Summary
我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。
Abstract
多くの人間の神経疾患は、脳内のニューロンおよびグリア細胞の変性によって引き起こされる。薬理学的および他の治療戦略の制限により、現在、負傷または病気の脳に対して利用可能な治療法はありません。細胞置換は、神経変性状態の有望な治療戦略として表示されます。.今日まで、神経幹細胞(NSC)は、胎児組織、ヒト胚細胞(ES)または人工多能性幹細胞(iPSC)から正常に生成されています。脱分化のプロセスは、多能性幹細胞の生成につながる新しいヒトGPI結合糖タンパク質の活性化によって開始された。これらの血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)は、明視野および免疫蛍光顕微鏡で示されるように、神経表現型を有する細胞に インビトロで 分化する。電子顕微鏡によるこれらの細胞の超構造解析は、その原始構造、ならびに神経細胞様形態および細胞内特性を確認する。
Introduction
基礎的および前臨床幹細胞研究法の開発は、神経疾患に対する幹細胞ベースの治療法の臨床応用を促進する。このような潜在的な治療は、機能回復につながるヒト神経細胞の生成方法に大きく依存する1.
神経幹細胞(NSC)は、成人神経新生と呼ばれるプロセスで、生涯を通じて新しいニューロンに自己更新し、分化します。非常に制限された脳領域だけが、成人期に新生児ニューロンを生成する能力のあるNSCを抱えています。このようなNSCは、学習や記憶に関与する成熟したニューロンを生み出し、失われたニューロンや損傷したニューロンを置き換えることができます。残念ながら、これらのNSCは制限された量で存在し、この限られた神経新生は若年発達中に急速に減少する2。したがって、神経細胞の他の供給源は、細胞治療の目的で考慮されなければならない。
変性神経疾患は、標準的な薬理学的アプローチを用いて治癒することは困難である。多くの薬用神経疾患を受け入れるための新しい治療戦略は、病気および負傷した組織の細胞置換療法に基づいています。NSC移植は、損傷した細胞を置き換え、有益な効果を提供することができます。神経細胞置換の他の供給源としては、哺乳類胚盤胞3の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(ESC)や、ESCのような広範な自己再生能力を有し、様々な細胞系統に分化することができるiPSC4が含まれる。NSCはまた、多能状態5を回避するヒト線維芽細胞からの直接再プログラミングによって生成することができる。
細胞補充療法は依然として困難な課題です。ESC、胎児、またはiPSは、多くの不治の神経疾患を治療するための神経細胞の生成源となり得るが、損傷した組織の自己成人SC細胞置換は、免疫学的、倫理的および安全上の懸念を回避するより良い代替手段である。
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTENのリン酸化による抗体架橋によるヒトGPI結合タンパク質の活性化は、血液前駆細胞の脱分化および血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)6の生成を開始する。これらの細胞は、明視野、免疫蛍光、透過型電子顕微鏡(TEM)解析によって確認されたニューロン細胞に対するインビトロで分化します。
本研究では、GMフリーのBD-PSCの生成と、ニューロン表現型を有する細胞への再分化の成功について述べている。
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Protocol
実験を行う際に倫理承認を得た。
1. ヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の単離
- すべてのドナーが、制度ガイドラインに従って血液を撤回する前に、インフォームド・コンセントに署名したことを確認してください。
- 標準的なプロトコルに従って訓練された医療関係者によって健康なドナーから血液の30 mLを取る。
- 密度勾配媒体によって PBMNC を分離します。リン酸緩衝塩水(PBS)で希釈した1:1の血液25mLの培地10mL、300xgの遠心分離機を30分間使用してください。
- プラズマと密度勾配媒体の間の相間層をピペット処理により分離する。5 mLの無菌PBSと遠心分離機で10分間300 x g で単離した細胞を洗浄し、2回繰り返します。
- カウントチャンバーを使用して標準的な方法で細胞の数を数えます。
2. PBMNCの表面上の抗体架橋によるヒトGPIアンカー糖タンパク質の活性化
- 6 x 106個 の単核細胞(MNC)を15 mLチューブに入れ、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体(30μg/mL)を30分間PBSで30分間、37°Cで1%の牛血清アルブミン(BSA)で培養して抗体架橋を行う。
- インキュベーション培地を、10%の胎児ウシ血清(FBS)で補ったイコーブの修飾ダルベッコ培地に置き換えます。
- 細胞を15 mLポリスチレンチューブで成長させ、37°Cでインキュベーターに入れ、8〜10日間(揺れせずに)5%CO2を入れます。D5では、15 mLチューブに10%FBSを加えたアイスコブの培地を1~2mL追加します。
3. 新たに生成された分化細胞のソート
- 自動細胞カウンター(18 μL細胞懸濁液+ 2 μL蛍光色素)または計数チャンバー内の細胞を数えます。
- 遠心分離機培養細胞懸濁液(5-7 x 106)で300xgで10分間、滅菌パスツールピペットで得られた上清を吸引した。
- 細胞ペレットを、予冷したPBS pH 7.2、0.5%BSAおよび2 mM EDTAの90 μLで再懸濁します。
- 細胞懸濁液にCD45正のナノサイズの磁気ビーズ(80 μL)を加え、氷の上で15分間インキュベートします。
- PBSバッファーと遠心分離機を2 mL 300 x g で10分間加えて細胞を洗浄します。
- 500 μL の PBS バッファーで細胞を再懸濁します。
- 500 μL の事前冷却 PBS バッファーでカラムを洗浄し、磁場に入れます。
- カラムに細胞懸濁液を置き、500μLのPBSバッファー(2回)とCD45陰性細胞を含む遠心分離機流で洗浄します。1%BSAを補充アイスコブの培地でそれらを収集します。
- 計数チャンバー内のセルをカウントします。
4. 新たに生成した幹細胞の神経分化のための細胞培養皿の準備
- 培養血管にポリ-L-オルニチンとラミニンを塗布し、神経細胞を増殖させます。
- ガラスカバーリップを4ウェルプレートに入れ、ddH2Oで1:5希釈ポリL-オルニチン(0.1mg/mL)を37°Cインキュベーターに1時間置きます。その後、ddH2Oで洗浄します。
- ラミニン(0.5-2.0 mg/mL)をゆっくりと解凍し、カバーリップの上部に追加します。37°Cで2時間インキュベートする。
- D-MEM/F12の49 mL、N2サプリメントの500 μL、400 μLの非必須アミノ酸(NEAA)、20 ng/mL最終濃度(100 μg/mLストック溶液から調製)での基本的なFGF溶液、および2ng/mLの最終濃度でヘパリンからなる神経誘導培地N2を準備する。
- ピペット処理により余分なラミニンを除去し、培養皿に神経培地N2を加えます。
神経細胞の分化血細胞の培養
- 培養BD由来CD45は、ラミニン/オルニチンコーティングガラスカバーリップ上で、37°C及び5%CO2のインキュベーターでN2培地で2日間培養し、新たにBD生成細胞の神経細胞分化を開始した。
- 神経基底培地の48 mLからなる神経分化培地の培養細胞はさらに、L-グルタミンの500 μL、B27サプリメントの1 mL、NEAAの500 μL、 50 μL の組換えヒトグリア由来神経栄養因子 (GDNF) を PBS/0.1% BSA で 5 μg/250 μL、50 μL の組換えヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF) を 5 μg/200μL で PBS/0.1% BSA/500 μL で 50 mLプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。
血液由来神経細胞の免疫蛍光顕微鏡分析
- 上記のように細胞を16日間培養し、培地を取り出す。
- 75 mLの無菌水、4gのパラホルムアルデヒドからなる、あらかじめ温め込まれた固定液をインキュベートする。必要に応じて10 N NaOHを加え、溶液がクリアになるまでかき混ぜます。その後、10x PBSの10mL、MgCl2の0.5mL、0.5 M EGTAの2 mL、および4gのスクロースを加えます。 6 N HClでpH 7.4に触れ、15分間100mLの無菌水を持ち込む、とMarchenkoら7.
- 固定剤を捨て、毎回5分間、細胞を3回洗浄します。すぐに作りたての0.3%トリトンX溶液を加え、5分間細胞を透過させます。PBSで3回洗浄し、PBSと5%BSAで作られたブロッキング溶液を追加します。
- ロッカープレートの室温で細胞を1時間ブロックします。
- 1%BSA/PBSで適切な抗体希釈を調製し、ロッカープレート上の抗体希釈液を室温で1.5時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、それぞれ5分間、DAPIで細胞をインキュベートし、顕微鏡上で視覚化するために取り付け培地でカバーリップを取り付けます。
注: この実験で使用した直接標識抗体は、一覧の 一覧は、材料表に記載されています。
7. 新たに発生した細胞の透過型電子顕微鏡解析
- 8ウェルチャンバースライドでTEM用セルをシードします。
- 37°Cで1時間、2%OsO4で2%OsO4で後固定し、暗闇の中で2%ウラニル酢酸を2時間30分間暗に汚します。
- 最後に、蒸留水で細胞をすすい、エタノールで脱水し、エポキシ樹脂に一晩埋め込みます。翌日、樹脂硬化のため70°Cのオーブンに72時間移します。
- 埋め込まれた細胞培養物をチャンバースライドから取り外し、接着してアルルディートブロックにします。
- シリアル半薄切片(1.5 μm)を機械で切り、ガラススライドに取り付け、1%トルイジンブルーで軽く汚します。
- 選択した半薄いセクションをaralditeブロックに接着し、凍結(液体窒素中)と解凍を繰り返してガラススライドから取り外します。
- 超薄いセクション(0.06-0.08 μm)を機械で準備し、さらにクエン酸鉛と対照的に。
- 電子顕微鏡をデジタルカメラで撮影。
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Representative Results
この新しいGMフリー法は、ヒトゲノムに直接作用することなく、血液前駆細胞を最も原始的な状態に戻すことができるという証拠を提供する。
我々は以前、GPI結合タンパク質特異的抗体架橋が、WNT、NOTCH、C-Kitなどの高度に保存された発達関連遺伝子のPLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTENアップレギュレーションを介して開始することを示し、HSCの生成への第一歩とBD-PS-PSの第2段階につながる脱分化のプロセスを開始した。
活性化されたMNC培養物は、CD45マイクロビーズを用いて免疫磁気選別を行った。この方法では再プログラムできない成熟した血液細胞(例えば、CD45陽性細胞)をカラムに保持し、再プログラムされた細胞を含む負の分画(CD45陰性細胞)を種々の神経系統細胞の生成に用いた。
まず、光とTEMを用いて、末梢BD分解細胞の形態学的側面を研究しました。 図1に示すように、ヒトMNCの特異的GPIアンカー型糖タンパク質抗体架橋は、細胞の新たな集団を着実に増殖させる(図1A)。これらの細胞をTEMで分析した。BD-分化細胞は、サイズが小さく、非成熟型顆粒細胞の特性を示し、ESCsと同様に、凝縮クロマチンを有するオルガネラおよび大きな核を徐々に少なくする(図1B)。非治療の文化は、徐々に消失する傾向を示した。
BD-CD45陰性細胞は、2段階で神経分化を行った。我々は、神経細胞分化培地中の培養後のN2培地において、CD45陰性細胞をポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆培養プレートに2日間播種することにより、神経系統に対する分化を開始した。ブライトフィールドの写真は、BD生成幹細胞のニューロン分化を開始すると、それぞれ4日目、8日目、10日目、10日目、14日目、30日目に取得された。
新たに生成された細胞の標的分化を開始してから4日後に、長い分岐構造を持つ最初の神経細胞様細胞を検出することができた。D2からD30への形態変化を、影響を含むより複雑な構造で観察し、培養期間を通じて神経系統への分化に向けた活発なプロセスを示唆する(図2)。16日間神経培地で培養した後の再分化細胞の神経細胞の特徴を確認するために、細胞を以前のプロトコル7に従って固定し、免疫細胞化学(ICC)を、抗体検出を用いてネシン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、微小管関連タンパク質2(MAP2)およびニューロン特異的クラスIII β-tubulin(Tuj1)を用いて行った。
GFAPは、成熟アストロサイトの主な中間フィラメントを表すアストロサイトにおける細胞骨格の一部を構成するタンパク質である。 図3に示すように、GFAPに対する抗体は、新たに生成された神経細胞においてこれらの構造を認識し、BD-PSCがヒトアストロサイト9に対して再分化できることを確認する。
MAP2は、管状に結合し、微小管を安定化させる細胞骨格タンパク質です。軸索、樹状突起および細胞体内で発現し、この発現は組織および発達的に特異的である。免疫蛍光顕微鏡の結果は、再分化した細胞10におけるこのタンパク質の発現を確認する。
Tuj1は典型的な神経細胞マーカーである。その機能は、神経細胞の体内および軸索における微小管状を安定化させることである。軸索輸送11にも関係している。新たに再分化した細胞は、ここで説明した条件でニューロン分化を開始した際にD16におけるこのタンパク質の発現を明確に確認した。
ネスチンは、最初にNSCで特徴付けられており、より分化された神経細胞からニューロン前駆細胞を区別する中間フィラメント(IF)タンパク質12 に属する神経上皮幹細胞タンパク質を表す。これらのIFタンパク質は、主に神経細胞で発現し、軸索の放射状成長に関与するが、多くの追加組織にも存在する。主にNSCのマーカーとしてのネスチンは、D16のBD再分化細胞の場合と同様に、特定の神経系に分化する経路上にある細胞において弱く発現している。
図1:脱分化(多能性)幹細胞の生成(A) フィコール単核細胞を、10%FBSを添加したイスコベ培地で増殖させた。活性化培養細胞の顕微鏡写真を、それぞれ1日目、5日目、10日目に撮影した。非活性化MNCを対照として研究した。スケールバー:培養時間を通じて新たに生成された細胞の 50μm(B)TEM 分析は、成熟細胞(D1)のオルガネラが徐々に消失し(D8)、ESCに似た完全に分化した細胞の生成につながることを示している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:BD-PSCの神経再分化(A)BD分解細胞をオルニチン/ラミニンコーティング培養皿に入れ、プロトコルに記載されているように30日間培養した。顕微鏡写真は、ニューロン分化条件で成長した後、それぞれ4日目、8日目、10日目、14日目、30日目に撮影されます。培養中のほとんどの細胞は、形態を小さな球形からより大きく細長い形状に変え、場合によっては分岐細胞に変化した。スケールバー:100μm(B)BD分解細胞を神経培地で16日間増殖させ、グルタルアルデヒドおよびEM分析で固定したプロトコルセクションに記載されるように行った。 これらの細胞の細胞体およびプロセスは、小器官および細胞骨格の観点から未分化細胞のそれよりも高い複雑さを示し、大まかな小胞体の積層水槽の高密度およびアクチンフィラメントの豊富な束(a,b)を示した。未分化BD細胞とは異なり、分化培地で増殖する細胞は、しばしば細胞間接触を確立した。これらの特殊な接触のいくつかは、細胞体(c)を含み、他のものは神経突起のような方法で細胞プロセスを含んでいました(d)。スケールバー :(a)20μm。(b-d)、500nm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:新たに生成した神経細胞の免疫形成BD分解細胞を16日間のプロトコルに記載されているように培養し、免疫細胞化学分析を、ネチン、GFAP、MAP2およびTuj1の神経マーカーに対する抗体を用いて行った。図示は、DAPIを核染色として免疫蛍光画像を伴う再分化細胞の明視野顕微鏡写真であり、関連する抗体による染色である。描かれているのは、特定の線に特有の神経マーカー特性の1つを表す特定の集団を示すフィールドである。スケールバー:100 μm。コントロールは 補助図 1に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:BD分解細胞制御 BD由来の未分化細胞は、プロトコルに記載されているように10%FBSを添加したIscoveの改変されたダルベッコの培地で培養し、GFAP、Tuj1およびMAP2に対する抗体で染色した。DAPIは核染色に使用されました。スケールバー:100 μm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で説明されたヒト細胞をリプログラミングする非GM法は、非操作ヒト末梢血から得られた自己再生PSCの 元生体 生成および拡張につながる脱分化のプロセスを開始するGPI結合ヒト膜糖タンパク質の背後にあるシグナル伝達の核活性化に膜に基づいている。これらの細胞は、適切な培地で培養した場合には、異なる生殖層6に属する細胞への再分化が可能である。
この研究で発表されたデータは、神経分化培地で培養したGMフリーのBD-PSC細胞が全く異なる表現型を獲得し、細長い形状を有し、オルガネラの発達が高まり、細胞間のより複雑な相互作用を確立したことを示している。また、ここで説明した条件を用いた再分化は、種々の神経系統に対する神経分化を意味する。
再分化研究で使用するために最適な数と再プログラム化された細胞の最高の品質を得るために、新鮮なMNC製剤は、凍結MNC製剤と比較して有利である可能性があります。この方法では再プログラムできない末端分化細胞からBD-PSCを分離した免疫磁気選別の方法は不完全であり、この処置を繰り返す必要があり、これは細胞にとって非常にストレスであり、早期死亡をもたらす。
プロトコル内の重要なステップは、記載された方法で得られる MNC の数と品質に関連しています。神経分化メディアの修飾と培養時間は、BD-PSCの分化可能性を改善し、特定の種類の神経細胞の生成につながる。
この方法の制限は、この方法では細胞株を生成することができないため、これらの再プログラムされた細胞の非催奇形性の性質である。多能性の最終段階に到達すると、多能性の細胞はほとんど静止し、より多くのBD-PSCを得るためにMNCの新しい部分を再び分解する必要があります。
ここで説明するリプログラミングは、血液前駆細胞の表面上での抗体架橋活性化に依存する。このパラダイムは、GM法と比較した場合の臨床安全性に関して、多くの潜在的な利点を提供します。神経組織の生成のための自家幹細胞を達成するという目標は、最小限の エキビボ 操作によって達成することができます。したがって、この細胞療法は神経学における効率的かつ安全な臨床アプローチの有望な候補となり得る可能性を強く示唆する。
パーキンソン病、アルツハイマー病、脳虚血は、ヨーロッパおよび世界の社会にとって最も社会的、経済的負担が高い疾患の一つです。高齢化に伴い神経変性疾患の負担が増大し、社会経済的に重要な問題となり、その問題に対する答えが絶望的に必要とされる。提示された方法は、現在難治性の神経疾患の治癒のための希望を保持している適切な自家幹細胞集団を生成するための簡単で費用対効果の高い手順を利用することにより、非侵襲的な治療戦略のための新しい道を開きます。
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Disclosures
対応する著者は、彼女が新しいヒトGPIにリンクされたタンパク質に関連する特許保有者であると宣言し、彼女はACA CELLバイオテックで共同設立し、働いています。他の著者は、彼らが利益相反を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
ライナー・サフリッチ博士の記憶に捧げ。
著者らは、比較神経生物学研究所、バレンシア大学CIBERNED、バレンシア、スペイン、プロメテオ・グラント・フォー・エクセレンス・リサーチ・グループPROMETEO/20190/077の研究資金によって支援された比較神経生物学研究所でEM実験と分析を行ったホセ・マヌエル・ガルシア=ヴェルドゥーゴとビセンテ・ヘランツ=ペレスに特に感謝している。この作品の残りの部分は、ACA CELLバイオテクノロジーGmbHハイデルベルク、ドイツによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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