Summary
Denne teknik giver mulighed for hurtig og enkel forberedelse af hele frø-størrelse harpiks sektion til observation og analyse af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frøet.
Abstract
Morfologien, størrelsen og mængden af celler, stivelsesgranulat og proteinstoffer i frø bestemmer frøets vægt og kvalitet. De er væsentligt forskellige blandt forskellige områder af frø. For at se morfologier af celler, stivelse granulat og protein organer klart, og kvantitativt analysere deres morfologi parametre præcist, hele frø-størrelse sektion er nødvendig. Selv om hele frø-størrelse paraffin sektion kan undersøge ophobning af lagermaterialer i frø, er det meget vanskeligt at kvantitativt analysere morfologi parametre for celler og opbevaringsmaterialer på grund af den lave opløsning af den tykke sektion. Den tynde harpiks sektion har høj opløsning, men den rutinemæssige harpiks sektionsmetode er ikke egnet til at forberede hele frø-størrelse del af modne frø med en stor volumen og høj stivelse indhold. I denne undersøgelse præsenterer vi en simpel tør sektionsmetode til forberedelse af hele frøstørrelse harpiks sektion. Teknikken kan forberede tværs og langsgående fuldkornsstørrelse dele af udvikle, modne, spirede, og kogte frø indlejret i LR Hvid harpiks, selv for store frø med højt stivelsesindhold. Hele frø-størrelse sektion kan farves med fluorescerende lysere 28, jod, og Coomassie strålende blå R250 til specifikt at udstille morfologi af celler, stivelse granulat, og protein organer klart, henholdsvis. Billedet opnået kan også analyseres kvantitativt for at vise morfologi parametre af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø.
Introduction
Plantefrø indeholder lagringsmaterialer såsom stivelse og protein og giver energi og ernæring til mennesker. Formen, størrelsen og mængden af celle- og opbevaringsmaterialer bestemmer frøets vægt og kvalitet. Cellerne og lagermaterialerne i forskellige områder af frø har betydeligt forskellige morfologier, især for nogle høj-amylose kornafgrøder med hæmning af stivelse forgreningsenzymet IIb1,2,3. Derfor er det meget vigtigt at undersøge morfologier af celler og opbevaringsmaterialer i forskellige områder af frø.
Paraffinsektion er en god metode til at forberede hele frøstørrelsen og kan udvise frøs vævsstruktur og akkumulering af opbevaringsmateriale i forskellige områder af frø4,5,6. Paraffinsektionerne har dog normalt 6-8 μm tykkelse med lav opløsning; Det er derfor meget vanskeligt klart at observere og kvantitativt analysere morfologien af celle- og lagringsmaterialer. Harpikssektionerne har normalt 1-2 μm tykkelse og høj opløsning og er meget velegnede til at observere og analysere morfologien af celle- og opbevaringsmaterialer7. Den rutinemæssige harpikssektionsmetode har imidlertid svært ved at forberede hele frødelen, især for frø med et stort volumen og højt stivelsesindhold; Således er der ingen måde at observere og analysere morfologi af celler og opbevaringsmaterialer i forskellige regioner af frøet. LR Hvid harpiks er en akryl harpiks og udviser lav viskositet og stærk gennemtrængelighed, hvilket fører til dens gode anvendelser i udarbejdelsen af harpiks del af frø, især for korn modne kerner med stor volumen og højt stivelsesindhold. Desuden kan prøven indlejret i LR Hvid harpiks let farves med mange kemiske farvestoffer til klart at udstille morfologi af celler og opbevaringsmaterialer under lys eller fluorescerende mikroskop7. I vores tidligere papir, har vi rapporteret en tør sektionsmetode til forberedelse af hele frø-størrelse dele af modne korn kerner indlejret i LR Hvid harpiks. Metoden kan også forberede hele frø-størrelse del af udvikling, spirede og kogte korn kerne8. Den opnåede hele frø-størrelse sektion har mange anvendelser i mikromorfologi observation og analyse, især for klart at se og kvantitativt analysere morfologi forskelle i celle-og lagermaterialer i forskellige regioner af frø8,9.
Denne teknik er velegnet til forskere, der ønsker at observere mikrostruktur af væv og formen og størrelsen af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø ved hjælp af lys mikroskop. Billederne af hel-frø-størrelse sektioner farves specielt til at udstille celler, stivelse granulat, og protein organer kan analyseres ved morfologi analyse software til kvantitativt at måle morfologi parametre af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige områder af frø. For at påvise den tekniske anvendelighed og afsnitsapplikationer af hele frøstørrelse har vi undersøgt de modne frø af majs og raps og risudviklede, spirede og kogte kerner af ris i denne undersøgelse. Protokollen indeholder fire processer. Her bruger vi moden majskerne, som er den vanskeligste til at forberede de store sektioner på størrelse med frø på grund af det store volumenindhold og det høje stivelsesindhold, som en prøve til at udstille processerne trin for trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af harpiksindreduceres frø (figur 1)
- Der bestemmes seks majsmodne kerner i 10 ml 2,5 % fosfatbupud (0,1 M, pH7.2) ved 4 °C i 48 timer. Forskerne kan vælge andre fiksative blandinger, fiksative koncentrationer, og fiksering betingelser i henhold til deres forskning mål og væv typer.
- Tag kernerne ud og skær dem i længderetningen eller på tværs til 2-3 mm tykkelse ved hjælp af en skarp dobbeltsidet klinge, og fastgør dem i 10 ml 2,5 % fosfatbuste buffer (0,1 M, pH 7,2) igen i 48 timer.
- Prøverne vaskes tre gange med 10 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,2) i 30 minutter hver gang.
- Dehydrer prøverne i stigende kvaliteter af ethanol vandig opløsning (10 ml) fra 30% til 50%, 70%, 90% én gang, og 100% tre gange i 30 min hver gang.
- Infiltrere prøverne i 10 ml stigende kvaliteter af LR Hvid harpiks opløsning fortyndet med ethanol fra 25% til 50%, 75% én gang, og 100% to gange ved 4 °C for 12 timer hver gang.
- Forbered piedestaler til prøver før indlejring. Der tilsættes 0,25 ml 100% LR Hvid harpiks i et 2-ml centrifugerør, og det polymeriseres ved 60 °C i 48 timer.
- Tilsættes successivt den rene LR White harpiks (0,5 ml) og den infiltrerede prøve i centrifugerøret med en piedestal. Ret prøverne ud med den anatomiske nål, og polymeriser dem ved 60 °C i en ovn i 48 timer.
2. Tørsektion til fremstilling af sektionen med hele frøstørrelse (figur 1)
- Tag de indlejrede kerner ud af centrifugerøret, og skær den overskydende harpiks ud omkring prøven ved hjælp af en skarp klinge.
- Fastspænd harpiksblokken i prøveholderen af ultramicrotome (EM UC7), og trim den overflødige harpiks af på prøvens overflade og omkring prøven med en klinge.
- Finpuds overfladen af prøven fint med en glaskniv, indtil en komplet sektion kan dannes.
- Sæt en lille kobberkrog ca. 2 mm over klingekanten, før du skærer, og skær prøven i en 2 μm sektion. Krogens rolle er at undgå curling opad af sektionen.
- Sæt krogen under sektionen for at støtte den, når sektionen bliver lang.
- Der tilsættes 100 μL vand på en uforberedt rutsjebane, og den komplette og ubrudte del overføres forsigtigt til vandet med pincet.
- For at udjævne den rynkede sektion opvarmes og tørres prøven på udfladningsbordet ved 50 °C natten over.
- Hvis sektionen smuldrer eller river, forlænges tiden for hver harpiksinfiltration af prøven fra 12 timer til 24 timer eller 48 timer.
- Hvis sektionen har nogle linjer parallelt med kniven, klemme prøveblokken stramt. Hvis sektionen har nogle linjer lodret til kniven, skal du bruge en ny kniv.
3. Farvning og observation af afsnittet
BEMÆRK: For at observere vævsstrukturen og morfologien af celler, stivelsesgranulat og proteinstoffer, plette sektionerne med specifikke pletter i henhold til formålet med forskningen. Her bruger vi fluorescerende lysere 28, jod opløsning, og Coomassie strålende blå R250 at plette cellevægge, stivelse granulat, og protein organer, henholdsvis.
- Til observation af cellernes morfologi skal afsnittet plettes med 40 ml 0,1 % (w/v) lysstofrør 28 vandige opløsninger i en 70 ml kompakt glasfarvningskrukke ved 45 °C i 10 min. og skyl den derefter med rindende vand i 5 min. Overhold og foto afsnittet under en fluorescens mikroskop udstyret med et CCD-kamera.
- Til observation af stivelsesgranulatets morfologi skal afsnittet med 40 μL jodopløsning (0,07 % (w/v) I2 og 0,14 % (w/v) KI plettes i 25 % (v/v) glycerol) i 1 min. og dække den prøve, der indeholder jodopløsning, med en dæksel. Se og fotografer prøven under et lysmikroskop udstyret med et CCD-kamera.
- Til observation af proteinstoffers morfologi nedsænkes sektionen med 40 ml 10 % (v/v) eddikesyre i en 70 ml kompakt glasfarvningskrukke i 10 min ved 45 °C og derefter plette det i 40 ml 1% (w / v) Coomassie strålende blå R250 i 25% (v / v) isopropanol og 10% (v / v) eddikesyre i 15 min ved 45 °C. Vask de farvede sektioner med rindende vand i 5 min, og tør det. Overhold og foto afsnittet under et lysmikroskop udstyret med et CCD-kamera.
4. Kvantitativ analyse af morfologiparametre
- Proces og kvantitativt analysere de fotograferede billeder for område, lang / kort akse, og rundhed af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø ved hjælp af morfologi analyse software (Image-Pro Plus 6.0 software) efter procedurerne i Zhao et al.9 nøjagtigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkel tørsektionsmetode til opnåelse af en sektion på hele frøstørrelse
Vi etablerer en simpel tør sektionsmetode til fremstilling af en hel-frø-størrelse sektion af frø indlejret i LR-hvid harpiks (Figur 1). Metoden kan forberede tværgående og langsgående helfrøstørrelsessektioner med en tykkelse på 2 μm (Figur 2-5, supplerende figur 1-4). For eksempel kan det modne frø af raps indsnit på tværs og i længderetningen (figur 2). For kornafgrøder er deres modne kerner fulde af stivelsesgranulat, hvilket fører til, at det er meget vanskeligt at forberede hele frøstørrelsessektionen. Ved hjælp af denne teknik kan der også fremstilles dele af den modne majs på tværs af og i længderetningen af moden majs med stor volumen(figur 4,supplerende figur 1). Desuden kan riss udviklingskerne ( supplerende figur2),spirede kerne ( supplerende figur3) og kogt kerne (supplerende figur 4) undersøges ved hjælp af metoden.
Anvendelser af hele frøstørrelse
Observation af frøs vævsstruktur
Hele frø-størrelse sektion kan bruges til at observere væv struktur af frø. For eksempel består embryonet af raps af radikel, hypocotyl, plumule og to cotyledons. De indre og ydre cotyledoner bøjes i halve, indpakning hypocotyl og radikel og gør fosteret sfærisk (Figur 2A,C). De langsgående og tværgående dele af hele embryostørrelse, der er besynet med safranin, udviste tydeligt radilen, hypocotyl, indre cotyledon og ydre cotyledon (Figur 2B,D). Den langsgående hele embryo-størrelse del af raps fremstilles vanskeligere end den tværgående sektion. Derfor anvendes embryonernes tværgående afsnit i vid udstrækning til at undersøge embryoners mikromorfologi i reference5,10.
Morfologi og analyse af celler i forskellige områder af frø
Hele frø-størrelse sektion kan bruges til at observere og analysere morfologi af celler i forskellige områder af frø. For eksempel blev de tværgående hele embryo-store dele af raps farves med fluorescerende lysere 28, og cellevæggene blev farves specifikt (Figur 3A). Mikromorfologien af celler i alle områder af embryon kunne tydeligt vises ved høj forstørrelse (Figur 3B,C). Radikel består af epiderm, cortex, og vaskulære væv. De epidermale celler placeret i det yderste lag af radikel var rektangulære og radialt arrangeret. De kortikale parenkymceller var runde i form og store i størrelse. Nogle forskellige rum blev observeret mellem kortikale celler. De kortikale celler blev arrangeret i lag indefra og ud (Figur 3B). De epidermale celler af cotyledon var firkantede og havde lille volumen. Der var ingen signifikante forskelle i form og størrelse af epidermale celler blandt ydre og indre overflader af indre og ydre cotyledons. Nogle vaskulære cylindre blev spredt i midten af mesophyll væv af indre og ydre cotyledons. Mesophyll parenkymcellerne var betydeligt større end epidermale celler og vaskulære cylinderceller i cotyledon. Mesophyll parenkymcellerne viste et typisk palisading-arrangement i den indre region af ydre cotyledon og den ydre region af indre cotyledon (Figur 3C). Parenkymcellerne havde signifikant forskellige morfologier i forskellige områder af embryon. For at afsløre deres forskelle i morfologi, blev region 1, 2, 3, 4 og 5 valgt i radicle kortikale væv, indre region af indre cotyledon, ydre region af indre cotyledon, indre region af ydre cotyledon, og ydre region af ydre cotyledon, henholdsvis (Figur 3B,C). Morfologiparametrene for parenkymcellerne i de fem ovennævnte regioner blev kvantitativt analyseret ved hjælp af morfologianalysesoftware (supplerende tabel 1). Området, lang akselængde, kort akselængde og rundhed af parenkymceller viste nogle forskelle i forskellige områder af embryoner.
Cellerne i endosperm var fulde af stivelse og opbevaringsprotein. Ved hjælp af hele frø-størrelse harpiks sektion, er det let at observere og analysere cellerne i forskellige regioner af endosperm. F.eks. kunne morfologien af celler i alle områder af majs endosperm ses tydeligt, efter at de tværgående dele af hele frøstørrelsen var blevet plettet med lysstofsprækker 28. De perifere, midterste og centrale endospermer i samme kerne udviste markant forskellige former og størrelser af celler (supplerende figur 1). For kvantitativt at analysere morfologi parametre af celler i forskellige regioner af endosperm, billederne af regioner blev analyseret ved hjælp af morfologi analyse software; cellernes morfologiparametre præsenteres i supplerende tabel 2. Endospermcellerne i region 1 havde det mindste område blandt fire regioner, dem i region 2 var større end cellerne i region 3, men mindre end i region 4.
Morfologi og analyse af stivelsesgranulat i forskellige områder af frø
De modne frø fra de fleste planteressourcer, især til kornafgrøder, indeholder et højt stivelsesindhold. Granul morfologi og størrelse stivelse har vigtige virkninger på stivelse egenskaber og spiller en rolle i kvaliteten af frø. Harpiksen del af frø kan farves med jod opløsning til at udstille morfologi stivelse granulat i forskellige områder af frø. F.eks. blev majssedelene på tværs af og i længderetningen tilberedt med succes. De afsnit, der er plettet med jod, udviste stivelsesmorologi (Figur 4). For at vise stivelsesgranulatets morfologi i forskellige regioner af endosperm blev de fire regioner og ni regioner udvalgt i henholdsvis tværgående og langsgående afsnit af fuldfrø (figur 4). Stivelsesgranulat i forskellige regioner viste signifikant forskellige morfologi, størrelse og mængde i endospermceller. For tværgående sektion havde region 1 sfæriske stivelsesgranulat, region 2 havde polygonale granulat, og stivelsesgranulat i begge regioner 3 og 4 var sfæriske. For afsnit i længderetningen var stivelsesgranulat med polygonal form i region 1, 4, 5 og 8 større end dem med sfærisk form i region 3, 7 og 9, og nogle sammensatte stivelsesgranulat blev observeret i region 2 og 6.
Den kvantitative analyse af morfologiske parametre for stivelsesgranulat i fire områder af tværsnitssektionen blev vist i supplerende tabel 3. Stivelsesgranulat i region 1 havde den mindste størrelse, dem i region 2 havde den største størrelse, og dem i region 3 var større end i region 4.
Mikromorfologi og analyse af proteinstoffer i forskellige områder af frø
Hele frø-størrelse sektion med høj opbevaring protein kan bruges til at vende og analysere morfologi af protein organer i forskellige regioner af frø. For eksempel blev den tværgående del af embryo af raps af raps plettet med Coomassie strålende blå R250, og opbevaringsproteinet var farvet blå (Figur 5). Den rumlige fordeling af lagringsproteinet i embryonet kan tydeligt observeres ved lav forstørrelse (figur 5A). Opbevaring protein er til stede i protein organer. Ved høj forstørrelse udviste proteinkroppen en heterogen matrix med nogle sorte granulat og en uindgroet gennemsigtig struktur (Figur 5B). Proteinstofferne i frø har tre typer: den første type består af en homogen proteinmatrix og har ingen indeslutninger, den anden type indeholder kugleformede krystaller, og den tredje type indeholder kugleformede krystaller og pseudokrystaller11. De kugleformede krystaller i proteinkroppen består af fytat og andre uorganiske salte, som ikke er farves. Disse kugleformede krystaller er sorte på grund af, at lyset ikke kan passere gennem dem under mikroskop. Desuden er den sfæriske krystal skrøbelig og vanskelig at blive trængt ind af fiksativ og indlejringsmidlet. Når du foretager afsnittet, de sfæriske krystaller undertiden brast ud, hvilket resulterer i en gennemsigtig hulrum inde i protein kroppen11. Proteinkroppen af rapsembryon indeholdt sfæriske krystaller i henhold til dets mikromorfologi (Figur 5B). For at undersøge den geografiske fordeling af proteinstoffer i embryonet blev fem regioner i hele embryo-afsnittet valgt til at repræsentere det radile kortikale væv, indre region af indre cotyledon, den ydre region af indre cotyledon, indre region af ydre cotyledon og den ydre region af ydre cotyledon (figur 5A,C-G). Proteinstofferne i alle embryonregioner var sfæriske, ellipseformede og uregelmæssige i form (Figur 5C-G).
Kvantitativ analyse af proteinstoffer i første og anden lay parenkym-celler tæt på epidermis i ovennævnte udvalgte fem regioner er beskrevet i supplerende tabel 4. Området protein krop havde en lille forskel mellem de valgte fem regioner. Den runde af protein kroppen var betydeligt lavere i den ydre region af ydre cotyledon end i de andre fire regioner, hvilket indikerer protein kroppen i ydre cotyledon var tæt på kuglen. Antallet og arealindekset for proteinkrop i celle var signifikant højere i radileparenkymcellen end i cotyledon parenkymcellen (supplerende tabel 4).
Figur 1: Forberedelse af en halvthinsektion i hele frøstørrelse ved hjælp af tørsektionsmetode. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Embryos vævsstruktur i modne frø af rapssort Huashuang 5. A )Embryoetsmorfologi. b) Vævsstruktur i sektionen på fuld og tværs af embryoner i længderetningen. c) Morfologi af tværgående fuld-embryo-størrelse sektion. d) Vævsstruktur af tværgående sektion på fuld fosterstørrelse. Sektionerne var plettet med safranin. H, hypocotyl; IC, indre cotyledon; OC, ydre cotyledon; R, radikel. Skalalinje = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologi af celler i embryo af rapssort Huashuang 5. a) Tværgående tværsnit, der er fyldt med embryoner, farves med lysstofrør 28. b) Forstærkning af region B i afsnitA, der viser radikelradilens cellemorfologi og vævsstruktur. c) Forstærkning af region C i (A), der viser cellemorfologi og vævsstruktur af indre og ydre cotyledon. Skalabar = 500 μm for (A) og 100 μm for (B,C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Morfologi af stivelsesgranulat i moden kerne af majssorten Zheng 58. De tværgående (A) og sektioner i længderetningen (B) blev plettet med jodopløsning, og deres regionale forstærkninger udviser morfologien af stivelsesgranulat i forskellige regioner af endosperm. Skalabar = 1 mm for sektionen af hele frøstørrelse og 20 μm til regionale forstærkninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Morfologi af proteinstoffer i embryo af rapssort Huashuang 5. (A) Tværgående fuld-embryo-størrelse sektion plettet med Coomassie strålende blå R250. (B) Forstærkning af proteinstoffer, der viser deres mikrostruktur. (C-G) Forstærkning af region C-G i (A), der viser proteinkroppens morfologi i radikel (C), indre region af indre cotyledon (D), den ydre region af indre cotyledon (E), indre region af ydre cotyledon ( F ),denydre region af indre cotyledon (G). Skalabar = 500 μm for (A), 5 μm for (B) og 50 μm for (C-G). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1: Morfologi af celler i moden kerne af majssorten Zheng 58. Den tværgående fuldkornsstørrelse sektion blev plettet med fluorescerende lysere 28, og dens regionale forstærkninger (1-4) udviser morfologien af endospermceller i forskellige regioner af endosperm. Skalabar = 1 mm for sektionen på hele frøstørrelse og 100 μm til regionale forstærkninger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 2: Morfologi for udvikling af rissortens kerne 9311. De tværgående helfrø-størrelser sektioner på forskellige dage efter blomstring (DAF) blev modstæntet med safranin O og jod opløsning. Skalalinje = 0,5 mm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Morfologi af spiret kerne af rissort Te-qing. Den langsgående fuld-frø-størrelse sektion på 8 dage efter imbibition blev modstændt med periodiske syre-Schiff's og toluidin blå O, og dens regionale forstærkninger udviser morfologi ændringer af endosperm i forskellige regioner af frø. Skala bar = 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 4: Morfologien af kogt kerne af rissort Te-qing. Den tværgående hele frø-størrelse sektion blev plettet med jod opløsning, og dens ydre, midterste og indre region forstærkninger udviser morfologi ændringer af stivelse granulat i frø under tilberedningsprocessen i 0, 10, 20 og 30 min. Skala bar = 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Morfologi parametre af celler i forskellige regioner af raps embryoa Klik her for at downloade denne tabel.
a. Dataene betyder, at ± afvigelser (n = 3), og værdierne i samme kolonne med forskellige bogstaver er væsentligt forskellige (p < 0,05).
b. Regionerne er vist i figur 3B, C.
kr. LAL: lang akselængde; SAL: kort akselængde; Afrundethed: (omkreds 2)/(4×π×område).
Supplerende tabel 2: Morfologi parametre for celler i forskellige regioner af majs endosperma Klik her for at downloade denne tabel.
a. Data betyder, ± standardafvigelser (n = 3). Værdierne i samme kolonne med forskellige bogstaver er væsentligt forskellige (p < 0,05).
b. Områderne er vist i den tværgående del af majskernen i supplerende figur 1.
kr. LAL: lang akselængde; SAL: kort akselængde; Afrundethed: (omkreds 2)/(4×π×område).
Supplerende tabel 3: Morfologi parametre for stivelse granulat i forskellige regioner af majs endosperma Klik her for at downloade denne tabel.
a. Data betyder, ± standardafvigelser (n = 3). Værdierne i samme kolonne med forskellige bogstaver er væsentligt forskellige (p < 0,05).
b. Regionerne er vist i den tværgående del af majskernen i figur 4A.
kr. LAL: lang akselængde; SAL: kort akselængde; Afrundethed: (omkreds 2)/(4×π×område).
Supplerende tabel 4: Morfologi parametre for protein organer i forskellige regioner af raps embryoa Klik her for at downloade denne tabel.
a. Dataene betyder, at ± afvigelser (n = 3), og værdierne i samme kolonne med forskellige bogstaver er væsentligt forskellige (p < 0,05).
b. Regionerne er vist i figur 5.
kr. Afrundethed: (omkreds2)/(4×π×område) Områdeindeks er området forholdet mellem protein krop til celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frøene er den vigtigste vedvarende ressource for fødevarer, foder og industrielle råvarer, og er rige på opbevaring materialer såsom stivelse og protein. Cellernes morfologi og kvantitet og opbevaringsmaterialernes indhold og konfiguration påvirker vægten og kvaliteten af frø7,12. Selvom stereologi og billedanalyseteknologi kan måle størrelsen og mængden af celler i en vævsregion, mangler de i mange laboratorier. Paraffin- og harpikssektionerne giver et todimensionelt billede (2D), hvilket på ingen måde kan analysere cellernes sande størrelse og mængde. Cellerne skæres dog tilfældigt på deres planer, gennemsnitsstørrelsen af mange celler (over 100) fra mindst tre forskellige dele af vævsområdet kan afspejle cellernes 2D-morfologiparametre (længde, bredde og område), og forholdet mellem det valgte områdeområde og middelcelleområdet kan afspejle mængden af celler. Derfor er det meget vigtigt for in situ visning og analyse af morfologi af celler og opbevaringsmaterialer i forskellige regioner af frø. Paraffin sektionen er den mest velegnede til forberedelse af hele frøstørrelse sektion, især for store frø7. Men cellerne er fulde af opbevaringsmaterialer med frøudvikling, hvilket fører til, at det er meget vanskeligt at opnå den gode hele frøstørrelse sektion fra sent udvikle frø og modne frø. Desuden er paraffinsektionen for tyk til at kunne tydeligt udstille morfologien og er kun egnet til at undersøge frøetsvævsstruktur 7.
Harpikssektionen er tynd og kan tydeligt udstille morfologien af celler, stivelsesgranulat og proteinstoffer7. Den rutinemæssige harpiks er dog ikke egnet til sektion på fuld frøstørrelse. Den teknik, der præsenteres her, repræsenterer en hurtig, enkel og skarp tilgang til udarbejdelse af tværgående og langsgående helfrø-store sektioner af modne frø indlejret i harpiks til visning af morfologi af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø ved hjælp af lys mikroskopi (Figur 2-5,SupplerendeFigur 1). Desuden kan teknikken også forberede den del af udvikling, spirede, og kogte frø til in situ undersøge morfologi ændringer af celle, stivelse, og protein organer i forskellige regioner af frø.
En anden klar fordel, at denne teknik giver, er anvendelsen af fuld-frø-størrelse sektioner. I den nye æra af phenomik og metabolomik er det vigtigt kvantitativt at måle morfologiparametrene for celler, stivelsesgranulat og proteinstoffer i forskellige områder af frø. Den nye teknik, sammen med morfologi analyse software, gør det muligt for forskeren at kvantitativt analysere morfologi parametre af celler, stivelse granulat, og protein organer i forskellige regioner af frø (Supplerende tabel 1-4).
Selv om den nuværende tørre sektionsmetode med held kan forberede hele frø-størrelse harpiks sektion, det har nogle begrænsninger og mangler. For paraffinsektionen kan paraffinen nemt fjernes fra sektionen. men for harpikssektionen kan harpiksen ikke fjernes fra sektionen, hvilket fører til den planteprøve, der er indlejret i harpiks. Sammenlignet med paraffinsektionen er den nuværende harpikssektion på størrelse med hele frø derfor ikke egnet til at udføre histokemi og immunhisemi. Desuden kan den rutinemæssige harpikssektionsmetode skære prøverne i 0,5-2 μm glatte sektioner på grund af prøveblokken med lille volumen. Men den nuværende tørre sektionsmetode er vanskelig at forberede de glatte sektioner med tykkelse på mindre end 2 μm, især for modne frø med stor volumen og højt stivelsesindhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansieringen blev ydet af National Natural Science Foundation of China (32071927), Talent Project of Yangzhou University og Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A.
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
