Summary
Vi beskriver en enkeltmolekyltilnærming til antigen-antistoff affinitet målinger ved hjelp av massemetri (MP). Den MP-baserte protokollen er rask, nøyaktig, bruker en svært liten mengde materiale, og krever ikke proteinmodifisering.
Abstract
Målinger av spesifisitet og affinitet av antigen-antistoff interaksjoner er kritisk viktig for medisinske og forskningsapplikasjoner. I denne protokollen beskriver vi implementeringen av en ny enkeltmolekylteknikk, massefotometri (MP), for dette formålet. MP er en etikett- og immobiliseringsfri teknikk som oppdager og kvantifiserer molekylære masser og populasjoner av antistoffer og antigen-antistoffkomplekser på et enkeltmolekylnivå. MP analyserer antigen-antistoffprøven i løpet av minutter, noe som gir nøyaktig bestemmelse av bindingsaffinitet og samtidig gir informasjon om stoichiometry og den oligomeriske tilstanden til proteinene. Dette er en enkel og grei teknikk som krever bare picomolemengder protein og ingen dyre forbruksvarer. Den samme prosedyren kan brukes til å studere protein-proteinbinding for proteiner med en molekylær masse større enn 50 kDa. For multivalente proteininteraksjoner kan affinitetene til flere bindingssteder oppnås i en enkelt måling. Imidlertid pålegger enkeltmolekylet målemåte og mangel på merking noen eksperimentelle begrensninger. Denne metoden gir de beste resultatene når den brukes på målinger av submikrolar interaksjonsaffiniteter, antigener med en molekylær masse på 20 kDa eller større, og relativt rene proteinprøver. Vi beskriver også fremgangsmåten for å utføre de nødvendige tilpasnings- og beregningstrinnene ved hjelp av grunnleggende dataanalyseprogramvare.
Introduction
Antistoffer har blitt allestedsnærværende verktøy for molekylærbiologi og brukes mye i både medisinske og forskningsapplikasjoner. I medisin er de kritisk viktige i diagnostikk, men deres terapeutiske applikasjoner utvides også og nye antistoffbaserte terapier utviklesstadig 1,2,3,4. De vitenskapelige anvendelsene av antistoffer inkluderer mange uunnværlige laboratorieteknikker som immunofluorescence5,immunoprecipitation6,flow cytometri7,ELISA og vestlig blotting. For hver av disse programmene er det avgjørende å oppnå nøyaktige målinger av antistoffets bindende egenskaper, inkludert bindende affinitet og spesifisitet.
Siden det første kommersielle overflateplasmonresonansinstrumentet (SPR) ble introdusert i 1990, har optiske biosensorer blitt "gullstandarden" for antistoffkarakterisering, men andre teknikker, inkludert ELISA, brukes også rutinemessig til å måle antistoffaffiniteter8,9. Disse metodene krever vanligvis immobilisering eller merking av de analyserte molekylene, noe som potensielt kan påvirke samspillet av interesse. De er også relativt trege, og involverer flere analysetrinn før resultatene kan samles inn for dataanalyse. En nylig utviklet enkeltmolekylmetode, massemetri (MP), oppdager molekyler direkte i løsningen når de lander på overflaten av mikroskopet dekker10,11. Den lysspappende optiske deteksjonen som MP bruker, krever ikke proteinmerking eller modifikasjon. Individuelle proteinmolekyler registreres av det interferometriske spredningsmikroskopet som mørke flekker som vises i bildet (figur 1D), og flere tusen molekyler kan oppdages i løpet av ett minutts datainnsamling12. Signalet som genereres av hver enkelt partikkel kvantifiseres, og kontrastverdien (relativ mørke) beregnes. De interferometriske kontrastverdiene er proporsjonale med proteinenes molekylære masser, noe som gjør det mulig å identifisere bundne og frie arter i antigenantistoffblandingen. Samtidig, ved å telle molekylære landingshendelser, måler MP direkte artsbestandene. Dette gir MP-baserte metoder en unik evne til selvstendig å kvantifisere affiniteter av flere bindende nettsteder.
Binding av antigen (Ag) molekyler til de to bindende stedene i det intakte antistoffet (Ab) kan beskrives som:
med likevektsforeningen konstanter Ka1 og Ka2 definert som:
der ci og f i representerer konsentrasjon og brøkdel av komponenten i, henholdsvis. Den totale antigenkonsentrasjonen (cAg)tot kan uttrykkes som:
Siden de totale konsentrasjonene av antistoffet (cAb)tot og antigen (cAg)tot er kjent, kan denne ligningen brukes til å passe direkte til de eksperimentelle komponentfraksjonene hentet fra MP-målingene og beregne likevektsforeningen konstanter Ka1 og Ka2 (se tilleggsinformasjon).
MP-dataene kan også brukes til å estimere samarbeid mellom de to antistoffbindingsstedene11. For to antistoffparatoper med identiske mikroskopiske bindende konstanter, er de statistiske faktorene som beskriver prosessen med populasjonen av Ab· Ag og Ab· Ag2 komplekser tilsier at den tilsynelatende makroskopiske likevekt konstanter Ka1 og Ka2 ikke vil være numerisk lik, og Ka1 = 4Ka2. De eksperimentelle verdiene til Ka1 < 4Ka2 indikerer derfor positiv samarbeid mellom de to antistoffbindingsstedene. Tilsvarende indikerer Ka1 > 4Ka2 negativ cooperativity.
MP målinger av antigen-antistoff binding affinitet er rask og krever en liten mengde materiale. MP massedistribusjoner som brukes for likevekt konstant beregninger gir tilleggsinformasjon om prøveegenskapene og aktiverer vurderingen av prøve renhet, oligomerisering, og aggregering i ett enkelt eksperiment. Den samme metoden kan brukes til å måle høy affinitet protein-protein binding, og MP er spesielt nyttig for studier av multi-valent protein interaksjoner. Multi-protein komplekser har vanligvis store molekylære masser, optimal for MP deteksjon, og enkeltmolekyldata kan brukes til å måle stoichiometry og beregne affiniteter av flere bindende steder samtidig. Denne informasjonen er vanligvis vanskelig å få tak i ved hjelp av bulkbaserte metoder.
Uten modifikasjoner er den nåværende protokollen egnet for målinger av relativt høy affinitet, submikrolarinteraksjoner med antigener av en molekylær masse på 20 kDa eller større. For optimale resultater bør proteinlagrene være av høy renhet, men det er ingen spesifikke bufferkrav. Ved hjelp av MP kan antigen-antistoffbindingen vurderes på mindre enn fem minutter. Datainnsamlingen og analysen som kreves for nøyaktige Kd-beregninger kan utføres innen 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjør strømningskamrene
- Rengjør glassdekslene
- Bruk vaskeflasker med destillert vann, etanol og isopropanol, skyll de 24 mm x 50 mm dekkslepper i følgende rekkefølge: vann, etanol, vann, isopropanol, vann. Tørk dekkglassene med en strøm av rent nitrogen. Det er viktig å skylle dekkglassene fra topp til bunn, og holder nederste hjørne med myktippet tang. Tørk dekkglasset i samme retning for å unngå å overføre kontaminering fra tangen (figur 2A).
- På samme måte skyll de 24 mm x 24 mm dekslepper med destillert vann, etanol og destillert vann. Tørk dekkglassene med en strøm av rent nitrogen.
- Identifiser arbeidssiden av dekkglasset, plasser en dråpe destillert vann på overflaten av den rene dekkslippen og følg trinn 3.1-3.2 i protokollen. Vanligvis har bare den ene siden av 24 mm x 50 mm dekslelip den optiske kvaliteten egnet for MP-målinger.
MERK: Etter fokusering bør ingen signifikante overflatefeil påvises, og "signal"-verdien som vises i datainnsamlingsprogramvaren, bør være mindre enn 0,05 % (figur 1A-C). Arbeidssidene av alle dekkslipper i esken er orientert i samme retning. Den samme prosedyren bør brukes til å teste effektiviteten av dekkglassrengjøring.
- Montere strømningskammeret
- Plasser de 24 mm x 24 mm dekslepperen på et stykke aluminiumsfolie. Plasser strimler med dobbeltsidig tape på toppen av de 24 mm x 24 mm dekslepperen som vist i figur 2B og kutt båndet langs kanten av glasset. Skill dekkslippen fra aluminiumsfolien og fest den til arbeidssiden av 24 mm x 50 mm dekkslipp (figur 2C).
MERK: Kanalstørrelsen kan variere, men en bredde på 3 mm–5 mm anbefales. Bredere kanaler krever større prøvevolumer og svært smale kanaler kan være vanskelig å laste inn. Vanligvis kan to parallelle kanaler enkelt opprettes på 24 mm x 24 mm deksler. Protokollen kan settes på pause her.
- Plasser de 24 mm x 24 mm dekslepperen på et stykke aluminiumsfolie. Plasser strimler med dobbeltsidig tape på toppen av de 24 mm x 24 mm dekslepperen som vist i figur 2B og kutt båndet langs kanten av glasset. Skill dekkslippen fra aluminiumsfolien og fest den til arbeidssiden av 24 mm x 50 mm dekkslipp (figur 2C).
2. Klargjør antistoff-antigenprøvene for affinitetsmålingene
- Filtrer minst 2 ml av PBS-bufferen ved hjelp av 0,22 μm sprøytefiltre for å fjerne støvpartikler eller aggregater. Sentrifuger proteinlageret i 10 minutter med maksimal hastighet på bordplaten sentrifuge (ca. 16 000 x g).
MERK: PBS er den anbefalte bufferen for denne protokollen, men MP har ingen spesielle bufferkrav, og andre biologiske buffere er også akseptable. Høye glyserolkonsentrasjoner (>10 %) og svært lave ioniske styrker (saltkonsentrasjon <10 mM) kan påvirke bilde- og datakvaliteten og anbefales ikke. - Bestem de faktiske konsentrasjonene av antistoffet og antigenlagrene ved å måle deres 280 nm UV-absorbans.
- Beregn målekonsentrasjonene til antistoffblandingen. Hvis den estimerte verdien av antistoffbindende affinitet ikke er kjent, må du planlegge å forberede en prøve med 30 nM antigen og 20 nM antistoffkonsentrasjon. Når den omtrentlige affiniteten er kjent, bør antistoffet til antigenforholdet og konsentrasjonene optimaliseres i henhold til de forventede Kd-verdiene. Bruk den totale antigenkonsentrasjonen i blandingen lik summen av forventet Kd og den totale antistoffkonsentrasjonen i ligningen nedenfor. Forutsatt Kd1 = Kd2 for de to paratopene av antistoffet, vil dette resultere i sammenlignbare konsentrasjoner av det frie antistoffet og antistoff-antigenkompleksene i prøven.
Juster antistoffkonsentrasjonen for å holde den totale proteinkonsentrasjonen i prøven innenfor 10 nM og 50 nM-området. De beste resultatene oppnås ved hjelp av blandinger med antistoffkonsentrasjoner mellom 5 nM og 25 nM.
MERK: MP oppdager proteiner med en molekylær masse større enn 40 kDa. Følgelig kan prøvekonsentrasjoner av antigener med en molekylær masse mindre enn 40 kDa overstige den typiske 50 nM-grensen. Men ved konsentrasjoner høyere enn ca 100 nM, kan selv lavmolekylære masseantigener påvirke bildekvaliteten og nøyaktigheten av Kd-bestemmelsen. - Forbered 50 μL av antistoff-antigenblandingen ved den endelige målekonsentrasjonen beregnet i trinn 2.3.
MERK: Kun én prøve av antistoffblandingen er nødvendig for bestemmelse av Kd. Men å forberede flere prøver med forskjellige antistoffforhold kan bidra til å optimalisere prøvekonsentrasjonen. Hvis data fra flere prøver samles inn, kan de analyseres via en global passform. - Inkuber antigenantistoffblandingen(e) i ca. 10 min ved romtemperatur for å la bindingsreaksjonen nå kjemisk likevekt. Unngå unødvendig lange inkubasjonstider.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av bindingen av kinetikken. For å bekrefte at den kjemiske likevekten er nådd, kan prøvemålinger gjentas ved forskjellige inkubasjonstider. Tidsvariant Kd-verdier indikerer tilstrekkelig lang inkubasjon. Langvarig inkubasjon kan føre til betydelig protein adsorpsjon til overflaten av plast labware og følgelig til betydelige feil i protein konsentrasjon bestemmelse. Av denne grunn anbefales labware med lav vedheft sterkt for MP-prøveforberedelse13.
3. Samle inn massemetridata
- Påfør en dråpe mikroskop nedsenking olje på MP instrument mål og plassere montert strømningskammer på mikroskopet scenen. Sørg for at oljen strekker seg over gapet mellom dekkglasset og målet.
- Last strømningskammeret og fokuser massefotometeret.
- Deponer 10 μL av en ren, filtrert bufferløsning i den ene enden av strømningskammerkanalen som er klargjort i trinn 1. Væske vil komme inn i kanalen ved kapillær handling.
- Juster scenens Z-posisjon for å fokusere mikroskopet på arbeidsflaten på 24 x 50 mm deksler.
- I kategorien Fokuskontroll i datainnsamlingsprogramvaren bruker du de grove trinnbevegelsen Opp- og Ned-knappene til å foreta de første justeringene.
- Klikk skarphet-knappen for å vise skarphetssignalavlesningen og bruk de fine opp- og nedjusteringsknappene for å maksimere skarphetsverdien.
- Klikk knappene Angi fokus og Lås fokus for å aktivere fokussporingsfunksjonen. Et riktig fokusert bilde (figur 1A,C) bør ha "signal" -verdien under 0,05%.
MERK: Hvis "signal"-verdien ved maksimal skarphetsposisjon er over 0,05 %, kan dette indikere urenheter på glassoverflaten eller i bufferen.
- Bruk samme kanal ved å laste 20 μL av antistoff-antigenprøven ved å deponere den på den ene siden av kanalen og blotting væsken fra den andre enden med et lite stykke blotting papir (Figur 2D).
MERK: Volumet på en 3–5 mm bred kanal er ca. 10 μL. Det ekstra prøvevolumet anbefales å erstatte bufferen som finnes i kanalen helt, og for å unngå prøvefortynning. - Når du har lastet inn eksemplet, klikker du umiddelbart på Post-knappen for å starte datainnsamling, og henter en 100 s video (Figur 1D).
- Skriv inn filnavnet på slutten av datainnsamlingen, og klikk OK for å lagre datafilen.
- Kast dekkglassene og tørk oljen fra objektivlinsen med optiske bomullspinner våte med isopropanol.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
4. Analyser MP-dataene
- Behandle den innsamlede videofilen ved hjelp av MP-databehandlingsprogramvaren for å identifisere landingshendelsene.
- Bruk alternativet Fil/åpne -menyen til å laste inn filen for analysen, og klikk Analyser.
- Klikk Last inn-knappen for å laste inn kalibreringsfunksjonen og lagre de analyserte dataene ved hjelp av menyalternativet Fil/lagre resultater som.
- Monter den molekylære massefordelingen med gaussiske funksjoner for å oppnå relative konsentrasjoner av hver art i prøven. Denne analysen kan utføres ved hjelp av en felles vitenskapelig grafprogramvare (se Materials tabell).
- Importer filen "eventsFitted.csv" til programvaren og plott den molekylære massedistribusjonen (kolonne M i .csv-filen) ved hjelp av handlingen / statistikk / Histogram -funksjonen.
- Dobbeltklikk på histogrammet for å åpne vinduet Egenskaper for plott. Deaktiver automatisk binning og velg en hyllestørrelse på 2,5 kDa. Klikk Bruk- og Gå-knappene for å opprette dataene For hyllesentre og tellinger.
- Velg kolonnene Hyllesentre og antall, og bruk menyfunksjonen Analyse/topper og Planlagt/Flere topptilpass for å passe til histogrammet med gaussiske funksjoner. Dobbeltklikk for å angi omtrentlige toppposisjoner på distribusjonsplottet, og klikk deretter Åpne NLFit-knappen.
- Sjekk de faste avmerkingsboksene for "xc" peak sentre og sette sine verdier til de forventede molekylære massene av gratis antistoff og enkelt og dobbel antigen-antistoff komplekser. Merk av for Del for breddeparameterne. Klikk Tilpass-knappen. De monterte topphøydeverdiene til de gaussiske komponentene representerer den relative konsentrasjonen av hver art iprøven 11.
MERK: Hyllestørrelsen kan justeres for å optimalisere oppløsningen på massedistribusjonsplottet. MP presisjonsgrensen er ca. 1 kDa, og mindre hyllestørrelser kan forsterke støyen fra distribusjonen, uten å avsløre ytterligere informasjon. Svært store bin størrelser vil skjule de fine detaljene i massedistribusjoner.
- Beregn konsentrasjonsfraksjonen av hver art ved hjelp av følgende ligning:
der verdienei h i og frepresenterer topphøyder og konsentrasjonsfraksjoner av det frie antistoffet og enkelt- og dobbeltbundet antistoffi prøven.
5. Beregn likevektskonstantverdier
- Monter konsentrasjonsfraksjonene av interaksjonsartene beregnet i trinn 4.3 med Eq. 1 og 2 ved hjelp av en passende analytisk programvare. Her demonstrerer vi en metode for å beregne likevektskonstanter ved hjelp av et regnearkprogram14 (se Tilleggsinformasjon).
- Åpne regnearket "Kd-beregning.xlsx". I dette regnearket kan celleverdiene i rad 1 til 10 uthevet i gult endres for å utføre likevektskonstantberegningene.
- Angi estimerte Kd-verdier i nanomlarenheter i cellene B1 og B2 i tabellen. Disse startverdiene vil bli optimalisert i tilpasningsprosedyren. Hvis de estimerteKd-verdiene ikke er kjent, lar du standardverdiene i cellene B1 og B2 være uendret.
- Angi verdiene for (cAb)tot og (cAg)tot i nanomlarenheter i cellene D2 og E2. Skriv inn brøkverdiene som er beregnet i trinn 4.3 i cellene F2, G2 og H2. Hvis flere prøver ved ulike konsentrasjonsforhold ble målt, kan ytterligere konsentrasjonsverdier oppnådd for disse prøvene angis i rad 2 til 10.
- Velg menyfunksjonen Data/Problemløser. Skriv inn "$B $ 15" i "Sett mål"-boksen og "$B $ 1: $B $ 2" i boksen "Ved å endre variable celler:". Velg Min-alternativknappen for til:-alternativet. Merk av for Gjør ikke-innrente variabler ikke-negative, og velg GRG Nonlinear som løsningsmetode. Klikk på Løs-knappen. De beste passformen Kd1 og Kd2 verdier vil bli vist i celle B1 og B2 og den endelige summen av kvadrerte feil i celle B15.
MERK: Hvis Problemløser-funksjonen ikke er aktiv, velger du Alternativer under Fil-menyen i regnearkprogrammet. I kategorien Tillegg velger du Problemløser-tillegget under Inaktive programtillegg, og klikk på Gå-knappen. Merk av for Problemløser-tillegget, og klikk OK.
Figur 1: Massefotometribilder. (A)Representativt opprinnelig visningsbilde av bildebufferen som samles inn på en ren dekkslip og(B) på en dekkslipp med overflatefeil. (C) Differensialrasjonsforholdsbilde av bildebufferen og (D) AHT· HT-løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MP strømningskammer forberedelse og lasting. (A) Dekslers holderposisjon for rengjøringsprosedyren. (B) Justering av 24 x 24 mm deksleglass (midtlag) og dobbeltsidig tape (øverste lag) på overflaten av aluminiumsfolie (bunnlag, ikke vist). Blå stiplede linjer viser plasseringen av kuttelinjer. (C) Topp og sidevisning av det monterte strømningskammeret med to prøvekanaler, og et bilde av det monterte strømningskammeret. (D) Prosedyre for prøveinnlasting i en flytkanal som tidligere var fylt med buffer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere undersøkt samspillet mellom humant α-trombin (HT) og mus monoklonalt anti-humant trombin antistoff (AHT) ved hjelp av MP-basert analyse11. Siden den molekylære massen av HT (37 kDa) er under 40 kDa-deteksjonsgrensen, kan maksimal prøvekonsentrasjon overskride 50 nM MP konsentrasjonsbegrensning uten å påvirke oppløsningen av massedistribusjoner negativt. Eksperimentet ble planlagt som en titreringsserie med AHT-antistoffet ved en fast 25 nM konsentrasjon, og HT ved konsentrasjoner på 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM og 120 nM. Figur 3 viser de molekylære massefordelingene av antigenantistoffblandingene og antistoffprøven. Her analyserer vi dataene ved hjelp av metoden som er beskrevet i protokollen. En vitenskapelig grafprogramvare ble brukt til å passe massedistribusjonene med tre gaussiske komponenter som representerer den frie AHT, AHT· HT og AHT· HT2. De kjente molekylære masseverdiene til de tre komponentene ble fikset, og en enkelt toppbreddeparameter ble montert for de tre artene. Best-fit peak høyde parametere av gaussiske komponenter ble normalisert ved hjelp av Eq. 3 for å oppnå arter konsentrasjon brøkdeler (Tabell 1). Disse verdiene, sammen med det totale antistoffet og antigenkonsentrasjonen for hver prøve ble inngått i "Kd-beregningen.xlsx". Den globale passformen i regnearket gir Kd1 = 40 nM (68,3% konfidensintervall: 28 nM, 68 nM) og Kd2 = 28 nM (68,3% konfidensintervall: 17 nM, 45 nM). De eksperimentelle konsentrasjonsfraksjonene og tilpasningsresultatene er plottet i figur 4. Dissosiasjonskonstantverdiene som oppnås her ved å montere de integrerte konsentrasjonsfraksjonene, er i samsvar med de som tidligere ble oppnådd ved direkte tilpasning av MP-distribusjoner, og med dissosiasjonskonstante verdier oppnådd av Isothermal Titration Calorimetry (ITC)11.
Figur 3: MP molekylære massedistribusjoner av 25 nM AHT blandet med HT på henholdsvis 0, 7,5, 15, 30, 60 og 120 nM (A-F). Svarte prikker viser eksperimentelle MP-data plottet med 2,5 kDa-hyllestørrelse. Cyan, grønne og blå linjer representerer de best tilpassede gaussiske fordelingene av det frie antistoffet, enkeltbundet antistoff og dobbeltbundet antistoffarter, henholdsvis. Røde linjer viser summen av de tre gaussiske komponentene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Brøkdeler av den frie AHT (blå), AHT· HT (rød) og AHT· HT2(svart) som en funksjon av HT konsentrasjon. Poeng representerer eksperimentelle verdier hentet fra gaussisk montering av MP-distribusjonene. Solide linjer representerer best passform ved hjelp av Eq. 1 og Eq. 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tekniske replikeringer av AHT molekylære massefordelingsmålinger. Plott viser reproduserbarheten til MP-målingene og renheten av antistoffpreparatet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 1000 000 000 000 000 000 000 000 0 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1.50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
Tabell 1: Normaliserte topphøyder på gaussiske komponenter oppnådd ved å montere MP-distribusjonene (figur 3).
Tilleggsinformasjon: Implementering av likevekt konstanter tilpasning prosedyre i Excel og Affinity beregning regneark. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Mass Photometry basert protokoll skissert her gir en rask og nøyaktig metode for å måle antigen-antistoff bindende affiniteter. MP-analyse bruker en svært liten mengde materiale, og tilleggsinformasjon , inkludert stoichiometry, oligomerization og renhet - kan vurderes fra de samme dataene (figur 5). Uten modifikasjoner gjelder denne metoden for målinger av dissosiasjonskonstanter i ca. 5 nM til 500 nM-området, og for ligandmolekyler med molekylær masse på ca. 20 kDa eller større. Den samme protokollen kan brukes ikke bare til å analysere antigen-antistoffbindingen, men også for å måle protein-protein interaksjonaffiniteter når den molekylære massen til minst en av bindingspartnerne er større enn 50 kDa. Siden MP-deteksjonen ikke er spesifikk, kan mp målinger ikke utføres på prøver som inneholder en høy konsentrasjon av bærerproteiner eller store molekylære masseurenheter.
SPR brukes vanligvis til karakterisering av antigen-antistoffbindingen, og direkte sammenligning av begge metodene kan hjelpe med analysevalget. Sammenlignet med SPR er MP-bindingsanalysen raskere og krever ikke proteinimmobilisering. For et typisk bindende eksperiment krever MP mindre materiale enn SPR. MP-data avslører stoichiometry av kompleksene som ikke er lett tilgjengelig fra SPR10,11. Kinetiske parametere for binding kan hentes fra MP data13, men SPR måler bindende kinetikk direkte, og er i stand til å måle et bredere spekter av tilknytnings- og dissosiasjonsrater. Tilknytningskonstantene for to separate bindingsområder kan bare hentes fra SPR-dataene når tilknytningen og dissosiasjonsratene for begge områdene er tilstrekkelig forskjellige. På den annen side kan MP nøyaktig karakterisere molekylære komplekser med flere bindende steder10,11. SPR er i stand til å måle bindende affinitet for små molekylære masseligande, og MP fungerer best for ligande med molekylær masse på ca. 20 kDa eller større.
Innsamling av MP-data av god kvalitet er et kritisk skritt for å oppnå nøyaktige resultater fra denne protokollen. Urenheter i bufferen eller på overflaten av dekkglassene vil forstyrre MP-datainnsamlingen. Feil fokusering forvrenger MP-signalet som fører til feil i molekylære masseestimater og likevektkonstantberegninger. Begge disse faktorene bør undersøkes ved feilsøking av protokollen. En viktig faktor når du arbeider med proteinløsninger med lav konsentrasjon er at overflate adsorpsjon kan føre til tap av materiale og endringer i prøvekonsentrasjonen. De resulterende feilene kan minimeres ved hjelp av lav adsorpsjonslabware og ved å bruke overflate passivisering. For å oppnå nøyaktige resultater er det viktig å la alle proteinfortynninger og blandinger nå kjemisk likevekt, men unødvendig lange inkubasjonstider bør unngås. For hvert proteinsystem anbefales det at frekvensen av det ikke-spesifikke proteinet som binder seg til dekkglassglasset vurderes fra MP-dataene. Hvis det observeres vesentlig forskjellige rater for forskjellige arter, kan MP-data enkelt korrigeres for å unngå potensielle feil i Kd-beregningene 10,11.
Flere faktorer bør vurderes ved planlegging av prøveklargjøring. Nøyaktige resultater kan oppnås ved å måle en enkelt prøve, men antistoffkonsentrasjonene og antistoffkonsentrasjonene må justeres for å oppnå en sammenlignbar konsentrasjon av de frie og bundne artene. Analyse av en enkelt massefordeling dominert av en av reaksjonsartene kan gi akseptable Kd-verdier estimater, men gir vanligvis relativt store tilpasningsfeil11. En alternativ strategi innebærer en global analyse av titreringsdata. Det programvarebaserte tilpasningsverktøyet for regneark som følger med denne protokollen, kan brukes til å tilpasse både individuelle data og for global analyse. Hvis ett enkelt eksperiment eller datasett analyseres, kan konfidensintervallene for parametere med best tilpasning estimeres ved hjelp av feilprojeksjonsmetoden. En detaljert beskrivelse av beregningsprosedyren for konfidensintervaller i regnearkprogramvaren er gitt andre steder14. Når du utformer analysen, anbefales det å planlegge for replikere eksperimenter. Når data fra replikere eksperimenter analyseres, kan standardavvik brukes til å rapportere feil iKd-verdiene.
Protokollen som er beskrevet her kan endres for å utvide sin anvendelighet utover de typiske molekylære masse- og affinitetsområdebegrensningene. Utvalget av målbare affiniteter er begrenset av proteinkonsentrasjonsområdet tilgjengelig av MP, vanligvis fra 10 nM til 50 nM. Dette området kan utvides og proteinprøver ved konsentrasjoner under 10 nM kan måles ved hjelp av perfused strømningsceller og lengre datainnsamlingstider. Proteinprøver ved høyere konsentrasjoner kan potensielt måles ved hjelp av passiverte dekkslepper for MP-målingene. For antigener med en liten molekylær masse vil det frie antistoffet og antigenantistoffkomplekset topper i MP-massedistribusjonene være uløste. Dette vil utelukke bruk av den gaussiske toppmonteringsanalysen som er beskrevet i protokollen. I så fall kan den bindende affiniteten fortsatt måles ved å titrere antistoffet med antigenet og gjennomsnitt mp-distribusjonene for å oppnå gjennomsnittlig molekylær masse av alle arter for hver prøve. Bindingsligningen kan deretter være egnet til disse dataene for å oppnå antigen-antistoffbindende affinitet11.
Når nøyaktig affinitetsinformasjon ikke er nødvendig, kan protokollen forenkles og brukes til rask antistoffinteraksjonsscreening. I så fall kan de kommersielt tilgjengelige pakningsbrønnene brukes i stedet for prøvekanaler for å forenkle den eksperimentelle prosedyren ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Keir Neuman for hans kritiske lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av det intramurale programmet til NHLBI, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Rosenberg, M. I. Protein Analysis and Purification. , Birkhauser. Basel. (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
