Summary
في هذه المقالة ، نصف عزل الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك المشتقة من الريسوس (ADSCs) باستخدام بروتوكول هضم الأنسجة الأنزيمية. بعد ذلك ، نصف انتشار ADSC الذي يشمل انفصال الخلايا والعد والطلاء. أخيرا ، يتم وصف تمايز ADSC باستخدام عوامل محفزة للأديبوجينيك محددة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف تقنيات التلوين لتأكيد التمايز.
Abstract
توفر الأنسجة الدهنية مصدرا غنيا ويمكن الوصول إليه من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والتي تكون قادرة على التجديد الذاتي. توفر هذه الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) نظاما خلويا متسقا خارج الجسم الحي يشبه وظيفيا نظام الخلايا الشحمية في الجسم الحي. يسمح استخدام ADSCs في الأبحاث الطبية الحيوية بالتحقيق الخلوي في تنظيم ووظيفة التمثيل الغذائي للأنسجة الدهنية. يعد تمايز ADSC ضروريا لتوسيع الخلايا الشحمية بشكل كاف ، والتمايز دون المستوى الأمثل هو آلية رئيسية للخلل الوظيفي الدهني. يعد فهم التغيرات في تمايز ADSC أمرا بالغ الأهمية لفهم تطور الخلل الأيضي والمرض. ستنتج البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة ، عند اتباعها ، خلايا دهنية ناضجة يمكن استخدامها في العديد من الاختبارات الوظيفية في المختبر لتقييم وظيفة التمثيل الغذائي ل ADSC ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر المقايسات التي تقيس امتصاص الجلوكوز ، وتحلل الدهون ، وتكوين الدهون ، والإفراز. المكاك الريسوس (Macaca mulatta) تشبه البشر من الناحية الفسيولوجية والتشريحية والتطورية ، وعلى هذا النحو ، فقد تم استخدام أنسجتها وخلاياها على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتطوير العلاجات. هنا ، نصف عزل ADSC باستخدام الأنسجة الدهنية تحت الجلد والعظام الطازجة التي تم الحصول عليها من المكاك الريسوس البالغة من العمر 4-9 سنوات. يتم هضم عينات الأنسجة الدهنية إنزيميا في كولاجيناز متبوعا بالترشيح والطرد المركزي لعزل ADSCs عن جزء الأوعية الدموية اللحمية. تتكاثر ADSCs المعزولة في الأوساط اللحمية متبوعة بما يقرب من 14-21 يوما من التمايز باستخدام مزيج من 0.5 ميكروغرام / مل ديكساميثازون ، 0.5 مللي مول إيزوبوتيل ميثيل زانثين ، و 50 ميكرومتر إندوميتاسين في وسط انسجة. لوحظت الخلايا الشحمية الناضجة في حوالي 14 يوما من التمايز. في هذه المخطوطة، نصف بروتوكولات عزل ADSC وانتشاره وتمايزه في المختبر. على الرغم من أننا ركزنا على ADSCs من الأنسجة الدهنية لقرود المكاك الريسوس ، إلا أنه يمكن استخدام هذه البروتوكولات للأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من الحيوانات الأخرى بأقل قدر من التعديلات.
Introduction
تتكون الأنسجة الدهنية من خليط غير متجانس من الخلايا والخلايا الشحمية الناضجة في الغالب وجزء الأوعية الدموية اللحمية بما في ذلك الخلايا الليفية والخلايا المناعية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs)1،2،3. يمكن عزل ADSCs الأولية مباشرة من الأنسجة الدهنية البيضاء وتحفيزها للتمايز إلى خلايا دهنية أو غضاريف أو خلايا عظمية4. تظهر ADSCs خصائص الخلايا الجذعية الكلاسيكية مثل الحفاظ على تعدد القدرات في المختبر والتجديد الذاتي. وتلتزم بالبلاستيك في الثقافة 5,6. تعتبر ADSCs ذات أهمية مهمة للاستخدام في الطب التجديدي نظرا لتعدد فعاليتها وقدرتها على حصادها بسهولة بكميات كبيرة باستخدام تقنيات غير جراحية7. ينتج عن التمايز الغدي ل ADSCs خلايا تحاكي وظيفيا الخلايا الشحمية الناضجة بما في ذلك تراكم الدهون ، وامتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين ، وتحلل الدهون ، وإفراز الأديبوكين8. أدى تشابهها مع الخلايا الشحمية الناضجة إلى الاستخدام الواسع النطاق ل ADSCs للتحقيق الفسيولوجي للخصائص الخلوية والوظيفة الأيضية للخلايا الشحمية. هناك أدلة متزايدة تدعم فكرة أن تطور الخلل الوظيفي والاضطرابات الأيضية ينشأ على المستوى الخلوي أو الأنسجة. مطلوب التمايز الأمثل ل ADSC لتوسيع الأنسجة الدهنية الكافية ، ووظيفة الخلايا الشحمية المناسبة ، والتنظيم الأيضي الفعال13.
البروتوكولات الموصوفة في هذه المخطوطة هي تقنيات مباشرة تستخدم معدات المختبرات القياسية والكواشف الأساسية. تصف المخطوطة أولا بروتوكول عزل ADSCs الأولية من الأنسجة الدهنية الطازجة باستخدام الهضم الميكانيكي والأنزيمي. بعد ذلك ، يتم وصف بروتوكول انتشار وتمرير ADSCs في الوسط اللحمي. أخيرا ، يتم وصف بروتوكول التمايز الأديبوجيني ل ADSCs. بعد التمايز ، يمكن استخدام هذه الخلايا للدراسات لفهم استقلاب الخلايا الشحمية وآليات الخلل الوظيفي بشكل أفضل. كما تم وصف بروتوكولات تأكيد التمايز الأديبوجيني واكتشاف قطرات الدهون باستخدام تلطيخ Oil Red O و boron-dipyrromethene (BODIPY). ركزت تفاصيل هذه البروتوكولات على ADSCs الأولية المعزولة من الأنسجة الدهنية الطازجة لقرود المكاك الريسوس. لقد استخدمنا نحن وآخرون هذا البروتوكول لعزل ADSCs بنجاح من مستودعات الأنسجة الدهنية تحت الجلد و omental14,15. بالنسبة لنفس الكمية من الأنسجة المستخدمة ، لاحظنا أن الأنسجة الدهنية تحت الجلد أكثر كثافة وصلابة وتنتج خلايا أقل من الهضم مقارنة بالأنسجة الدهنية الفموية. تم استخدام هذا البروتوكول أيضا لعزل ADSCs من عينات الدهون البشرية16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأنسجة والإجراءات التي تم الحصول عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مركز العلوم الصحية بجامعة ولاية لويزيانا وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-12 ، المنقح عام 1996).
1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول
- قم بإعداد محلول محلول غسيل ملحي معقم 5-فوسفات (5-PBS) بإضافة 5٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا ) و 0.25 ميكروغرام / مل من المثبط الفطري إلى 1x PBS. قم بإعداد محلول غسيل معقم 2-PBS (2-PBS) عن طريق إضافة 2٪ قلم / بكتيريا و 0.25 ميكروغرام / مل من مثبط الفطريات في 1x PBS. يمكن تخزين مخازن الغسيل في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل ويجب استخدامها في غضون 4 أسابيع.
ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت 5-PBS لجمع الأنسجة الدهنية والغسيل الأولي لتقليل التلوث المحتمل حيث يتم جمع عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها في التشريح في بيئة غير معقمة. - تحضير محلول كولاجيناز معقم (CB) من خلال الجمع بين 0.075٪ كولاجيناز من النوع الأول (125 وحدة / نشاط مجم) ، 2٪ قلم / بكتيريا ، و 0.25 ميكروغرام / مل من مثبط الفطريات في محلول هانك الملحي المتوازن (HBSS) مع 1٪ ألبومين مصل الأبقار. يجب استخدام CB في غضون 1 ساعة.
- تحضير وسط نمو ADSC المعقم باستخدام المخزن المؤقت α-MEM. اجمع 100 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5 مل من محلول الجلوتامين 200 مللي مول ، و 500 ميكرولتر من 0.25 ميكروغرام / مل من المثبطات الفطرية و 10 مل من محلول القلم / البكتيريا العقدية في 394 مل من المخزن المؤقت α-MEM. يمكن تخزين وسط نمو ADSC عند 4 درجات مئوية ويجب استخدامه في غضون 4 أسابيع.
ملاحظة: التعطيل الحراري ل FBS ليس ضروريا. - تحضير وسط تمايز ADSC معقم من خلال الجمع بين وسط نمو ADSC كما هو موضح أعلاه وعوامل الحث لتحقيق التركيز النهائي ل 0.5 ميكروغرام / مل ديكساميثازون و 0.5 mM إيزوبوتيل ميثيل زانثين و 50 ميكرومتر إندوميتاسين.
2. عزل ADSC
- إعداد الأنسجة والهضم
- ماصة ~ 10 مل من المخزن المؤقت 5-PBS في أربعة أطباق زراعة الخلايا 100 ملم.
- نقل ~ 50 غرام من عينة دهنية إلى واحد من أطباق 100 ملم تحتوي على 5-PBS. اغسل عينة الأنسجة الدهنية المجمعة أربع مرات عن طريق نقلها بالتتابع عبر أطباق المزرعة الأربعة التي تحتوي على 5-PBS.
- انقل العينة الدهنية إلى طبق زراعة نظيف 100 مم وفرم الأنسجة الدهنية جيدا باستخدام مقص أو مشرطين معقمين. يسمح الفرم بزيادة مساحة السطح من أجل الهضم الأنزيمي الفعال والكامل.
- انقل الأنسجة الدهنية المفرومة إلى أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 50 مل يحتوي على 13 مل من CB (مقطع 1-3 سم من الأنسجة لكل 15 مل من CB).
- شطف طبق الثقافة مع 2 مل من CB ونقل المتوسطة إلى أنبوب مخروطي بلاستيكي 50 مل.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن يكون هناك ما مجموعه 15 مل من CB مع الأنسجة في أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 50 مل. - ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل لتسهيل هضم الأنسجة الميكانيكية.
- احتضان الأنبوب المخروطي البلاستيكي سعة 50 مل الذي يحتوي على أنسجة في CB على هزاز بسرعة متوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- طلاء ADSC للثقافة
- أضف 10 مل من وسط نمو ADSC إلى الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على أنسجة لتحييد نشاط الإنزيم. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل لفصل أي مجاميع للأنسجة الدهنية.
- انقل الجزء السائل إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل تاركا المواد الصلبة وراءه. اغسل الأنبوب الأصلي سعة 50 مل 3 مرات باستخدام ~ 7 مل من المخزن المؤقت 2-PBS وانقل الجزء السائل إلى أنبوب 50 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبات خلوية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية باستخدام ماصة مصلية دون إزعاج حبيبات الخلية. لا صب.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من 1x محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف 5 مل من وسط نمو ADSC إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية.
- أضف 5 مل من وسط نمو ADSC وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق لغسل حبيبات الخلية. تخلص من المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط نمو ADSC وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي بلاستيكي معقم جديد سعة 50 مل.
- اشطف مصفاة الخلايا ب 2 مل إضافية من وسط نمو ADSC. انقل 4 مل من المعلق الذي يحتوي على ADSCs من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل إلى طبق استزراع معقم مقاس 100 مم.
- اغسل الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مرتين باستخدام 3 مل من وسط نمو ADSC وانقل السائل إلى طبق الاستزراع 100 مم الذي يحتوي على ADSCs ليصبح المجموع 10 مل من الوسط في طبق الاستزراع.
- اعرض الخلايا تحت مجهر مقلوب بتكبير 10x للتحقق من وجود خلايا عائمة في الوسائط كما هو موضح في الشكل 1 أ. يجب الحفاظ على الخلايا في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 ورطوبة نسبية 100٪.
- بعد 24 ساعة ، اعرض الخلايا تحت المجهر المقلوب للتحقق من التصاق الخلية. قم بشفط وسط نمو ADSC من اللوحة واستبدله ب 10 مل من الوسائط الطازجة والدافئة (37 درجة مئوية). قم بإزالة الوسائط واستبدالها كل 48 ساعة حتى تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ -90٪ (الشكل 1 ب).
ملاحظة: سيتم التصاق ما لا يقل عن 10-20٪ من الخلايا بحلول 24 ساعة. تحقق من ثقافة الخلية بحثا عن علامات التلوث مثل تحبب الخلية أو تعكر الوسائط أو نمو الجراثيم. بمجرد أن تتلاقى الخلايا بنسبة 80٪ ، يمكن حصادها للتكاثر والحفظ بالتبريد أو حثها على التمايز. يمكن توسيع ADSCs إلى 4-6 مقاطع قبل أن تفقد قدرتها على الانتشار أو التمايز بكفاءة.
3. انتشار ADSC
- انفصال الخلية
- قم بإزالة وسيط نمو ADSC باستخدام شفاط / ماصة. شطف ADSCs المتقاربة مرتين مع 2 مل من PBS المعقمة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح PBS وأضف 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لكل لوحة استزراع 100 مم. تأكد من تغطية مساحة السطح بالكامل بالتربسين.
- احتضان لوحة لمدة ~ 7 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حتى يتم فصل ADSCs. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وطرد الخلايا ميكانيكيا عن طريق سحب محلول التربسين بقوة في اللوحة.
- أضف 2 مل من وسط نمو ADSC إلى الخلايا المفككة وماصة برفق للخلط. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي بلاستيكي معقم سعة 50 مل. لضمان أقصى قدر من استعادة الخلايا، اشطف طبق المزرعة ب 2 مل أخرى من وسط نمو ADSC، وانقل الوسط إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا منفصلة.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات خلوية. صب بعناية طاف دون إزعاج بيليه الخلية.
- أعد تعليق حبيبات الخلايا في 5-6 مل من وسط نمو ADSC لكل 1 × 106 خلايا.
- عدد الخلايا والطلاء
- في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محلول الخلية من الأعلى و 10 ميكرولتر من محلول التربيق الأزرق بنسبة 0.04٪ (0.4٪ من التريبان الأزرق المخفف 1:10 في برنامج تلفزيوني) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
- إعادة تعليق العدد المطلوب من ADSCs في وسط النمو. بالنسبة لطبق الاستزراع 100 مم ، لوحة ~ 3.0 × 105 خلايا في وسائط نمو ADSC سعة 10 مل للسماح بالتقاء 80٪ في 72 ساعة أو التقاء 100٪ في 96 ساعة.
- شاهد الطبق تحت مجهر مقلوب بتكبير 10x قبل الحضانة لضمان وجود خلايا معلقة. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 و 100٪ رطوبة نسبية.
- كل 48 ساعة تستنشق وسط النمو واستبدله بوسط دافئ (37 درجة مئوية) حتى تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ إلى 90٪ كما هو موضح في الشكل 1 ب.
- كرر الخطوات من القسمين 3.1 و 3.2 للحصول على عدد مناسب من المقاطع للحصول على رقم الخلية المطلوب.
ملاحظة: بعد الممرات من 5 إلى 6 ، يبدو أن الخلايا الأولية تخضع للشيخوخة. لذلك ، تهدف إلى الحصول على أرقام الخلايا المطلوبة عن طريق المرور 4.
4. تمايز ADSC الأديبوجيني
- استشف وسط نمو ADSC من ADSCs الملتصقة التي وصلت إلى 80٪ إلى 90٪ التقاء.
- شطف بسرعة طبقة خلية ADSC مع PBS معقمة ، درجة حرارة الغرفة.
- إضافة وسيط تمايز ADSC. بالنسبة لطبق الاستزراع 100 مم ، أضف 10 مل من وسيط تمايز ADSC.
- استبدل الوسط كل 3 أيام لمدة 14-21 يوما تقريبا. يتم ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة بشكل عام بعد 14 يوما من التمايز.
- افحص الخلايا تحت مجهر ضوئي مقلوب عند تكبير 40x للتأكد من وجود قطرة ليبيدية كما هو موضح في الشكل 2 أ.
5. الكشف عن الخلايا الشحمية
ملاحظة: سيصف هذا القسم بروتوكولات التلوين المستخدمة للكشف عن قطرات الدهون في الخلايا الشحمية المتباينة ، ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي ل CD105 ، وهو علامة الخلايا الجذعية الوسيطة ، لتأكيد ADSC.
- النفط الأحمر يا تلطيخ
- تحضير 0.5٪ زيت أحمر يا محلول مخزون في الأيزوبروبانول. للحصول على 20 مل من محلول مخزون Oil Red O ، قم بإذابة 100 مجم من الزيت الأحمر O في 20 مل من الأيزوبروبانول. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة معقم بغشاء 0.2 ميكرومتر.
- استنشاق بعناية وسط التمايز وغسل الخلايا 2 مرات عن طريق إضافة PBS على طول جوانب البئر لعدم إزعاج أحادية الخلية أحادية.
- استنشاق PBS بعناية من الخلايا وإضافة ما يكفي من الفورمالين المحايد (NBF ، 10٪) لتغطية طبقة الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- أثناء خطوة تثبيت الفورمالين ، قم بإعداد محلول عمل Oil Red O عن طريق تخفيف 3 أجزاء من محلول مخزون Oil Red O مع 2 أجزاء من الماء المقطر. امزج المحلول وقم بالتصفية من خلال مرشح حقنة معقم بغشاء 0.2 ميكرومتر. حل العمل مستقر لمدة تصل إلى 2 ساعة.
- استنشاق NBF بعناية وغسل بسرعة (~ 15 ثانية) طبقة الخلية بالماء المقطر. أضف ما يكفي من 60٪ إيزوبروبانول لتغطية طبقة الخلية بعد شفط الماء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- استنشاق الأيزوبروبانول بعناية بعد 5 دقائق من الحضانة وإضافة ما يكفي من محلول عمل Oil Red O لتغطية طبقة الخلية واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
- استنشق بعناية من محلول العمل Oil Red O واغسل طبقة الخلية عدة مرات بالماء المقطر حتى يصبح الماء صافيا.
- أضف PBS إلى طبق زراعة الخلايا وافحص الخلايا تحت المجهر المقلوب للإشارة إلى التمايز ووجود قطرات الدهون (الشكل 2 ب).
- تلطيخ بوديبي
- تحضير محلول مخزون BODIPY 5 mM عن طريق إذابة 1.3 جم من BODIPY في 1 مل من DMSO. قم بإعداد حل عمل BODIPY 2 ميكروغرام / مل عن طريق تخفيف محلول المخزون 1: 25000 مرة في برنامج تلفزيوني.
- استنشاق بعناية وسط التمايز وغسل الخلايا 2 مرات عن طريق إضافة PBS على طول جوانب البئر لعدم إزعاج أحادية الخلية أحادية.
- استنشاق PBS بعناية وإضافة ما يكفي من محلول عمل BODIPY لتغطية طبقة الخلية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: من هذه النقطة ، قم بحماية الخلايا من الضوء عن طريق تغطية اللوحة بالرقائق. - استنشاق بعناية حل العمل BODIPY وغسل طبقة الخلية 3 مرات مع PBS.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 4 ٪ بارافورمالدهيد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- استنشاق بعناية العازلة التثبيت وغسل الخلايا 2 مرات عن طريق إضافة PBS على طول جوانب البئر لعدم إزعاج أحادية الخلية أحادية.
- أضف PBS إلى طبق زراعة الخلايا وافحص الخلايا تحت مجهر الفلورسنت المقلوب للحصول على دليل على تمايز ووجود قطرات دهنية (الشكل 2C). خلايا الصورة باستخدام مجموعة مرشح FITC / EGFP / Bodipy Fl / Fluo3 / DiO Chroma. يبلغ الطول الموجي للإثارة 480 نانومتر بعرض نطاق 40 نانومتر وطول موجة الانبعاث عند 535 نانومتر مع عرض نطاق ترددي 50 نانومتر. يمكن استخدام مجموعة مرشحات مماثلة أو مناسبة ، والمجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم زرع ADSCs المعزولة من عينات الأنسجة الدهنية لقرود المكاك الريسوس على ألواح المزرعة ويظهر في الشكل 1. في يوم الطلاء ، تكون الخلايا غير ملتصقة وتطفو في طبق الاستزراع كما هو موضح في الشكل 1 أ. في غضون 72 ساعة ، ستصبح ADSCs متقاربة بنسبة 80٪ وتكون جاهزة لتمايز الخلايا الشحمية (الشكل 1 ب). تظهر ADSCs خصائص قوية للدهون بعد الحث الكيميائي. بعد 14 يوما من التمايز ، يمكن ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق الفحص المجهري الضوئي (الشكل 2 أ). لتأكيد تمايز ADSC الأديبوجيني ، يمكن استخدام بقع مختلفة لتصور قطرات الدهون في الخلايا الشحمية الناضجة المتمايزة. في اليوم 14 من التمايز ، تم تلطيخ الخلايا وتثبيتها باستخدام Oil Red O (الشكل 2B) و BODIPY (الشكل 2C) لتصور قطرات الدهون. يمثل السهم الأسود خلية دهنية متمايزة (الشكل 2 ب). تشير هذه البيانات إلى أنه بعد هذا البروتوكول ، تم إنشاء ADSCs من الأنسجة الدهنية لقرود المكاك الريسوس وتم تمييزها إلى خلايا دهنية ناضجة.
الشكل 1: صور مجهرية ضوئية ل ADSCs في يوم الطلاء وعند التقاء الخلايا بنسبة 80٪. (أ) صورة مجهرية ضوئية تمثيلية للخلايا الوعائية اللحمية في يوم الطلاء بعد عزل ADSC عن الأنسجة الدهنية لقرود المكاك الريسوس الطازجة (تكبير 10x). (ب) صورة مجهرية ضوئية تمثيلية ل ADSCs عند التقاء 80٪ (تكبير 20x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور مجهرية ل ADSCs في اليوم 14 من التمايز. (A) صورة مجهرية ضوئية تمثيلية تم الحصول عليها في اليوم 14 من تمايز ADSC (تكبير 40x). (ب) صورة مجهرية تمثيلية لتلطيخ الزيت الأحمر O في اليوم 14 من تمايز ADSC (تكبير 20x). (C) صورة مجهرية تمثيلية لتلطيخ البورون ديبيروميثان (BODIPY) في اليوم 14 من تمايز ADSC (تكبير 20x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتبر بروتوكولات عزل ADSC وانتشارها وتمايزها مباشرة وقابلة للتكرار ، ولكنها تتطلب تقنية دقيقة لضمان العزل الكافي والتوسع الصحي والتمايز الفعال. بيئة العمل المعقمة أمر بالغ الأهمية لجميع تجارب زراعة الخلايا. يمكن إدخال البكتيريا أو الفطريات إلى مزارع الخلايا من خلال الأدوات أو الوسائط أو بيئة العمل الملوثة. يشار إلى التلوث الفطري من خلال نمو البوغ في الثقافة ، في حين يشار إلى التلوث البكتيري من خلال وجود تعكر في الوسائط. نقترح تطهير خزانة السلامة الحيوية وجميع الماصات والزجاجات والأدوات قبل الاستخدام ، وتشغيل تدفق الهواء الصفحي قبل 15 دقيقة على الأقل من استخدام خزانة السلامة الحيوية وتطهير الخزانة وجميع الماصات بعد الاستخدام لتقليل مخاطر التلوث. أيضا ، نقترح تعقيم أطراف ماصة غير مرشحة لشفط الفراغ وشطف الشافطة بالماء المعقم متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد الاستخدام. يمكن وضع طبق الاستزراع مع الوسائط فقط في الحاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لبضعة أيام للتحقق من عقم الوسائط. يجب تبييض الثقافات الملوثة لمدة 30 دقيقة والتخلص منها. يجب أيضا تطهير حاضنة زراعة الخلايا.
يتمثل الاختلاف الرئيسي بين البروتوكولات الموجودة في هذه المخطوطة وتلك المنشورة سابقا في استخدام BSA في مخزن هضم كولاجيناز ADSC الذي يسمح بعزل الخلايا الشحمية الناضجة و ADSCs. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم بروتوكولنا وسيط نمو ADSC مع 20٪ FBS مقارنة ب 10٪ FBS كما هو مقترح في معظم البروتوكولات. لقد لاحظنا أن ADSCs الأولية لقرود المكاك الريسوس تتكاثر وتتمايز بشكل أفضل مع 20٪ FBS. يتم تحفيز تمايز ADSC في المختبر بواسطة عوامل تحريض خاصة بالنسب. يتم قبول عوامل الحث المستخدمة في هذا البروتوكول على نطاق واسع للتمايز الدهني في المختبر ل ADSCs. ومع ذلك ، على عكس العديد من البروتوكولات المنشورة سابقا ، لا يشمل كوكتيل التمايز الأديبوجيني الأنسولين أو منبهات PPARγ. لقد استخدمنا نحن وآخرون هذا البروتوكول للتمييز بنجاح بين كل من المكاك الريسوس و ADSCs البشرية14،15،16.
في هذا البروتوكول ، يتم تأكيد تمايز ADSC adipogenic من خلال الكشف عن قطرات الدهون باستخدام تقنيات تلوين Oil Red O و BODIPY. على الرغم من التعرف على هذه البقع جيدا في هذا المجال ، إلا أن هناك طرقا أخرى شائعة الاستخدام بما في ذلك قياس التدفق الخلوي للكشف عن CD105 لتحديد ADSCs ، أو علامات الخلايا البطانية والمناعية لإثبات نقاء ADSCs17.
يوفر استخدام ADSCs أداة قيمة للطب التجديدي وأبحاث التمثيل الغذائي. ينتج عزل وتكاثر ADSC عددا كبيرا من الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات النهائية والتقنيات التجريبية بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تلك الموصوفة في هذا البروتوكول. يشمل الاستخدام الرئيسي المقصود للخلايا الشحمية المتمايزة في هذا البروتوكول استخدام المقايسات الأيضية مثل امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين ، وتكوين الدهون ، وتحلل الدهونالمحفز 18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمييز ADSCs إلى سلالة عظمية و غضروفية واستخدامها للتحليل النهائي بما في ذلك هندسة الأنسجة7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا كورتيس فاندي ستوي على مساعدته التقنية. تم دعم البحث الأساسي لتطوير البروتوكولات بمنح من المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (5P60AA009803-25 و 5T32AA007577-20 و 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
