Summary
In diesem Artikel beschreiben wir die Isolierung von aus Rhesusaffen gewonnenen Fettstammzellen (ADSCs) unter Verwendung eines enzymatischen Gewebeverdauungsprotokolls. Als nächstes beschreiben wir die ADSC-Proliferation, die Zellablösung, Zählen und Plattieren umfasst. Schließlich wird die ADSC-Differenzierung unter Verwendung spezifischer adipogener Induktoren beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir Färbetechniken, um die Differenzierung zu bestätigen.
Abstract
Fettgewebe bietet eine reiche und zugängliche Quelle für multipotente Stammzellen, die sich selbst erneuern können. Diese aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs) bilden ein konsistentes ex vivo Zellsystem, das funktionell dem von in vivo Adipozyten ähnelt. Der Einsatz von ADSCs in der biomedizinischen Forschung ermöglicht die zelluläre Untersuchung der metabolischen Regulation und Funktion des Fettgewebes. Die ADSC-Differenzierung ist für eine adäquate Adipozytenexpansion notwendig, und die suboptimale Differenzierung ist ein wichtiger Mechanismus der Fettdysfunktion. Das Verständnis von Veränderungen in der ADSC-Differenzierung ist entscheidend für das Verständnis der Entwicklung von metabolischen Dysfunktionen und Erkrankungen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle ergeben, wenn sie befolgt werden, reife Adipozyten, die für mehrere In-vitro-Funktionstests zur Beurteilung der ADSC-Stoffwechselfunktion verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Assays zur Messung der Glukoseaufnahme, Lipolyse, Lipogenese und Sekretion. Rhesusaffen (Macaca mulatta) sind physiologisch, anatomisch und evolutionär dem Menschen ähnlich und als solche wurden ihre Gewebe und Zellen ausgiebig in der biomedizinischen Forschung und zur Entwicklung von Behandlungen verwendet. Hier beschreiben wir die ADSC-Isolierung mit frischem subkutanem und omentalem Fettgewebe, das von 4-9-jährigen Rhesusaffen gewonnen wird. Fettgewebeproben werden enzymatisch in Kollagenase verdaut, gefolgt von Filtration und Zentrifugation, um ADSCs aus der stromalen Gefäßfraktion zu isolieren. Isolierte ADSCs werden in stromalen Medien proliferiert, gefolgt von etwa 14-21 Tagen Differenzierung unter Verwendung eines Cocktails aus 0,5 μg / ml Dexamethason, 0,5 mM Isobutylmethylxanthin und 50 μM Indomethacin in stromalen Medien. Reife Adipozyten werden nach etwa 14 Tagen der Differenzierung beobachtet. In diesem Manuskript beschreiben wir Protokolle für die Isolierung, Proliferation und Differenzierung von ADSC in vitro. Obwohl wir uns auf ADSCs aus Rhesusaffen-Fettgewebe konzentriert haben, können diese Protokolle für Fettgewebe verwendet werden, das von anderen Tieren mit minimalen Anpassungen gewonnen wird.
Introduction
Fettgewebe besteht aus einer heterogenen Mischung von Zellen, überwiegend reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion einschließlich Fibroblasten, Immunzellen und aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs)1,2,3. Primäre ADSCs können direkt aus weißem Fettgewebe isoliert und zur Differenzierung in Adipozyten, Knorpel- oder Knochenzellen angeregt werden4. ADSCs weisen klassische Stammzelleigenschaften wie die Aufrechterhaltung der Multipotenz in vitro und die Selbsterneuerung auf; und haften an Kunststoff in Kultur 5,6. ADSCs sind aufgrund ihrer Multipotenz und der Fähigkeit, mit nicht-invasiven Techniken leicht in großen Mengen geerntet zu werden 7, von großem Interessefür den Einsatz in der regenerativen Medizin. Die adipogene Differenzierung von ADSCs erzeugt Zellen, die funktionell reife Adipozyten nachahmen, einschließlich Lipidakkumulation, insulinstimulierter Glukoseaufnahme, Lipolyse und Adipokinsekretion8. Ihre Ähnlichkeit mit reifen Adipozyten hat zur weit verbreiteten Verwendung von ADSCs zur physiologischen Untersuchung der zellulären Eigenschaften und der metabolischen Funktion von Adipozyten geführt. Es gibt zunehmend Hinweise auf die Idee, dass die Entwicklung von metabolischen Dysfunktionen und Störungen auf zellulärer oder Gewebeebene ihren Ursprung hat 9,10,11,12. Eine optimale ADSC-Differenzierung ist für eine ausreichende Fettgewebeexpansion, eine ordnungsgemäße Adipozytenfunktion und eine effektive metabolische Regulation erforderlich13.
Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle sind einfache Techniken, die Standardlaborgeräte und grundlegende Reagenzien verwenden. Das Manuskript beschreibt zunächst das Protokoll zur Isolierung von primären ADSCs aus frischem Fettgewebe mittels mechanischer und enzymatischer Verdauung. Als nächstes wird das Protokoll für die Proliferation und das Passaging von ADSCs in Stromamedium beschrieben. Schließlich wird das Protokoll für die adipogene Differenzierung von ADSCs beschrieben. Nach der Differenzierung können diese Zellen für Studien verwendet werden, um den Adipozytenstoffwechsel und die Mechanismen der Dysfunktion besser zu verstehen. Die Protokolle zur Bestätigung der adipogenen Differenzierung und des Lipidtröpfchennachweises unter Verwendung von Ölrot-O und Bor-Dipyrromethen-Färbung (BODIPY) werden ebenfalls beschrieben. Die Details dieser Protokolle konzentrierten sich auf primäre ADSCs, die aus frischem omentalem Fettgewebe von Rhesusaffen isoliert wurden. Wir und andere haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich ADSCs aus Rhesusaffen subkutanen und omentalen Fettgewebedepots zu isolieren14,15. Für die gleiche Menge an verwendetem Gewebe haben wir beobachtet, dass subkutanes Fettgewebe dichter und zäher ist und im Vergleich zu omentalem Fettgewebe weniger Zellen aus der Verdauung liefert. Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um ADSCs aus menschlichen Fettproben zu isolieren16.
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Protocol
Alle erhaltenen Gewebe und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Louisiana State University Health Sciences Center genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (NIH-Publikation Nr. 85-12, überarbeitet 1996) durchgeführt.
1. Herstellung von Puffern und Lösungen
- Bereiten Sie eine sterile 5-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (5-PBS) vor, indem Sie 5% Penicillin / Streptomycin (Pen/Streptokokken) und 0,25 μg / ml Pilzhemmer zu 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie eine sterile 2-PBS-Waschpufferlösung (2-PBS) durch Zugabe von 2% Pen/Streptokokken und 0,25 μg/ml Pilzinhibitor in 1x PBS vor. Waschpuffer können bei 4 °C für den späteren Gebrauch gelagert werden und müssen innerhalb von 4 Wochen verwendet werden.
HINWEIS: 5-PBS-Puffer wird für die Fettgewebesammlung und das anfängliche Waschen verwendet, um eine mögliche Kontamination zu minimieren, da Gewebeproben, die bei der Nekropsie gewonnen werden, in einer nicht sterilen Umgebung gesammelt werden. - Herstellung eines sterilen Kollagenasepuffers (CB) durch Kombination von 0,075% Kollagenase Typ I (125 Einheiten/mg Aktivität), 2% Pen/Streptokokken und 0,25 μg/ml Pilzinhibitor in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit 1% Rinderserumalbumin. CB muss innerhalb von 1 h verwendet werden.
- Bereiten Sie steriles ADSC-Wachstumsmedium mit α-MEM-Puffer vor. Kombinieren Sie 100 ml fetales Rinderserum (FBS), 5 ml 200 mM L-Glutaminlösung, 500 μL 0,25 μg/ml Pilzhemmer und 10 ml Pen/Streptokokkenlösung in 394 ml α-MEM-Puffer. ADSC-Wachstumsmedium kann bei 4 °C gelagert werden und muss innerhalb von 4 Wochen verwendet werden.
HINWEIS: Eine Wärmeinaktivierung von FBS ist nicht erforderlich. - Das sterile ADSC-Differenzierungsmedium wird durch Kombination des oben hergestellten ADSC-Wachstumsmediums und Induktionsmittel hergestellt, um eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml Dexamethason, 0,5 mM Isobutylmethylxanthin und 50 μM Indomethacin zu erreichen.
2. ADSC-Isolierung
- Gewebevorbereitung und Verdauung
- Pipette ~10 mL 5-PBS-Puffer in vier 100 mm Zellkulturschalen.
- Überführen Sie ~50 g Fettprobe in eine der 100-mm-Schalen, die 5-PBS enthalten. Die gesammelte Fettgewebeprobe wird viermal gewaschen, indem sie nacheinander über die vier Kulturschalen mit 5-PBS übertragen wird.
- Die Fettprobe wird in eine saubere 100-mm-Kulturschale überführt und das Fettgewebe mit einer Schere oder zwei sterilen Skalpellen gründlich zerkleinert. Das Zerkleinern ermöglicht die Vergrößerung der Oberfläche für eine effiziente und vollständige enzymatische Verdauung.
- Das gehackte Fettgewebe wird in ein 50 ml konisches Kunststoffröhrchen mit 13 ml CB (1–3 cm Gewebeschnitt pro 15 ml CB) überführt.
- Spülen Sie die Kulturschale mit 2 mL CB und geben Sie das Medium in das 50 ml konische Kunststoffrohr.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten insgesamt 15 ml CB mit Gewebe in einem 50 ml Kunststoffkonischen Röhrchen vorhanden sein. - Pipettieren Sie mehrmals mit einer 25-ml-serologischen Pipette, um die mechanische Gewebeverdauung zu erleichtern.
- Inkubieren Sie das 50 mL konische Kunststoffröhrchen, das Gewebe in CB enthält, auf einer Wippe bei mittlerer Geschwindigkeit bei 37 °C für 30–60 min.
- ADSC-Plattierung für Kultur
- Fügen Sie 10 ml ADSC-Wachstumsmedium in das 50-ml-Röhrchen mit Gewebe hinzu, um die Enzymaktivität zu neutralisieren. Pipettieren Sie mehrmals mit einer 25-ml-serologischen Pipette, um Fettgewebeaggregate zu trennen.
- Die flüssige Portion wird in ein neues steriles 50 ml konisches Röhrchen überführt, wobei die Feststoffe zurückbleiben. Waschen Sie das ursprüngliche 50-ml-Röhrchen 3 Mal mit ~ 7 ml 2-PBS-Puffer und übertragen Sie den Flüssigkeitsteil in das 50-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich mit einer serologischen Pipette, ohne das Zellpellet zu stören. Nicht dekantieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml 1x Erythrozyten-Lysepuffer (RBC) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min. 5 ml ADSC-Wachstumsmedium in das Röhrchen geben und 5 min bei 500 x g zentrifugieren, dann den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen.
- Fügen Sie 5 ml ADSC-Wachstumsmedium hinzu und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min, um das Zellpellet zu waschen. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL ADSC-Wachstumsmedium und filtrieren Sie durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues steriles 50-ml-Kunststoffkonisches Röhrchen.
- Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 2 ml ADSC-Wachstumsmedium. 4 ml der ADSC-haltigen Suspension aus dem 50-ml-Konikröhrchen in eine sterile 100-mm-Kulturschale überführen.
- Waschen Sie das 50 ml konische Röhrchen 2 mal mit 3 ml ADSC-Wachstumsmedium und geben Sie die Flüssigkeit in die 100-mm-Kulturschale mit ADSCs für insgesamt 10 ml Medium in der Kulturschale.
- Betrachten Sie Zellen unter einem inversen Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung, um nach schwebenden Zellen in den Medien zu suchen, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Zellen sollten in einem CO2-Inkubator bei 37 °C bei 5%CO2 und 100% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten werden.
- Nach 24 h betrachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop, um die Zelladhärenz zu überprüfen. ADSC-Wachstumsmedium von der Platte absaugen und durch 10 ml frisches, warmes (37 °C) Medium ersetzen. Entfernen und ersetzen Sie die Medien alle 48 Stunden, bis die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind (Abbildung 1B).
HINWEIS: Mindestens 10-20 % der Zellen werden nach 24 h anhaften. Überprüfen Sie die Zellkultur auf Anzeichen einer Kontamination wie Zellgranularität, Trübung des Mediums oder Wachstum von Sporen. Sobald die Zellen zu 80% konfluent sind, können sie zur Proliferation und Kryokonservierung geerntet oder zur Differenzierung induziert werden. ADSCs können auf 4-6 Passagen erweitert werden, bevor sie ihre Fähigkeit verlieren, sich effizient zu vermehren oder zu differenzieren.
3. Verbreitung von ADSC
- Zellablösung
- Entfernen Sie das ADSC-Wachstumsmedium mit einem Absauggerät/einer Pipette. Spülen Sie konfluierende ADSCs 2 mal mit 2 ml sterilem PBS bei Raumtemperatur.
- PBS aspirieren und 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA pro 100 mm Kulturplatte hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche mit Trypsin bedeckt ist.
- Inkubationsplatte für ~7 min bei 37 °C in 5%CO2 , bis sich ADSCs gelöst haben. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie die Zellen mechanisch, indem Sie die Trypsinlösung in der Platte gewaltsam pipettieren.
- 2 ml ADSC-Wachstumsmedium zu den gelösten Zellen geben und vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Transferzellen in sterile 50 ml Kunststoffkonische Röhrchen. Um eine maximale Zellerholung zu gewährleisten, spülen Sie die Kulturschale mit weiteren 2 ml ADSC-Wachstumsmedium aus und überführen Sie das Medium in das konische Röhrchen mit abgelösten Zellen.
- Zentrifugieren Sie das 50 ml konische Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um ein Zellpellet zu erhalten. Überstand vorsichtig dekantieren, ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5–6 ml ADSC-Wachstumsmedium pro 1 x 106 Zellen.
- Zellzahl und Beschichtung
- In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 μL Zelllösung von oben und 10 μL 0,04% Trypanblau-Lösung (0,4% Trypanblau verdünnt 1:10 in PBS) verdünnen und Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
- Resuspendieren Sie die gewünschte Anzahl von ADSCs im Wachstumsmedium. Für 100 mm Kulturschale, Platte ~ 3,0 x 105 Zellen in 10 ml ADSC Wachstumsmedien, um 80% Konfluenz in 72 h oder 100% Konfluenz in 96 h zu ermöglichen.
- Betrachten Sie die Schale vor der Inkubation unter einem inversen Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein von suspendierten Zellen sicherzustellen. Halten Sie die Zellen bei 37 °C bei 5%CO2 und 100% relativer Luftfeuchtigkeit.
- Alle 48 h saugen Sie das Wachstumsmedium ab und ersetzen Sie es durch warmes (37 °C) Medium, bis die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind, wie in Abbildung 1B dargestellt.
- Wiederholen Sie die Schritte aus den Abschnitten 3.1 und 3.2, um die gewünschte Anzahl von Passagen zu erhalten.
HINWEIS: Nach den Passagen 5 bis 6 scheinen die Primärzellen eine Seneszenz zu durchlaufen; Ziel ist es daher, die gewünschten Zellzahlen durch Passage 4 zu erhalten.
4. ADSC adipogene Differenzierung
- Aspirieren Sie ADSC-Wachstumsmedium aus geklebten ADSCs, die einen Zusammenfluss von 80% bis 90% erreicht haben.
- Spülen Sie die ADSC-Zellschicht schnell mit sterilem PBS bei Raumtemperatur aus.
- Fügen Sie das ADSC-Differenzierungsmedium hinzu. Für 100 mm Kulturschale 10 ml ADSC-Differenzierungsmedium hinzufügen.
- Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage für ca. 14-21 Tage. Reife Adipozyten werden im Allgemeinen nach 14 Tagen der Differenzierung beobachtet.
- Untersuchen Sie die Zellen unter einem Inverslichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein von Lipidtröpfchen zu bestätigen, wie in Abbildung 2A dargestellt.
5. Nachweis von Adipozyten
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden Färbeprotokolle beschrieben, die für den Nachweis von Lipidtröpfchen in differenzierten Adipozyten verwendet werden, jedoch kann die Immunfluoreszenzfärbung für CD105, einen mesenchymalen Stammzellmarker, auch zur ADSC-Bestätigung verwendet werden.
- Ölrot-O-Färbung
- 0,5% Ölrot-O-Stammlösung in Isopropanol herstellen. Für 20 ml Oil Red O Stammlösung 100 mg Oil Red O in 20 mL Isopropanol auflösen. Die Lösung wird durch einen sterilen Spritzenfilter mit 0,2 μm Membran filtriert.
- Saugen Sie das Differenzierungsmedium vorsichtig ab und waschen Sie die Zellen 2 mal, indem Sie PBS entlang der Seiten des Brunnens hinzufügen, um die Zellmonoschicht nicht zu stören.
- Saugen Sie PBS vorsichtig aus den Zellen ab und fügen Sie genügend neutrales gepuffertes Formalin (NBF, 10%) hinzu, um die Zellschicht abzudecken. Bei Raumtemperatur 30–60 min inkubieren.
- Während des Formalinfixierungsschritts die Ölrot-O-Arbeitslösung vorbereiten, indem Sie 3 Teile Oil Red O-Stammlösung mit 2 Teilen destilliertem Wasser verdünnen. Mischen Sie die Lösung und filtern Sie durch einen sterilen Spritzenfilter mit 0,2 μm Membran. Die Arbeitslösung ist bis zu 2 h stabil.
- NBF vorsichtig absaugen und die Zellschicht schnell (~ 15 s) mit destilliertem Wasser waschen. Fügen Sie genügend 60% Isopropanol hinzu, um die Zellschicht nach dem Absaugen von Wasser zu bedecken, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
- Isopropanol nach 5-minütiger Inkubation vorsichtig absaugen und genügend Oil Red O-Arbeitslösung hinzufügen, um die Zellschicht zu bedecken und bei Raumtemperatur für 10-15 min zu inkubieren.
- Die Ölrot-O-Arbeitslösung vorsichtig absaugen und die Zellschicht mehrmals mit destilliertem Wasser waschen, bis das Wasser klar wird.
- Geben Sie PBS in die Zellkulturschale und untersuchen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop auf Hinweise auf Differenzierung und Vorhandensein von Lipidtröpfchen (Abbildung 2B).
- BODIPY Färbung
- Bereiten Sie 5 mM BODIPY Stammlösung vor, indem Sie 1,3 g BODIPY in 1 ml DMSO auflösen. Bereiten Sie 2 μg/ml BODIPY-Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung 1:25.000 Mal in PBS verdünnen.
- Saugen Sie das Differenzierungsmedium vorsichtig ab und waschen Sie die Zellen 2 mal, indem Sie PBS entlang der Seiten des Brunnens hinzufügen, um die Zellmonoschicht nicht zu stören.
- PBS vorsichtig absaugen und genügend BODIPY-Arbeitslösung hinzufügen, um die Zellschicht zu bedecken und bei 37 °C für 30 min zu inkubieren.
HINWEIS: Schützen Sie die Zellen ab diesem Punkt vor Licht, indem Sie die Platte mit Folie abdecken. - Die BODIPY Arbeitslösung vorsichtig absaugen und die Zellschicht 3 mal mit PBS waschen.
- Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Saugen Sie den Fixierpuffer vorsichtig ab und waschen Sie die Zellen 2 mal, indem Sie PBS an den Seiten des Brunnens hinzufügen, um die Zellmonoschicht nicht zu stören.
- Geben Sie PBS in die Zellkulturschale und untersuchen Sie die Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop auf Hinweise auf Differenzierung und Vorhandensein von Lipidtröpfchen (Abbildung 2C). Bildzellen mit einem FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma Filterset. Die Anregungswellenlänge liegt bei 480 nm mit einer Bandbreite von 40 nm und die Emissionswellenlänge bei 535 nm bei einer Bandbreite von 50 nm. Ein ähnlicher oder geeigneter Filtersatz und ein Mikroskop können verwendet werden.
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Representative Results
Die aus Rhesusaffen-Fettgewebeproben isolierten ADSCs wurden auf Kulturplatten ausgesät und sind in Abbildung 1 dargestellt. Am Tag der Beschichtung sind die Zellen nicht haftend und schwimmen in der Kulturschale, wie in Abbildung 1A gezeigt. Innerhalb von 72 h werden ADSCs zu 80% konfluent und sind bereit für die Adipozytendifferenzierung (Abbildung 1B). ADSCs zeigen starke adipogene Eigenschaften nach chemischer Induktion. Nach 14 Tagen Differenzierung können reife Adipozyten lichtmikroskopisch beobachtet werden (Abbildung 2A). Um die adipogene ADSC-Differenzierung zu bestätigen, können verschiedene Färbungen verwendet werden, um Lipidtröpfchen der differenzierten reifen Adipozyten sichtbar zu machen. Am 14. Tag der Differenzierung wurden die Zellen gefärbt und mit Ölrot O (Abbildung 2B) und BODIPY (Abbildung 2C) zur Visualisierung von Lipidtröpfchen fixiert. Der schwarze Pfeil stellt einen differenzierten Adipozyten dar (Abbildung 2B). Diese Daten deuten darauf hin, dass nach diesem Protokoll ADSCs aus Rhesusaffen-Fettgewebe erzeugt und in reife Adipozyten differenziert wurden.
Abbildung 1: Lichtmikroskopische Aufnahmen von ADSCs am Tag der Beschichtung und bei 80% Zellkonfluenz. (A) Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme stromaler Gefäßzellen am Tag der Beschichtung nach ADSC-Isolierung aus frischem Rhesusaffen-Fettgewebe (10-fache Vergrößerung). (B) Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme von ADSCs bei 80% Konfluenz (20-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahmen von ADSCs am Tag 14 der Differenzierung. (A) Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme am Tag 14 der ADSC-Differenzierung (40-fache Vergrößerung). (B) Repräsentative Mikroaufnahme der Ölrot-O-Färbung am Tag 14 der ADSC-Differenzierung (20-fache Vergrößerung). (C) Repräsentative Mikroaufnahme der Bor-Dipyrromethen-Färbung (BODIPY) am Tag 14 der ADSC-Differenzierung (20-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
ADSC-Isolations-, Proliferations- und Differenzierungsprotokolle sind einfach und reproduzierbar, erfordern jedoch eine sorgfältige Technik, um eine angemessene Isolierung, gesunde Expansion und effiziente Differenzierung zu gewährleisten. Eine sterile Arbeitsumgebung ist für alle Zellkulturexperimente von entscheidender Bedeutung. Bakterien oder Pilze können durch kontaminierte Werkzeuge, Medien oder Arbeitsumgebungen in Zellkulturen eingeführt werden. Pilzkontamination wird durch Sporenwachstum in der Kultur angezeigt, während bakterielle Kontamination durch das Vorhandensein von Trübung des Mediums angezeigt wird. Wir empfehlen, die Biosicherheitswerkbank und alle Pipetten, Flaschen und Werkzeuge vor Gebrauch zu desinfizieren, den laminaren Luftstrom mindestens 15 Minuten vor der Verwendung der Biosicherheitswerkbank einzuschalten und den Schrank und alle Pipetten nach Gebrauch zu desinfizieren, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Außerdem empfehlen wir, die Pipettenspitzen ohne Filter für die Vakuumaspiration zu autoklavieren und den Absauger nach Gebrauch mit sterilem Wasser zu spülen, gefolgt von 70% Ethanol. Eine Kulturschale mit nur Medien kann für einige Tage bei 37 °C und 5 % CO2 in den befeuchteten Inkubator gestellt werden, um die Sterilität der Medien zu überprüfen. Kontaminierte Kulturen sollten 30 Minuten lang gebleicht und verworfen werden. Der Zellkulturinkubator sollte ebenfalls desinfiziert werden.
Ein wesentlicher Unterschied zwischen den Protokollen in diesem Manuskript und den zuvor veröffentlichten ist die Verwendung von BSA in unserem ADSC-Kollagenase-Verdauungspuffer, der die Isolierung reifer Adipozyten und ADSCs ermöglicht. Darüber hinaus verwendet unser Protokoll ein ADSC-Wachstumsmedium, das mit 20% FBS im Vergleich zu 10% FBS ergänzt wird, wie von den meisten Protokollen vorgeschlagen. Wir haben festgestellt, dass Rhesusaffen primäre ADSCs vermehren und sich mit 20% FBS besser differenzieren. Die ADSC-Differenzierung in vitro wird durch linienspezifische Induktionsmittel induziert. Die in diesem Protokoll verwendeten Induktionsmittel sind für die in-vitro-adipogene Differenzierung von ADSCs weitgehend akzeptiert. Im Gegensatz zu vielen zuvor veröffentlichten Protokollen enthält der adipogene Differenzierungscocktail jedoch kein Insulin oder PPARγ-Agonisten. Wir und andere haben dieses Protokoll verwendet, um sowohl Rhesusaffen als auch menschliche ADSCs 14,15,16 erfolgreich zu unterscheiden.
In diesem Protokoll wird die adipogene ADSC-Differenzierung durch Lipidtröpfchendetektion unter Verwendung von Ölrot-O- und BODIPY-Färbetechniken bestätigt. Obwohl diese Färbungen in der Praxis gut bekannt sind, gibt es andere Methoden, die häufig verwendet werden, einschließlich der Durchflusszytometrie zum Nachweis von CD105 zur Identifizierung von ADSCs oder Markern von Endothel- und Immunzellen, um die Reinheit von ADSCs17 zu bestimmen.
Der Einsatz von ADSCs ist ein wertvolles Werkzeug für die regenerative Medizin und die Stoffwechselforschung. Die ADSC-Isolierung und -Proliferation erzeugt eine große Anzahl von Stammzellen, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen und experimentelle Techniken verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die in diesem Protokoll beschriebenen. Ein Hauptverwendungszweck für differenzierte Adipozyten in diesem Protokoll umfasst die Verwendung von metabolischen Assays wie insulinstimulierte Glukoseaufnahme, Lipogenese und stimulierte Lipolyse18. Darüber hinaus können ADSCs in osteogene und chondrogene Linien differenziert und für die nachgelagerte Analyse einschließlich für das Tissue Engineering verwendet werden7.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Die Autoren danken Curtis Vande Stouwe für seine technische Unterstützung. Die Forschung, die der Entwicklung der Protokolle zugrunde liegt, wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus unterstützt (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 und 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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