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Biology

रीसस मकाक वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का अलगाव, प्रसार और भेदभाव

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61732
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center - New Orleans, 2Comprehensive Alcohol-HIV/AIDS Research Center, Louisiana State University Health Sciences Center - New Orleans

Summary

इस लेख में, हम एक एंजाइमेटिक ऊतक पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग करके रीसस मकाक व्युत्पन्न वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) के अलगाव का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम एडीएससी प्रसार का वर्णन करते हैं जिसमें सेल डिटेचमेंट, गिनती और चढ़ाना शामिल है। अंत में, एडीएससी भेदभाव को विशिष्ट एडिपोजेनिक उत्प्रेरण एजेंटों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, हम भेदभाव की पुष्टि करने के लिए धुंधला तकनीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

वसा ऊतक मल्टीपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध और सुलभ स्रोत प्रदान करता है, जो आत्म-नवीनीकरण करने में सक्षम हैं। ये वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी) एक सुसंगत पूर्व विवो सेलुलर प्रणाली प्रदान करते हैं जो कार्यात्मक रूप से विवो एडिपोसाइट्स की तरह होते हैं। बायोमेडिकल अनुसंधान में एडीएससी का उपयोग वसा ऊतक चयापचय विनियमन और कार्य की सेलुलर जांच के लिए अनुमति देता है। एडीएससी भेदभाव पर्याप्त एडिपोसाइट्स विस्तार के लिए आवश्यक है, और उप-मानक भेदभाव वसा शिथिलता का एक प्रमुख तंत्र है। एडीएससी भेदभाव में परिवर्तन को समझना चयापचय शिथिलता और बीमारी के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल, जब पालन किया जाता है, तो परिपक्व एडिपोसाइट्स उत्पन्न होंगे जिनका उपयोग एडीएससी चयापचय समारोह का आकलन करने के लिए कई इन विट्रो कार्यात्मक परीक्षणों के लिए किया जा सकता है, जिसमें ग्लूकोज अपटेक, लिपोलिसिस, लिपोजेनेसिस और स्राव को मापने के लिए सीमित नहीं है। रीसस मकाक (मकाका मुलाटा) शारीरिक रूप से, शारीरिक रूप से और विकासवादी रूप से मनुष्यों के समान हैं और इस तरह, उनके ऊतकों और कोशिकाओं का उपयोग जैव चिकित्सा अनुसंधान और उपचार के विकास के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। यहां, हम 4-9 वर्षीय रीसस मकाक से प्राप्त ताजा चमड़े के नीचे और ओमेंटल वसा ऊतक का उपयोग करके एडीएससी अलगाव का वर्णन करते हैं। वसा ऊतक के नमूने कोलेजनेज में एंजाइमेटिक रूप से पच जाते हैं, जिसके बाद स्ट्रोमल संवहनी अंश से एडीएससी को अलग करने के लिए निस्पंदन और सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। स्ट्रोमल मीडिया में पृथक एडीएससी का प्रसार होता है, जिसके बाद 0.5 μg / mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, और स्ट्रोमल मीडिया में 50 μM इंडोमेथासिन के कॉकटेल का उपयोग करके लगभग 14-21 दिनों का भेदभाव होता है। परिपक्व एडिपोसाइट्स लगभग 14 दिनों के भेदभाव पर देखे जाते हैं। इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो में एडीएससी अलगाव, प्रसार और भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हालांकि, हमने रीसस मकाक वसा ऊतक से एडीएससी पर ध्यान केंद्रित किया है, इन प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूनतम समायोजन के साथ अन्य जानवरों से प्राप्त वसा ऊतक के लिए किया जा सकता है।

Introduction

वसा ऊतक में कोशिकाओं का एक विषम मिश्रण होता है, मुख्य रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) 1,2,3 सहित एक स्ट्रोमल संवहनी अंश। प्राथमिक एडीएससी को सीधे सफेद वसा ऊतक से अलग किया जा सकता है और एडिपोसाइट्स, उपास्थि या हड्डी की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए उत्तेजित कियाजा सकता है। एडीएससी शास्त्रीय स्टेम सेल विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं जैसे कि विट्रो में मल्टीपोटेंसी का रखरखाव और आत्म-नवीकरण; और संस्कृति 5,6 में प्लास्टिक के अनुयायी हैं। एडीएससी पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग के लिए महत्वपूर्ण रुचि रखते हैं क्योंकि उनकी बहुशक्ति और गैर-इनवेसिवतकनीकों का उपयोग करके बड़ी मात्रा में आसानी से काटने की क्षमता है। एडीएससी का एडिपोजेनिक भेदभाव कोशिकाओं का उत्पादन करता है जो कार्यात्मक रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स की नकल करते हैं जिनमें लिपिड संचय, इंसुलिन-उत्तेजित ग्लूकोज अपटेक, लिपोलिसिस और एडिपोकिन स्रावशामिल हैं। परिपक्व एडिपोसाइट्स के साथ उनकी समानता ने सेलुलर विशेषताओं की शारीरिक जांच और एडिपोसाइट्स के चयापचय कार्य के लिए एडीएससी के व्यापक उपयोग को जन्म दिया है। इस विचार का समर्थन करने वाले सबूत बढ़ रहे हैं कि चयापचय शिथिलता और विकारों का विकास सेलुलर या ऊतक स्तर 9,10,11,12 पर उत्पन्न होता है। पर्याप्त वसा ऊतक विस्तार, उचित एडिपोसाइट्स फ़ंक्शन और प्रभावी चयापचय विनियमन13 के लिए इष्टतम एडीएससी भेदभाव की आवश्यकता होती है।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल मानक प्रयोगशाला उपकरण और बुनियादी अभिकर्मकों का उपयोग करने वाली सीधी तकनीकें हैं। पांडुलिपि पहले यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन का उपयोग करके ताजा वसा ऊतक से प्राथमिक एडीएससी के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। इसके बाद, स्ट्रोमल माध्यम में एडीएससी के प्रसार और पासिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अंत में, एडीएससी के एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। भेदभाव के बाद, इन कोशिकाओं का उपयोग एडिपोसाइट चयापचय और शिथिलता के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए अध्ययन के लिए किया जा सकता है। ऑयल रेड ओ और बोरॉन-डिपिरोमेथेन (बीओडीआईपीवाई) धुंधला होने का उपयोग करके एडिपोजेनिक भेदभाव और लिपिड बूंद का पता लगाने की पुष्टि के लिए प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं। इन प्रोटोकॉल का विवरण रीसस मकाक के ताजा ओमेंटल वसा ऊतक से अलग प्राथमिक एडीएससी पर केंद्रित था। हमने और अन्य लोगों ने रीसस मकाक चमड़े के नीचे और ओमेंटल वसा ऊतक डिपो14,15 से एडीएससी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। उपयोग किए गए ऊतक की समान मात्रा के लिए, हमने देखा है कि चमड़े के नीचे वसा ऊतक अधिक घना, कठिन होता है और ओमेंटल वसा ऊतक की तुलना में पाचन से कम कोशिकाओं का उत्पादन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एडीएससी को मानव वसा के नमूने16 से अलग करने के लिए भी किया गया है।

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Protocol

सभी प्राप्त ऊतकों और प्रक्रियाओं को लुइसियाना स्टेट यूनिवर्सिटी हेल्थ साइंसेज सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-12, संशोधित 1996) के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. बफर और समाधान तैयार करना

  1. 1x PBS में 5% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) और 0.25 μg/mL फंगल इनहिबिटर जोड़कर बाँझ 5-फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन वॉश बफर (5-पीबीएस) घोल तैयार करें। 1x PBS में 2% पेन/स्ट्रेप और 0.25 μg/mL फंगल इनहिबिटर जोड़कर बाँझ 2-पीबीएस वॉश बफर (2-पीबीएस) घोल तैयार करें। वॉश बफर को भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 4 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।
    नोट: 5-पीबीएस बफर का उपयोग वसा ऊतक संग्रह और प्रारंभिक धोने के लिए किया जाता है ताकि संभावित संदूषण को कम किया जा सके क्योंकि नेक्रोपसी में प्राप्त ऊतक के नमूने एक गैर-बाँझ वातावरण में एकत्र किए जाते हैं।
  2. हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 1% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन के साथ 0.075% कोलेजनेज टाइप 1 (125 यूनिट / मिलीग्राम गतिविधि), 2% पेन / स्ट्रेप, और 0.25 μg / mL फंगल अवरोधक के संयोजन से बाँझ कोलेजनेज बफर (सीबी) तैयार करें। सीबी का उपयोग 1 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।
  3. α-एमईएम बफर का उपयोग करके बाँझ एडीएससी विकास माध्यम तैयार करें। 100 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 5 एमएल 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन समाधान, 0.25 μg / mL फंगल अवरोधक के 500 μL और 394 mL α-MEM बफर में 10 mL पेन / स्ट्रेप समाधान मिलाएं। एडीएससी विकास माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 4 सप्ताह के भीतर इसका उपयोग किया जाना चाहिए।
    नोट: एफबीएस की गर्मी निष्क्रियता आवश्यक नहीं है।
  4. ऊपर तैयार किए गए एडीएससी विकास माध्यम और प्रेरण एजेंटों को मिलाकर बाँझ एडीएससी भेदभाव माध्यम तैयार करें ताकि 0.5 μg / mL dexamethasone, 0.5 mM आइसोब्यूटिल मिथाइलक्सैंथिन और 50 μM इंडोमेथैसिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जा सके।

2. एडीएससी अलगाव

  1. ऊतक तैयारी और पाचन
    1. पिपेट ~ 10 एमएल 5-पीबीएस बफर को चार 100 मिमी सेल कल्चर व्यंजनों में विभाजित करता है।
    2. 5-पीबीएस युक्त 100 मिमी व्यंजनों में से एक में ~ 50 ग्राम वसा के नमूने को स्थानांतरित करें। एकत्रित वसा ऊतक के नमूने को 5-पीबीएस युक्त चार संस्कृति व्यंजनों में क्रमिक रूप से स्थानांतरित करके चार बार धोएं।
    3. एडीपोज के नमूने को एक साफ 100 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें और कैंची या दो बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके वसा ऊतक को अच्छी तरह से कीमा करें। कीपिंग कुशल और पूर्ण एंजाइमेटिक पाचन के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने की अनुमति देता है।
    4. कीमा वाले वसा ऊतक को 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 13 एमएल सीबी (सीबी के प्रति 15 एमएल ऊतक का 1-3 सेमी खंड) होता है।
    5. कल्चर डिश को 2 एमएल सीबी के साथ कुल्ला करें और माध्यम को 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: इस बिंदु पर, 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक के साथ कुल 15 एमएल सीबी होना चाहिए।
    6. यांत्रिक ऊतक पाचन की सुविधा के लिए 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कई बार ऊपर और नीचे।
    7. सीबी में ऊतक युक्त 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब को 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम गति से एक रॉकर पर इनक्यूबेट करें।
  2. संस्कृति के लिए एडीएससी चढ़ाना
    1. एंजाइम गतिविधि को बेअसर करने के लिए ऊतक युक्त 50 एमएल ट्यूब में एडीएससी विकास माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। किसी भी वसा ऊतक समुच्चय को अलग करने के लिए 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पिपेट को कई बार ऊपर और नीचे करें।
    2. ठोस पदार्थों को पीछे छोड़ते हुए तरल भाग को एक नए बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। मूल 50 एमएल ट्यूब को 2-पीबीएस बफर के ~ 7 एमएल के साथ 3 बार धोएं और तरल भाग को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सेल पेलेट को परेशान किए बिना सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें। संकोच न करें।
    4. सेल पेलेट को 1 एमएल 1 एक्स रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब में 5 एमएल एडीएससी विकास माध्यम जोड़ें और 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें और छोड़ दें।
    5. सेल पेलेट को धोने के लिए 5 मिनट के लिए 5 एमएल एडीएससी विकास माध्यम और 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    6. एडीएससी विकास माध्यम के 2 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें और 70 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से एक नए बाँझ 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें।
    7. एडीएससी विकास माध्यम के अतिरिक्त 2 एमएल के साथ सेल छन्नी को कुल्ला करें। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से एडीएससी युक्त निलंबन के 4 एमएल को बाँझ 100 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
    8. एडीएससी विकास माध्यम के 3 एमएल के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 2 बार धोएं और तरल को कल्चर डिश में कुल 10 एमएल माध्यम के लिए एडीएससी युक्त 100 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
    9. चित्र 1 ए में दिखाए गए अनुसार मीडिया में फ्लोटिंग कोशिकाओं की जांच करने के लिए 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखें। कोशिकाओं कोसीओ 2 इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2और 100% सापेक्ष आर्द्रता पर 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए।
    10. 24 घंटे के बाद, सेल पालन की जांच करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखें। एस्पिरेट एडीएससी प्लेट से बढ़ता है और 10 एमएल ताजा, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करता है। हर 48 घंटे में मीडिया को हटाएं और बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% -90% कॉन्फ्लुएंट न हों (चित्रा 1 बी)।
      नोट: कम से कम 10-20% कोशिकाएं 24 घंटे तक अनुयायी होंगी। संदूषण के संकेतों के लिए सेल कल्चर की जांच करें जैसे कि सेल ग्रैन्यूलैरिटी, मीडिया की टर्बिडिटी, या बीजाणुओं की वृद्धि। एक बार जब कोशिकाएं 80% संकुचित हो जाती हैं, तो उन्हें प्रसार और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए काटा जा सकता है या अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। एडीएससी को कुशलतापूर्वक प्रसार या अंतर करने की उनकी क्षमता खोने से पहले 4-6 मार्गों तक विस्तारित किया जा सकता है।

3. एडीएससी प्रसार

  1. Cell detachment
    1. एक एस्पिरेटर / पिपेट का उपयोग करके एडीएससी विकास माध्यम को हटा दें। 2 मिलीलीटर बाँझ, कमरे के तापमान पीबीएस के साथ 2 बार एडीएससी को धोएं।
    2. एस्पिरेट पीबीएस और प्रति 100 मिमी कल्चर प्लेट में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि संपूर्ण सतह क्षेत्र ट्रिप्सिन से ढका हुआ है।
    3. 5% CO2 में ~ 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेट जब तक कि एडीएससी अलग न हो जाएं। इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और प्लेट में ट्रिप्सिन समाधान को बलपूर्वक पाइप करके यांत्रिक रूप से कोशिकाओं को हटा दें।
    4. हटाए गए कोशिकाओं में 2 एमएल एडीएससी विकास माध्यम जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट करें। कोशिकाओं को बाँझ 50 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। अधिकतम सेल रिकवरी सुनिश्चित करने के लिए, एडीएससी विकास माध्यम के एक और 2 एमएल के साथ कल्चर डिश को धोएं, और माध्यम को अलग कोशिकाओं वाले शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. सेल गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल पेलेट को परेशान किए बिना सावधानीपूर्वक सतह पर तैरने वाला।
    6. प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं में एडीएससी विकास माध्यम के5-6 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  2. सेल गिनती और चढ़ाना
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, ऊपर से सेल समाधान के 10 μL और 0.04% ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन (पीबीएस में 0.4% ट्रिपैन ब्लू पतला 1:10) के 10 μL को पतला करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    2. विकास माध्यम में एडीएससी की वांछित संख्या को पुन: निलंबित करें। 100 मिमी कल्चर डिश के लिए, प्लेट ~ 3.0 x 105 कोशिकाओं को 10 एमएल एडीएससी विकास मीडिया में 72 घंटे में 80% संगम या 96 घंटे में 100% संयोजन की अनुमति देने के लिए।
    3. निलंबित कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेशन से पहले 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत डिश देखें। कोशिकाओं को 5% सीओ2 और 100% सापेक्ष आर्द्रता पर 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    4. प्रत्येक 48 घंटे में विकास माध्यम को एस्पिरेट करें और गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) माध्यम से प्रतिस्थापित करें जब तक कि कोशिकाएं 80% से 90% कॉन्फ्लुएंट न हों जैसा कि चित्र 1 बी में दिखाया गया है।
    5. वांछित सेल नंबर प्राप्त करने के लिए उचित संख्या में अंशों के लिए अनुभाग 3.1 और 3.2 से चरणों को दोहराएँ।
      नोट: मार्ग 5 से 6 के बाद, प्राथमिक कोशिकाएं शिथिलता से गुजरती हैं; इसलिए, मार्ग 4 द्वारा वांछित सेल संख्या प्राप्त करने का लक्ष्य रखें।

4. एडीएससी एडिपोजेनिक भेदभाव

  1. एस्पिरेट एडीएससी विकास माध्यम का पालन किया गया एडीएससी जो 80% से 90% संगम तक पहुंच गया है।
  2. बाँझ, कमरे के तापमान पीबीएस के साथ एडीएससी सेल परत को जल्दी से कुल्ला करें।
  3. एडीएससी भेदभाव माध्यम जोड़ें। 100 मिमी कल्चर डिश के लिए, एडीएससी भेदभाव माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
  4. लगभग 14-21 दिनों के लिए हर 3 दिनों में माध्यम को बदलें। परिपक्व एडिपोसाइट्स आमतौर पर भेदभाव के 14 दिनों के बाद देखे जाते हैं।
  5. चित्र 2 ए में दिखाए गए लिपिड बूंद की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए 40x आवर्धन पर एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें।

5. एडिपोसाइट्स का पता लगाना

नोट: यह खंड विभेदित एडिपोसाइट्स में लिपिड बूंद का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन करेगा, हालांकि, सीडी 105 के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन, एक मेसेनकाइमल स्टेम सेल मार्कर, एडीएससी पुष्टि के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. तेल लाल ओ धुंधला
    1. आइसोप्रोपेनॉल में 0.5% तेल लाल ओ स्टॉक समाधान तैयार करें। 20 एमएल तेल लाल ओ स्टॉक समाधान के लिए, 20 एमएल आइसोप्रोपेनोल में 100 मिलीग्राम तेल लाल ओ घोलें। 0.2 μm झिल्ली के साथ बाँझ सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से घोल को फ़िल्टर करें।
    2. सेल मोनोलेयर को परेशान न करने के लिए कुएं के किनारों के साथ पीबीएस जोड़कर विभेदन माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2 बार धोएं।
    3. कोशिकाओं से सावधानीपूर्वक पीबीएस को एस्पिरेट करें और सेल परत को कवर करने के लिए पर्याप्त तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन (एनबीएफ, 10%) जोड़ें। 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. फॉर्मलिन निर्धारण चरण के दौरान, आसुत जल के 2 भागों के साथ तेल लाल ओ स्टॉक समाधान के 3 भागों को पतला करके ऑयल रेड ओ वर्किंग समाधान तैयार करें। घोल मिलाएं और 0.2 μm झिल्ली के साथ बाँझ सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। कामकाजी समाधान 2 घंटे तक स्थिर है।
    5. ध्यान से एनबीएफ को एस्पिरेट करें और आसुत जल के साथ सेल परत को जल्दी से धो लें (~ 15 एस)। पानी को गर्म करने के बाद सेल परत को कवर करने के लिए पर्याप्त 60% आइसोप्रोपेनॉल जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. 5 मिनट के बाद सावधानीपूर्वक एस्पिरेट आइसोप्रोपेनोल इनक्यूबेशन और सेल परत को कवर करने और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए पर्याप्त तेल रेड ओ वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें।
    7. तेल रेड ओ काम करने वाले घोल को सावधानीपूर्वक हटा दें और सेल परत को आसुत पानी से कई बार धोएं जब तक कि पानी साफ न हो जाए।
    8. सेल कल्चर डिश में पीबीएस जोड़ें और लिपिड बूंदों के भेदभाव और उपस्थिति के संकेत के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें (चित्रा 2 बी)।
  2. BODIPY धुंधलापन
    1. डीएमएसओ के 1 एमएल में 1.3 ग्राम बीओडीआईपीवाई को भंग करके 5 एमएम बोडिपी स्टॉक समाधान तैयार करें। पीबीएस में स्टॉक समाधान को 1: 25,000 बार पतला करके 2 μg / mL BODIPY कार्य समाधान तैयार करें।
    2. सेल मोनोलेयर को परेशान न करने के लिए कुएं के किनारों के साथ पीबीएस जोड़कर विभेदन माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2 बार धोएं।
    3. सावधानी से पीबीएस को एस्पिरेट करें और सेल परत को कवर करने के लिए पर्याप्त बीओडीआईपीवाई वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस बिंदु से, पन्नी के साथ प्लेट को कवर करके कोशिकाओं को प्रकाश से बचाएं।
    4. सावधानी से बीओडीआईपीवाई काम करने वाले समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ सेल परत को 3 बार धोएं।
    5. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. सेल मोनोलेयर को परेशान न करने के लिए कुएं के किनारों के साथ पीबीएस जोड़कर फिक्सेशन बफर को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2 बार धोएं।
    7. सेल कल्चर डिश में पीबीएस जोड़ें और लिपिड बूंद के भेदभाव और उपस्थिति के सबूत के लिए एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें (चित्रा 2 सी)। एफआईटीसी /ईजीएफपी / बोडिपी एफएल / फ्लूओ 3 / डीआईओ क्रोमा फ़िल्टर सेट का उपयोग करके छवि कोशिकाएं। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 40 एनएम की बैंड चौड़ाई के साथ 480 एनएम पर है और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 50 एनएम की बैंडविड्थ के साथ 535 एनएम पर है। एक समान या उपयुक्त फ़िल्टर सेट, और माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

रीसस मकाक वसा ऊतक के नमूनों से अलग एडीएससी को कल्चर प्लेटों पर बीज दिया गया था और इसे चित्र 1 में दिखाया गया है। चढ़ाना के दिन, कोशिकाएं गैर-अनुयायी होती हैं और संस्कृति पकवान में तैरती हैं जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है। 72 घंटे के भीतर, एडीएससी 80% कॉन्फ्लुएंट हो जाएगा और एडिपोसाइट भेदभाव (चित्रा 1 बी) के लिए तैयार है। एडीएससी रासायनिक प्रेरण के बाद मजबूत एडिपोजेनिक विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। भेदभाव के 14 दिनों के बाद, परिपक्व एडिपोसाइट्स को प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ए) के माध्यम से देखा जा सकता है। एडीएससी एडिपोजेनिक भेदभाव की पुष्टि करने के लिए विभेदित परिपक्व एडिपोसाइट्स की लिपिड बूंदों की कल्पना करने के लिए विभिन्न दागों का उपयोग किया जा सकता है। विभेदन के 14 वें दिन, लिपिड ड्रॉपलेट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कोशिकाओं को ऑयल रेड ओ (चित्रा 2 बी) और बीओडीआईपीवाई (चित्रा 2 सी) के साथ दाग और तय किया गया था। काला तीर एक विभेदित एडिपोसाइट्स (चित्रा 2 बी) का प्रतिनिधित्व करता है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एडीएससी रीसस मकाक वसा ऊतक से उत्पन्न हुए थे और परिपक्व एडिपोसाइट्स में विभेदित थे।

Figure 1
चित्र 1: प्लेटिंग के दिन और 80% सेल कंफ्लुएंसी पर एडीएससी के हल्के माइक्रोग्राफ। (ए) ताजा रीसस मकाक वसा ऊतक (10 एक्स आवर्धन) से एडीएससी अलगाव के बाद चढ़ाना के दिन स्ट्रोमल संवहनी कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ। (बी) 80% कंफ्लुएंसी (20x आवर्धन) पर एडीएससी का प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: भेदभाव के 14 वें दिन एडीएससी के माइक्रोग्राफ। (ए) एडीएससी भेदभाव (40x आवर्धन) के दिन 14 पर प्राप्त प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ। (बी) एडीएससी भेदभाव (20 एक्स आवर्धन) के 14 वें दिन ऑयल रेड ओ स्टेनिंग का प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। (ग) एडीएससी विभेदन (20x आवर्धन) के 14वें दिन बोरान-डिपिरोमेथेन (बीओडीआईपीवाई) धुंधला होने का प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एडीएससी अलगाव, प्रसार और भेदभाव प्रोटोकॉल सीधे-आगे और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, लेकिन उन्हें पर्याप्त अलगाव, स्वस्थ विस्तार और कुशल भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक तकनीक की आवश्यकता होती है। सभी सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए एक बाँझ कामकाजी वातावरण महत्वपूर्ण है। बैक्टीरिया या कवक को दूषित उपकरणों, मीडिया या कार्य वातावरण के माध्यम से सेल संस्कृतियों में पेश किया जा सकता है। कवक संदूषण संस्कृति में बीजाणु वृद्धि द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि जीवाणु संदूषण मीडिया के मैलापन की उपस्थिति से इंगित किया जाता है। हम उपयोग से पहले जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी पिपेट, बोतलों और उपकरणों को कीटाणुरहित करने, जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करने से कम से कम 15 मिनट पहले लामिनार वायु प्रवाह को चालू करने और संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए उपयोग के बाद कैबिनेट और सभी पिपेट को कीटाणुरहित करने का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, हम वैक्यूम आकांक्षा के लिए नॉनफिल्टर पिपेट युक्तियों को ऑटोक्लेव करने और उपयोग के बाद 70% इथेनॉल के बाद बाँझ पानी के साथ एस्पिरेटर को फ्लश करने का सुझाव देते हैं। मीडिया की बाँझपन की जांच करने के लिए केवल मीडिया के साथ एक संस्कृति डिश को कुछ दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। दूषित संस्कृतियों को 30 मिनट के लिए ब्लीच किया जाना चाहिए और छोड़ दिया जाना चाहिए। सेल कल्चर इनक्यूबेटर को भी कीटाणुरहित किया जाना चाहिए।

इस पांडुलिपि के भीतर प्रोटोकॉल और पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के बीच एक बड़ा अंतर हमारे एडीएससी कोलेजनेज पाचन बफर में बीएसए का उपयोग है जो परिपक्व एडिपोसाइट्स और एडीएससी के अलगाव की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, हमारा प्रोटोकॉल अधिकांश प्रोटोकॉल द्वारा सुझाए गए 10% एफबीएस की तुलना में 20% एफबीएस के साथ पूरक एडीएससी विकास माध्यम का उपयोग करता है। हमने देखा है कि रीसस मकाक प्राथमिक एडीएससी 20% एफबीएस के साथ बेहतर अंतर करते हैं। विट्रो में एडीएससी भेदभाव वंश-विशिष्ट प्रेरण एजेंटों द्वारा प्रेरित होता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रेरण एजेंटों को एडीएससी के इन विट्रो एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है। हालांकि, पहले प्रकाशित कई प्रोटोकॉल के विपरीत, एडिपोजेनिक भेदभाव कॉकटेल में इंसुलिन या पीपीएआर एगोनिस्ट शामिल नहीं हैं। हमने और अन्य लोगों ने रीसस मकाक और मानव एडीएससी 14,15,16 दोनों को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है।

इस प्रोटोकॉल में, एडीएससी एडिपोजेनिक भेदभाव की पुष्टि ऑयल रेड ओ और बीओडीआईपीवाई धुंधला तकनीकों का उपयोग करके लिपिड ड्रॉपलेट डिटेक्शन द्वारा की जाती है। यद्यपि इन दागों को क्षेत्र में अच्छी तरह से पहचाना जाता है, आमतौर पर एडीएससी की पहचान करने के लिए सीडी 105 का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री सहित अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है, या एडीएससी17 की शुद्धता स्थापित करने के लिए एंडोथेलियल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मार्कर।

एडीएससी का उपयोग पुनर्योजी चिकित्सा और चयापचय अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। एडीएससी अलगाव और प्रसार बड़ी संख्या में स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन करता है जिनका उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और प्रयोगात्मक तकनीकों के लिए किया जा सकता है, जिसमें इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों तक सीमित नहीं है। इस प्रोटोकॉल में विभेदित एडिपोसाइट्स के लिए एक प्रमुख इच्छित उपयोग में इंसुलिन-उत्तेजित ग्लूकोज अपटेक, लिपोजेनेसिस और उत्तेजित लिपोलिसिस18 जैसे चयापचय परख का उपयोग शामिल है। इसके अलावा, एडीएससी को ओस्टोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंश में विभेदित किया जा सकता है और ऊतक इंजीनियरिंग सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयोग कियाजा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

लेखक अपनी तकनीकी सहायता के लिए कर्टिस वंदे स्टोव को धन्यवाद देना चाहते हैं। प्रोटोकॉल के अंतर्निहित अनुसंधान विकास को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज एंड अल्कोहलिज्म (5पी 60एए009803-25, 5टी32एए007577-20 और 1एफ31एए028459-01) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 % trypan blue Thermo-Fisher 15250061
1.5-ml microcentrifuge tube Dot Scientific 707-FTG
100 % isopropanol Sigma-Aldrich PX1838-P
100-mm cell culture dish Corning 430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018
50-mL plastic conical tube Fisher Scientific 50-465-232
70-µm cell strainer Corning CLS431751
a-MEM Thermo-Fisher 12561056
Aluminum foil Reynolds Wrap
BODIPY Thermo-Fisher D3922
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 05470
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Collagenase, Type I Thermo-Fisher 17100017
Dexamethasone-Water Soluble Sigma-Aldrich D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO Sigma-Aldrich D2650
Distilled water Thermo-Fisher 15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved Sigma-Aldrich F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) Thermo-Fisher 15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo-Fisher 14175095
Hemacytometer with cover slip Sigma-Aldrich Z359629
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Inverted light microscope Nikon DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM) Thermo-Fisher 25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz Reliable Scientific Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %) Pharmco 8BUFF-FORM
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Paraformeldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo-Fisher 10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer Qiagen 158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 Sanyo MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo-Fisher 25200056

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References

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Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e61732, doi:10.3791/61732 (2021).

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