Summary
यहां, हम वक्ष वाहिनी लिम्फोसाइट्स एकत्र करने और समय-चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके 3 घंटे के लिए चूहे पेयर के पैच में आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स के प्रवास को देखने के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करते हैं। यह तकनीक स्पष्ट कर सकती है कि भड़काऊ परिस्थितियों में लिम्फोसाइट्स की गतिशीलता कैसे प्रभावित होती है।
Abstract
भोले लिम्फोसाइट्स रक्त से शारीरिक स्थिति के तहत लिम्फोइड ऊतकों को फिर से प्रसारित करते हैं और इसे आमतौर पर आंत प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण घटना के रूप में पहचाना जाता है। माध्यमिक लिम्फोइड अंगों का स्ट्रोमा, जैसे कि पेयर के पैच (पीपीएस) या मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, जहां भोले लिम्फोसाइट्स सेंस एंटीजन हैं। भोले लिम्फोसाइट्स पीपीएस में प्रवेश के पोर्टल उच्च एंडोथेलियल वेणुल्स तक पहुंचने के लिए खून के माध्यम से प्रसारित होते हैं। कुछ इम्यूनोमोडुलेटर्स को लिम्फोसाइट माइग्रेशन को प्रभावित करने का अनुमान है, लेकिन माइक्रोसर्कुलेशन गतिशीलता का सटीक मूल्यांकन बहुत मुश्किल है, और वीवो में लिम्फोसाइट माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए एक विधि स्थापित करना सटीक तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान दे सकता है। हमने लिम्फोसाइट्स को लिम्फोसाइट्स को लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने और चूहे के पीपीएस में आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स की विस्तृत गतिशीलता को देखते हुए परिष्कृत किया। हमने वीवो में चूहे के पीपीएस का निरीक्षण करने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी को चुना और समय-चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके इसे रिकॉर्ड किया। अब हम स्पष्ट छवियां प्राप्त कर सकते हैं जो लिम्फोसाइट गतिशीलता के विश्लेषण में योगदान दे सकते हैं।
Introduction
पीयर के पैच (पीपीएस) में छोटी आंत के लैमिना प्रोपरिया में सैकड़ों लिम्फोइड रोम शामिल हैं। पीपीएस को रोम, इंटरफोलिकुलर क्षेत्र और रोम के निचले हिस्से में स्थित अंकुरित केंद्रों में विभाजित किया जाता है, जहां लिम्फोसाइट्स एंटीजन प्रस्तुति द्वारा उत्तेजित होते हैं। कोई अफरेंट लिम्फेटिक जहाज नहीं हैं, और एंटीजन एपिथेलियल सेल परत के माध्यम से आंतों के लुमेन से लैमिना प्रोप्रिया पर आक्रमण करते हैं। लिम्फोइड कूप को कवर करने वाले एपिथेलियल क्षेत्र को कूप से जुड़े एपिथेलियम कहा जाता है, जिसके भीतर विशेष इंटरस्प्रेड एम कोशिकाएं म्यूकोसल एंटीजन को तेज करती हैं। एम कोशिकाएं ल्यूमिनल साइड से एंटीजन में लेती हैं और एंटीजन को फिर डेंड्रिटिक कोशिकाओं द्वारा कैप्चर किया जाता है और भोले लिम्फोसाइट्स की ओर प्रस्तुत किया जाता है जो उच्च एंडोथेलियल वेणुल्स (एचईवी)1के एंडोथेलियम के माध्यम से पीपीएस में प्रवाहित होते हैं। पीपीएस आंतों की प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सूजन के प्रारंभिक चरण से संबंधित हैं। कई आणविक बातचीत में लिम्फोसाइट्स के प्रवेश द्वार को माध्यमिक लिम्फोइड अंगों (एसएलओ) में शामिल किया जाता है, जिसमें आसंजन अणु, केमोकिंस2,3और स्कोफिंगोसाइन-1-फॉस्फेट4शामिल हैं; इस प्रकार, कई अपेक्षित चिकित्सीय लक्ष्य हैं। इसलिए, पीपीएस के भीतर लिम्फोसाइट गतिशीलता को देखने से हम सूजन के प्रारंभिक चरण की एक झलक पकड़ने और कई आशाजनक दवाओं की उपयोगिता की जांच करने में सक्षम होते हैं।
यहां की विधि पीपीएस में लिम्फोसाइट्स के प्रवास पर केंद्रित है, जिसमें कई प्रक्रियाएं (वक्ष वाहिनी5 में कैनुलेशन और एकत्र लिम्फोसाइट्स में इंजेक्शन के बाद लिम्फोसाइट्स और दीर्घकालिक अवलोकन एकत्र करना) शामिल है। चूंकि ये प्रक्रियाएं जटिल हैं और यह देखना मुश्किल था कि पिछली रिपोर्टों में प्रत्येक प्रक्रिया का प्रदर्शन कैसे किया गया था, इसलिए हमने यहां एक सफल अवलोकन प्राप्त करने के लिए कुछ सुझावों का उल्लेख किया । उदाहरण के लिए, वक्ष वाहिनी में ट्यूबों का कैनुलेशन बहुत मुश्किल था, और कैनुलेशन की प्रारंभिक सफलता दर 50% से कम थी। हालांकि, हमने विधि में सुधार किया और 80% से अधिक सफलता दर हासिल की। हमने इस पांडुलिपि में कुछ अन्य सुझावों का उल्लेख किया है जो सफल अवलोकन के लिए आवश्यक हैं ताकि कई शर्तों के तहत लिम्फोसाइट्स के ट्रांसेंडोथेलियल माइग्रेशन का मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सके।
पिछली रिपोर्टों में, समय के साथ त्रि-आयामी परिवर्तनों को समझना मुश्किल था, जैसे कि भारत की स्याही का नसों में इंजेक्शन पीपीएस6की संवहनी संरचना को दागना, या माइक्रोस्कोप मोनोफोकल7। हाल के वर्षों में, कुछ फोटोवर्टिबल फ्लोरेसेंस प्रोटीन ट्रांसजेनिक जानवरों जैसे कादे चूहों का उपयोग करके एक अवलोकन विधि ने वीवो8में व्यवस्थित सेलुलर आंदोलनों को स्पष्ट किया है। अन्य अध्ययन में पीपीएस9से लिम्फोसाइट एग्रेस के सीडी 69 स्वतंत्र शटडाउन को स्पष्ट किया गया । हमने अपनी उच्च विश्लेषणात्मक क्षमता के कारण कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग किया। अब हम आसानी से उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त कर सकते हैं और लिम्फोसाइट गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।
इस रिपोर्ट में, हमने पीपीएस में लिम्फोसाइट माइग्रेशन के मूल्यांकन के लिए कई तरीकों का प्रदर्शन किया । सबसे पहले, हमने लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए वक्ष वाहिनी कैनुलेशन के परिष्कृत तरीके दिखाए। दूसरा, हमने सूक्ष्म अवलोकन के तहत जब भी संभव हो वस्तुनिष्ठ अंगों को बनाए रखने के लिए कई तरीकों से अवलोकन विधियों में सुधार किया, जिससे हम 3 घंटे के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त कर सकें। तीसरा, हमने कुछ दवाओं के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए लिम्फोसाइट माइग्रेशन के सेलुलर आंदोलनों की मात्रा निर्धारित की। ये संशोधित प्रोटोकॉल म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी मूल्यांकनों के विकास में योगदान देंगे।
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Protocol
प्रायोगिक प्रोटोकॉल को नेशनल डिफेंस मेडिकल कॉलेज की पशु अनुसंधान समिति (नंबर 16058) ने मंजूरी दी थी। जानवरों को मानक प्रयोगशाला चाउ (CLEA जापान इंक, टोक्यो, जापान) पर बनाए रखा गया था । प्रयोगशाला के पशुओं का उपचार राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया ।
1. लिम्फोसाइट्स का संग्रह और अलगाव
नोट: चूंकि लिम्फोसाइट्स ताजा होना चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, इसलिए उन्हें प्रत्येक प्रयोग के लिए चूहों से एकत्र किया जाना चाहिए। इसके अलावा, आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स को सीधे वक्ष वाहिनी से एकत्र किया जाना चाहिए जहां वे प्रसारित होते हैं। सभी प्रक्रियाओं को 6 घंटे के भीतर पूरा होने की उम्मीद है, और सभी उपकरण, दस्ताने और सतह साफ हैं। जानवरों को शारीरिक रूप से स्थिर अवस्था में रखने के लिए प्रयोग में इस्तेमाल होने वाले सभी खारे और अन्य तरल पदार्थों को गर्म रखना चाहिए।
- गर्म पानी (लगभग 80-90 डिग्री सेल्सियस) में डुबकी लगाने के बाद एक हेपरिन वक्र (लगभग 5 मिमी के त्रिज्या) की तरह एक कैनुलेशन ट्यूब (1 मिमी व्यास) बनाएं और इसे पहले से कुछ घंटों के लिए चिपकने वाले टेप का उपयोग करके प्लास्टिक बोर्ड में ठीक करें।
- एक नर विस्टार चूहे (8-12 सप्ताह) को मिदाजोलम (2 मिलीग्राम/किलो), डोमिटर (0.15 मिलीग्राम/किलो), और बैतूलपहर (2.5 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ और हेयर क्लिपर का उपयोग करके पेट के शरीर के बालों को काट दें। शेविंग के बाद बालों को मजबूती से निकाल दें ताकि बाल पेट की गुहा में प्रवेश न करें।
- इस बात की पुष्टि करने के बाद कि प्रक्रिया के लिए आवश्यक संज्ञाहरण की स्थिर गहराई को अंगुली चुटकी द्वारा प्राप्त किया जाता है, शल्य कैंची के साथ एक चीरा क्षैतिज रूप से मिडलाइन से बाएं उपकोस्टल क्षेत्र में बनाते हैं। सावधान रहें कि प्रकाश के तहत जहाजों को देखकर पैरेटल पेरिटोनम में रक्त वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचाएं।
- पेट को गीली धुंध से लपेटें और पेट को धीरे-धीरे शरीर के बाहर सही में ले जाएं ताकि रेट्रोपेरिटोनियल अंगों को प्रकट किया जा सके। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर रीढ़ की इरेक्टर मांसपेशियों और एडीपोज ऊतक के बीच एक पायदान डालें और उन्हें उंगलियों से स्पष्ट रूप से अलग करें।
- ध्यान से वक्ष वाहिनी के आसपास संयोजी ऊतक बंद पट्टी। उम्र के साथ अतिरिक्त कनेक्टिव टिश्यू बढ़ जाता है। वक्ष वाहिनी की 20 मिमी लंबाई दिखाई देने तक डायाफ्राम कौडाली के बाएं क्रूस के नीचे से वक्ष वाहिनी का पर्दाफाश करें। सटीक चिमटी या गीले कपास झाड़ू का उपयोग करके वक्ष वाहिनी और महाधमनी के बीच धीरे-धीरे आसंजन अलग करें।
- इस प्रक्रिया को ध्यान से करें क्योंकि कुछ चूहों में पेट की धमनी से पंच नलिका या लिम्फ प्लेक्सस (मकड़ी के जाले की तरह फैलने वाली छोटी छाती नलिका) की उच्च स्थिति के कारण एक छोटी छाती वाहिनी पर पार करने वाले धमनियों में ब्रांचिंग होती है। एडिमा को प्रेरित करने से बचने के लिए वक्ष वाहिनी से अनावश्यक संपर्क से बचें।
- डायाफ्राम के बाएं टुकड़ों के ठीक नीचे वक्ष नलिका पर एक स्ट्रिंग (3-0 रेशम) द्वारा एक लिगेचर लागू करें। कौडल वक्ष वाहिनी डिस्टर्ब हो जाती है।
- सर्जिकल कैंची के अत्याधुनिक छुरा द्वारा पेट की दीवार में एक छेद (5 मिमी व्यास) बनाओ, हेयरपिन-घुमावदार कैनुलेशन ट्यूब पास करें, और एक बिंदु पर iliopsoas मांसपेशी पर ट्यूब को लिगेट करें। कैनुलेशन ट्यूब को सामान्य नमकीन युक्त 10 यू/एमएल हेपरिन से भरें।
- डिटेन्ड वक्ष वाहिनी के नीचे एक स्ट्रिंग (3-0 रेशम) रखने के बाद, एक कैनुलेशन ट्यूब के तेजी से कटे हुए किनारे के साथ वक्ष वाहिनी पर वार करें, इसे पूंछ की ओर 5 मिमी की ओर कैनुलेट करें, और निर्धारण के लिए कैनुलेशन ट्यूब के साथ वक्ष वाहिनी को लिगेट करें।
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए नमकीन की आपूर्ति करने के लिए, सटीक चिमटी का उपयोग करके पेट के अंत्येय दीवार पर एक छेद (3 मिमी व्यास) बनाएं और पाइलोरिक रिंग के माध्यम से डुओडेनम में सिलिकॉन ट्यूब (व्यास में 2 मिमी) पास करें। एक घाव सिलाई और Bollman पिंजरों में जानवरों को बनाए रखने के बाद, 3 एमएल/एच की एक प्रवाह दर पर सिलिकॉन ट्यूब से प्रत्येक चूहे के duodenum में चीनी से लदी खारा संचार शुरू करते हैं । इसे गर्म रखने के लिए पूरे पिंजरे को एक कागज तौलिया से ढक दें।
- 6 यू/एमएल हेपरिन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, और आरपीएमआई 1640 मध्यम (पीएच 7.4; सामग्री की मेज देखें), और बर्फ पर छाती नली (टीडीएल) युक्त बर्फ पर 50-एमएल शंकु नली के ढक्कन के केंद्र में छेद करने के लिए कैनुलेशन ट्यूब को ठीक करें। सावधान रहें कि ट्यूब के अंदर फाइब्रिन क्लॉट गठन के कारण कैनुलेटेड-ट्यूब ऑक्क्यूज़ेशन को रोकने के लिए शंकु नली की दीवार पर ट्यूब की नोक से संपर्क न करें। लिम्फ तरल पदार्थ (लगभग 20 एमएल) सहित लगभग 1.0 x 108~ 109 लिम्फोसाइट्स 6 घंटे में प्राप्त किए जा सकते हैं। पूर्ण संज्ञाहरण के तहत लिम्फोसाइट्स प्राप्त करने के लिए, संज्ञाहरण के विमान की निगरानी की जाती है और लिम्फ प्रवाह उचित रूप से मनाया जाता है। चूहों को 6 घंटे तक लगातार गहरे संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए बॉलमैन के पिंजरे में डालने के लगभग 3 घंटे बाद एक ही खुराक पर एक ही एनेस्थेटिक्स जोड़ा जाता है।
2. कार्बोक्सीफ्लोरेसेइन डायसेट सुसिनिमिडिल एस्टर (सीएफडीई) के साथ लिम्फोसाइट लेबलिंग
- सीडीएसई(सामग्री की तालिका)को डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 15.6 mM (500 माइक्रोन ऑफ सीडीएसई को भंग) में भंग करें।
- आरपीएमआई 1640 के 50मिलियन में 1 x 10 ~10 9) में 30 मिनट के लिए 50 माइक्रोन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर10वर्णित है।
3. माइक्रोवैस्कुलर अध्ययन के लिए प्रायोगिक सेटअप
- मिडाजोलम (2mg/kg), डोमिटर (0.15 मिलीग्राम/किलो), और बैतूलफार (2.5 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ प्राप्तकर्ता चूहों (8-12 सप्ताह) को एनेस्थेटाइज करें और चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। बालों के संदूषण को कम करने के लिए फर को संवारने से पहले पेट को गीला करें। फिर एक मिडलाइन चीरा के माध्यम से प्राप्तकर्ता विस्स्टर चूहे के पेट को खोलें।
- एक पोर्टेबल स्टेनलेस स्टील प्लेट (लगभग 120 x 300 मिमी) पर एक चूहा रखें जिसमें एक ग्लास स्लाइड (24 x 50 मिमी) से ढके केंद्र के चारों ओर आयत छेद है। अवलोकन के लिए पीपीएस सहित इलियल सेगमेंट के लगभग 10 सेमी चुनें।
- आंत को यथासंभव गर्म रखें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ नम 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म रखें। पीबीएस के साथ छोटी आंत को कवर करने के लिए उपयोग की जाने वाली धुंध को सोख ें।
- 2% आइसोफ्लुन (सामग्रियों की तालिका देखें) के साथ निरंतर संज्ञाहरण देते समय, माइक्रोस्कोप के चरण पर स्लाइड डालें और पीपीएस में माइक्रोसर्कुलेशन के अवलोकन के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का चयन करें जहां कुछ एचईवी सेरोसा के माध्यम से चल रहे हैं। पीपीएस आकार में रेंज; बड़े लोग सीएलएसएम का उपयोग करके माइक्रोसर्कुलेशन के अवलोकन के लिए उपयुक्त हैं। छोटी आंत सीधे स्थानों में नहीं है; बिना किसी तनाव के कम से कम 2 सेमी लंबा सीधा सेगमेंट अवलोकन के लिए उपयुक्त है।
- पीबीएस से लथपथ शोषक कपास के साथ आसन्न आंतों के खंड और मेसेंट्री को कवर करें। आंत खंड को दो लुढ़का हुआ कपास गेंदों के बीच रखें और चूहे के शरीर से जहां तक संभव हो इसे चूहे के दिल की धड़कन और सांस लेने से कंपन होने से रोकने के लिए इसे रखें।
- 1 मिली सिरिंज का उपयोग करके, प्राप्तकर्ता चूहों की जुगलबंदी नस में धीरे-धीरे (1 मिनट से अधिक) सीएफएस लेबल वाले टीडीएसी(1 x 10 8 कोशिकाएं) इंजेक्ट करें। एक तेजी से नसों में इंजेक्शन प्रणालीगत परिसंचरण को प्रभावित कर सकता है।
4. लिम्फोसाइट्स का माइक्रोसर्कुलेशन
- लगातार 30 एस अंतराल पर समय-चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके 3 घंटे के लिए एक कंप्यूटर पर रिकॉर्ड का उपयोग कर CLSM का उपयोग कर पीपीएस के माइक्रोवसकुलेचर में टीडीएसल की निगरानी करें। सेरोसा से पीपीएस के एचईवी तक की गहराई लगभग 25 माइक्रोन है, जिससे स्ट्रोमा और केशिका लिम्फ जहाजों के अवलोकन को 30 माइक्रोन की गहराई तक सक्षम बनाया जा सके।
- कोशिका नाभिक को दागने के लिए रक्तप्रवाह और Hoechest ३४२ (5 मिलीग्राम/kg) को दाग करने के लिए प्रत्येक प्राप्तकर्ता चूहे की जुगलबंदी नस में टेक्सास रेड-डेक्सट्रान (25 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्ट करें ।
- (वैकल्पिक) लिम्फोसाइट गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 30 सेकंड से अधिक HEVs का पालन करने वाले लिम्फोसाइट्स को "चिपकने वाले लिम्फोसाइट्स" और लिम्फोसाइट्स को 'माइग्रेटिंग लिम्फोसाइट्स' के रूप में हेवी से स्ट्रोमा में बसने के रूप में परिभाषित करें। फिर दृष्टि के क्षेत्र (लगभग 0.3 मिमी2)प्रति प्रवासन (माइग्रेट लिम्फोसाइट्स / चिपकने वाले लिम्फोसाइट्स + माइग्रेटिंग लिम्फोसाइट्स) के औसत प्रतिशत की गणना करें।
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Representative Results
लिम्फ से लिम्फोसाइट्स का संग्रह
छाती वाहिनी कैनुलेशन के लिए चूहे को तैयार करने के लिए, चित्रा 1 में दिखाए गए तनावपूर्ण वक्ष वाहिनी में एक चीरा बनाएं और फिर चित्रा 2में दिखाए गए बॉलमैन के पिंजरे में चूहे को बनाए रखें।
जब लिम्फोसाइट्स अच्छी तरह से एकत्र किए जाते हैं, तो हम लगभग 20 एमएल/6 एच लिम्फ तरल पदार्थ प्राप्त कर सकते हैं जिसमें लगभग 107~10 8/एमएललिम्फोसाइट्स होते हैं। टीडीएल में से, 70% एक्सप्रेस सीडी 4, जिसमें से लगभग 90% कोशिकाएं सीडी 62एल व्यक्त करती हैं, जिसका अर्थ है टीडीएल की मुख्य संरचना (>60%) भोले आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स होते हैं। चूंकि यहां एकत्र किए गए लिम्फोसाइट्स कोशिकाएं हैं जो विशेष रूप से आंतों के पथ पर स्थानांतरित होती हैं, वे पीयर के पैच में माइग्रेशन की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त हैं।
सूक्ष्म अवलोकन
फ्लोरोसेंट लिम्फोसाइट्स की पर्याप्त खुराक इंजेक्ट करने के बाद, प्राप्तकर्ता चूहे की आंत को ग्लास स्लाइड पर माउंट करें जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। शारीरिक स्थिति में पीपीएस की एक सूक्ष्म छवि चित्र 4में दिखाई गई है ।
सूक्ष्म अवलोकन के लिए, चूहों को लगभग 3 घंटे तक लेप्रोटॉमी के तहत स्थिर रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है। लिम्फोसाइट्स एचईवी, रोल का पालन करते हैं, और आसपास के स्ट्रोमा में स्थानांतरित हो जाते हैं, और फिर लिम्फ केशिकाओं में स्थानांतरित हो जाते हैं। हमने अवलोकन अवधि के भीतर स्ट्रोमा में माइग्रेट किए गए लिम्फोसाइट्स के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित और मूल्यांकन किया।
फ्लोरोसेंट लिम्फोसाइट्स की पर्याप्त खुराक के इंजेक्शन के बाद, आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स HEVs का पालन करना शुरू कर देते हैं और एंडोथेलियम में लगभग 1 घंटे में स्ट्रोमा में स्थानांतरित हो जाते हैं। अधिकांश स्ट्रोमा के भीतर चलते हैं, जबकि अन्य लगभग 2-3 घंटे में लिम्फ केशिकाओं में स्थानांतरित हो जाते हैं। इस अध्ययन में पूर्व वीवो को अच्छी तरह से विकसित फ्लोरेसेंस लेबलिंग के परिणामस्वरूप उच्च तीव्रता हुई और यह हमें बहुत गहरे क्षेत्र की लिम्फोसाइट गतिशीलता का निरीक्षण करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, एक अलग तरह की फ्लोरेसेंस लेबलिंग का उपयोग करके, हम आसानी से एक साथ विभिन्न प्रकार के लिम्फोसाइट की गतिशीलता का निरीक्षण कर सकते हैं। इस आंत-रेखा लिम्फोसाइट माइग्रेशन को हमारी पिछली रिपोर्ट में दिखाए गए FTY720 जैसे कुछ इम्यूनोमोडुलेटर्स द्वारा दमन के लिए नेत्रहीन रूप से स्पष्ट किया जा सकता है।
माइक्रोसर्कुलेटरी सिस्टम का अवलोकन ही बेहद मुश्किल है, और एक आसान मूल्यांकन विधि स्थापित करना वांछनीय है। इस अध्ययन से यह भी पता लगाना संभव हो गया है कि दवा की एक्शन साइट पीयर के पैच में कहां है। विशेष रूप से, FTY720 के पूर्व वीवो प्रशासन ने लिम्फोसाइट्स के लिए कार्रवाई की साइट को केवल लिम्फोसाइट्स तक सीमित करना संभव बनाया लेकिन एंडोथेलियम के लिए नहीं। विशिष्ट लिम्फोसाइट की छंटाई के साथ संयुक्त, अधिक विस्तृत परिणाम प्राप्त किए जाएंगे।
चित्रा 1: वक्ष वाहिनी का पर्दाफाश करने और कैनुलेशन करने की प्रक्रिया। पेरिटोनम को नेलिट्यूडिनली काटने के बाद, पेट को कपाल से ले जाकर और पेट महाधमनी के पृष्ठीय दाईं ओर संयोजी ऊतक को विच्छेदन करके छाती की नली को उजागर किया जा सकता है। डायाफ्राम के आसपास संयोजी ऊतक को चोट को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया जाना चाहिए। छाती की नली को कैनुलेशन के लिए पर्याप्त स्थान बनाने के लिए यथासंभव व्यापक कपाल के रूप में उजागर किया जाना चाहिए और फिर लिम्फ के प्रवाह को रोकने और तरल पदार्थ को बनाए रखने के लिए डायाफ्राम के नीचे 3-0 रेशम सीवन द्वारा लिगामेंट किया जाना चाहिए। दूधिया लिम्फ तरल पदार्थ लिम्फ डक्ट के माध्यम से दिखाई देता है, जहां कैथेटर डाला जा सकता है। चूहे की छाती वाहिनी को एक चिकनी कैनुलेशन सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा तनावपूर्ण होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: वक्ष वाहिनी लिम्फोसाइट्स (टीडीएलएस) एकत्र करने के लिए पूरी सेटिंग की एक छवि। चूहों को बॉलमैन के पिंजरों में बनाए रखा जाता है और टीडीएलएस को प्रत्येक शीशी में कैनुलेशन ट्यूब के माध्यम से एकत्र किया जाता है। शीशियों बर्फ पर सेट कर रहे है और हर 12 घंटे की जगह ताजा लिम्फ तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए । चीनी से लदी खारा निर्जलीकरण को रोकने के लिए लगभग 3 एमएल/एच की दर से एक सिरिंज पंप का उपयोग कर एक सिलिकॉन ट्यूब के माध्यम से प्रशासित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: चूहे को संज्ञाहरण मशीन से जुड़े माइक्रोस्कोप के चरण पर रखा जाता है, और एक फ्लोरोसेंट पदार्थ या फ्लोरोसेंटी-लेबल लिम्फोसाइट्स को आंतरिक जुगुलर नस(ए)के माध्यम से वेनस कैथेटर से इंजेक्ट किया जाता है। आंतों के पथ का अवलोकन क्षेत्र धीरे-धीरे दो लुढ़का हुआ कपास गेंदों के बीच तय किया गया था। श्वसन आंदोलनों द्वारा कंपन से बचने के लिए आंतों की नली को ट्रंक से दूर तय किया गया था। प्रेक्षण अवधि(बी)के दौरान आंत के सूखने से रोकने के लिए लुढ़का हुआ कपास की गेंदों को फॉस्फेट बफर नमकीन में भिगोया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: शारीरिक स्थिति(ए)में पीयर के पैच की सूक्ष्म छवि। वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का नाभिक नीला दाग रहा है। रक्त प्लाज्मा लाल है, और रक्त प्रवाह अन दाग कोशिकाओं के प्रवाह से पता चला है। आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स (दाग हरे) उच्च एंडोथेलियल वेणुल्स(बी)का पालन करते हुए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां हमने भोले आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने और चूहे के पीपीएस में उनके प्रवास को देखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। इन प्रक्रियाओं से पता चल सकता है कि लिम्फोसाइट्स पीपीएस के माइक्रोवैस्कुलेचर में कैसे चलते हैं और सामान्य या औषधीय स्थिति के तहत नेत्रहीन उनकी गतिशीलता की तुलना करना संभव बनाते हैं। इन गतिशीलता के प्रत्यक्ष अवलोकन में कुछ दवाओं द्वारा प्रतिरक्षा संशोधन के लिए सुराग प्राप्त करने के लिए बहुत योग्यता है, हालांकि अवलोकन अवधि केवल कुछ घंटों तक सीमित है।
हमने तरीकों में कुछ सुझावों का उल्लेख किया। उनमें से, सबसे नाजुक प्रक्रियाओं में से एक यह है कि ऑपरेटर को वक्ष वाहिनी को जल्दी और ठीक से कैनुलेट करना चाहिए। यदि किसी ऑपरेशन में लंबा समय लगता है और इसमें अनावश्यक क्षति होती है, तो महत्वपूर्ण रक्तस्राव और सूजन होती है, जिसके परिणामस्वरूप कनेक्टिव ऊतक के एडीमा और वक्ष वाहिनी की बाधा के कारण टीडीएल संग्रह में कमी आती है। हम एक छोटे से अत्याधुनिक के साथ कैंची का उपयोग कर छाती वाहिनी पर एक छोटा सा चीरा बनाने के बाद ट्यूब cannulate करते थे । हालांकि, यह प्रक्रिया लिम्फ को निकालने के कारण कैनुलेशन साइट में हस्तक्षेप करती है। इसलिए, अब हम छाती की नली में कटौती नहीं करते हैं; बल्कि, हम इसे एक तेज धार के साथ वार करते हैं। यह विधि कैनुलेशन को आसान बनाती है और सफलता दर को बढ़ाती है। इसके अलावा पेट की सीमित गुहा के कारण छाती की नली में चीरा साइट बहुत महत्वपूर्ण है। यदि चीरा साइट डायाफ्राम के बहुत करीब है, तो कैनुलेशन ट्यूब का घुमावदार हिस्सा डायाफ्राम के खिलाफ टक्कर देगा। यदि यह डायाफ्राम से बहुत दूर है, तो कौडल थोरेसिक डक्ट के लिम्फ प्लेक्सस के कारण निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को गहराई से कैनुलेट करना भी मुश्किल है। यहां तक कि अच्छे कैनुलेशन के मामलों में, कैनुलेशन ट्यूब को आसानी से फाइब्रिन गठन द्वारा किया जा सकता है। इस प्रकार, हम समय-समय पर धीरे-धीरे हेपरिन के साथ ट्यूब को फ्लश करने की सलाह देते हैं।
सीएलएसएम में हाल की प्रगति ने पिछले अध्ययन11की तुलना में वास्तविक समय में केंद्रित क्षेत्र का अधिक स्पष्ट रूप से और ठीक रूप से निरीक्षण करना संभव बनाया । अब हम अपनी प्रयोगशाला में सीएलएसएम का उपयोग करते हैं, लेकिन हम मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोसर्कुलेशन का अधिक स्पष्ट रूप से निरीक्षण कर सकते हैं। यद्यपि प्रोटोकॉल में तकनीकी प्रगति के साथ-साथ कई बिंदुओं में संशोधन की आवश्यकता होती है, लेकिन यह ब्याज12, 13के अंग के स्थानीयकृत क्षेत्र का अवलोकन करने में सक्षम बनाता है।
योग्यता और विधि की कुंजी यह है कि इसमें प्राप्तकर्ता जानवरों से लिम्फोसाइट्स को अलग करना, उन्हें विट्रो में किसी भी प्रकार के यौगिकों का उपयोग करके इनक्यूबेटिंग करना और प्राप्तकर्ता जानवरों में उनके इंजेक्शन के बाद उन्हें देखना शामिल है। इससे अकेले लिम्फोसाइट्स के प्रभावों को स्पष्ट करना संभव हो जाता है। इसके विपरीत, यदि हम लिम्फोसाइट्स के अलावा अन्य कोशिकाओं पर किसी भी प्रकार के यौगिकों के प्रभावों को स्पष्ट करना चाहते हैं, जैसे संवहनी एंडोथेलियम, हम प्राप्तकर्ता जानवरों को किसी भी प्रकार के यौगिकों के साथ इलाज कर सकते हैं और नियंत्रण लिम्फोसाइट्स के इंजेक्शन के बाद उनका निरीक्षण कर सकते हैं। चूहों का उपयोग कर एक ही बातें स्पष्ट करने के लिए, हम सशर्त आनुवंशिक रूप से हेरफेर जानवरों को एक के बाद एक बनाना चाहिए । इसके अलावा, विशिष्ट सतह मार्कर का उपयोग करके अलग लिम्फोसाइट्स को छांटने से विशिष्ट प्रकार के लिम्फोसाइट्स की गतिशीलता का अध्ययन करना संभव होगा।
जैसा कि इस अध्ययन के वीडियो में दिखाया गया है, लिम्फोसाइट्स वास्तविक शरीर के संवहनी एंडोथेलियम के माध्यम से अनिश्चित काल तक और बाद में आगे बढ़ते हैं, इसलिए केवल वीवो टिप्पणियों में उपयोग करके उनके व्यवहार पर प्रभाव का मूल्यांकन करना मुश्किल है। इसके अलावा, यदि प्रशासित दवा की कार्रवाई के तंत्र की जांच की जानी है, तो यह मूल रूप से कार्रवाई की प्रत्येक साइट की जांच करने के लिए अनुपयुक्त है। इस अध्ययन की खूबी यह है कि लिम्फोसाइट्स को अलग करके और उन्हें विट्रो में इनक्यूबेटिंग करके वैस्कुलर और लिम्फोसाइट साइड्स पर अलग से औषधीय प्रभावों की जांच की जा सकती है। कम चर का विश्लेषण करना आसान है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को राष्ट्रीय रक्षा मेडिकल कॉलेज से अनुदान और स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय, जापान से असभ्य रोगों पर अनुसंधान के लिए एक स्वास्थ्य और श्रम विज्ञान अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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