reaksjon på is i henhold til tabell 8. Se tabell 7 for alle grunninger.
Komponent 1x
2x qPCR reaksjon mastermix 5
0,1 μM P5 primer (fremover) 0.8
0,1 μM BC primer (revers) 0.8
cDNA (eller vann som en negativ kontroll) 1
H2O 2.4
Siste bind 10 μL

Tabell 8: qPCR-reaksjonsblanding.

  1. For riktig kvantifisering av syklusene som trengs for amplifikasjon, bruk tre tekniske replikater for cDNA og tre negative (dvs. vann) kontroller.
  2. Forsegl platene med optisk gjennomsiktig film og kjør qPCR i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Analyser prøvene gjennom en absolutt kvantifiseringsmetode for å identifisere antall sykluser (n) hvor kneet for eksponentiell vekst nås (se figur 4C for et eksempel). Dette antall sykluser brukes deretter til den endelige amplifiseringen av resten av cDNA.

11. PCR-reaksjon og gelekstraksjon

  1. Sett opp PCR-reaksjonen på is i henhold til tabell 9. Se tabell 7 for alle grunninger.
    MERK: Bare 5 μL av cDNA-biblioteket brukes.
Komponent 1x
10 x korrekturlesing polymerasebuffer 5
10 μM P5 primer (fremover) 1
10 μM BC primer (revers) 1
5 mM dNTP 2.5
Korrekturlesing av polymeraseenzym 1
cDNA 5
H2O 34.5
Siste bind 50 μL

Tabell 9: PCR-reaksjonsblanding.

  1. Kjør PCR som følger: 95 °C i 2 minutter; n sykluser på 98 °C i 20 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 1 min; og 72 °C i 5 min. Antallet (n) sykluser for forsterkning av χCRAC-biblioteket bestemmes av qPCR beskrevet i avsnitt 10.
  2. Tilsett 1 μL eksonuklease I og inkuber ved 37 °C i 60 minutter.
  3. Rengjør det forsterkede cDNA-et ved hjelp av SPRI-perler som beskrevet ovenfor ved å bruke to volumer perler (dvs. 100 μL). Elute i 11 μL.
  4. Tilsett 3 μL 6x lastestoff og kjør på en prefabrikkert 6 % TBE-gel ved 100 V i 1 time i 1x TBE-buffer. Bruk en stige som passer for kvantifisering av korte DNA-fragmenter.
  5. Når du er ferdig, fjern gelen fra kassetten og legg den i en egnet, væsketett beholder med nok 1x TBE til å dekke gelen (f.eks. ~50 ml). Tilsett en passende mengde SYBR-sikkert fargestoff (f.eks. for 50 ml, bruk 5 μL av et 10 000x fargestoff)
  6. La gelen få flekker gjennom forsiktig blanding i 15 min ved RT. Tøm den SYBR-inneholdende 1x TBE og erstatt med ren 1x TBE. Vask gelen i 10 min med forsiktig risting ved RT.
  7. Tøm 1x TBE og legg gelen i en gjennomsiktig mappe. Klipp mappen til en passende størrelse.
  8. Avbilde gelen på en passende måte, for eksempel en fosforbilder. Punktafgifterte DNA-fragmenter mellom ~175 bp og ~400 bp. Legg gelskiven i et 1,5 ml rør.
  9. Knus gelskiven grundig med en P1000-spiss og tilsett 400 μL H2O. Inkuber ved 37 °C med risting i 1 time i en termoblokk.
  10. Frys prøven på tørris i 10 min, og legg den deretter tilbake i termoblokken ved 37 °C med risting i 1 time.
  11. Lag en filterenhet ved å ta en filterkolonne og sette inn to mikrofiberfiltre i glass inni. Plasser enheten i et 1,5 ml rør.
  12. Klipp av enden av en P1000-spiss med en ren skalpell og ta opp den knuste TBE-gelsuspensjonen, og dispenser deretter i filterenheten som ble opprettet i trinn 11.12. Spinn på 17 000 x g i 30 s.
  13. Tilsett 1 μL glykogen til supernatanten, sammen med 40 μL natriumacetat, pH = 5,2 og 1 ml 96% etanol. Inkuber ved -80 °C i 30 minutter.
  14. Sentrifuge i 30 min ved 17 000 x g, 4 °C. Kast supernatanten og vask med 500 μl 70 % etanol.
  15. Spinn i 5 min, fjern etanolen helt og tørk deretter pelleten i en avtrekkshette i 3 minutter.
  16. Resuspender i 10 μL H2O og måle DNA-konsentrasjonen.

Representative Results

For å demonstrere effekten av χCRAC-metoden ble det utført et tidskurseksperiment med gjærstammer som uttrykker et HTP-merket Nrd1-protein. En detaljert skjematisk fremstilling som beskriver hvordan metoden fungerer, er gitt i figur 1. I likhet med Nab3 er Nrd1 involvert i kjernefysisk RNA-forfall av en rekke RNA-transkripsjoner37. Tidligere arbeid fra Corden-laboratoriet antydet at Nrd1-binding til RNA-målene endres betydelig når celler blir utsatt for glukose sult28,38. Som sådan ble celler som vokste eksponentielt i medium som inneholdt glukose (SD-TRP) skiftet til samme medium uten glukose (S-TRP) over et tidsforløp for å overvåke dynamiske endringer i Nrd1-RNA-interaksjoner. Det ble tatt prøver og kryssbundet i Vari-X-linkerkammeret (figur 3A) før skiftet og deretter etter 1, 2, 4, 8, 14 og 20 min. Mediet som ble brukt til cellevekst var bevisst mangelfull i tryptofan for å redusere UV-absorpsjon av denne aromatiske aminosyren. Merk at det er best å bruke syntetisk medium som er filtersterilisert som fordi autoklavering av mediet kan føre til karamellisering av sukker. Dette reduserer deretter tverrbindingseffektiviteten.

Figur 4A viser en representativ autoradiograf fra et χCRAC-eksperiment. Merk at i dette eksemplet ble ikke prøvene slått sammen. I stedet ble hver kjørt individuelt på gelen. Dette anbefales for innledende eksperimentelle tester for å vise at proteinet kryssbinder effektivt til RNA på alle de testede tidspunktene. Et spesielt intenst signal ble observert ved den forventede molekylvekten til RBP, som representerer proteinet bundet til svært korte, radiomerkede RNA som ikke er egnet for sekvensering. Derfor ble smøresignalet over dette båndet, som er proteinet kryssbundet til lengre RNA-fragmenter, isolert. Fragmentet ble kuttet fra like over proteinbåndet pluss rundt 30 kDa. Figur 4B viser et autoradiogram etter eksisjon, med proteinet kryssbundet til korte RNA igjen i gelen og det tidligere smøresignalet nå skåret ut.

Etter revers transkripsjon må cDNA-biblioteket amplifiseres med PCR. Imidlertid må overforsterkning av biblioteket unngås, da dette kan introdusere skjevhet mot sekvenser fortrinnsvis forsterket av polymerasen og generere PCR-artefakter. Overforsterkede biblioteker inneholder også et stort antall dupliserte sekvenser som kaster bort lesing på sequenceren. For å beregne det ideelle antall PCR-sykluser for amplifisering av det endelige biblioteket, ble en alikot av cDNA amplifisert gjennom qPCR ved bruk av P5- og BC-oligonukleotidene. Den første syklusen der biblioteket nådde topp fluorescens ble valgt som PCR-syklustelling. Figur 4C gir et eksempel på en qPCR fra et typisk cDNA-bibliotek, som ga et toppsyklustall på 16. Denne verdien ble deretter brukt for den endelige χCRAC PCR. For å behandle de sekvenserte dataene brukte vi programvare som tidligere ble utviklet i laboratoriet vårt (pyCRAC) og den tilsvarende rørledningen for analyse av kinetiske CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Disse programvareverktøyene med åpen kildekode muliggjør demultipleksing og trimming av dataene, fjerning av PCR-duplikater, identifisering av statistisk signifikante topper, klyngelesing i sammenhengende sekvenser og identifisering av bindingsmotiver39. Ytterligere detaljer om hvordan disse verktøyene fungerer, finnes på deres respektive nettsider.

Vi begynte også å utvikle en χCRAC-protokoll for pattedyrceller. De fleste pattedyrcellelinjer dyrkes som et monolag, og brettet i vår tverrbinder med den UV-permeable posen er ikke egnet for eksperimenter med adherente celler. For å løse dette problemet utviklet vi et stadium der brukerne kan UV-bestråle 1–2 petriskåler (150 mm diameter og 25 mm i dybden) med adherente celler (figur 3B). Som en første test ble effektiviteten til kryssbinderen for pattedyrceller målt gjennom kryssbinding og fangst av stabilt merket GFP-RBM7 ved bruk av anti-GFP-antistoffer og en tradisjonell CLIP-basert rensing. Som vist i figur 5A, var kryssbinderen i stand til å gjenopprette protein-RNA-komplekser fra pattedyrceller dyrket som et monolag ved bruk av 254 nm UV-bestråling ved effektivitet som kan sammenlignes med en mye brukt UV-bestrålingsanordning. Imidlertid er standard cellekulturplastikk som normalt brukes til UV-kryssbindingseksperimenter, ugjennomtrengelig for 254 nm UV. Derfor vil cellene i vår tverrbinder bare motta bestråling fra den øvre bredden av UV-lamper. For å overvinne dette utviklet vi en UV-permeabel petriskål i kvarts for cellevekst og tverrbinding. Bruk av kvartskulturvarer viste robust gjenvinning av protein-RNA-komplekser med så få som 2 s UV-bestråling (figur 5B). Når de kombineres med RBP-fangstmetoder for pattedyrceller som CLIP-teknologier, er disse korte kryssbindingstidene mottagelige med tidskurs for å gjenopprette spatiotemporale RNA-bindende profiler av RBP som respons på genotoksiske påkjenninger eller raske uttømminger av proteinfaktorer, eller parallelt med transkripsjons- eller cellesyklussynkronisering.

Figur 6 viser flere eksempler på Nrd1-data behandlet av χCRAC-rørledningen. Denne figuren ble utarbeidet ved hjelp av bedgraph-filene generert av rørledningen og python GenomeBrowser-pakken (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi designet for å forenkle å lage genomleserbilder av dataene i publikasjonskvalitet. De grå rektanglene representerer genomiske regioner som uttrykte ikke-kodende RNA, slik som kryptisk ustabil transkript (CUT), stabile ukarakteriserte transkripsjoner (SUTs)40 og Xrn1-sensitive ustabile transkripsjoner (XUTs)41. Dataene i figur 6 viser at Nrd1 binder seg til mange av disse ikke-kodende RNA-transkriptene, i samsvar med ideen om at dette proteinet er involvert i nedbrytning av denne klassen av transkripsjoner42. Figur 6A viser en ~ 15 kb region på kromosom IV. Her var det en signifikant økning i binding av Nrd1 til transkripsjoner som koder for glukosetransportørene HXT6 og HXT7 med høy affinitet, som begge oppreguleres under glukosesult. Det er sannsynlig at transkripsjonsterminering av NNS-komplekset kan påvirke induksjonskinetikken til disse genene under glukosesult. Figur 6B viser et eksempel på Nrd1-kryssbinding til Imd3-transkripsjonen, som er kjent for å være regulert av Nab343. I dette tilfellet viste dataene en signifikant reduksjon i binding ved glukosesult. Tidligere arbeid viste redusert binding av Nab3 til Tye7-transkripsjonen under glukose sult44. I samsvar med denne observasjonen antyder χCRAC-dataene at bindingen av Nrd1 ble redusert under glukosesult og Nrd1-kryssbindingen til Tye7 var på sitt laveste etter 8 minutters stress (figur 4C). Det ser imidlertid ut til at denne effekten bare var forbigående, for etter 14 min glukosesult gikk Nrd1-bindingen tilbake til startnivå.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av χCRAC-protokollen. Merkede stammer ble dyrket til ønsket tetthet. RBP indikerer RNA-bindende protein. Deretter ble det tatt en referanseprøve og kryssbundet med 254 nm UV-lys. De gjenværende cellene ble høstet ved filtrering og deretter raskt skiftet til det stressinduserende mediet. I χCRAC-eksperimentet som er beskrevet her, ble det tatt prøver og kryssbundet 1, 2, 4, 8, 14 og 20 minutter etter skiftet (1). RBP av interesse ble deretter renset ved hjelp av en svært streng to-trinns affinitetsrensing (2). Deretter ble de fangede tverrbundne RNAene delvis fordøyd med RNaser, radiomerket i 5'-enden og adaptere ble ligert på dem (3). 5'-adapterne inneholdt unike "in-read" strekkodesekvenser slik at de enkelte prøvene kunne separeres bioinformatisk etter sekvensering. Deretter ble RBP-RNA-kompleksene eluert, slått sammen og utfelt (4), løst av SDS-PAGE og visualisert ved autoradiografi (5). Deretter ble en enkelt gelskive med det radioaktive signalet like over hovedbåndet, illustrert med stiplet rød boks i autoradiografibildet, kuttet ut av gelen (5). Gelskivene ble behandlet med protease K, deretter ble RNA ekstrahert (6), omdannet til cDNA og amplifisert ved PCR (7). PCR-trinnet introduserte flere strekkoder (gul blokk introdusert av P7 oligo) slik at mange biblioteker kunne multiplekses til en enkelt bane. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tverrbinding og vakuumfiltrering. (A) Krysslenkeren. Cellesuspensjonen helles i en trakt øverst til høyre på maskinen (se også figur 3A for et nærbilde) og holdes i en UV-gjennomsiktig pose i midtskuffen. Denne posen er flankert av to skodder som forblir lukket til brukeren instruerer maskinen om å starte bestrålingstrinnet. Cellene bestråles med UV-lys fra brettene både over og under. Maskinen leveres med 254 og 365 nm UV-lamper, hvor sistnevnte kan brukes til PAR-CLIP-eksperimenter. Maskinen betjenes via et berøringsskjermpanel øverst til høyre som gjør det mulig å kontrollere UV-dosering eller eksponeringstid. (B) Etter tverrbinding dreneres cellene fra venstre side av maskinen. Cellesuspensjoner gjenvinnes gjennom vakuum og dreneres til en glasskolbe hvor de deretter kan helles i en vakuumfiltreringsanordning for høsting. (C) Vakuumfiltreringsenheter. Disse åpnes og lukkes via et klipp og et filter settes inn mellom det. Fire filtreringsenheter ble brukt parallelt i svært korte tidsserier for ikke å miste tid som følge av bytte av filtre. (D) Etter filtrering ble mediesupernatanten drenert til kolber for senere destruksjon. Ventiler ble installert under vakuumfiltreringsenhetene for å opprettholde vakuumet i systemet når filteret fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kryssbinding av suspenderte vs. adherente celler. (A) Tverrbinderen med Vari-X-linkerkammeret for suspensjonsceller. Cellekulturen helles i prøveinnløpet (trakten) øverst til høyre i skuffen. (B) Brett som kan inneholde petriskåler av plast eller kvarts for kryssbinding av adherente celler eller små volumer av suspensjonsceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Forberedelse av bibliotek. (A) Eksempel på et autoradiogram fra et Nrd1-HTP χCRAC-eksperiment. Det sterke, konsentrerte signalet representerer proteinet kryssbundet til svært korte RNA, mens smøret ovenfor representerer proteinet kryssbundet til RNA med tilstrekkelig lengde for sekvensering. (B) Utstryket ble skåret ut som vist i et autoradiogram tatt etter geleksisjon. (C) En representativ qPCR fra et χCRAC cDNA-bibliotek. I dette eksemplet ble maksimal amplifisering av cDNA nådd ved 16 sykluser. Dermed ble 16 sykluser brukt til den endelige forsterkningen. Feillinjen representerer standardavviket til tre tekniske qPCR-replikater. (D) Eksempel på et fosforbilde fra et cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. (E) cDNA-lengde og kvalitetsanalyse fra en chipbasert kapillær elektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Høy RNase-test iCLIP-eksperiment for å teste kryssbinding i pattedyrceller. Vist er autoradiogrammer fra GFP-RBM7 iCLIP-eksperimenter som testet effektiviteten av RNP-utvinning på tvers av ulike kryssbindende energier. Immunutfelling ble utført ved bruk av anti-GFP-antistoffer koblet til magnetiske perler på tverrbundne celler som stabilt uttrykte GFP-RBM7. Immunutfellinger ble inkubert med høye konsentrasjoner av RNase I for å trimme assosierte RNA til korte, ensartede lengder. RNP ble visualisert ved 32P-merking og SDS-PAGE og migrerer som et definert bånd, nær migrasjonen av det ikke-kryssbundne proteinet. Kvantifisering indikerer resultatene av densitometriske analyser av radiomerket RBM7-RNA-signal normalisert til anti-GFP western blot-signalet. (A) Cross-linking time-course av den ofte brukte UVP cross-linker versus vår cross-linker (Vari-X-linker; VxL). (B) Tverrbindende tidsforløp av vår kryssbinder på kvarts (venstre) og plast (høyre) kulturvarer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på genom-nettleserplott som viser kraften til χCRAC for å vise differensiell, tidsmessig binding av Nrd1 til målene. Hver boks viser plott for individuelle genomiske regioner. Pilene angir hvilken streng genene er kodet på (venstre pekende pil = minus streng; høyre pekende pil = pluss streng). Tidspunktene (min) er angitt med t0, t1, t2 osv. på y-aksene til hver delplott. Romertall som indikerer kromosomene og koordinatene vises. (A) Ved glukosemangel binder Nrd1 to glukosetransportører med høy affinitet, HXT6 og HXT7, som begge er oppregulert i denne tilstanden. (B) Nrd1 observeres å binde seg til Imd3, et allerede validert mål på Nab344, med redusert intensitet etter glukosesult. (C) Nrd1-binding av Tye7 utviser en dynamisk og forbigående natur, og avtar etter glukosesult til et minimum etter 8 minutters stress. Bindingen går imidlertid deretter tilbake til basalnivå etter 14 min. Leser ble normalisert til "leser per million" (RPM; y-aksen). Grå bokser angir områder som koder for ikke-kodende RNAer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

χCRAC-metoden, kombinert med de nye kryssbindings- og cellehøstingsenhetene, har stort potensial fordi den er anvendelig for et bredt spekter av modellorganismer og derfor bør være av generell interesse for RNA-feltet. Det er mange områder der χCRAC kan utnyttes. For eksempel kan metoden brukes til å måle den hierarkiske samlingen av proteiner i store makromolekylære komplekser, som spleiseosomet og ribosomet, som ofte involverer dynamiske interaksjoner mellom proteiner og RNA-molekyler. Vi bruker det også rutinemessig til å overvåke interaksjoner mellom RNA-henfallsfaktorer og deres substrater når celler blir utsatt for ulike slags påkjenninger. Dette gjør oss i stand til å bestemme på hvilket stadium av den adaptive responsen disse faktorene er mest aktive, hvilke substrater de binder seg til, og hvor dynamiske disse interaksjonene er. Slike data skal gjøre det mulig for forskere å bestemme det relative bidraget fra hver faktor i tilpasning til miljøendringer.

χCRAC bruker dual affinity purification tags (HTF eller HTP) for å rense proteinet under svært strenge og denaturerende forhold. Dette sikrer at det korensede RNA er svært beriket for RNA som var kovalent kryssbundet til proteinet av interesse. Å stole på affinitetsmerker har imidlertid ulemper. For eksempel kan koden forstyrre proteinfunksjonen, noe som kan gi en forvrengt avlesning av dets RNA-bindende interaktom. I tillegg kan det for noen modellorganismer ikke alltid være mulig å bruke koder fordi de genetiske verktøyene for å integrere DNA-fragmenter i genomet eller for å transformere ekspresjonsplasmider ennå ikke er tilgjengelige. Det er imidlertid enkelt å endre noen deler av χCRAC-protokollen for å gjøre den kompatibel med CLIP-baserte protokoller som er avhengige av antistoffer for rensing av RBP. Denne studien viste faktisk at det er mulig å kombinere iCLIP-baserte rensinger med vår crosslinker. Vi er nå i ferd med å utvikle CLIP-protokoller for å studere den tidsmessige assosiasjonen av humane RNA-bindende proteiner med begynnende RNA-transkripter.

Når χCRAC utføres på et nytt protein, må UV-eksponeringen optimaliseres for å indusere maksimal tverrbinding. Dette er viktig fordi høy UV-eksponering kan redusere utvinningen av RNA under rensetrinnet. Celler som uttrykker rekombinant RBP ble utsatt for forskjellige UV-doser, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 og 1 J/cm 2. RNP-ene ble deretter fanget og RNAene ble fragmentert og radiomerket. Etterpå ble RNPene løst av SDS-PAGE og et autoradiogram ble tatt for å utlede hvilken eksponering som ga det mest intense signalet (dvs. maksimal tverrbinding).

Når de eksperimentelle forholdene er optimalisert, anbefales flere kontrolleksperimenter når du utfører χCRAC. For det første kan en UV-bestrålt, umerket prøve brukes til å overvåke bakgrunnsbindingen til rensekulene. For det andre, når man bruker χCRAC under et skifteksperiment, vil en andre tidsserie hvor cellene forskyves tilbake til det opprinnelige mediet muliggjøre undersøkelse av om filtreringen av cellene i seg selv induserer endringer i RNA-nivåer eller protein-RNA-interaksjoner.

Som nevnt i introduksjonen, foreslår mange nylig publiserte artikler en rekke optimaliseringer av CLIP-protokollen. Dette inkluderer bruk av fluorescerende merkede adaptere for å oppdage protein-RNA-komplekset gjennom infrarød skanning10, samt optimaliseringer til forskjellige nukleinsyrerensing og størrelsesvalgstrinn vist å øke kompleksiteten til de resulterende bibliotekene 12,45. Vi implementerer for tiden noen av disse forbedringene for å forbedre χCRAC-protokollen ytterligere. Protokollen som presenteres her inneholder allerede en rekke forbedringer av de opprinnelige CRAC- og χCRAC-protokollene som øker kompleksiteten til dataene. For eksempel, tidligere, etter å ha løst de tverrbundne, radioaktive protein-RNA-kompleksene på SDS-PAGE-geler, ble de overført til en nitrocellulosemembran og det tverrbundne RNA ble isolert fra flekken. Imidlertid kan overføringen av RNP og påfølgende RNA-ekstraksjon være svært ineffektiv, spesielt når det gjelder store RBP-er som RNA-polymerase-underenheter. Dette kan resultere i en betydelig reduksjon i utvinningen av det tverrbundne RNA. I den nåværende protokollen ekstraheres det tverrbundne RNA direkte fra SDS-PAGE gelskiver som illustrert i figur 1. Dette økte utvinningen av tverrbundne RNAer. I tillegg, etter PCR-amplifisering av cDNAene, ble produktet opprinnelig løst på 3%, agarosegeler med lav smeltetemperatur, og deretter ble 175-300 bp PCR-produkter ekstrahert fra gelen. Imidlertid kan disse gelene lett overbelastes, noe som resulterer i svært dårlig separasjon av DNA. Bytte av agarosegeler med prefabrikkerte TBE-geler resulterte i mer konsistent størrelsesseparasjon og bedre gjenvinning av PCR-produkter.

Disclosures

A. Langford og W. Worboys er tilknyttet UVO3, et kommersielt selskap. De hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Wellcome Trust (091549 til S.G og 109093/Z/15/A til S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) og Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 til S.G.), European Molecular Biology Organization under et langsiktig postdoktorstipend (ALTF 1070-2017 til R.A.C.), og Danmarks uavhengige forskningsfond (T.H.J).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369 (2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632 (2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49 (2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12 (2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité? Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8 (2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

Tags

Biokjemi utgave 159 CRAC CLIP RNA-proteininteraksjon UV-tverrbinding engineering stressrespons tidsløst

Erratum

Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 02/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKellar, S. W., Ivanova, I., van… More

McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter