Summary
דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה המאופיינת בדלקת ופיברוזיס של הלבלב, הקשורים לעתים קרובות עם כאבי בטן עקשניים. מאמר זה מתמקד בשיפור הטכניקה ליצירת מודל עכבר של CP באמצעות עירוי צינור המרה עם 2,4,6 -טרינדרובנזן חומצה גופרתית (TNBS).
Abstract
דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה מורכבת הכוללת דלקת לבלב ופיברוזיס, ניוון בלוטות, כאבי בטן ותסמינים אחרים. מספר מודלים מכרסמים פותחו כדי לחקור CP, אשר צינור המרה 2,4,6 -טריניטרובנזן חומצה גופרתית (TNBS) מודל עירוי משכפל את התכונות של כאב נוירופתי לראות CP. עם זאת, עירוי סמים צינור המרה בעכברים הוא מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מדגים את ההליך של עירוי TNBS צינור המרה עבור הדור של מודל עכבר CP. TNBS היה חדורה לתוך הלבלב דרך האמפולה של ואטר בתריסריון. פרוטוקול זה מיטב את נפח התרופה, טכניקות כירורגיות וטיפול בסמים במהלך ההליך. עכברים שטופלו ב-TNBS הראו תכונות של CP כפי שמשתקפות על ידי הפחתות במשקל הגוף והלבלב, שינויים בהתנהגויות הקשורות לכאב, ומורפולוגיה לבלב חריגה. עם שיפורים אלה, התמותה הקשורה הזרקת TNBS היה מינימלי. הליך זה הוא לא רק קריטי ביצירת מודלים מחלת הלבלב, אלא הוא גם שימושי במשלוח תרופות הלבלב המקומי.
Introduction
דלקת לבלב כרונית (CP) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת על ידי ניוון הלבלב, פיברוזיס, כאבי בטן, ובסופו של דבר אובדן של תפקודים אקסוקריניים ואנדוקרינים1. הטיפולים הרפואיים והכירורגיים הנוכחיים אינם מרפאים אך נעשים כדי להקל על הסימפטומים שהם תוצאה של המחלה: כאבי בטן עקשן, תפקוד אנדוקריני ואקסוקריני. לכן, טיפולים יעילים יותר נדרשים בדחיפות2. מודלים של בעלי חיים מספקים כלי חיוני לפיתוח הבנה טובה יותר של המחלה וחקירת טיפולים פוטנציאליים3. מודלים עכבר מרובים עבור CP פותחו, אשר cerulein ו / או מודלים אלכוהול נפוצים. Cerulein, אוליגופפטיד מגרה הפרשת הלבלב, הוכח לגרום להתרבות מודל CP הכולל ניוון הלבלב, פיברוזיס, בין היתר4. מודל נפוץ אחר משתמש זריקות סדרתיות של L-ארגנין, אשר מייצרת אי ספיקה אקסוקרינית דומה לזו שנצפו בחולים אנושיים5. CP יכול גם להיות מושרה על ידי קשירת צינור הלבלב מלאה או חלקית, כמו גם יתר לחץ דם צינור הלבלב6,7. למרות מגוון המודלים של בעלי חיים הזמינים עבור CP, אף אחד מהמודלים האלה למעשה משחזר את כאבי הבטן שחווים חולי CP8.
מחקרים קודמים הראו כי הזרקת לבלב מקומית של 2,4,6 - טריילרבנזן חומצה גופרתית (TNBS) משכפלת את הכאב המתמשך שחווים חולי CP9,10,11. עכברים שטופלו ב- TNBS הדגימו רגישות יתר בבטן והתנהגויות מוגברות הקשורות לכאב, כמו גם "רגישות יתר כללית" לגירויים כואבים, תופעה שנצפתה בחולי CP10. בנוסף לחיקוי מדויק של כאבי CP, מודל TNBS משכפל גם תכונות פתולוגיות אחרות של המצב האנושי כגון פיברוזיס, חדירת תאים מונונוקלאריים והחלפת תאי סינאר ברקמתשומן 10,12. עם זאת, עירוי TNBS באמצעות צינור המרה הוא הליך מאתגר מבחינה טכנית בעכברים שעלול לגרום למוות. למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול חזותי כדי להראות כיצד עירוי צינור המרה מבוצע. במאמר זה, אנו מדגימים את ההליך של עירוי אוורור מרה של TNBS כדי ליצור מודל עכבר CP. הליך זה יסייע לייצר מודלים בעלי ערך לבעלי חיים לחקר CP ומחלות לבלב אחרות וניתן להשתמש בו כדי להחדיר חומרים אחרים (למשל, וירוס, תאים) לתוך הלבלב13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נערכו באישור ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובמרכז הרפואי ראלף ה. ג'ונסון. C57BL / 6J עכברים זכרים בין 8-10 שבועות של גיל שימשו במחקר זה. עכברים שוכנו תחת מחזור כהה סטנדרטי של 12 אור/ 12 עם ליביטומקס עד למזון ומים.
1. הכנת פתרון TNBS להזרקה
- הכן 10% אתנול ב 0.9% מלוחים. להמיס את המניה TNBS (ראה טבלה של חומרים) ב 10% אתנול לריכוז סופי של 7.5 מ"מ על ידי הוספת 7.5 μL של TNBS לתוך 1 מ"ל של 10% אתנול.
זהירות: TNBS מהווה סכנה כימית. הכן את הפתרון בתוך מכסה המנוע של האדים והשתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה כדי להימנע ממגע ישיר עם TNBS. - לטעון 50 μL של 0.75% פתרון TNBS לתוך מזרק אינסולין עם מחט 31-מד. לטעון 50 μL של 10% אתנול מלוח לתוך מזרק באותו גודל כמו בקרת רכב. מניחים את המזרקים על הקרח ומגינים עליהם מפני אור עד הצורך.
2. הכנת עכבר וניתוח
- תגלח את השיער מאזור ניתוח הבטן.
- הזריקו מנה אחת מראש של המשפך (למשל, בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג i.p. ) לפני הניתוח.
- לגרום ולשמור על העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו 1 L / min של חמצן. אשר את ההשפלה על ידי צביטת בהונות והתבוננות בחיה מחוסר רפלקס.
- מניחים את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח. החל משחה וטרינרית על כל עין כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה.
- לחטא את האתר הכירורגי על ידי ניגוב האזור הכירורגי 3x עם 2% יוד, ואחריו 70% אלכוהול(שולחן החומרים).
- בצע לפרוסטומיה עם מספריים מיקרו כדי ליצור 0.5-1 ס"מ ירידה.
- לחשוף בעדינות את התריסריון ולאתר את צינור המרה המשותף באמצעות צמר גפן(שולחן החומרים).
- הנח קליפ מיקרו המו ישר(שולחן חומרים)מעל הצינור המשותף הפרוקסימלי כדי למנוע את זרימת TNBS או פתרונות רכב לתוך הכבד וכיס המרה (איור 1A,B).
- לחשוף בעדינות את התריסריון ולהכניס את המחט לתוך צינור הלבלב דרך הפפילה של ואטר.
- לאחר המחט היא בתוך הצינור, למקם קליפ מיקרו המו מעוקל (שולחן החומרים) מעל התריסריון המקיף את המחט (איור 1A) כדי לאבטח את המחט במקום ולמנוע את הפתרון המוזרק מלהיכנס לתריסריון.
- בהדרגה להחדיר את הפתרון (TNBS או רכב) לתוך צינור הלבלב במהלך דקה אחת.
הערה: TNBS צריך להיות חדור לאט על פני דקה אחת של זמן, וזה קל לשלוט על מהירות העירוי כאשר הלבלב הוא perfused עם מזרק אינסולין עם מחט 5/16 אינץ 'ו 31G. שמור על היד יציבה ככל האפשר כדי למנוע דקירה צינור המרה. אם TNBS מוזרק בהצלחה, צבע צהוב עשוי להיות גלוי בתוך הלבלב. - לאחר עירוי, להסיר בזהירות את מהדק מיקרו ליד הכבד, ולאחר מכן להסיר את מהדק מיקרו מחזיק את המחט ואת התריסריון.
- החזירו בזהירות את התריסריון למיקומו המקורי.
- השאירו 0.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חמה (36-37 מעלות צלזיוס) בחלל הבטן לפני הסגירה, כדי לעזור לתריסריון לחזור למיקומו המקורי ולסייע בהתאוששות של פריסטלזיס.
- סגור את החתירה בשכבת השריר באמצעות תפר רציף עם תפר 5-0. סגור את העור באמצעות תפר מופרע עם תפר 4-0.
- מניחים את הכלוב המכיל עכברים על כרית חימום כדי לאפשר התאוששות מההרדמה.
- אשר כי העכברים חמים ומסוגלים תנועה ספונטנית לפני החזרתם לחדר ההחזקה.
- המשך לספק מכנס לשון (למשל, buprenorphine 0.1 מ"ג / קילוגרם i.p.) כל 12 שעות חום משלים עבור 48 שעות לאחר הניתוח.
3. ניטור התנהגות העכבר
- הסר תפרים ביום 7 לאחר הניתוח.
- נטר את בריאות העכבר ואת התנהגותו מדי יום במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח. צפה בסימני מצוקה כגון השמעה, תנוחת גב כפופה או ירידה בקטר. למדוד את משקל הגוף כל יומיים.
- השתמש פון פרי monofilaments (VFFs) כדי למדוד רגישות יתר מכנית בטן לפני, ו 2, 3 שבועות לאחר הניתוח כמתואר9,14.
- החל VFFs של כוחות מיושמים שונים בסדר עולה על אזור הבטן העליונה 10x כל 1-2 s. שקול את העלאת, נסיגה, או ליקוק הבטן (תגובת גמילה) כתגובה חיובית.
- החל גירוי חזק יותר אם לא נצפתה תגובה חיובית, וגירוי חלש יותר אם נצפתה תגובה חיובית. סף המשיכה הוא הכוח שבו העכבר מגיב 50% מהזמן.
4. איסוף וניתוח היסתולוגי של רקמת הלבלב
- להקריב את העכברים תחת הרדמה על ידי נקע צוואר הרחם, בזהירות לנתח את הלבלב מן המעי ואיברים אחרים.
- תקן את הלבלב ב 10% paraformaldehyde עבור 24 שעות, הטמעה פרפין, לחתוך קטעי רקמות של 5 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.
- בצע המטוקסילין-אאוזין, והכתמת טריכרום של מאסון בשיטות סטנדרטיות כפי שדווח בעבר4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליכי עירוי צינור המרה היו אופטימיזציה כדי להפחית את תמותת העכבר הקשורים להליך זה10. TNBS ניתן לראשונה בנפח כולל של 35 μL או 50 μL. הזרקת TNBS בנפח של 50 μL יכול להגיע הלבלב כולו ולעורר פנוטיפ מחלה הומוגנית יותר (איור 1B). בנוסף, הזרקת TNBS באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 31G יכול לשלוט טוב יותר על מהירות עירוי ביחס מזרקים רגילים וגדלי מחט. TNBS מוכן טרי מאוחסן על קרח בשימוש בתוך שעה אחת של הכנת סמים גם הניב תוצאה טובה יותר בהשוואה TNBS מוכן יותר משעה אחת. עם שיפורים אלה, התמותה של נמענים נשלטה ונשארה מתחת ל -10%.
ירידה במשקל הגוף היא אחד המאפיינים של CP. עכברים בקבוצת הביקורת איבדו כ -6% ממשקל גופם המקורי במהלך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח, ואז התאוששו בהדרגה (104.6% ממשקל הגוף המקורי ביום 21) (איור 1C). לעומת זאת, עכברים שקיבלו TNBS איבדו בממוצע כ-15% ממשקל גופם המקורי במהלך 5 הימים הראשונים וחזרו למשקל לאחר מכן (99.8% ממשקל הגוף המקורי ביום 21)(איור 1C). בנוסף, בהשוואה לבקרות, עכברי TNBS הראו רגישות יתר מכנית בטן מוגברת ב 2 ו 3 שבועות לאחר הזרקת TNBS (איור 1D),אשר היה קשור ככל הנראה עם כאביבטן מוגברת 10.
כדי לאשר כי צינור המרה TNBS עירוי ביעילות גרם שינויים בלבלב לחקות CP אנושי, אספנו רקמות הלבלב מ TNBS או עכברי בקרה שטופלו ברכב ב 3 שבועות לאחר הניתוח. הן הגודל והן המשקל למשקל הגוף של הלבלב הופחתו באופן משמעותי בעכברים TNBS לעומת פקדים (איור 2A,B),דבר המצביע על ניוון לבלב מסומן העולה בקנה אחד עם הממצאים בבני אדם עם CP חמור וארוך טווח. בנוסף, הלבלב מעכברי הבקרה נראה נורמלי ללא שינויים מורפולוגיים ברורים, ואילו עכברי TNBS הראו vacuolization עם אובדן מסיבי של תאי acinar הוחלפו על ידי חדירת תאי שומן ופיברוזיס (איור 2C). ממצאים אלה היו עקביים עם דיווחים ממחקרים אחרים9,10.
איור 1: עירוי צינור המרה TNBS ליצירת עכברי CP. (A)איור של הזרקת צינור המרה. (B)צינור המרה לאחר הזרקה של 50 μL של דיו. (C)ממוצעים של שינוי במשקל הגוף בעכברים המקבלים TNBS או רכב. (D)סף תגובת הבטן ב- TNBS ועכברי בקרה 3 שבועות לאחר עירוי. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח זמינה (למשל, GraphPad 8.2.1). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ההבדלים בין קבוצות נותחו באמצעות מבחן t של התלמיד, ** p < 0.01 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. אפיון של CP בעכברים שטופלו TNBS. (א)מיקרוגרפים של הלבלב משליטה (CTR) ועכברי TNBS. (B)משקל הלבלב הממוצע מחולק על ידי משקל גוף העכבר בעכברים CTR ו- TNBS. (C)הכתמת המטוקסילין ואוסין של מקטעי הלבלב של עכברי CTR ו- TNBS. סרגל קנה מידה =100 מיקרומטר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. **, עמ' < 0.01 לפי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עירוי צינור המרה של TNBS כדי לגרום דלקת לבלב כרונית הוא מאתגר מבחינה טכנית בעכברים, כמו עד 22.5% של עכברים יכולים למות בתוך 3-4 ימים של עירוי סמים10. כאן, דו"ח זה חידד את ההליך בהתבסס על מחקרים קודמים והפחית את תמותת העכברים המוקדמים ל -<10%. לדוגמה, נפח התרופה המוגבר (מ 35 μL ל 50μL) יכול להבטיח את התרופות להגיע כל הלבלב. שימוש במזרק אינסולין וגודל מחט קטן יותר (31G) מפחית את הנזק הפוטנציאלי לצינור הלבלב ואת דליפת המרה לתוך כיס המרה או הבטן, אשר ככל הנראה יגרום למוות עכבר בתוך הימים הראשונים לאחר הניתוח. הידוק שני קצות צינור המרה יכול למנוע TNBS מדליפה אל כיס המרה והמעי, אשר עלול לגרום לתמותה. קליפים hemo לרסן TNBS בתוך הלבלב המוזרק, שיפור היעילות תוך הפחתת נזקים לרקמות אחרות. בנוסף, TNBS אינו יציב בטמפרטורות מעל 0 °C (50 °F). לכן, באמצעות TNBS מוכן טרי, אינדוקציה CP השיג תוצאות יציבות.
פרוטוקול זה גורם ביעילות CP בעכברים זכר C57BL / 6J בגיל 8-12 שבועות ומייצר מודל המחקה תסמינים עיקריים של דלקת לבלב כרונית, כולל אובדן משקל גוף, ניוון הלבלב, פיברוזיס, וכאב בטן סביר. בהשוואה לדגמי עכבר CP אחרים, מודל TNBS נמצא בשימוש נרחב להערכת השפעות משעכיכות בנוסף לדלקת10,15,16. היתרון הנוסף של מודל TNBS הוא כי התרופה מוזרקת ישירות לתוך הלבלב, אשר מפחית נזק לאיברים אחרים שעלול להפריע למחקר17. מודל עכבר TNBS CP זה יכול לשמש כדי ללמוד פתוגנזה, כמו גם אפשרויות טיפול יחד עם מודלים אחרים דלקת לבלב כרונית.
מגבלה אחת של מחקר זה היא כי רק עכברים בין 8-10 שבועות של גיל שימשו. מאז עכברים בגילאים שונים עשויים להיות הבדל גדלי הלבלב, אשר כתוצאה מכך להשפיע על התפתחות TNBS-CP. לכן, אם עכברים בגילאים / גדלים שונים צריך להינתן מנה שונה של TNBS צריך להיבדק. עם זאת, מחקר זה מדגים את ההליכים לביצוע מוצלח עירוי צינור הלבלב שעשוי לעזור עם מחקרים התמקדו במחלות הלבלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא (VA-ORD BLR&D הצטיינות I01BX004536), והמכון הלאומי לבריאות מענקי # 1R01DK105183, DK120394, ו- DK118529 ל- HW. אנו מודים לד"ר הונגג'ו וו על שיתוף הניסיון הטכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
