Summary
यह प्रोटोकॉल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एंडोस्पर्म और स्टार्च ग्रेन्युल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अनाज के बीज (जैसे, चावल) के अनुप्रस्थ वर्गों की तैयारी के लिए अनुमति देता है।
Abstract
स्टार्च ग्रैन्यूल्स (एसजी) पौधे की प्रजातियों के आधार पर विभिन्न आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, विशेष रूप से पोएसी परिवार के एंडोस्पर्म में। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग का उपयोग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक (एसईएम) विश्लेषण का उपयोग करके एसजी मोर्फोटाइप के आधार पर जीनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है। एसजी को कर्नेल (पेरिकार्प, एल्यूरोन परतों, और एंडोस्पर्म) के माध्यम से स्लाइसिंग करके और ऑर्गेनेलर सामग्री को उजागर करके एसईएम का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। वर्तमान विधियों के लिए चावल कर्नेल को प्लास्टिक राल में एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है और एक माइक्रोटोम का उपयोग करके विभाजित किया जाता है या एक कटे हुए पिपेट टिप में एम्बेडेड किया जाता है और रेजर ब्लेड का उपयोग करके हाथ से विभाजित किया जाता है। पूर्व विधि के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और यह समय लेने वाली होती है, जबकि उत्तरार्द्ध चावल जीनोटाइप के आधार पर समस्याओं का एक नया मेजबान पेश करता है। चॉकी चावल की किस्में, विशेष रूप से, उनके एंडोस्पर्म ऊतक की friable प्रकृति के कारण इस प्रकार के सेक्शनिंग के लिए एक समस्या पैदा करती हैं। यहां प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी के लिए पारभासी और चॉकी चावल कर्नेल वर्गों को तैयार करने के लिए एक तकनीक है, जिसमें केवल पिपेट टिप्स और एक स्केलपेल ब्लेड की आवश्यकता होती है। एक पिपेट टिप की सीमाओं के भीतर वर्गों को तैयार करना चावल कर्नेल एंडोस्पर्म को टूटने से रोकता है (पारभासी या 'विट्रियस' फेनोटाइप के लिए) और ढहने (चॉकी फेनोटाइप के लिए)। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, एंडोस्पर्म सेल पैटर्निंग और बरकरार एसजी की संरचना को देखा जा सकता है।
Introduction
स्टार्च ग्रैन्यूल्स (एसजी) पौधे की प्रजातियों के आधार पर विभिन्न आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, विशेष रूप से पोएसी परिवार1,2के एंडोस्पर्म में। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग का उपयोग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण का उपयोग करके एसजी फेनोटाइप के आधार पर जीनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है। एसजी को कर्नेल को टुकड़ा करने और एंडोस्पर्म सेल की दीवारों को दूर करने के द्वारा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके कल्पना की जा सकतीहै।
इस तकनीक का उद्देश्य आसानी से तेजी से SEM विश्लेषण के लिए पूरी तरह से अनुप्रस्थ चावल कर्नेल वर्गों को तैयार करना है। इस तकनीक का विकास एक तेजी से क्रॉस सेक्शनिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता से प्रेरित था जिससे नमूने न्यूनतम उपकरणों का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन से तुरंत पहले SEM माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार किए जाते हैं।
इस तकनीक में पूरी तरह से स्थिरीकरण के लिए पिपेट टिप में भूसी हुई चावल कर्नेल का सम्मिलन शामिल है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब क्रॉस-सेक्शनिंग चॉकी चावल कर्नेल फेनोटाइप, जो फ्रिएबल होते हैं और दबाव3के तहत आसानी से उखड़ जाते हैं। चॉकनेस चावल में एक अवांछनीय गुणवत्ता है क्योंकि यह कर्नेल की उपस्थिति को प्रभावित करता है और चमकाने और मिलिंग के दौरान कर्नेल को आसानी से तोड़ने का कारण बनता है3. चॉकनेस कर्नेल के एक क्रॉस-सेक्शन में एक अपारदर्शी क्षेत्र के रूप में प्रस्तुत करता है जिसे नग्न आंखों से देखा जा सकता है; माइक्रोस्कोपिक स्तर पर, चॉकनेस को छोटे, ढीले पैक स्टार्च दानों की विशेषता है। चॉकीनेस के कारण आनुवांशिक4,5 या पर्यावरणीय 6,7हो सकते हैं .
पैराफिन मोम या एक अन्य ठोस मैट्रिक्स 4 ,8,9,10में नमूने को एम्बेड करने के बाद पारंपरिक रूप से रासायनिक निर्धारण विधियों और सेक्शनिंग का उपयोग करके अनाज बीज क्रॉस सेक्शन तैयार किए गए हैं . 2010 में, मात्सुशिमा विधि को जटिल और समय लेने वाले चावल कर्नेल नमूनातैयारीसे बचने के तरीके के रूप में पेश किया गया था। इस विधि में एक कटा हुआ पिपेट टिप में भूसीदार चावल कर्नेल का सम्मिलन शामिल था। टिप को एक ब्लॉक ट्रिमर द्वारा स्थिर रखा जाता है, और पतले, आंशिक एंडोस्पर्म वर्गों को हाथ से आयोजित रेजर ब्लेड का उपयोग करके काटा जाता है। 2016 में विकसित एक और तेजी से तकनीक ने विभिन्न प्रकार के सूखे बीजों के पतले पूरे विभाजन के लिए अनुमति दी, जिसमें चाकी किस्में10शामिल हैं। इन विधियों ने यहां प्रस्तुत तेजी से तकनीक के विकास को प्रेरित किया।
यह नई तकनीक उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो एसईएम का उपयोग करके एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग और स्टार्च आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए चावल की गुठली के बरकरार अनुप्रस्थ क्रॉस सेक्शन प्राप्त करना चाहते हैं।
यह प्रोटोकॉल कई उल्लेखनीय संशोधनों के साथ मात्सुशिमा कटे हुए पिपेट टिप विधि4के अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है: (1) कर्नेल तकनीक के किसी भी बिंदु पर आत्मसात नहीं किए जाते हैं; (2) अनुभागों को तैयार करने के लिए न तो एक ब्लॉक ट्रिमर और न ही एक अल्ट्रामाइक्रोबियलोम की आवश्यकता होती है। एक जंगली प्रकार 'पारभासी' cultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) और निप्पॉनबेरे(ssg1, घटिया स्टार्च अनाज1)4 की एक उत्परिवर्तित 'चॉकी' लाइन की जांच इस अध्ययन में की गई थी। इन दो cultivars को यहां विश्लेषण के लिए चुना गया था ताकि पारभासी और चॉकी-प्रकार के चावल वर्गों के प्रसंस्करण में तकनीकी और दृश्य अंतर प्रदर्शित किया जा सके।
Protocol
1. अनुप्रस्थ चावल अनुभाग की तैयारी
- डी-भूसी सूखी, बरकरार गुठली जैसा कि चित्र 1Aमें दिखाया गया है।
- दो फ्लैट रबर स्टॉपर के बीच गुठली को पीसकर भूसी और डीहुल चावल की गुठली को ढीला करें। यदि आवश्यक हो तो पैनिकल से भूसी हुई चावल की गुठली को हटा दें।
- एक कार्य बेंच पर एक फ्लैट रबर स्टॉपर पर एक एकल कर्नेल रखें(चित्रा 1 बी)। सुनिश्चित करें कि यह स्टॉपर स्थिर रहता है।
- पर्याप्त दबाव(चित्रा 1डी) का उपयोग करके कर्नेल को पहले रबर स्टॉपर के खिलाफ घुमाकर इसे घुमाकर एब्राड करने के लिए एक दूसरे फ्लैट रबर स्टॉपर(चित्रा 1 सी)का उपयोग करें। कर्नेल से भूसी निकालें, ध्यान रखें कि एंडोस्पर्म को चकनाचूर न करें। ठीक संदंश का उपयोग करके किसी भी शेष भूसी को हटा दें। एक डी-भूसी हुई कर्नेल को चित्र 1Eमें दिखाया गया है।
- ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, एक प्लास्टिक पिपेट टिप (250 μL आकार, एक बीज / टिप) में एक व्यक्तिगत भूसी हुई कर्नेल डालें(चित्रा 1 एफ)। सुनिश्चित करें कि कर्नेल का भ्रूण अंत पिपेट टिप(चित्रा 1 जी)के (शंक्वाकार) छोर की ओर सामना कर रहा है।
नोट: कर्नेल को इस तरह से सम्मिलित करना यह सुनिश्चित करता है कि कर्नेल पिपेट टिप में जितना संभव हो सके उतना snugly फिट होगा क्योंकि कर्नेल अपने समीपस्थ अंत की ओर संकीर्ण है। - कर्नेल को पिपेट टिप में मजबूर करने के लिए एक दूसरा 250 μL पिपेट टिप डालें और सेक्शनिंग के दौरान कर्नेल को स्थिर रखने के लिए, कर्नेल को नुकसान पहुंचाने या दूसरे पिपेट टिप को मोड़ने के लिए ध्यान न रखें(चित्रा 1 एच)। उचित 'दूरबीन' संयोजन चित्र 1Iमें दर्शाया गया है।
- एक काम बेंच पर पिपेट टिप असेंबलिंग फ्लैट रखें और हाथ से जगह में पकड़ें(चित्रा 1 जे)। दूसरे हाथ के साथ, कर्नेल के केंद्र के माध्यम से स्लाइस करने के लिए एक तेज स्केलपेल ब्लेड (नंबर 20) का उपयोग करें और पिपेट टिप के अंत को काट दें(चित्रा 1K)। स्कैल्पल का उपयोग करके चावल कर्नेल के 1 मिमी मोटे वर्गों को काट दिया जाताहै (चित्रा 1 एल)।
नोट: कर्नेल अनुभाग कसकर प्लास्टिक के एक annulus के भीतर संलग्न है(चित्रा 1M). तीन उदाहरण जीनोटाइप के लिए माध्य अनुभाग मोटाई तालिका 1में पाई जाती है। 1 मिमी की तुलना में काफी पतले खंड चकनाचूर या उखड़ जाएंगे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कर्नेल के किस हिस्से से प्रत्येक खंड की उत्पत्ति होती है यदि यह प्रयोग तुलना के लिए चावल की कई किस्मों पर किया जा रहा है, क्योंकि स्टार्च आकृति विज्ञान एंडोस्पर्म11में भिन्न होता है।
2. अनुप्रस्थ चावल वर्गों की परावर्तित प्रकाश माइक्रोस्कोपी
- भारी गेज काले कागज के एक काले टुकड़े पर अनुप्रस्थ चावल वर्गों (खंड 1 में तैयार) रखने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
- तिरछी रोशनी के लिए घुड़सवार goosenecks के साथ एक stereomicroscope का उपयोग कर निप्पॉनबेयर के अनुप्रस्थ वर्गों की प्रकाश छवियों को प्राप्त करें, जैसा कि चित्र 1एन-एसमें दिखाया गया है।
- कम से कम 10x आवर्धन के तहत एंडोस्पर्म आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
नोट: कोई भी एपिलाइट स्रोत उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए बेहतर है क्योंकि इस तकनीक का उपयोग करके प्राप्त अनुभाग प्रकाश के माध्यम से गुजरने के लिए पर्याप्त पतले नहीं हैं।
3. अनुप्रस्थ चावल वर्गों के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- एक एल्यूमीनियम स्टब करने के लिए अटक एक कार्बन डिस्क पर नमूनों जगह और एक चार्ज कमी नमूना धारक पर जगह. SEM के वैक्यूम उपकरण में प्रवेश करने से प्लास्टिक को रोकने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करके पिपेट टिप माउंट से प्लास्टिक की अंगूठी को हटा दें।
नोट: एंडोस्पर्म कोशिकाओं, SGs, और subgranules की छवियाँ एक डेस्कटॉप SEM मशीन का उपयोग करके प्राप्त की जाती हैं, जिसके लिए नमूनों को sputter लेपित होने की आवश्यकता नहीं होती है। - 10 kV पर एक उच्च संवेदनशीलता बहु मोड backscatter इलेक्ट्रॉन (बीएसई) डिटेक्टर का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करें।
Representative Results
जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे(चित्रा 2 ए)और एसएसजी 1 वर्गों(चित्रा 2 बी)की जांच तीन आवर्धनों के तहत की गई थी: 260x, 920x, और 4200x। यह तकनीक पूरे एंडोस्पर्म सेल(चित्रा 3 ए),यौगिक स्टार्च दानों (चित्रा 3 बी), और व्यक्तिगत उप-अनाज(चित्रा3 सी)का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता वाले वर्गों की तैयारी की अनुमति देती है। भूसी हुई गुठली को पॉलिश की गई गुठली की तुलना में संसाधित करने में अधिक समय लगता है क्योंकि सूखे पतवारों को सेक्शनिंग से पहले घर्षण द्वारा हटाने की आवश्यकता होती है। चॉकी कर्नेल को पॉलिश किए गए पारभासी गुठली की तुलना में प्रक्रिया में अधिक समय लगता है, क्योंकि सेक्शनिंग के दौरान कर्नेल को चकनाचूर न करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। एक ठीक से तैयार चावल अनुभाग लगभग 0.9 मिमी मोटा होना चाहिए(तालिका 1)एंडोस्पर्म(चित्रा 1 एन)और बरकरार पेरिकार्प और एल्यूरोन परतों(चित्रा 1 ओ)के कम से कम टूटने के साथ। पिपेट टिप पर स्केलपेल का अनुचित प्लेसमेंट जब सेक्शनिंग 'चिप्ड' वर्गों(चित्रा 1 पी)को जन्म दे सकता है। इसी तरह, एसएसजी 1 (चित्रा 1Q)के इष्टतम अनुप्रस्थ वर्गों की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों ने बरकरार एंडोस्पर्म, पेरिकार्प, और एल्यूरोन परतों को बरकरार रखा और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपलब्ध(चित्रा 1 आर)का प्रदर्शन किया। एक टूटी हुई चॉकी कर्नेल अनुभाग(चित्रा 1 एस)अभी भी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपयोग करने योग्य हो सकता है यदि एकमात्र उद्देश्य एसजी का निरीक्षण करना है, लेकिन एंडोस्पर्म सेल पैटर्न दिखाई नहीं देगा। एक टूटे हुए अनुभाग को विश्लेषण के लिए संभालना मुश्किल हो सकता है। एंडोस्पर्म सेल की दीवारों का अधिक कर्तन जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे में देखा गया था, क्योंकि कोशिकाएं एसएसजी 1 गुठली की तुलना में अधिक कसकर पैक और कम friable होती हैं। एसएसजी 1 वर्गों में एंडोस्पर्म कोशिकाओं का कोई कर्तन नहीं देखा गया था और यौगिक स्टार्च दानों को बरकरार रखा गया है।
चित्रा S1 चावल की गुठली अनुभाग करने के लिए 'दूरबीन' तकनीक का उपयोग कर परिणामों की विश्वसनीयता को दर्शाता है। चावल लाइनों पारभासी कर्नेल उत्पादकों के रूप में पहचाना - जंगली प्रकार प्रतिरोधी स्टार्च (RS) हाइब्रिड लाइन Xieyou 7954(Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 (चित्रा S1A)और कोबाल्ट-जनित उत्परिवर्ती RS11113,15 (चित्रा S1B)ने उन वर्गों का उत्पादन किया जिनके माध्यम से एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रकाश दिखाई दे रहा था। इसी SEM छवियों से पता चला है कि ये लाइनें 'सामान्य' चावल एंडोस्पर्म फेनोटाइप का उत्पादन करती हैं: कसकर पैक, पॉलीहेड्रल स्टार्च ग्रैन्यूल्स। चॉकी कर्नेल उत्पादकों, वाणिज्यिक किस्मयी-तांग 16 (चित्रा S1C)और RS413,RS11115 (चित्रा S1D)का एक उत्परिवर्ती, सफेद, अपारदर्शी कर्नेल वर्गों का प्रदर्शन किया। इसी SEM छवियों ने जंगली प्रकार के पारभासी आरएस पृष्ठभूमि लाइन की तुलना में स्पष्ट रूप से अलग आकारिकी प्रदर्शित की: स्टार्च ग्रैन्यूल्स गोल और ढीले पैक किए गए थे। जंगली प्रकार Xiushui 11(Oryza sativa L. ssp. japonica)(चित्रा S1E)और इसके उत्परिवर्ती, KMD1 (Kemingdao1), जो कीट शिकार को बाधित करने के लिए Cry1Ab जीन को व्यक्त करते हैं17,18,19 (चित्रा S1F)ने पारभासी RS लाइनों के समान वर्गों और एंडोस्पर्म मोर्फोटाइप का प्रदर्शन किया।
यहां प्रस्तुत तकनीक फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए चॉकी-प्रकार के चावल की गुठली के नमूने तैयार करने के लिए इष्टतम है, लेकिन पारभासी चावल कर्नेलफेनोटाइप्स 20को विभाजित करने के लिए भी लाभ प्रदान करती है: ऊपर से दबाव का उपयोग करके नमूनों को टुकड़ा करने से एंडोस्पर्म और अव्यवस्था के टूटने का खतरा कम हो जाता है। नमूने आसानी से सेकंड के भीतर तैयार किए जा सकते हैं(तालिका 2)। इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करके कई जीनोटाइप का विश्लेषण किया गया था(तालिका 3)। जैसा कि चित्र S2में दिखाया गया है, इस तकनीक को अन्य प्रजातियों के बीजों पर लागू किया जा सकता है। मॉडल मोनोकोट ब्रैकीपोडियम डिस्टाचियोन बहुत कठोर बीज पैदा करता है जिसमें केवल बी-ग्रेन्युल स्टार्च21होता है, जिसमें प्यूरोइंडोलिन ए की कमी होती है, एक प्रोटीन जो स्टार्च ग्रैन्यूल्स को कोमलता प्रदान करता है22। यह अभी भी एक बरकरार अनुप्रस्थ अनुभाग(चित्रा S2A)प्राप्त करने के लिए संभव था। नरम सफेद सर्दियों के गेहूं (SWWW) से एक बरकरार अनुप्रस्थ अनुभाग प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण था लेकिन प्रदर्शन किया जा सकता है(चित्रा S2B)। SWWW बीज puroindoline A में उच्च होते हैं और बड़े होते हैं जब B. distachyon बीज और चावल की गुठली की तुलना में। दूरबीन संयोजन का उपयोग करके विभाजित करते समय ये बीज अक्सर उखड़ जाते हैं।
| जीनोटाइप | दूरबीन संयोजन का उपयोग करके माध्य अनुभाग चौड़ाई (μm) | माध्य अनुभाग चौड़ाई (μm) फ़्रीहैंड अनुभाग |
| निप्पॉनबेरे (भूसी हुई) | 971.7 ± 152.4ab | 1059.571 ± 394.2ab |
| Xieyou 7954 | 825.1 ± 128.3b | 1306.187 ± 179.1a |
| RS4 | 910.6 ± 165.0ab | 1126.694 ± 395.3ab |
| एक ही अक्षर के बाद के साधन P < 0.01 पर विचरण (एनोवा) और टुकी के परीक्षण (एन = 10) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके काफी अलग नहीं हैं। जेएमपी 15 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। | ||
तालिका 1: कर्नेल अनुभाग मोटाई मतलब है।
| जीनोटाइप | माध्य समय (s)* |
| निप्पॉनबेरे (भूसी हुई) | 14.7 ± 1.36a |
| Xieyou 7954 | 9.81 ± 0.98b |
| RS4 | 11.9 ± 1.28c |
| * दूरबीन संयोजन का उपयोग करना। | |
| एक ही अक्षर के बाद के साधन P < 0.01 पर विचरण (एनोवा) और टुकी के परीक्षण (एन = 10) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके काफी अलग नहीं हैं। जेएमपी 15 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। | |
तालिका 2: मतलब नमूना तैयारी समय.
| जीनोटाइप | पृष्ठभूमि | गुण |
| निप्पॉनबेयर | जंगली प्रकार | पारभासी |
| घटिया स्टार्च अनाज1 (ssg1) | निप्पॉनबेयर | खड़ियामय |
| प्रतिरोधी स्टार्च (RS) Xieyou 7954 | जंगली प्रकार | पारभासी |
| RS111 | Xieyou 7954 | पारभासी |
| RS4 | RS111 | खड़ियामय |
| Yi-Tang, 'नया जीवन', Lujuren ब्रांड | Xieyou 7954 | खड़ियामय |
| Xiushui 11 | जंगली प्रकार | पारभासी |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui 11 | पारभासी |
तालिका 3: चावल जीनोटाइप इस अध्ययन में जांच की|
चित्रा 1: अनुप्रस्थ चावल वर्गों की तैयारी। (ए)बरकरार भूसी के साथ जंगली प्रकार निप्पॉनबेरे कर्नेल। (बी)कर्नेल एक फ्लैट चार इंच व्यास रबर स्टॉपर पर रखा गया है। (सी)भूसी को दो एप्पोजिंग रबर स्टॉपर के बीच कर्नेल को पीसकर हटा दिया गया था। (डी)भूसी को चावल की गिरी से अलग कर दिया गया है। (ई)भूसी वाले चावल की गिरी का क्लोज-अप। भ्रूण अंत इंगित किया जाता है। (एफ)ठीक संदंश का उपयोग करके पिपेट टिप में कर्नेल का सम्मिलन। (जी)कर्नेल पिपेट टिप के डिस्टल छोर में दर्ज किया गया था। (एच)सेक्शनिंग ('टेलीस्कोप' असेंबलिंग) के लिए कर्नेल को स्थिर करने के लिए दूसरे पिपेट टिप का सम्मिलन। (I)चावल कर्नेल को पिपेट टिप के डिस्टल छोर में स्नगली फिट किया गया था। (जे)संयोजन के भीतर चावल कर्नेल का विभाजन। (के)अनुभाग कट का क्लोज़-अप. (एल)प्लास्टिक एनुलस द्वारा संलग्न कर्नेल का एक खंड। (एम)अनुप्रस्थ अनुभाग का क्लोज-अप। (एन)जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे का अनुप्रस्थ अनुभाग। (ओ)जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे अनुभाग के भीतर एंडोस्पर्म का क्लोज-अप। (पी)जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे कर्नेल का गरीब, सबऑप्टिमल अनुभाग। (Q) निप्पॉनबेरे उत्परिवर्ती ssg14का अनुप्रस्थ अनुभाग . (आर) एसएसजी 1 अनुभाग के भीतर एंडोस्पर्म का क्लोज-अप। (एस) ssg1के गरीब, suboptimal अनुभाग | बार (पैनल A, N-S)= 1 मिमी पूरे चावल कर्नेल और वर्गों को एक डिजिटल ज़ूम कैमरा और gooseneck रोशनी के साथ एक stereomicroscope का उपयोग कर imaged थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: अनुप्रस्थ कर्नेल वर्गों की SEM छवियाँ. (ए) जंगली प्रकार निप्पॉनबेयर, एक पारभासी किस्म। यौगिक स्टार्च दानों को एक दूसरे को कसकर सीमेंट किया गया था; (बी)निप्पॉनबेरे उत्परिवर्ती एसएसजी 14,एक चॉकी फेनोटाइप। यौगिक स्टार्च दानों को शिथिल रूप से पैक किया गया था और जंगली प्रकार के निप्पॉनबेरे स्टार्च मोर्फोटाइप की सीमेंटाइटियस प्रकृति की कमी थी। बाएं से दाएं आवर्धन: 260x, 920x, और 4200x। बार लंबाई पैनलों में इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: Xiushui 11 के एक अनुप्रस्थ कर्नेल अनुभाग के SEM माइक्रोस्कोपिक शरीर रचना विज्ञान. (ए)एक एकल एंडोस्पर्म सेल को लाल रंग में रेखांकित किया गया है। 260x आवर्धन. (बी)एक यौगिक स्टार्च ग्रेन्युल लाल रंग में उल्लिखित है। 920x आवर्धन. (C)एकाधिक स्टार्च subgranules लाल रंग में उल्लिखित हैं। 2250x आवर्धन. बार लंबाई पैनलों में इंगित कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा S1: इस तकनीक का उपयोग करके SEM के लिए तैयार किए गए अन्य चावल जीनोटाइप के अनुप्रस्थ अनुभाग। (ए)प्रतिरोधी स्टार्च (आरएस) Xieyou 795412| (बी)RS111, 795413का एक उच्च-आरएस पारदर्शी उत्परिवर्ती। (C) RS4, RS11115का एक चाकदार उत्परिवर्ती। (डी)यी-तांग, उच्च एमाइलोज चावल की एक वाणिज्यिक किस्म16| (ई)Xiushui 11. (च) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए 10x आवर्धन. सफेद पट्टी = 1 मिमी 2250x SEM छवियों के लिए आवर्धन. बार लंबाई पैनलों में इंगित कर रहे हैं. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
चित्रा S2: तकनीक अन्य बीजों के लिए उपयोगी है। (ए) झूठे बैंगनी ब्रोम का अनुप्रस्थ अनुभाग(ब्रैकीपोडियम डिस्टाचियोन एल परिग्रहण Bd21) बीज। (बी)नरम सफेद सर्दियों के गेहूं का अनुप्रस्थ अनुभाग(Triticum aestivum L. cv. Augusta) बीज। उज्ज्वल क्षेत्र, 20x आवर्धन. बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहां प्रस्तुत तकनीक डेस्कटॉप एसईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुप्रस्थ चावल क्रॉस सेक्शन तैयार करने की दिशा में एक तेज़, सरल और उत्सुक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। यह सेक्शनिंग तकनीक एंडोस्पर्म संरचना, एंडोस्पर्म सेल आकार, आकार और पैटर्न, यौगिक दानों और स्टार्च आकृति विज्ञान के तेजी से अवलोकन के लिए अनुमति देती है। एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग और जर्मप्लाज्म स्क्रीनिंग के प्रयोजनों के लिए, चावलकर्नेल4,23,24के पूरे क्रॉस सेक्शन को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। एंडोस्पर्म को उखड़ने या चकनाचूर करने के लिए मजबूर करने से स्केलपेल ब्लेड के दबाव को रोकने के लिए पिपेट टिप के भीतर पूरी तरह से कर्नेल को सम्मिलित करना सर्वोपरि है। बशर्ते 'दूरबीन' संयोजन ठीक से बनाया गया है, नमूनों को 15 सेकंड के भीतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तैयार किया जा सकता है(तालिका 2)एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग में पहले से ही हाथ में सामग्री को नियोजित करना। यह तकनीक किसी भी अंडाकार बीज के क्रॉस-सेक्शनिंग पर लागू होती है जो इसके सबसे व्यापक बिंदु पर लगभग चार मिलीमीटर व्यास में होती है। मॉडल घास Brachypodium distachyon (चित्रा S2A)के बीज इसी तरह से विभाजित किया जा सकता है, लेकिन annulus के भीतर संलग्न नहीं रहते हैं। बड़े बीज, जैसे गेहूं, आसानी से फ्रैक्चर और सेक्शनिंग(चित्रा S2B)करते समय देखभाल की आवश्यकता होती है।
हालांकि, यहां प्रस्तुत तकनीक की कई सीमाएं हैं। इस तकनीक का उपयोग करके प्राप्त अनुभाग प्रकाश के गुजरने के लिए पर्याप्त पतले नहीं हैं, जो उज्ज्वल क्षेत्र (चावल कर्नेल अनुभागों25के लिए 500 μm अधिकतम नमूना मोटाई) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) (500 एनएम अधिकतम नमूना मोटाई26) जैसे संचारित-प्रकाश आधारित माइक्रोस्कोपिक दृष्टिकोणों के लिए इस तकनीक के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। ). सेक्शनिंग 'मैट्रिक्स' के रूप में एक पिपेट टिप का उपयोग भी बीज के आकार को सीमित करता है जिसे इस तकनीक का उपयोग करके विभाजित किया जा सकता है। चावल से अत्यधिक असमान प्रजातियों के लिए इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए आगे की समस्या निवारण की आवश्यकता होगी, और 'मैट्रिक्स' का आकार खरीद के लिए उपलब्ध पिपेट युक्तियों के आकार से सीमित है।
एक और विशिष्ट लाभ जो यह तकनीक प्रदान करती है वह नमूनों की गुणवत्ता है जिसे चॉकी फेनोटाइप चावल की गुठली से उत्पादित किया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि यहां तक कि मात्सुशिमा अध्ययन ने स्वीकार किया कि चॉकीफेनोटाइप्स 4के लिए उस विशेष विधि का उपयोग करके क्रॉस सेक्शन प्राप्त करना मुश्किल था, जैसा कि तुलना के उद्देश्य से इस अध्ययन में दोहराया गया था(चित्रा 1 एस)। उनके मामले में, रासायनिक रूप से उनके चॉकी चावल के नमूनों को ठीक करना और उन्हें सेक्शनिंग के लिए राल में एम्बेड करना आवश्यक हो गया। नई तकनीक, डेस्कटॉप एसईएम इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में, शोधकर्ता को आसानी से स्थिरीकरण समर्थन के बिना अधिक स्थिरता के साथ माइक्रोस्कोपी के लिए चावल की गुठली के अनुप्रस्थ वर्गों को तैयार करने की अनुमति देती है(तालिका 3)।
Phenomics और metabolomics के नए युग में, बीज में स्टार्च के कार्य और महत्व को बेहतर ढंग से समझने के लिए म्यूटाजेनाइज्ड लाइनों और ट्रांसपोसन-टैग किए गए पुस्तकालयों की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, अंतर्राष्ट्रीय चावल जीनबैंक में 130,000 से अधिक चावल परिग्रहण27हैं। यहां प्रस्तुत एक तेजी से बीज फेनोटाइपिंग तकनीक की तरह एक पोषण गुणवत्ता के लिए वर्गीकरण और नमूनाकरण में तेजीलाएगी। अंत में, यह तकनीक जलवायु परिवर्तन के प्रभावों के अतिक्रमण के प्रकाश में उपयोगी हो सकती है। अनाज भरने के दौरान मौसमी उच्च तापमान के तनाव को पहले से ही चॉकनेस6के एक प्रमुख कारण के रूप में पहचाना जा चुका था, लेकिन हाल के अध्ययनों ने चावल की पैदावार7,29की बढ़ती चॉकनेस में बढ़ते वैश्विक तापमान को शामिल किया है। इस तरह के त्वरित एंडोस्पर्म फेनोटाइपिंग वैश्विक तापमान में वृद्धि के प्रभाव की एक व्यापक कृषि छवि प्रदान करने में मदद कर सकते हैं।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों को उनके Phenom ProX डेस्कटॉप SEM साधन के उपयोग के लिए अनुसंधान के लिए सिस्टम (SFR Corp.) के लिए आभारी हैं, साथ ही साथ मारिया Pilarinos (अनुसंधान के लिए प्रणाली (SFR) कॉर्प) और Chloë वैन Oostende-Triplet (सेल जीव विज्ञान और छवि अधिग्रहण कोर सुविधा, चिकित्सा के संकाय, ओटावा विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। वित्तपोषण ओंटारियो सरकार के आर्थिक विकास, नौकरी सृजन और व्यापार मंत्रालय, और प्रोटीन ईजी कॉर्प से कम कार्बन इनोवेशन फंड (LCIF) द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
References
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