Summary
Detta protokoll gör det möjligt att förbereda tvärgående delar av spannmålsfrön (t.ex. ris) för analys av endoskopi och stärkelsegranulatmorfologi med hjälp av scanningelektronmikroskopi.
Abstract
Stärkelsegranulat (SGs) uppvisar olika morfologier beroende på växtarten, särskilt i poaceaefamiljens endosperm. Endosperm fenotypning kan användas för att klassificera genotyper baserat på SG morphotype med hjälp av scanning elektron mikroskopisk (SEM) analys. SGs kan visualiseras med SEM genom att skära genom kärnan (pericarp, aleurone lager och endosperm) och exponera organellar innehållet. Nuvarande metoder kräver att riskorn är inbäddad i plastharts och sektionerad med en mikrotom eller inbäddad i en trunkerad pipettspets och sektionerad för hand med hjälp av ett rakblad. Den tidigare metoden kräver specialiserad utrustning och är tidskrävande, medan den senare introducerar en ny mängd problem beroende på risgenotyp. Kritiga rissorter utgör särskilt ett problem för denna typ av sektionering på grund av den spröda karaktären hos deras frövita vävnad. Presenteras här är en teknik för att förbereda genomskinliga och kritiga riskärnsektioner för mikroskopi, som endast kräver pipettspetsar och ett skalpellblad. Genom att förbereda sektionerna inom ramen för en pipettspets förhindras att riskärnornas endosperm splittras (för genomskinliga eller "glasaktiga" fenotyper) och smulas sönder (för kritiga fenotyper). Med hjälp av denna teknik kan endosperm cell mönstrar och strukturen av intaktA SGs observeras.
Introduction
Stärkelsegranulat uppvisar olika morfologier beroende på växtarten, särskilt i poaceaefamiljens endosperm1,2. Endosperm fenotypning kan användas för att klassificera genotyper baserat på SG fenotyp med hjälp av scanning elektron mikroskopisk analys. SGs kan visualiseras med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM) genom att skära kärnan och bända bort frövita cellväggarna2.
Syftet med denna teknik är att enkelt förbereda tvärgående riskärnsektioner enbart för den snabba SEM-analysen. Utvecklingen av denna teknik motiverades av behovet av en snabb tvärsnittsmetod där prover bereds för SEM-mikroskopi omedelbart före visualisering med minimal utrustning.
Denna teknik innebär införandet av den skalade riskärnan i pipettens spets för fullständig immobilisering. Detta är särskilt viktigt vid tvärsnitt av kritiga riskärnfenotyper, som är spröda och lätt smula under tryck3. Kritighet är en oönskad kvalitet i ris eftersom det påverkar kärnans utseende och gör att kärnan lätt bryts under polering ochfräsning 3. Kritighet presenteras som ett ogenomskinligt område i ett tvärsnitt av kärnan som kan observeras med blotta ögat; på mikroskopisk nivå kännetecknas kritigheten av små, löst packade stärkelsegranulat. Orsaker till kritighet kan vara genetiska4,5 eller miljö6,7.
Tvärsnitt av spannmålssäde har traditionellt beretts med hjälp av kemiska fastsättningsmetoder och sektionering efter provinbäddning i paraffinvax eller annan fast matris4,8,9,10. År 2010 introducerades Matsushima-metoden som ett sätt att undvika komplicerad och tidskrävande riskärnprovberedning4. Denna metod involverade införandet av den skalade riskärnan i en trunkerad pipettspets. Spetsen hålls stillastående av en blocktrimmer, och tunna, partiella endoskopisektioner skördas med ett handhållet rakblad. En annan snabb teknik som utvecklades 2016 möjliggjorde tunn hela sektionering av en mängd olika torra frön, inklusive kritiga sorter10. Dessa metoder motiverade utvecklingen av den snabba tekniken som presenteras här.
Denna nya teknik är lämplig för forskare som vill få intakta tvärgående tvärsnitt av riskärnor för endosperm fenotypning och stärkelsemorfologianalys med SEM.
Detta protokoll representerar en anpassning av Matsushima trunkerad pipettspetsmetod4, med flera anmärkningsvärda modifieringar: (1) kärnor är inte insupna vid någon tidpunkt i tekniken; (2) varken en blocktrimmer eller en ultramicrotom krävs för att förbereda sektionerna. En vild typ "genomskinlig" sort (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) och en mutageniserad "kritig" linje av Nipponbare (ssg1, undermålig stärkelsekorn1)4 undersöktes i denna studie. Dessa två sorter valdes ut för analysen här för att visa de tekniska och visuella skillnaderna i bearbetning av genomskinliga risavsnitt av och krittyp.
Protocol
1. Beredning av tvärgående rissektion
- Torka av skal, intakta kärnor enligt figur 1A.
- Lossa skalen och dehulla riskärnorna genom att mala kärnorna mellan två platta gummiproppar. Ta bort de skalade riskärnorna från paniken, om det behövs.
- Placera en enda kärna på en platt gummipropp på en arbetsbänk (figur 1B). Se till att proppen står stilla.
- Använd en andra platt gummipropp(figur 1C) för att abrade kärnan genom att vrida in den mot den första gummiproppen med tillräckligt tryck (figur 1D). Ta bort skal från kärnan, var försiktig så att du inte krossar frövitan. Ta bort eventuellt återstående skal med fina tångar. En avskalningskärna visas i figur 1E.
- För in en enskild skalkärna i en pipettspets av plast (250 μL-storlek, ett frö/spets) (figur 1F). Se till att kärnans embryoände är vänd mot pipettens (koniska) ände(figur 1G).
OBS: Genom att sätta in kärnan på detta sätt säkerställs att kärnan passar så tätt som möjligt in i pipettspetsen eftersom kärnan är smalare mot sin proximala ände. - Sätt in en andra pipettspets på 250 μL för att tvinga in kärnan i pipettspetsen och för att hålla kärnan orörlig under sektionering, var försiktig så att kärnan inte skadas eller böjer den andra pipettspetsen(figur 1H). Den korrekta teleskopmonteringen anges i figur 1I.
- Lägg pipettspetsmonteringen platt på en arbetsbänk och håll på plats för hand (figur 1J). Använd med den andra handen ett vasst skalpellblad (nr 20) för att skära genom kärnans mitt och skära av pipettspetsens ände (figur 1K). Använd skalpellskuren 1 mm tjocka delar av riskorn(figur 1L).
OBS: Kärnsektionen är tätt innesluten i en annulus av plast (figur 1M). Genomsnittlig sektionstjocklek för tre exempelgenotyper finns i tabell 1. Sektioner som är betydligt tunnare än 1 mm kommer att splittras eller smulas sönder. Det är viktigt att notera från vilken del av kärnan varje avsnitt härrör om detta experiment utförs på flera rissorter för jämförelse, eftersom stärkelsemorfologi varierar i hela endokmen11.
2. Reflekterad ljusmikroskopi av tvärgående rissektioner
- Använd fina tångar för att placera de tvärgående rissektionerna (beredda i avsnitt 1) på en svart bit svart papper med tung mätare.
- Få ljusbilder av tvärgående delar av Nipponbare med hjälp av ett stereomikroskop med monterade gåsnäckor för sned belysning, som visas i figur 1N-S.
- Observera endosperm morfologi under minst 10x förstoring.
OBS: Alla epilight-källor är att föredra framför ljus fältmikroskopi eftersom sektioner som erhålls med denna teknik inte är tillräckligt tunna för att ljuset ska passera igenom.
3. Scanning elektronmikroskopi av tvärgående rissektioner
- Placera proverna på en kolskiva som fastnat på en aluminiumstubbe och placera på en laddningsreduktionsprovhållare. Ta bort plastringen från pipettspetsfästet med fina tångar för att förhindra att plasten kommer in i SEM:s vakuumapparat.
OBS: Bilder av endoskopiceller, SGs och subgranules erhålls med hjälp av en stationär SEM-maskin som inte kräver att proverna ska vara sputterbelagda. - Få bilderna med hjälp av en högkänslig multiläges backscatterelektron (BSE) detektor vid 10 kV.
Representative Results
Vilda typ Nipponbare (figur 2A) och ssg1 sektioner (figur 2B) undersöktes under tre förstoringar: 260x, 920x och 4200x. Denna teknik gör det möjligt att förbereda sektioner av tillräcklig kvalitet för att observera hela frövitamen(figur 3A),sammansatta stärkelsegranulat(figur 3B)och enskilda undergranulat(figur 3C). Skalkärnor tar längre tid att bearbeta än polerade kärnor eftersom de torra skroven måste avlägsnas genom nötning före sektionering. Kritkärnor tar också längre tid att bearbeta än polerade genomskinliga kärnor, eftersom man måste vara försiktig så att kärnan inte splittras under sektionering. En korrekt förberedd rissektion bör vara cirka 0,9 mm tjock(tabell 1) med minimal till ingen förkrossning av frövitan (figur 1N) och intakta perikarp- och aleuroneskikt(figur 1O). Felaktig placering av skalpellen på pipettspetsen vid sektionering kan leda till "flisade" sektioner (figur 1P). På samma sätt visade ljusa fältbilder av optimala tvärgående sektioner av ssg1 (figur 1Q) intakta endoskopiska, perikarp- och aleuronelager intakta och tillgängliga för visualisering(figur 1R). Ett trasigt kritkärnavsnitt (bild 1S) kan fortfarande vara användbart för visualisering om det enda syftet är att observera SGs, men fröscellmönstret inte kommer att vara synligt. En trasig sektion kan vara svår att hantera för analys. Mer klippning av frövita cellväggar observerades i vilda typ Nipponbare, eftersom cellerna är tätare packade och mindre spröda än ssg1 kärnor. Ingen skjuvning av frövita celler observerades i ssg1 avsnitt och sammansatt stärkelse granulat är intakta.
Figur S1 visar tillförlitligheten hos resultaten med hjälp av "teleskoptekniken" för att dela upp riskärnor. Rislinjer som identifierats som genomskinliga kärnproducenter – hybridlinje av vild typ resistent stärkelse (RS) Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 (figur S1A)och koboltgenererad mutant RS11113,15 ( figurS1B)producerade sektioner genom vilka ljuset var synligt med hjälp av ett stereomikroskop. Motsvarande SEM bilder visade att dessa linjer producerar "normala" ris endosperm fenotyp: tätt packade, polyhedrliga stärkelse granulat. Kritkärnproducenter, kommersiella sorten Yi-Tang16 (figur S1C) och RS413, en mutant av RS11115 (figur S1D),uppvisade vita, ogenomskinliga kärnsektioner. Motsvarande SEM-bilder visade markant olika morfologi jämfört med den vilda typen genomskinligA RS bakgrundslinje: stärkelsegranulat var runda och löst packade. Vild typ Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (figur S1E) och dess mutant, KMD1 (Kemingdao1), som uttrycker Cry1Ab-genen för att hämma insektsfördyning17,18,19 ( figurS1F) uppvisade sektioner och endoskopimorfotyper som liknar de genomskinliga RS-linjerna.
Tekniken som presenteras här är optimal för att förbereda prover av kritliknande riskärnor för fenotypisk analys, men ger också fördelar för att dela upp genomskinliga riskärnor fenotyper20:att skära proverna med hjälp av tryck ovanifrån minskar risken för att endosperm och förskjutning. Proverna kan enkelt beredas inom några sekunder (tabell 2). Flera genotyper analyserades med denna teknik för att testa dess effektivitet (tabell 3). Som visas i figur S2kan denna teknik tillämpas på frön av andra arter. Modellen monocot Brachypodium distachyon producerar mycket hårda frön som endast innehåller B-granulatstärkelse21, som saknar puroindoline A, ett protein som ger mjukhet till stärkelsegranulat22. Det var fortfarande möjligt att få ett intakt tvärgående avsnitt (figur S2A). Att få en intakt tvärgående sektion från mjukt vitt höstvete (SWWW) var utmanande men kan utföras (figur S2B). SWWW frön är höga i puroindoline A och stora jämfört med B. distachyon frön och riskärnor. Dessa frön smulas ofta vid sektionering med hjälp av teleskopuppsättningen.
| Genotyp | Genomsnittlig sektionsbredd (μm) med hjälp av teleskopmontering | Genomsnittlig sektionsbredd (μm) sektionering frihand |
| Nipponbare (skal) | 971,7 ± 152,4ab | 1059.571 ± 394.2ab |
| Xieyou 7954 | 825,1 ± 128,3b | 1306.187 ± 179.1a |
| RS4 | 910,6 ± 165,0ab | 1126.694 ± 395.3ab |
| Medel som följs av samma bokstäver skiljer sig inte nämnvärt vid P < 0,01 med hjälp av en enkelriktad analys av variansen (ANOVA) och Tukeys test (n = 10). Statistiska analyser utfördes med JMP 15 programvara. | ||
Tabell 1: Genomsnittlig tjocklek på kärnsektionen.
| Genotyp | Genomsnittlig tid (s)* |
| Nipponbare (skal) | 14,7 ± 1,36a |
| Xieyou 7954 | 9,81 ± 0,98b |
| RS4 | 11.9 ± 1.28c |
| *Använda teleskopuppsättningen. | |
| Medel som följs av samma bokstäver skiljer sig inte nämnvärt vid P < 0,01 med hjälp av en enkelriktad analys av variansen (ANOVA) och Tukeys test (n = 10). Statistiska analyser utfördes med JMP 15 programvara. | |
Tabell 2: Genomsnittlig tillagningstid för prover.
| Genotyp | Bakgrund | Kvalitet |
| Nipponbare | Vild typ | Genomskinlig |
| Undermåligt stärkelsekorn1 (ssg1) | Nipponbare | Kalkhaltig |
| Resistent stärkelse (RS) Xieyou 7954 | Vild typ | Genomskinlig |
| RS111 | Xieyou 7954 | Genomskinlig |
| RS4 | RS111 | Kalkhaltig |
| Yi-Tang, "Nytt liv", Varumärket Lujuren | Xieyou 7954 | Kalkhaltig |
| Xiushui 11 | Vild typ | Genomskinlig |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui 11 | Genomskinlig |
Tabell 3: Risgenotyper som undersökts i denna studie.
Figur 1: Beredning av tvärgående rissektioner. (A) Wild typ Nipponbare kärna med intakt skal. (B). Kärna placerad på en platt 4-tums diameter gummipropp. (C) Skalen avlägsnades genom att kärnan slipades mellan två aptitretande gummiproppar. d)Skal har separerats från riskorn. e)Närbild av råriskärnan. Embryoänden anges. (F) Införande av kärnan i pipettspetsen med hjälp av fina tångar. G)Kärnan fastnade i pipettspetsens distala ände. ( H) Införande av den andra pipettspetsen för att immobilisera kärnan för sektionering (teleskopets sammansättning). (I)Riskärnan monterades tätt i den distala änden av pipettspetsen. j)Sektionering av riskorn i monteringen. (K) Närbild av sektionsskärningen. l)En del av kärnan som omges av annulus av plast. (M)Närbild av den tvärgående delen. (N) Tvärgående sektion av vild typ Nipponbare. O)Närbild av frövitan inom avsnittet Nipponbare av typen Nipponbare. (P) Dålig, suboptimal sektion av vild typ Nipponbare kernel. ( Q) Tvärgående delen av Nipponbare mutant ssg14. (R) Närbild av frövitan inom ssg1-sektionen. ( S)Dålig, suboptimal sektion av ssg1. Stapel (panelerna A, N-S) = 1 mm. Hela riskärnan och sektionerna avbildades med hjälp av ett stereomikroskop med en digital zoomkamera och gåsnäckaljus. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: SEM-bilder av tvärgående kärnsektioner. A)Wild type Nipponbare, en genomskinlig sort. De sammansatta stärkelsegranulat cementerades tätt mot varandra; (B) Nipponbare mutant ssg14, en kritig fenotyp. Föreningen stärkelse granulat var löst packade och saknar cementitious natur av vilda typ Nipponbare stärkelse morfotyp. Förstoring från vänster till höger: 260x, 920x och 4200x. Stapellängd anges i paneler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: SEM mikroskopisk anatomi av en tvärgående kärna avsnitt av Xiushui 11. (A) En enda frövitacell är röd. 260x förstoring. b)Ett sammansatt stärkelsegranulat är belyst i rött. 920x förstoring. c)Flera stärkelsesubgranulat är belyst i rött. 2250x förstoring. Stapellängder anges i panelerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur S1: Tvärgående delar av andra risgenotyper som bereds för SEM med denna teknik. a)Resistent stärkelse (RS) Xieyou 795412. b)RS111, en transparent mutant med hög RS-höjd av 795413. C) RS4, en kritig mutant av RS11115. D)Yi-Tang, en kommersiell mängd hög amylosris16. e)Xiushui 11. F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. 10x förstoring för ljusa fältbilder. Vit stapel = 1 mm. 2250x förstoring för SEM-bilder. Stapellängder anges i panelerna. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Figur S2: Tekniken är användbar för andra frön. A) Tvärgående del av falskt lila brom(Brachypodium distachyon L. accession Bd21) utsäde. B) Tvärgående del av mjukt vitt höstvete(Triticum aestivum L. cv. Augusta) utsäde. Ljust fält, 20x förstoring. Bar = 1 mm. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
Tekniken som presenteras här representerar ett snabbt, enkelt och skarpt tillvägagångssätt för att förbereda tvärgående ris tvärsnitt för desktop SEM visualisering. Denna sektionsteknik möjliggör snabb observation av frövita struktur, endoskopi cell form, storlek och mönster, sammansatta granulat och stärkelse morfologi. Vid endospermfenotypning och screening av könsceller är det viktigt att erhålla ett helt tvärsnitt av riskorn4,23,24. Det är av största vikt att sätta in kärnan helt i pipettspetsen för att förhindra att trycket från skalpellbladet tvingar frövitan att smula eller splittras. Under förutsättning att "teleskopets" sammansättning är korrekt konstruerad kan proverna förberedas för visualisering inom 15 sekunder(tabell 2) med material som redan finns i en typisk laboratoriemiljö. Denna teknik är tillämplig på tvärsnitt av alla ellipsoidala frö cirka fyra millimeter i diameter vid dess bredaste punkt. Frön av modellgräset Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan på samma sätt delas upp men förblir inte inneslutna i annulus. Större frön, som vete, spricker lätt och kräver vård vid sektionering (figur S2B).
Det finns dock flera begränsningar i tekniken som presenteras här. Sektioner som erhålls med denna teknik är inte tillräckligt tunna för att ljuset ska passera genom vilket förbjuder användning av denna teknik för överförda ljusbaserade mikroskopiska metoder som ljust fält (500 μm maximal provtjocklek för riskärnsektioner25) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maximal provtjocklek26 ). Användningen av en pipettspets som sektionsmatris begränsar också storleken på utsädet som kan delas upp med denna teknik. Ytterligare felsökning skulle krävas för att anpassa denna teknik för arter som är mycket olikt ris, och storleken på "matrisen" begränsas av storleken på pipettspetsar som finns att köpa.
En annan tydlig fördel som denna teknik ger är kvaliteten på prover som kan produceras från kritiga fenotypriskärnor. Det är värt att notera att även Matsushima-studien medgav att det var svårt att få tvärsnitt med den specifika metoden för kritiga fenotyper4, som replikeras i denna studie för jämförelse (figur 1S). I deras fall blev det nödvändigt att kemiskt fixa sina kritiga risprover och bädda in dem i harts för sektionering. Den nya tekniken, i kombination med desktop SEM imaging, gör det möjligt för forskaren att enkelt förbereda tvärgående delar av riskärnor för mikroskopi med mer konsistens än utan immobiliseringsstöd (tabell 3).
I den nya eran av fenomen och metabolomik är det viktigt att övervaka mutageniserade linjer och transposonmärkta bibliotek för att bättre förstå stärkelsens funktion och betydelse i frön. Dessutom har Den internationella risgenbanken över 130 000 risanslutninger27. En snabb fröfenotypningsteknik som den som presenteras här skulle påskynda klassificering och provtagning för näringskvalitet28. Slutligen kan denna teknik vara användbar mot bakgrund av inkräktande klimatförändringseffekter. Säsongsbetonad högtemperaturstress under spannmålsfyllning hade redan identifierats som en viktig orsak till kritighet6, men nyligen genomförda studier har involverat stigande globala temperaturer i ökande kritighet hos risutbyten7,29. Sådan påskyndad endosperm fenotypning kan bidra till att ge en bred jordbruksbild av effekten av ökande globala temperaturer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Systems for Research (SFR Corp.) för användning av deras Phenom ProX Desktop SEM-instrument, liksom för det tekniska stödet från Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) och Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Finansiering tillhandahölls av Low Carbon Innovation Fund (LCIF) från regeringen i Ontarios ministerium för ekonomisk utveckling, skapande och handel med arbetstillfällen och proteiner Easy Corp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
References
- James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M.
- Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives. Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).
- Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants. Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).
- Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).
- Zhao, X., et al. Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments. Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).
- Nagato, K., Ebata, M. Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels. Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).
- Zhao, X., Fitzgerald, M. Climate change: implications for the yield of edible rice. PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).
- Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein. LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).
- Feiz, L., et al. Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content. Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).
- Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed. Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954". Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).
- Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. Slow digestion properties of rice different in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).
- Zhou, H., et al. Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).
- Yang, C. Z., et al. Starch properties of mutant rice high in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).
- Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment. Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).
- Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).
- Liu, H., et al. Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip. Food Control. 107, 106775 (2020).
- Shu, Q., et al. Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species. Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).
- Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties. Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).
- Chen, G., et al. Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina. BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).
- Giroux, M. J., Morris, C. F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).
- Matsushima, R., Hisano, H. Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice. Scientific Reports. 9, 3745 (2019).
- Matsushima, R., et al. Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm. Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).
- Monjardino, P., et al. Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells. Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).
- Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. Sample preparation for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).
- International Rice Genebank. , Available from: www.irri.org (2018).
- Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties. Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).
- Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change. Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).
