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Biochemistry

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61027
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 4, 3, 1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

ERRATUM NOTICE

Summary

A reticulação cinética e análise de cDNA é um método que permite investigar a dinâmica das interações proteína-RNA em células vivas em alta resolução temporal. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, incluindo o crescimento de células de levedura, reticulação UV, colheita, purificação de proteínas e etapas de preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

Abstract

A interação entre proteínas ligadoras de RNA (RBPs) e seus substratos de RNA exibe fluidez e complexidade. Dentro de sua vida útil, um único RNA pode ser ligado por muitas RBPs diferentes que irão regular sua produção, estabilidade, atividade e degradação. Como tal, muito tem sido feito para compreender a dinâmica que existe entre estes dois tipos de moléculas. Um avanço particularmente importante veio com o surgimento da "cross-l inking and immunoprecipitation" (CLIP). Essa técnica permitiu uma investigação rigorosa sobre quais RNAs estão ligados por uma RBP em particular. Em suma, a proteína de interesse é reticulada UV com seus substratos de RNA in vivo, purificada sob condições altamente rigorosas, e então os RNAs covalentemente reticulados à proteína são convertidos em bibliotecas de cDNA e sequenciados. Desde a sua concepção, muitas técnicas derivadas foram desenvolvidas a fim de tornar o CLIP passível de campos de estudo particulares. No entanto, ligações cruzadas usando luz ultravioleta são notoriamente ineficientes. Isso resulta em tempos de exposição prolongados que impossibilitam o estudo temporal das interações RBP-RNA. Para superar esse problema, recentemente projetamos e construímos dispositivos de irradiação UV e colheita de células muito aprimorados. Usando essas novas ferramentas, desenvolvemos um protocolo para análises resolvidas no tempo de interações RBP-RNA em células vivas em alta resolução temporal: Cinética CRoss-linking e Analysis of cDNAs (χCRAC). Recentemente, utilizamos esta técnica para estudar o papel das RBPs de levedura na adaptação ao estresse por nutrientes. Este manuscrito fornece uma visão detalhada do método χCRAC e apresenta resultados recentes obtidos com a RBP Nrd1.

Introduction

Os RNAs frequentemente dependem de RBPs para exercer sua função, o que tem levado a um grande interesse em entender a dinâmica entre essas moléculas. Muitas RBPs têm sido identificadas em uma grande variedade de organismos. No entanto, sempre foi notoriamente difícil estudar interações RBP-RNA in vivo. Um grande avanço no estudo de tais interações veio com o surgimento do CLIP1. Este método utiliza irradiação ultravioleta (UV, 254 nm) para induzir ligações covalentes entre RBPs e seus RNAs diretamente ligados (i.e., reticulação de distância zero). Posteriormente, a RBP de interesse é imunopurificada sob condições rigorosas para garantir que apenas RNAs covalentemente ligados às proteínas sejam identificados. Os RNAs ligados são então parcialmente digeridos com RNases e posteriormente convertidos em bibliotecas de cDNA para sequenciamento. A alta erudência de purificação é importante, pois aumenta muito a especificidade da recuperação de proteínas e RNA, que também é reforçada através da purificação SDS-PAGE do complexo ribonucleoproteína reticulada (RNP). O CLIP e métodos relacionados também fornecem informações sobre a resolução de nucleotídeos no sítio de ligação às proteínas, pois durante a preparação da biblioteca de sequenciamento, aminoácidos que se reticulam com o RNA frequentemente terminam a transcriptase reversa ou fazem com que a enzima introduza mutações nesse local 1,2,3.

Desde sua introdução, o protocolo CLIP original produziu uma notável variedade de metodologias derivadas. Um avanço particularmente importante veio com o desenvolvimento do HITS-CLIP (ou CLIP-seq), que mescla o sequenciamento de alto rendimento com a abordagem CLIP3. Isso já foi adotado por todas as metodologias baseadas em CLIP. O iCLIP introduziu melhorias nas técnicas de corte mediado por RNase e ligadura adaptadora que facilitam o mapeamento mais preciso dos sítios de ligação da RBP4. PAR-CLIP combinou marcação 4tio-uridina/uracila com reticulação a 365 nm, tornando possível mapear sítios de reticulação analisando substituições T-C5. CRAC, ureia-iCLIP, dCLIP e uvCLAP introduziram condições de desnaturação e etapas de purificação de dupla afinidade que reduzem ainda mais a ligação de fundo à resina de afinidade e aumentam ainda mais a especificidade da captura de proteínas 2,6,7,8,9. Além disso, CRAC, uvCLAP e dCLIP introduziram a marcação da RBP de interesse com uma etiqueta de afinidade, superando assim a necessidade de gerar anticorpos específicos.

Várias otimizações também foram feitas para agilizar a metodologia CLIP. O protocolo CLIP original utilizava radiomarcação dos RNAs capturados para visualizar os complexos RBP-RNA após SDS-PAGE. No entanto, o uso de radioatividade pode ser problemático para laboratórios não configurados para esse tipo de trabalho. O irCLIP incorpora um adaptador acoplado a fluoróforo que facilita a visualização através de imagens infravermelhas10 e o sCLIP utiliza a biotinilação de RNAs capturados para visualizá-los através da HRP conjugada com estreptavidina11. Além disso, o eCLIP renuncia completamente à marcação de RNA; em vez disso, a proteína é excisada com base apenas em seu tamanho conhecido12. A purificação à base de estreptavidina também tem sido usada para acelerar o processo de preparação da biblioteca no FAST-iCLIP, onde um adaptador biotinilado de 3' é ligado aos RNAs e usado para permitir a purificação após transcrição reversa e circularização13. Aprimoramentos adicionais no protocolo iCLIP também aumentaram consideravelmente a complexidade das bibliotecas4.

Finalmente, o CLIP foi modificado para permitir a captura de RBPs de diferentes subcompartimentos celulares 14,15, para visualizar RNAs recém-transcritos usando indução pulsada de ribonucleosídeos fotoativáveis 5,16,17, para capturar RNAs metilados18,19,20, para examinar interações RNA-RNA 21,22 e para mapear as extremidades 3' 23,24.

Apesar das grandes contribuições das técnicas baseadas em CLIP para auxiliar nossa compreensão das interações entre RBPs e RNAs, ela tem sido limitada pela ineficiência da reticulação UV. Embora as células de cultura cultivadas em uma monocamada sejam geralmente relativamente fáceis de fazer ligações cruzadas, isso é significativamente mais desafiador em tecidos ou células em solução. Os tecidos podem requerer várias rodadas de exposição UV para penetrar nas camadas celulares necessárias, enquanto as células microbianas são frequentemente cultivadas em meios ricos que contêm compostos aromáticos que absorvem UV25. De fato, tempos de irradiação UV de até 30 min têm sido usados para gerar ligações cruzadas suficientes entre RBPs e seus RNAs ligados para tais amostras26,27,28. Essa exposição prolongada aos raios UV induz respostas de estresse dentro da célula, tais danos ao DNA induzidos por UV, que podem contaminar os dados finais em algumas aplicações.

A maioria dos estudos CLIP tem se concentrado em gerar "instantâneos" únicos de interações específicas proteína-RNA em uma célula. No entanto, as interações proteína-RNA são inerentemente dinâmicas, particularmente quando as células estão sujeitas a mudanças em seu ambiente. Isso pode incluir uma redução repentina na disponibilidade de nutrientes essenciais ou mudanças rápidas na temperatura. Como tal, para realmente entender o papel de uma RBP durante o estresse, é melhor realizar análises resolvidas no tempo, porque elas podem capturar todo o espectro de alvos de RBP durante o estresse e determinar em que estágio da resposta ao estresse a RBP escolhida está ativa. Em particular, estudos em leveduras mostraram que os primeiros minutos de adaptação são absolutamente cruciais para a sobrevivência e meias-vidas de RNA em bactérias podem variar de minutos a segundos 29,30,31,32,33. Portanto, essas análises resolvidas no tempo idealmente devem ser realizadas em alta resolução temporal. No entanto, os longos tempos de ligações cruzadas tornam o estudo de respostas adaptativas em estágio inicial particularmente desafiador.

A fim de superar esses problemas, desenvolvemos recentemente um método aprimorado que é capaz de reticular e coletar células em escalas de tempo de minutos longos. Nosso método χCRAC permite a medição quantitativa de mudanças dinâmicas nas interações RBP-RNA em resolução não testemunhada anteriormente. Crucial para este método foi o desenvolvimento de um novo dispositivo de irradiação UV32 que reduz o tempo necessário de reticulação em leveduras e bactérias em solução em cerca de 10 vezes, congelando efetivamente as interações RBP-RNA instantaneamente. Além disso, a fim de colher rapidamente as células após a irradiação UV, desenvolvemos um dispositivo de filtração a vácuo que pode colher leveduras de crescimento exponencial em uma cultura de 0,5 L em cerca de 30 s32. Essas inovações tecnológicas permitem o estudo da dinâmica do RNA-RBP em resolução em escala minúscula. Além disso, também introduzimos várias otimizações ao protocolo CRAC2 original, a fim de aumentar sua praticidade.

Usando χCRAC, recentemente estudamos o targetoma de uma RBP nuclear de levedura, Nab3, em resposta à privação de glicose. Em Saccharomyces cerevisiae, Nab3 pode formar um complexo com Nrd1, um RBP, e o RNA helicase Sen1 para formar o complexo NNS. A ligação do NNS à RNA polimerase e ao transcrito nascente pode desencadear a terminação transcricional34. Este complexo está principalmente envolvido na remoção de transcritos de RNA não codificantes crípticos, mas também foi mostrado para regular a expressão de genes codificadores de proteínas. O estudo mostrou direcionamento diferencial de Nab3 para transcritos não codificantes e codificantes após apenas um minuto de estresse32. Demonstramos que a terminação cotranscricional por Nab3 resulta em uma expressão muito transitória, semelhante a pulso, de genes retrotransposons, o que teria sido difícil de detectar usando abordagens tradicionais baseadas em CLIP. Além disso, os curtos tempos de irradiação UV em nosso reticulador UV também aumentaram significativamente a recuperação de RNAs não codificantes de curta duração32. χCRAC provavelmente será uma ferramenta crucial para elucidar não apenas como as RBPs moldam a resposta ao estresse em escalas de tempo imediatas, mas também suas mudanças de papéis durante todo o ciclo de vida de uma resposta. Este manuscrito fornece uma visão detalhada de todas as etapas do protocolo χCRAC. Para fins ilustrativos, o método foi usado para estudar a proteína Nrd1 da levedura, que está envolvida na terminação transcricional e decaimento do RNA35,36, e seu alvo de RNA em resposta à privação de glicose em uma infinidade de pontos de tempo. Finalmente, também demonstramos que nossa unidade de irradiação UV pode rapidamente fazer ligações cruzadas de RBPs ao RNA em células HeLa, tornando possível também realizar análises de alta resolução resolvidas no tempo em células aderentes.

Protocol

TN150
50 mM Tris pH 7,8
NaCl de 150 mM
0,1% NP-40
1X inibidor de protease
TN1000
50 mM Tris pH 7,8
NaCl 1M
0,1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7,8
10 mM MgCl2
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoetanol
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM MgCl2
50 mM beta-mercaptoetanol
BM I
50 mM Tris-HCl pH 7,8
NaCl de 300 mM
imidazol 10 mM
guanidina 6M-HCl
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoetanol
Banco Mundial II
50 mM Tris-HCl pH 7,8
NaCl de 50 mM
imidazol 10 mM
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoetanol
Buffer de eluição
50 mM Tris pH 7,8
NaCl de 50 mM
imidazol 250 mM
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoetanol
Tampão Protease K
Tris de 50 mM
0,1% NP-40
5 mM β-mercaptoetanol
1% SDS
EDTA de 5 mM
NaCl2 de 50 mM
Tampão de lise para mamíferos
50 mM Tris-HCl pH 8
NaCl 100 mM
0,5% v/v Triton X-100
0,25% p/v Na-desoxicolato
0,1% p/v SDS
EDTA de 5 mM
1 mM TDT (adicionado fresco)
1X inibidor de protease

Tabela 1: Os buffers necessários para χCRAC e suas composições.

1. Reticulação UV e produção de lisado

  1. Microrganismos em solução
    1. Inocular 3,5 L do meio desejado com levedura de uma cultura noturna para um ODinicial de 600 de 0,05. Crescer a 30 °C com agitação contínua a 180 rpm.
    2. Durante o crescimento, prepare outros materiais necessários.
      1. Prepare um recipiente com nitrogênio líquido.
      2. Preparar 3 L de meio indutor de tensão e aquecer a 30 °C em banho-maria.
      3. Montar o aparelho filtrante, ligar o reticulador (Figura 2A) e etiquetar os tubos cônicos de 50 mL, um para cada momento.
    3. Quando as células atingirem o OD 600 desejado, despeje500 mL de células diretamente no reticulador e irradie UV com 250 mJ de UV de 254 nm. Consulte a Figura 2A e a Figura 3A para obter detalhes sobre o uso do reticulador.
      NOTA: A energia de irradiação UV deve ser cuidadosamente otimizada para cada proteína de interesse. Consulte a Discussão para obter mais detalhes.
    4. Após a reticulação, filtrar as células usando um dos dispositivos de filtração a vácuo (Figura 2B,C). Enrolar a membrana com as células filtradas, colocar no tubo cônico t = 0 (tempo zero) de 50 mL e congelar em nitrogênio líquido.
    5. Filtre as células restantes em seis filtros diferentes. Ressuspender as células coletadas nos 3 L de meio indutor de estresse previamente aquecido, soltando as membranas no meio e misturando vigorosamente com uma stripette por 50 s. Após os 50 s, prepare-se para a coleta da amostra t = 1.
    6. Após 1 min, reticule 500 mL de células e colete por filtração como nas etapas 1.1.3–1.1.4. Repita após 2, 4, 8, 14 e 20 minutos ou momentos diferentes, conforme necessário.
    7. Conservar os tubos cónicos que contêm as células a -80 °C. Definir solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C durante a noite.
    8. No dia seguinte, tomar cada tubo cônico contendo uma amostra reticulada e ressuspender as células em 25 mL de PBS frio, agitando vigorosamente.
    9. Transfira as suspensões celulares para novos tubos cônicos e gire a 4.600 x g, 5 min a 4 °C.
    10. Despeje o PBS, gire rapidamente novamente para coletar PBS residual e, em seguida, decante o líquido restante com uma pipeta.
    11. Calcule o peso do pellet no tubo comparando-o com um tubo vazio.
    12. Adicionar dois volumes de pellet de TN150 gelado, 60 μL de DNase 1 e 10 μL de inibidor de RNase. Incubar no gelo por 30 min.
      1. Por exemplo, para 400 mg de células, adicione 800 μL de TN150 gelado.
      2. A adição da DNase não é essencial para a maioria das proteínas solúveis, mas é muito importante quando se estudam proteínas ligadas à cromatina, como a RNA polimerase. Além disso, reduz a viscosidade dos lisados bacterianos. É muito importante usar exatamente dois volumes de pellet do tampão de lise, ou a eficiência da lise pode diminuir.
    13. Adicionar três volumes de pastilhas (em mL) de esferas de zircônia à suspensão celular. Para leveduras, use esferas de 0,5 mm de diâmetro e para bactérias use 0,1 mm.
      1. Por exemplo, para 400 mg de células, medir 1,2 mL de esferas de zircônia em um tubo de 1,5 mL e adicioná-las às células ressuspensas em tampão de lise.
    14. Vórtice as suspensões celulares por 1 minuto e, em seguida, coloque no gelo por 1 min. Repita para um total de 5x.
    15. Adicione dois volumes de pellet de tampão TN150 e vórtice vigorosamente para misturar.
    16. Centrifugar a suspensão no tubo cónico a 4.600 g durante 20 minutos a 4 °C numa centrífuga de bancada.
      1. Após a centrifugação, pegue uma amostra de 50 μL do sobrenadante para futura análise de Western blot para examinar a expressão de proteínas de células inteiras.
    17. Transferir os sobrenadantes para tubos de 1,5 mL e girar o lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 °C, em um microfuge.
      1. Alternativamente, se usar tubos de 5 mL, centrifugar a 13.000 x g por 20 min.
      2. Após a centrifugação, pegue uma amostra de 50 μL do sobrenadante para futura análise de Western blot para examinar a expressão solúvel da proteína.
    18. Prossiga para a captura RBP (seção 2).
  2. Células aderentes cultivadas
    1. Seme células aderentes suficientes em uma placa de Petri 24 h antes da reticulação UV para que possam atingir 80% de confluência no dia seguinte. Crescer durante a noite no meio desejado em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Se usar placas de Petri de quartzo, é benéfico promover a adesão celular através do tratamento da cultura com poli-D-lisina (70.000-140.000 peso) e soro fetal de bezerro (FCS) 2,5 h antes da semeadura. Adicionar poli-D-lisina suficiente para cobrir toda a superfície de crescimento e incubar à temperatura ambiente (TR) por 5 min. Em seguida, a placa de Petri de quartzo deve ser bem lavada com água e seca na incubadora de cultura celular por 2 h ou até secar completamente. Depois, adicione FCS suficiente para cobrir completamente a superfície de crescimento e coloque na incubadora por pelo menos 30 min. O SFC deve ser completamente removido antes da semeadura das células.
    2. Quando as células atingirem 80% de confluência, retirar o meio e lavar com 15 mL de PBS gelado. Em seguida, remova completamente todo o líquido restante e prossiga imediatamente para a próxima etapa.
    3. Transfira a placa de Petri para a bandeja para as células aderentes (Figura 3B) e irradie UV com 300 mJ de UV 254 nm. Consulte a Figura 2A e a Figura 3B para obter detalhes sobre o uso do reticulador.
      NOTA: A energia de irradiação UV deve ser cuidadosamente otimizada para cada proteína de interesse. Consulte a Discussão para obter mais detalhes.
    4. Imediatamente após a reticulação, coloque a placa de Petri no gelo e adicione 10 mL de PBS gelado. Coletar células por raspagem e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Pellet por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Remova o PBS e ressuspenda o pellet de célula em 1 mL de PBS gelado e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Células de pellet novamente por centrifugação durante 5 min a 300 x g a 4 °C.
    6. Remova o PBS e congele rapidamente os pellets de células em gelo seco. Conservar os pellets de células a -80 °C até ser necessário.
    7. Repita as etapas 1.2.3–1.2.6 para cada ponto de tempo.
    8. Ressuspender os pellets celulares em 1 mL de tampão de lise e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Em seguida, adicionar 1 mL de tampão de lise para um total de 2 mL.
    9. Adicionar 5 μL de inibidor de RNase de mamíferos.
    10. Sonicate 5x por 10 s no gelo a 10 amperes. Aguarde 30 s entre as rodadas de sonicação.
    11. Calcular a concentração de proteína de cada amostra e normalizar para a concentração mais baixa.
    12. Transferir 1,98 mL de lisado para um tubo de 2 mL.
    13. Adicionar 10 μL de DNase I e incubar a 37 °C durante 5 min com agitação a 1.200 rpm.
    14. Centrifugar o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C.
      1. Após a centrifugação, colher uma amostra de 50 μL do sobrenadante para futura análise de Western blot para examinar a expressão solúvel da proteína.
    15. Prossiga para a captura RBP (seção 2).

2. Captura de RBP

  1. Lavar as esferas magnéticas anti-FLAG (75 μL de lama por amostra) ou IgG agarose (500 μL de chorume por amostra) 3x com 5 mL de TN150. Ressuspender em um volume final de 700 μL de TN150 e adicionar 100 μL de contas lavadas a sete tubos cônicos de 15 mL.
    1. Conservar no gelo até ser necessário.
  2. Uma vez esclarecidos os lisados, adicionar o sobrenadante ao tubo contendo as esferas anti-FLAG/IgG.
  3. Nutate a 4 °C durante 2 h.
    NOTA: Alguns protocolos descrevem incubações noturnas com as contas, mas isso não é recomendado, porque longos tempos de incubação podem reduzir drasticamente a recuperação de RNAs reticulados.

3. Lavagem das contas e clivagem TEV das etiquetas

  1. Colha as contas e retire o lisado.
    1. Pegue uma amostra de 50 μL do sobrenadante para futura análise de Western blot para examinar a proteína não capturada.
  2. Ressuspender as esferas em TN1000 gelado e transferir para um tubo de 1,5 mL. Lave por 10 min, 4 °C, com nutação. Repita para um total de três lavagens.
    1. Se estiver usando contas de agarose IgG, lavar com 5 mL de TN1000. Se estiver usando contas anti-FLAG, use 2 mL.
  3. Em seguida, lave as contas 3x com TN150, com o mesmo volume acima.
  4. Após a terceira lavagem, ressuspender as esferas em 600 μL de TN150.
  5. Adicionar 30 U de protease GST-TEV caseira à suspensão do talão e girar por 2 h no TR.
    NOTA: A protease GST-TEV recombinante também está disponível comercialmente, mas não foi testada com este protocolo.
    1. Durante a digestão, prepare-se para as próximas etapas montando colunas de três tubos de 1,5 mL para cada amostra (ou seja, para sete amostras, ter três fileiras de sete colunas).
    2. À última fileira de tubos, adicionar 0,4 g de cloridrato de guanídio, 27 μL de cloreto de sódio 5M e 3 μL de imidazol 2,5 M (pH = 8). Note que o pH do imidazol deve ser 8. Isso é fundamental para manter a integridade do RNA.
    3. Além disso, lave o volume necessário de esferas de níquel em WB I 3x. Utilizar 100 μL de chorume por amostra. Após a lavagem final, ressuspenda as contas no mesmo volume original do WB I e guarde no gelo.
  6. Uma vez concluída a digestão do TEC, colete o sobrenadante usando um rack magnético para contas anti-FLAG ou centrifugação para contas IgG e transfira para a primeira fileira dos tubos previamente configurados.
    1. Colher 50 μL de amostra do eluato de TEV para análise de Western blot.
  7. Ajuste uma incubadora termobloco a 37 °C. Na segunda fileira de tubos, adicionar 1 μL de coquetel de RNase (diluição 1:50).
  8. Tome 550 μL de eluato de TEV da primeira fileira de tubos e adicione à segunda fileira (contendo o coquetel RNase). Pipetar vigorosamente para garantir a mistura.
  9. Depois de completar isso para a primeira amostra, coloque imediatamente o tubo no termobloco e inicie um temporizador. Passe para as amostras subsequentes, de modo que cada uma seja escalonada.
  10. Incube por exatamente 5 min. Uma vez concluída, remova a primeira amostra do termobloco e transfira a solução para a terceira fileira de tubos (contendo o pó de cloridrato de guanídio).
    NOTA: Uma incubação de 5 minutos com uma diluição de 1:50 do coquetel de RNase é geralmente adequada para a maioria das proteínas, mas essa etapa precisará ser cuidadosamente otimizada com diferentes tempos de incubação ou concentrações para cada proteína para garantir que os RNAs reticulados tenham o tamanho correto (30-100 nt).
  11. Vórtice imediatamente por alguns segundos a toda velocidade para dissolver o pó de guanídio e, em seguida, passar para a próxima amostra.
  12. Depois que todas as amostras tiverem sido transferidas para o pó de guanídio, vórtice novamente para garantir que todo o pó esteja totalmente dissolvido.
  13. Adicionar 100 μL de esferas de níquel lavadas e rodar durante a noite a 4 °C. Esta incubação pode ser encurtada para 2 h.

4. Tratamento com fosfatase alcalina em esferas

  1. Ajuste um termobloco para 37 °C.
  2. Colocar uma coluna de spin de purificação num tubo de 2 ml, um para cada amostra. Transfira as esferas de níquel para as colunas e deixe o sobrenadante escorrer. Em seguida, certifique-se de que todas as esferas de níquel foram removidas do tubo de 1,5 mL enxaguando com WB I e aplicando na coluna.
  3. Montar tubos de 2 mL, seis por amostra (um para coletar cada lavagem). Mantenha a parte externa das colunas seca para manter o fluxo. Lavar as contas 3x com 500 μL de WB I e depois 3x com 500 μL de NP-PNK.
  4. Feche a tampa da coluna de rotação e gire brevemente as contas para remover o excesso de buffer.
  5. Colocar a rolha na coluna, colocar colunas em tubos de 1,5 ml e adicionar 60 μL da mistura de reacção indicada na Tabela 2.
Componente 1x 7,5x
5 x buffer PNK 12 90
Fosfatase alcalina 4 30
Inibidor de RNase 2 15
H2O 42 315
Volume final 60 μL 450 μL

Tabela 2: Mistura de reação de fosfatase alcalina.

  1. Incubar as contas durante 1 h a 37 °C.
  2. Lavar as esferas 1x com 500 μL de WB I para inativar a fosfatase alcalina e depois 3x com 500 μL de tampão NP-PNK. Certifique-se de enxaguar completamente o interior da coluna com o tampão NP-PNK para remover quaisquer vestígios de guanídio.

5. Ligadura no talão do ligante App-PE à extremidade 3' do RNA

  1. Gire o buffer restante e adicione 60 μL da mistura especificada na Tabela 3 (consulte a Tabela 4 para a sequência App-PE) às colunas. Incubar a reação durante 6 h a 25 °C.
Componente 1x 7,5x
5 x buffer PNK 12 90
Adaptador App-PE (100 μM) 0.6 4.5
T4 RNA ligase 2 truncado K227Q 3 22.5
Inibidor de RNase 1.5 11.25
50% PEG 8000 12 90
H2O 30.9 231.75
Volume final 60 μL 450 μL

Tabela 3: Mistura de reação de ligadura do ligante App-PE.

Nome do oligonucleotídeo Sequência (5'-3')
L5Aa invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5Ab invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrArGrCrN-OH
L5Ac invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrArUrCrUrNrNrNrGrCrGrCrArGrCrN-OH
L5Ad invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrCrUrUrArGrCrN-OH
L5Ba invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5Bb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArGrCrN-OH
L5BC invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrArGrCrN-OH
L5Bd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrCrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH
L5Ca invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5Cb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrArGrCrN-OH
L5CC invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrUrCrArGrCrN-OH
L5Cd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH
L5Da invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrUrGrArUrN-OH
L5Db invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrArCrUrArN-OH
L5Dc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArGrUrGrCrN-OH
L5Dd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrCrArCrGrN-OH
L5Ea invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5Eb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5Ec invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5Ed invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PE App-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

Tabela 4: As sequências dos adaptadores de DNA e RNA necessárias para a ligadura nas extremidades 5' e 3' dos RNAs capturados. Estes foram purificados por CLAE-RNase-livre.

  1. Lavar contas 1x com 500 μL de WB I e 3x com 500 μL de tampão NP-PNK. Coloque a coluna em um novo tubo e gire o buffer restante.

6. Fosforilação no cordão das extremidades 5' do RNA

  1. Adicionar 80 μL da mistura especificada no quadro 5 às colunas. Incubar a reação durante 40 min a 37 °C.
    NOTA: As amostras agora serão altamente radioativas. Assim, todo o trabalho subsequente deve ser realizado atrás de uma tela de proteção e os resíduos devem ser descartados de acordo com as regras locais de saúde e segurança.
Componente 1x 7,5x
5 x buffer PNK 16 120
32ºP-ɣATP (10 μCi/μL) 3 22.5
T4 PNK 3 22.5
H2O 58 435
Volume final 80 μL 600 μL

Tabela 5: Mistura de reação de fosforilação.

  1. Adicione 1 μL de 100 mM de ATP e deixe a reação prosseguir por mais 20 min. Isso garantirá que quase todas as extremidades de 5' tenham fosfatos para facilitar a ligadura do ligante de 5'.
  2. Montar tubos de 2 mL, cinco por amostra.
  3. Lavar contas 1x com 500 μL de WB I e 3x com 500 μL de tampão NP-PNK. Observe que essas eluções serão muito radioativas e, portanto, devem ser descartadas adequadamente.
  4. Mova a coluna para o tubo final e gire para fora o buffer restante.

7. Ligadura no talão do linker de 5'

NOTA: Os ligadores de 5' contêm um código de barras de RNA que é usado para identificação de cada amostra após o sequenciamento. Assim, é absolutamente crucial observar qual linker é usado para qual amostra.

  1. Adicionar 78 μL da mistura descrita no quadro 6 às colunas. Adicionar 2 μL do adaptador de 5' (100 μM; ver quadro 4) a cada tubo e incubar durante a noite a 18 °C.
Componente 1x 7,5x
5 x buffer PNK 16 120
ATP (10 mM) 8 60
Inibidor de RNase 2 15
RNA ligase T4 4 30
H2O 48 360
Volume final 78 μL 585 μL

Tabela 6: Mistura de reação de ligadura de 5'.

  1. No dia seguinte, lavar as contas 1x com 500 μL de WB I e 3x com 500 μL de WB II e transferir as colunas para um novo tubo de 2 mL.

8. Elução, SDS-PAGE e extração de RNA

  1. Ajuste a centrífuga para 4 °C. Preparar duas fileiras de tubos de 1,5 ml por amostra para eluição.
  2. Gire o volume vazio das colunas com contas de níquel com um giro rápido. Colocar as colunas na primeira fileira de tubos de eluição e adicionar 200 μL de tampão de eluição. Aguarde 2 minutos e, em seguida, force o buffer através da coluna com um giro rápido.
  3. Mova as colunas para a segunda linha de tubos e repita o passo 8.2. Cada amostra terá agora 400 μL de eluato no total, divididos em dois tubos de 1,5 mL.
    1. Tome todos os eluato e transfira-os juntos para um tubo de 5 mL. Adicionar 2 μL de 20 mg/mL de glicogênio. Assim, se forem utilizadas sete amostras, haverá agora 2,8 mL de eluato agrupado no tubo de 5 mL.
  4. Adicionar 100 μL de ácido tricloroacético (TCA) por amostra [por exemplo, 700 μL de TCA para 7 amostras (2,8 ml de eluato agrupado)] ao tubo de 5 ml e lançar um poço de vórtice durante 30 s.
  5. Incubar no gelo por 20 min.
  6. Centrifugar por 30 min a 17.000 x g, 4 °C, em centrífuga de bancada.
  7. Retire cuidadosamente o sobrenadante do tubo cônico, verificando a pipeta com um contador Geiger para garantir que o pellet não tenha sido removido acidentalmente. Se tiver, devolva o sobrenadante ao tubo e centrifugue por mais 10 min.
    NOTA: O sobrenadante ainda pode ser altamente radioativo. Certifique-se de usar a blindagem adequada.
  8. Ressuspender totalmente o pellet em 2 mL de acetona gelada.
  9. Centrifugar por 15 min a 17.000 x g, 4 °C.
  10. Retire o máximo possível da acetona com uma pipeta P1000. Depois, gire brevemente o tubo para coletar pequenas gotículas de acetona e, em seguida, remova com uma pipeta P10. Secar por 2 min em um exaustor.
    NOTA: O sobrenadante da acetona ainda pode ser radioativo. Certifique-se de usar a blindagem adequada.
  11. Ressuspender a amostra em 30 μL de tampão de carga proteico 1x. Para garantir que o pellet seja ressuspendido corretamente, verifique se a grande maioria da radioatividade está agora presente no tampão de carga e não é deixada no tubo de 1,5 mL, removendo a solução em uma pipeta P200 e medindo a atividade deixada no tubo de 1,5 mL usando um contador Geiger.
  12. Aquecer a amostra durante 10 min a 65 °C. Carregue num gel pré-moldado Bis-Tris de 1 mm a 4–12% e corra durante 1,5 h a 125 V em tampão MOPS.
  13. Depois que o gel terminar de funcionar, abra o de gel. O gel deve ser retido na placa inferior. Descarte a parte superior.
  14. Embrulhe o gel em película aderente e, em seguida, fixe-o com fita adesiva no interior de uma à prova de luz. Certifique-se de que o tenha uma tela amplificadora para melhorar o sinal.
  15. Expor um filme autorradiográfico ao gel e conservar o a -80 °C durante a exposição. O tempo de exposição varia entre proteínas com diferentes eficiências de reticulação.
    1. Ao colocar o filme, deve haver uma maneira de realinhá-lo ao, a fim de cortar a faixa de interesse na etapa subsequente. Para garantir isso, use uma régua fluorescente e também certifique-se de que o gel esteja em um canto do, que é então coberto pela película também colocada no canto máximo.
      NOTA: Como regra geral, eluato no buffer de carregamento que dão uma leitura de pelo menos ~250 cps quando exibido a um contador Geiger dão sinal suficiente para uma exposição de 3 h. Caso contrário, a exposição noturna é realizada.
  16. Desenvolva o filme. Corte a película aderente que cobre o gel, mas não mova o gel. Caso contrário, a imagem será deslocada do gel.
    NOTA: O gel provavelmente será altamente radioativo. Certifique-se de usar blindagem adequada ao cortar a fatia de gel.
  17. Coloque a película sobre o gel e extire a faixa de interesse. Coloque a fatia de gel em um tubo de 2 mL.
  18. Esmagar a fatia de gel utilizando uma ponta de pipeta P1000 e adicionar 600 μL de tampão proteinase K mais 200 μg de proteinase K (este protocolo utiliza 10 μL de uma solução de proteinase K a 20 mg/ml). Incubar durante 2 h a 55 °C com agitação vigorosa.
  19. Em seguida, corte a extremidade de uma ponta P1000 com um bisturi limpo e transfira o sobrenadante e os pedaços de gel para uma coluna de spin colocada em um tubo de 2 mL.
  20. Gire a coluna por 1 min a 17.000 x g em RT. Colete o fluxo, que contém os RNAs radioativos e isolados.
  21. Realizar uma extração de fenol:clorofórmio.
    1. Adicionar 50 μL de acetato de sódio 3 M, pH = 5,2, e 500 μL de fenol:clorofórmio e vórtice poço. Gire por 5 min a 17.000 x g. Retire a camada superior aquosa e coloque em um novo tubo de 1,5 mL.
    2. Adicione 500 μL de clorofórmio e vórtice vigorosamente por 10–15 s. Gire por 5 min a 17.000 x g em RT. Retire a camada aquosa e coloque em um novo tubo de 1,5 mL.
    3. Adicionar 1 μL de 20 mg/mL de glicogênio e 1 mL de etanol gelado a 96%. Precipitar durante 30 minutos a -80 °C ou durante a noite a -20 °C.
    4. Centrifugar por 30 min a 4 °C, 17.000 x g. Retire o sobrenadante, adicione 500 μL de etanol a 70% e centrifugar por 5 min, 4 °C a 17.000 x g. Retire todo o etanol, faça um giro rápido para coletar o resíduo e remova o excesso com uma pipeta P10.
    5. Seque o pellet por ~3 min em um exaustor. Ressuspender em 20 μL de água tratada com DEPC.
  22. Armazenar o RNA a -80 °C durante a noite ou prosseguir imediatamente para a etapa de transcrição reversa.

9. Transcrição reversa

  1. Adicionar 2 μL de 10 μM RT oligo (PE_reverse; ver Tabela 7) e 4 μL de 5 mM dNTPs aos 20 μL de RNA.
Nome do oligonucleotídeo Sequência (5'-3')
P5 para a frente AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
BC1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
BC3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
BC4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCTCT
BC5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
BC8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
BC9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
BC10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCT
PE_reverse CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabela 7: Os primers da PCR (incluindo as sequências de código de barras) e o primer de transcrição reversa.

  1. Transfira para um termobloco pré-aquecido a 85 °C por 3 minutos e, em seguida, resfrie no gelo por 5 min. Recolher o conteúdo do tubo por centrifugação breve e, em seguida, adicionar 8 μL de tampão de transcriptase reversa 5x, 2 μL de TDT 100 mM e 2 μL de inibidor de RNase.
  2. Incubar a mistura a 50 °C durante 3 min e, em seguida, adicionar 2 μL de transcriptase reversa e incubar durante 1 h a 50 °C.
  3. Inativar a transcriptase reversa por incubação a 65 °C por 15 min.
  4. Transfira os tubos para um termobloco pré-aquecido a 37 °C e deixe por 3 min para aclimatar.
  5. Adicionar 2 μL de RNase H e incubar durante 30 min a 37 °C.
  6. Isole o cDNA usando esferas SPRI.
    1. Adicione dois volumes de 84 μL de contas. Incubar por 15 min. Coloque as contas em um rack magnético e deixe por 1 min para colher as contas.
    2. Retire e elimine o sobrenadante e adicione 200 μL de etanol a 70%. Não remova as contas do rack magnético. Incubar as contas com o etanol por 30 s.
    3. Retire o etanol e repita a etapa de lavagem. Remova todo o etanol residual usando uma ponta P10.
    4. Coloque as contas em um exaustor por 2 min para secá-las. Retire as contas do rack, ressuspenda-as em 12 μL de água e, em seguida, coloque as contas de volta no rack. Remover 11 μL de sobrenadante.
  7. Congelar o cDNA a -20 °C ou prosseguir imediatamente para a etapa de PCR.

10. Reação qPCR

  1. Antes da PCR final para amplificação dos cDNAs, uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é realizada para identificar o número ideal de ciclos para amplificar os cDNAs para evitar a superamplificação da biblioteca.
  2. Estabelecer uma reação de qPCR no gelo de acordo com a Tabela 8. Ver Tabela 7 para todos os primers.
Componente 1x
2x mastermix de reação qPCR 5
Primer P5 de 0,1 μM (para frente) 0.8
Primer de 0,1 μM BC (reverso) 0.8
cDNA (ou água como controle negativo) 1
H2O 2.4
Volume final 10 μL

Tabela 8: Mistura de reação de qPCR.

  1. Para a quantificação adequada dos ciclos necessários para a amplificação, use três réplicas técnicas para o cDNA e três controles negativos (ou seja, água).
  2. Sele as placas com filme opticamente transparente e execute o qPCR de acordo com as instruções do fabricante do kit.
  3. Analise as amostras através de um método de quantificação absoluta para identificar o número de ciclos (n) em que o joelho de crescimento exponencial é atingido (ver Figura 4C para um exemplo). Este número de ciclos é então usado para a amplificação final do resto do cDNA.

11. Reação de PCR e extração em gel

  1. Estabelecer a reação de PCR no gelo de acordo com a Tabela 9. Ver Tabela 7 para todos os primers.
    NOTA: Apenas 5 μL da biblioteca de cDNA é usada.
Componente 1x
10 x tampão polimerase de revisão 5
Primer P5 de 10 μM (para frente) 1
Primer de 10 μM BC (reverso) 1
5 mM dNTPs 2.5
Prova de leitura da enzima polimerase 1
cDNA 5
H2O 34.5
Volume final 50 μL

Tabela 9: Mistura de reação de PCR.

  1. Execute o PCR da seguinte forma: 95 °C por 2 min; n ciclos de 98 °C por 20 s, 52 °C por 30 s e 72 °C por 1 min; e 72 °C por 5 min. O número (n) de ciclos para amplificação da biblioteca χCRAC é determinado pela qPCR descrita na seção 10.
  2. Adicionar 1 μL de exonuclease I e incubar a 37 °C durante 60 min.
  3. Limpe o cDNA amplificado usando esferas SPRI como descrito acima usando dois volumes de contas (ou seja, 100 μL). Elute em 11 μL.
  4. Adicionar 3 μL de corante de carga 6x e executar em um gel TBE pré-moldado a 6% a 100 V por 1 h em tampão TBE 1x. Use uma escada apropriada para quantificação de fragmentos curtos de DNA.
  5. Uma vez terminado, retire o gel do e coloque em um recipiente adequado e estanque com 1x TBE suficiente para cobrir o gel (por exemplo, ~50 mL). Adicione uma quantidade adequada de corante seguro SYBR (por exemplo, para 50 mL, use 5 μL de um corante de 10.000x)
  6. Deixe o gel manchar através de uma mistura suave por 15 min no RT. Escorra o 1x TBE contendo SYBR e substitua por 1x TBE limpo. Lave o gel por 10 min com agitação suave no RT.
  7. Escorra o TBE 1x e coloque o gel em uma pasta transparente. Recorte a pasta para um tamanho apropriado.
  8. Imagem do gel através de um meio apropriado, como um imageador de fósforo. Excise fragmentos de DNA entre ~175 bp e ~400 bp. Coloque a fatia de gel em um tubo de 1,5 mL.
  9. Esmague completamente a fatia de gel com uma ponta P1000 e adicione 400 μL de H2O. Incubar a 37 °C com agitação durante 1 h num termobloco.
  10. Congelar a amostra em gelo seco por 10 min e, em seguida, colocar novamente no termobloco a 37 °C com agitação por 1 h.
  11. Crie uma unidade de filtro pegando uma coluna de filtro e inserindo dois filtros de microfibra de vidro dentro. Coloque a unidade em um tubo de 1,5 mL.
  12. Corte a extremidade de uma ponta P1000 com um bisturi limpo e absorva a suspensão de gel TBE esmagada e, em seguida, distribua na unidade de filtro criada no passo 11.12. Gire a 17.000 x g por 30 s.
  13. Adicionar 1 μL de glicogênio ao sobrenadante, juntamente com 40 μL de acetato de sódio, pH = 5,2, e 1 mL de etanol 96%. Incubar a -80 °C durante 30 min.
  14. Centrifugar por 30 min a 17.000 x g, 4 °C. Descarte o sobrenadante e lave com 500 μL de etanol 70%.
  15. Gire por 5 min, retire o etanol por completo e seque o pellet em uma exaustora por 3 min.
  16. Ressuspender em 10 μL de H2O e medir a concentração de DNA.

Representative Results

Para demonstrar a eficácia do método χCRAC, um experimento de curso de tempo com cepas de levedura expressando uma proteína Nrd1 marcada com HTP foi realizado. Uma representação esquemática detalhada descrevendo como o método funciona é fornecida na Figura 1. Assim como Nab3, Nrd1 está envolvido no decaimento do RNA nuclear de uma variedade de transcritos de RNA37. Trabalhos anteriores do laboratório de Corden sugeriram que a ligação de Nrd1 ao seu RNA tem como alvo mudanças significativas quando as células são submetidas à falta de glicose28,38. Como tal, as células que crescem exponencialmente em meio contendo glicose (SD-TRP) foram deslocadas para o mesmo meio sem glicose (S-TRP) ao longo de um curso de tempo para monitorar mudanças dinâmicas nas interações Nrd1-RNA. As amostras foram retiradas e reticuladas na câmara Vari-X-linker (Figura 3A) antes do turno e depois de 1, 2, 4, 8, 14 e 20 min. O meio utilizado para o crescimento celular foi deliberadamente deficiente em triptofano para reduzir a absorção de UV por este aminoácido aromático. Note que o melhor é usar meio sintético que seja esterilizado por filtro, pois a autoclavagem do meio pode levar à caramelização dos açúcares. Isso reduz a eficiência da reticulação.

A Figura 4A mostra uma autorradiografia representativa de um experimento χCRAC. Observe que, neste exemplo, as amostras não foram agrupadas. Em vez disso, cada um foi executado individualmente no gel. Isso é recomendado para testes experimentais iniciais para mostrar que a proteína se liga efetivamente ao RNA em todos os momentos testados. Um sinal particularmente intenso foi observado no peso molecular esperado da RBP, representando a proteína ligada a RNAs radiomarcados muito curtos e não passíveis de sequenciamento. Portanto, o sinal do esfregaço acima dessa banda, que é a proteína reticulada a fragmentos de RNA mais longos, foi isolado. O fragmento foi cortado logo acima da banda proteica mais cerca de 30 kDa. A Figura 4B mostra um auto-radiograma após a excisão, com a proteína reticulada a RNAs curtos deixados no gel e o sinal previamente esfreguado, agora excisado.

Após a transcrição reversa, a biblioteca de cDNA deve ser amplificada por PCR. No entanto, a superamplificação da biblioteca deve ser evitada, pois pode introduzir viés para sequências preferencialmente amplificadas pela polimerase e gerar artefatos de PCR. Bibliotecas superamplificadas também contêm um grande número de sequências duplicadas que desperdiçam leituras no sequenciador. Para calcular o número ideal de ciclos de PCR para amplificação da biblioteca final, uma alíquota do cDNA foi amplificada através de qPCR usando os oligonucleotídeos P5 e BC. O primeiro ciclo em que a biblioteca atingiu o pico de fluorescência foi escolhido como contagem do ciclo de PCR. A Figura 4C fornece um exemplo de uma qPCR de uma biblioteca típica de cDNA, que produziu uma contagem de ciclo de pico de 16. Esse valor foi então utilizado para a PCR final do χPCAC. Para o processamento dos dados sequenciados, utilizamos um software previamente desenvolvido em nosso laboratório (pyCRAC) e o pipeline correspondente para análise dos dados cinéticos do CRAC (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Essas ferramentas de software de código aberto permitem a desmultiplexação e o corte dos dados, a remoção de duplicatas de PCR, a identificação de picos estatisticamente significativos, leituras de cluster em sequências contíguas e a identificação de motivos de ligação39. Mais detalhes sobre como essas ferramentas operam podem ser encontrados em suas respectivas páginas da Web.

Também começamos a desenvolver um protocolo χCRAC para células de mamíferos. A maioria das linhagens celulares de mamíferos é cultivada como uma monocamada e a bandeja em nosso reticulante com o saco permeável aos raios UV não é adequada para experimentos com células aderentes. Para superar esse problema, desenvolvemos uma etapa em que os usuários podem irradiar UV 1–2 placas de Petri (150 mm de diâmetro e 25 mm de profundidade) com células aderentes (Figura 3B). Como um primeiro teste, a eficiência do reticulante para células de mamíferos foi medida através de reticulação e captura de GFP-RBM7 marcada de forma estável usando anticorpos anti-GFP e uma purificação tradicional baseada em CLIP. Como mostrado na Figura 5A, o reticulante foi capaz de recuperar complexos proteína-RNA de células de mamíferos cultivadas como uma monocamada usando irradiação UV de 254 nm em eficiências comparáveis a um dispositivo de irradiação UV amplamente utilizado. No entanto, o material plástico padrão de cultura celular normalmente usado para experimentos de reticulação UV é impenetrável até 254 nm UV. Portanto, em nosso reticulador as células só receberiam irradiação da margem superior das lâmpadas UV. Para superar isso, desenvolvemos uma placa de Petri de quartzo permeável aos raios UV para crescimento celular e reticulação. O uso da cultura de quartzo mostrou recuperação robusta de complexos proteína-RNA com apenas 2 s de irradiação UV (Figura 5B). Quando combinados com métodos de captura de RBP para células de mamíferos, como as tecnologias CLIP, esses curtos tempos de reticulação são passíveis de cursos temporais para recuperar perfis espaço-temporais de ligação de RNA de RBPs em resposta a estresses genotóxicos ou depleções rápidas de fatores proteicos, ou em paralelo com a sincronização transcricional ou do ciclo celular.

A Figura 6 mostra vários exemplos dos dados Nrd1 processados pelo pipeline χCRAC. Esta figura foi preparada usando os arquivos bedgraph gerados pelo pipeline e o pacote python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), que projetamos para simplificar a criação de imagens de navegador genômico com qualidade de publicação dos dados. Os retângulos cinzentos representam regiões genômicas que expressaram RNAs não codificantes, como transcritos instáveis crípticos (CUTs), transcritos estáveis não caracterizados (SUTs)40 e transcritos instáveis sensíveis a Xrn1 (XUTs)41. Os dados da Figura 6 mostram que Nrd1 liga-se a muitos desses transcritos de RNA não codificantes, consistente com a ideia de que esta proteína está envolvida na degradação dessa classe de transcritos42. A Figura 6A mostra uma região de ~15 kb no cromossomo IV. Aqui houve um aumento significativo na ligação de Nrd1 aos transcritos que codificam os transportadores de glicose de alta afinidade HXT6 e HXT7, ambos os quais são upregulated durante a inanição de glicose. É provável que a terminação da transcrição pelo complexo NNS possa influenciar a cinética de indução desses genes durante a inanição de glicose. A Figura 6B mostra um exemplo de ligação cruzada de Nrd1 com a transcrição Imd3, que é conhecida por ser regulada por Nab343. Neste caso, os dados demonstraram uma redução significativa na ligação à falta de glicose. Trabalhos anteriores mostraram diminuição da ligação do Nab3 ao transcrito Tye7 durante a falta de glicose44. Consistente com essa observação, os dados do χCRAC sugerem que a ligação de Nrd1 diminuiu durante a inanição de glicose e a ligação cruzada de Nrd1 com Tye7 foi mais baixa após 8 min de estresse (Figura 4C). No entanto, parece que esse efeito foi apenas transitório, porque após 14 min de falta de glicose, a ligação de Nrd1 voltou aos níveis iniciais.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do protocolo χCRAC. As cepas marcadas foram cultivadas até a densidade desejada. RBP indica proteína ligadora de RNA. Em seguida, uma amostra de referência foi coletada e reticulada com luz UV de 254 nm. As células restantes foram colhidas por filtração e, em seguida, rapidamente deslocadas para o meio indutor de estresse. Para o experimento χCRAC aqui descrito, amostras foram coletadas e reticuladas 1, 2, 4, 8, 14 e 20 min após o turno (1). A RBP de interesse foi então purificada usando uma purificação de afinidade em duas etapas altamente rigorosa (2). Em seguida, os RNAs reticulados capturados foram parcialmente digeridos com RNases, radiomarcados na extremidade 5' e adaptadores foram ligados a eles (3). Os adaptadores de 5' continham sequências de código de barras exclusivas "em leitura" para que as amostras individuais pudessem ser separadas bioinformaticamente após o sequenciamento. Os complexos RBP-RNA foram então eluídos, agrupados e precipitados em conjunto (4), resolvidos por SDS-PAGE e visualizados através de autorradiografia (5). Em seguida, um único corte de gel contendo o sinal radioativo logo acima da banda principal, ilustrado com caixa vermelha tracejada na imagem da autorradiografia, foi cortado do gel (5). As fatias de gel foram tratadas com protease K e o RNA foi posteriormente extraído (6), convertido em cDNAs e amplificado por PCR (7). A etapa de PCR introduziu códigos de barras adicionais (bloco amarelo introduzido pelo oligo P7) para que muitas bibliotecas pudessem ser multiplexadas em uma única faixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Reticulação e filtração a vácuo. (A) O reticulador. A suspensão da célula é despejada em um funil localizado no canto superior direito da máquina (veja também a Figura 3A para um close-up) e mantida em um saco transparente UV localizado na bandeja do meio. Este saco é flanqueado por duas persianas que permanecem fechadas até que o usuário instrua a máquina a iniciar a etapa de irradiação. As células são irradiadas com luz UV das bandejas acima e abaixo. A máquina vem fornecida com lâmpadas UV de 254 e 365 nm, sendo esta última aplicável para experimentos PAR-CLIP. A máquina é operada através de um painel touchscreen localizado no canto superior direito que permite controlar a dosagem UV ou o tempo de exposição. (B) Após a reticulação, as células são drenadas do lado esquerdo da máquina. As suspensões celulares são recuperadas através do vácuo e drenadas para um frasco de vidro, onde podem ser posteriormente despejadas em um dispositivo de filtragem a vácuo para a colheita. (C) Dispositivos de filtração a vácuo. Estes são abertos e fechados através de um clipe e um filtro é inserido entre ele. Quatro dispositivos de filtração foram usados em paralelo por séries temporais muito curtas para não perder tempo como resultado da troca de filtros. (D) Após a filtração, o sobrenadante do meio foi drenado em frascos para posterior descarte. Válvulas foram instaladas abaixo dos dispositivos de filtração a vácuo para manter o vácuo no sistema quando o filtro é removido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Reticulação de células suspensas versus células aderentes. (A) O reticulador com a câmara de ligação Vari-X para células de suspensão. A cultura celular é despejada na entrada da amostra (funil) localizada no canto superior direito da bandeja. (B) Bandeja que pode conter placas de Petri de plástico ou quartzo para reticulação de células aderentes ou pequenos volumes de células de suspensão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Preparação da biblioteca. (A) Exemplo de um auto-radiograma de um experimento χCRAC Nrd1-HTP. O sinal forte e concentrado representa a proteína reticulada a RNAs muito curtos, enquanto o esfregaço acima representa a proteína reticulada a RNAs de comprimento suficiente para sequenciamento. (B) O esfregaço foi excisado como mostrado em um auto-radiograma obtido após a excisão do gel. (C) Um qPCR representativo de uma biblioteca de cDNA χCRAC. Neste exemplo, a amplificação máxima do cDNA foi atingida em 16 ciclos. Assim, foram utilizados 16 ciclos para a amplificação final. A barra de erro representa o desvio padrão de três réplicas técnicas de qPCR. (D) Exemplo de uma imagem de fósforo de uma biblioteca de cDNA em gel de TBE a 6%. (E) análise do comprimento e da qualidade do cDNA a partir de eletroforese capilar baseada em chips. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Experimento iCLIP de teste de alta RNase para testar ligações cruzadas em células de mamíferos. São mostrados auto-radiogramas de experimentos iCLIP GFP-RBM7 que testaram a eficiência da recuperação de RNP em várias energias de reticulação. As imunoprecipitações foram realizadas utilizando anticorpos anti-GFP acoplados a esferas magnéticas em células reticuladas que expressavam de forma estável a GFP-RBM7. Os imunoprecipitados foram incubados com altas concentrações de RNase I para aparar os RNAs associados a comprimentos curtos e uniformes. As RNPs foram visualizadas por marcação de 32P e SDS-PAGE e migram como uma banda definida, próxima à migração da proteína não reticulada. A quantificação indica os resultados das análises densitométricas do sinal radiomarcado RBM7-RNA normalizado para o sinal anti-GFP western blot. (A) Curso de tempo de cross-linking do reticulador UVP comumente usado versus nosso reticulador (Vari-X-linker; VxL). (B) Curso de tempo de cross-linking do nosso cross-linker em quartzo (esquerda) e plástico (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Gráficos de exemplo de navegador de genoma mostrando o poder de χCRAC para mostrar a ligação temporal diferencial de Nrd1 a seus alvos. Cada caixa mostra gráficos para regiões genômicas individuais. As setas indicam em qual fita os genes estão codificados (seta apontando para a esquerda = menos fita; seta apontando para a direita = mais fita). Os pontos de tempo (min) são indicados por t0, t1, t2, etc nos eixos y de cada subparcela. Os algarismos romanos que indicam os cromossomos e as coordenadas são mostrados. (A) Após a privação de glicose, Nrd1 liga-se a dois transportadores de glicose de alta afinidade, HXT6 e HXT7, que são ambos upregulated nesta condição. (B) Observa-se que Nrd1 se liga a Imd3, um alvo já validado de Nab344, com intensidade reduzida após a falta de glicose. (C) A ligação de Nrd1 de Tye7 exibe uma natureza dinâmica e transitória, diminuindo após a falta de glicose ao mínimo após 8 min de estresse. No entanto, a ligação retorna subsequentemente aos níveis basais após 14 min. As leituras foram normalizadas para "leituras por milhão" (RPM; eixo y). As caixas cinzas indicam regiões que codificam RNAs não codificantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O método χCRAC, combinado com os novos dispositivos de reticulação e colheita celular, tem grande potencial porque é aplicável a uma ampla gama de organismos modelo e, portanto, deve ser de interesse geral para o campo do RNA. Existem muitas áreas em que o χCRAC pode ser utilizado. Por exemplo, o método poderia ser usado para medir a montagem hierárquica de proteínas em grandes complexos macromoleculares, como o spliceossomo e o ribossomo, que muitas vezes envolve interações dinâmicas entre proteínas e moléculas de RNA. Nós também agora o usamos rotineiramente para monitorar interações entre fatores de decaimento de RNA e seus substratos quando as células são submetidas a diversos tipos de estresse. Isso nos permite determinar em que estágio da resposta adaptativa esses fatores são mais ativos, a que substratos eles se ligam e quão dinâmicas são essas interações. Tais dados devem permitir aos pesquisadores determinar a contribuição relativa de cada fator na adaptação às mudanças ambientais.

χCRAC usa etiquetas de purificação de dupla afinidade (HTF ou HTP) para purificar a proteína sob condições altamente rigorosas e desnaturantes. Isso garante que o RNA copurificado seja altamente enriquecido para RNAs que foram covalentemente reticulados com a proteína de interesse. No entanto, confiar em tags de afinidade tem desvantagens. Por exemplo, a etiqueta poderia interferir com a função da proteína, o que poderia dar uma leitura distorcida de seu interactome de ligação ao RNA. Além disso, para alguns organismos modelo nem sempre é possível utilizar tags porque as ferramentas genéticas para integrar fragmentos de DNA no genoma ou para transformar plasmídeos de expressão ainda não estão disponíveis. No entanto, é simples alterar algumas partes do protocolo χCRAC para torná-lo compatível com protocolos baseados em CLIP que dependem de anticorpos para purificação da RBP. De fato, este estudo mostrou que é possível combinar purificações baseadas em iCLIP com nosso reticulador. Estamos agora no processo de desenvolvimento de protocolos CLIP para estudar a associação temporal de proteínas ligadoras de RNA humano com transcritos de RNA nascente.

Ao realizar χCRAC em uma nova proteína, a exposição UV deve ser otimizada para induzir o máximo de ligações cruzadas. Isso é importante porque altas exposições UV podem reduzir a recuperação de RNA durante a etapa de purificação. As células que expressam RBP recombinante foram expostas a várias doses de UV, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 e 1 J/cm 2. As RNPs foram então capturadas e os RNAs foram fragmentados e radiomarcados. Em seguida, as RNPs foram resolvidas por SDS-PAGE e um auto-radiograma foi realizado para deduzir qual exposição deu o sinal mais intenso (ou seja, o cross-linking máximo).

Uma vez otimizadas as condições experimentais, vários experimentos de controle são recomendados na realização do χCRAC. Primeiro, uma amostra não marcada irradiada por UV pode ser usada para monitorar a ligação de fundo às esferas de purificação. Em segundo lugar, ao aplicar χCRAC durante um experimento de turno, uma segunda série temporal onde as células são deslocadas de volta para o meio original permite investigar se a filtração das próprias células induz mudanças nos níveis de RNA ou interações proteína-RNA.

Como mencionado na Introdução, numerosos artigos publicados recentemente sugerem uma série de otimizações para o protocolo CLIP. Isso inclui o uso de adaptadores fluorescentes marcados para detectar o complexo proteína-RNA por meio de varredura infravermelha10, bem como otimizações para várias etapas de purificação de ácido nucleico e seleção de tamanho que mostraram aumentar a complexidade das bibliotecas resultantes12,45. Atualmente, estamos implementando algumas dessas melhorias para refinar ainda mais o protocolo χCRAC. O protocolo aqui apresentado já contém uma série de melhorias em relação aos protocolos CRAC e χCRAC originais que aumentam a complexidade dos dados. Por exemplo, anteriormente, depois de resolver os complexos de proteína-RNA radioativo reticulados em géis SDS-PAGE, eles foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose e o RNA reticulado foi isolado do blot. No entanto, a transferência do RNP e a subsequente extração do RNA podem ser muito ineficientes, particularmente quando se trata de grandes RBPs, como as subunidades da RNA polimerase. Isso pode resultar em uma redução significativa na recuperação do RNA reticulado. No protocolo atual, o RNA reticulado é extraído diretamente de cortes de gel SDS-PAGE, conforme ilustrado na Figura 1. Isso aumentou a recuperação de RNAs reticulados. Além disso, após a amplificação por PCR dos cDNAs, o produto foi originalmente resolvido em géis de agarose de baixa temperatura de fusão a 3% e, em seguida, produtos de PCR de 175–300 pb foram extraídos do gel. No entanto, esses géis podem ser facilmente sobrecarregados, resultando em uma separação muito pobre do DNA. A substituição de géis de agarose por géis TBE pré-moldados resultou em separação de tamanho mais consistente e melhor recuperação dos produtos de PCR.

Disclosures

A. Langford e W. Worboys são afiliados à UVO3, uma empresa comercial. Eles não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e interpretação dos dados ou na decisão de submeter o trabalho para publicação.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Wellcome Trust (091549 para S.G e 109093/Z/15/A para S.M.), o Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) e Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 para S.G.), a Organização Europeia de Biologia Molecular sob uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo (ALTF 1070-2017 para R.A.C), e o Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating

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References

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Tags

Bioquímica CRAC CLIP RNA-interação proteína ligação cruzada UV engenharia resposta ao estresse resolvido no tempo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 02/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC
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McKellar, S. W., Ivanova, I., van… More

McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).

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