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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Qui descriviamo metodi ex vivo e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Abstract

Le infezioni correlate al biofilm sono implicate in una vasta gamma di condizioni croniche come ulcere del piede diabetiche non curative, sinusite cronica, media di otite che si verificano e molti altri. Le cellule microbiche all'interno di queste infezioni sono protette da una sostanza polimerica extracellulare (EPS), che può impedire agli antibiotici e alle cellule immunitarie ospiti di eliminare l'infezione. Per superare questo ostacolo, gli investigatori hanno iniziato a sviluppare agenti di dispersione come potenziali terapie. Questi agenti prendono di mira vari componenti all'interno del biofilm EPS, indebolendo la struttura e avviando la dispersione dei batteri, che può teoricamente migliorare la potenza antibiotica e la clearance immunitaria. Per determinare l'efficacia degli agenti di dispersione per le infezioni delle ferite, abbiamo sviluppato protocolli che misurano la dispersione del biofilm sia ex vivo che in vivo. Usiamo un modello di escissione chirurgica del topo che è stato ben descritto per creare infezioni croniche delle ferite associate al biofilm. Per monitorare la dispersione in vivo,infettiamo le ferite con ceppi batterici che esprimono luciferasi. Una volta accertate le infezioni mature, irrigamo le ferite con una soluzione contenente enzimi che degradano i componenti del biofilm EPS. Monitoriamo quindi la posizione e l'intensità del segnale luminescente nella ferita e negli organi filtranti per fornire informazioni sul livello di dispersione raggiunto. Per l'analisi ex vivo della dispersione del biofilm, il tessuto della ferita infetta viene immerso in una soluzione enzimatica degradante per biofilm, dopo di che viene valutata la carica batterica rimanente nel tessuto, rispetto alla carica batterica in soluzione. Entrambi i protocolli hanno punti di forza e di debolezza e possono essere ottimizzati per aiutare a determinare con precisione l'efficacia dei trattamenti di dispersione.

Introduction

L'aumento della resistenza agli antibiotici in tutto il mondo sta portando alla mancanza di opzioni antibiotiche per trattare una varietà di infezioni batteriche1. Oltre alla resistenza agli antibiotici, i batteri possono ottenere tolleranza agli antibiotici adottando uno stile di vita associato al biofilm2. Un biofilm è una comunità di microrganismi che sono protetti da una matrice di polisaccaridi, DNA extracellulare, lipidi e proteine 3 ,collettivamente chiamatasostanza polimerica extracellulare (EPS). Mentre la crisi di resistenza agli antibiotici continua, sono estremamente necessarie nuove strategie che prolungano l'uso o potenziano l'efficacia degli antibiotici. Gli agenti anti-biofilm sono una soluzione promettente4.

Tra le diverse strategie anti-biofilm che sono state proposte, l'utilizzo di agenti di dispersione, che si rivolgono a diversi componenti del biofilm EPS, sono in prima linea nello sviluppo terapeutico5. Le idrolasi glicosidi (GH) sono una di queste classi di agente dispersivo. I GH sono una grande classe di enzimi che catalizzano la scissione di diversi legami all'interno dei polisaccaridi che forniscono integrità strutturale all'EPS. Il nostro gruppo, così come altri, hanno dimostrato che gh può degradare efficacemente i biofilm, indurre dispersione e migliorare l'efficacia antibiotica per una serie di diverse specie batteriche, sia in vitro che in vivo6,7,8,9,10,11.

Con un crescente interesse per la dispersione del biofilm, è importante sviluppare metodi efficaci che valutazioneno l'efficacia della dispersione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trattamento delle infezioni della ferita associate al biofilm con un agente di dispersione nei topi e la valutazione dell'efficacia della dispersione, in vivo ed ex vivo. L'obiettivo generale è quello di fornire metodi efficaci che possano essere utilizzati con modelli preclinici per misurare la dispersione del biofilm in modo efficace ed efficiente.

Un modello di infezione da escissione chirurgica murina è stato utilizzato in questi studi per stabilire un'infezione associata al biofilm. Abbiamo utilizzato questo modello per oltre 15 anni e pubblicato ampiamente le nostre osservazioni7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. In generale, questo è un modello di infezione non letale in cui i batteri rimangono localizzati nel letto della ferita e sono associati al biofilm (batteri visti in aggregati circondati da EPS), creando un'infezione cronica che dura fino a 3 settimane. Tuttavia, se i topi sono immunocompro compromessi (ad esempio con diabete di tipo 1), possono diventare più suscettibili allo sviluppo di un'infezione sistemica fatale in questo modello.

In questa relazione, forniamo protocolli per valutare la dispersione dei batteri da una ferita, sia in vivo che ex vivo. Entrambi i protocolli possono essere utilizzati per esaminare l'efficacia di un agente di dispersione e avere i propri punti di forza e di debolezza. Ad esempio, valutare la dispersione in vivo può fornire informazioni importanti e in tempo reale sulla diffusione dei batteri in altre parti del corpo dopo la dispersione e su come l'ospite risponde. D'altra parte, valutare la dispersione ex vivo può essere più desiderabile per lo screening di più agenti, dosi o formulazioni, in quanto il tessuto può essere diviso in più sezioni che possono essere testate separatamente, riducendo così il numero di topi richiesti. Quando valutiamo più agenti, in genere misuriamo la dispersione prima in vitro come descritto in precedenza 6,9,22. Testiamo quindi l'ex vivo più efficace e riserviamo test in vivo per un numero limitato di agenti molto promettenti.

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Protocol

Questo protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Texas Tech University Health Sciences Center (protocollo numero 07044). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Preparare i batteri per le infezioni del topo

NOTA: Qui descriviamo infettare i topi solo con Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, altre specie batteriche possono essere utilizzate per causare infezioni. Ceppi e materiali batterici sono dettagliati nella tabella dei materiali.

  1. Utilizzare pseudomonas aeruginosa ceppo di tipo selvatico PAO1 che trasporta la luminescenza plasmide pQF50-lux23 per questi esperimenti come descritto in precedenza7.
  2. Coltivare ceppi di P. aeruginosa in fiasche Sconcertate di Erlenmeyer, con scuotimento a 200 giri/min, in brodo Luria-Bertani (LB) a 37 °C per 16-20 ore. Aggiungere una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina alla coltura notturna di PAO1(pQF50-lux) per il mantenimento del plasmide.
  3. Sottocultura P. aeruginosa aggiungendo 100 μL della coltura notturna ad un pallone Erlenmeyer contenente 10 ml di brodo LB con una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina. Quindi crescere per 2-2,5 h a 37 °C con scuotimento, a un OD600 nm di 0,4, quindi diluire serialmente (1:10) tre volte per una dose infettante di circa 104 cellule.

2. Preparazione dell'enzima di dispersione del biofilm

NOTA: Per questo studio utilizziamo una soluzione al 10% di amilasi e cellulasi delle parti uguali (5% di ciascuna), che sarà definita "GH", per il trattamento di dispersione.

  1. Utilizzare una soluzione di GH al 10% (w/v) di amilasi (da Bacillus subtilis)e cellulasi fungina (da Aspergillus niger)diluita in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS). Utilizzare PBS come trattamento di controllo del veicolo.
  2. Riscaldare tutti i trattamenti a 37 °C per 30 minuti per l'attivazione enzimatica.

3. Animali da esperimento e allestimento preoperatorio

  1. Topi domestici, 5 cucciolate per gabbia, in condizioni controllate dall'ambiente, con cicli di luce / buio di 12 ore e un corretto accesso a cibo e acqua.
  2. Preferibilmente, utilizzare topi Webster svizzeri femminili, di età compresa tra 8 e 10 settimane.
  3. Pesare i topi per determinare la giusta quantità di anestesia da somministrare.
  4. Somministrare anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di chetamina 10 mg/kg di xiazina.
  5. Applicare con cura la crema per gli occhi (ad esempio, Refresh P.M.) sull'occhio utilizzando un batuffolo di cotone per ridurre la secchezza.
  6. Monitorare i parametri fisiologici tra cui la frequenza respiratoria, la colorazione della pelle e la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.

4. Chirurgia dell'escissione dorsale a pieno spessore

  1. Valutare il piano chirurgico dell'anestesia con il pizzico e il monitoraggio della frequenza respiratoria e dello sforzo. Radere la superficie dorsale e applicare una crema depilatoria per 10 min (o secondo le istruzioni del prodotto), dopo di che rimuovere delicatamente, assicurandosi che la pelle fosse asciutta.
  2. Per la gestione del dolore, somministrare 0,05 mL di lidocaina per via sottocutanea nell'area da asportare e iniettare 0,02 mL di buprenorfina per via sottocutanea nella tracolla del collo. Attendere 10 minuti per assicurarsi che la gestione del dolore sia stata raggiunta.
  3. Prima dell'escissione, disinfettare la superficie dorsale usando un tampone alcolico e disegnare un cerchio di 1,5 cm di diametro verso la porzione posteriore della schiena. Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura e ha utilizzato strumenti autoclavati e guanti sterili. Per limitare la contaminazione, condurre l'intervento chirurgico da un bruciatore Bunsen acceso e utilizzare strumenti puliti per ogni animale.
  4. Somministrare una ferita cutanea a pieno spessore e incisionale al livello del muscolo panniculo con forbici chirurgiche.
  5. Dopo l'escissione, coprire immediatamente le ferite con una medicazione semipermeabile in poliuretano.
  6. Iniettare circa10 4 CFU di batteri in 100 μL PBS sotto la medicazione, sul letto della ferita, per stabilire un'infezione.
    NOTA: Le ferite possono anche essere infettate contemporaneamente da più specie di batteri e/o funghi, o posizionando biofilm pre-formati12, o anche tessuto di debridemento estrattodai pazienti 19, sul letto della ferita.
  7. Dopo l'infezione, mettere i topi in gabbia con pastiglie riscaldanti e monitorare fino a quando non hanno riacquistato il loro riflesso di destra.
    NOTA: Assicurarsi che i topi non si raffreddori in quanto ciò può portare alla morte.
  8. Stabilire infezioni da ferite per 48 ore.
  9. Ispezionare quotidianamente le medicazioni adesive per verificare lacerazioni e aree di non aderenza e sostituirle se necessario.

5. Trattamento di dispersione in vivo

NOTA: Qui descriviamo la somministrazione degli agenti di dispersione applicando una serie di 3 soluzioni di irrigazione a carica topica(Figura 1). Tuttavia, il protocollo può essere adattato per altri tipi di consegna come l'applicazione di gel, creme o condimenti.

  1. Posizionare i topi sotto anestesia isoflurana (al 3% e 1 L al minuto di ossigeno) durante la somministrazione dei trattamenti.
  2. Preparare tre siringhe da 1 ml, con aghi da 25 G, contenenti 200 μL di trattamento per ogni topo.
  3. Iniettare 200 μL di soluzione enzimatica o controllo PBS sulla ferita sollevando e pizzicando con cura la pelle con le forcep, leggermente sopra la ferita verso la testa dell'animale. Perforare con cura la siringa attraverso la pelle sollevata e iniettare lentamente la soluzione tra la medicazione e il letto della ferita. La medicazione utilizzata in questo studio spesso aderisce sia al letto della ferita che al tessuto circostante.
    1. Per assicurarsi che l'intero letto avvolto sia coperto da soluzione, sollevare delicatamente la medicazione con le forcep, allontanandolo dal letto della ferita, mentre si inietta lentamente la soluzione.
  4. Dopo il trattamento, riposizionare i topi nelle loro gabbie per 30 minuti.
  5. Dopo 30 minuti di esposizione al trattamento, riaestestizzare i topi con isoflurane e aspirare la soluzione con una siringa, assicurandosi di forare nella stessa area di prima.
    NOTA: Questa soluzione aspirata contiene cellule batteriche disperse, che possono essere salvate per varie analisi a valle.
  6. Somministrare il secondo e il terzo trattamento di irrigazione come primo, utilizzando ogni volta una nuova siringa.

6. Imaging e analisi di dispersione in vivo

NOTA: Se un ceppo luminescente di batteri viene utilizzato per avviare l'infezione, è possibile utilizzare un sistema di imaging In Vivo (IVIS) per visualizzare la dispersione dal letto della ferita.

  1. Immagini topi immediatamente prima e dopo il trattamento e a 10 e 20 ore dopo il trattamento(figura 2 e figura supplementare 1).
  2. Eseguire immagini mentre i topi sono in anestesia posizionandoli singolarmente nell'IVIS e imaging ciascuno per 5 s a una lunghezza d'onda di 560 nm. Salvare le immagini per ulteriori analisi.
    NOTA: La lunghezza d'onda ottimale e il tempo di esposizione dipenderanno dal reporter utilizzato e dallo strumento IVIS e dal software di imaging.
  3. Per l'analisi, aprire le immagini nel software IVIS e selezionare l'area da analizzare nella tavolozza degli strumenti.
  4. Per tenere conto dello sfondo, posizionare un cerchio sullo sfondo di una foto e quindi posizionare lo stesso cerchio di dimensioni sopra il letto della ferita per ogni mouse.
  5. Per caricare i valori di misurazione, selezionare Visualizza misurazioni > regione di interesse (ROI) e caricare la tabella delle misurazioni in un foglio di calcolo. Sottrarre la lettura del cerchio di sfondo da ciascuna delle misurazioni del letto della ferita per calcolare la luminescenza per ogni campione. Calcolare la luminescenza percentuale modificata da:
    ROI pre-trattamento-ROI post-trattamento/ roi pretrattamento) x 100.
    NOTA: I topi di controllo e trattati devono essere analizzati contemporaneamente per normalizzarsi per le variabili che possono influire sull'acquisizione o sulla luminosità dell'immagine.

7. Valutazione della dispersione determinando la CFU

  1. Eutanasia umana dei topi mediante iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di sodio pentobarbitale (ad esempio Fatal Plus) in anestesia con 100 mg/kg di ketamina 10 mg/kg di xiazina.
  2. Raccogliere il tessuto del letto avvolto rimuovendo prima delicatamente la medicazione con forcelle sterili, quindi tagliare intorno al perimetro del letto della ferita con forbici chirurgiche sterili. Sollevare delicatamente un'estremità del letto della ferita con le forcep mentre si usano le forbici per tagliare / stuzzicare il campione lontano dallo strato muscolare.
  3. Posizionare il tessuto dal letto della ferita in un tubo di omogeneizzazione da 2 ml preetitolato e pre-pesato contenente 1 ml di PBS. Pesare nuovamente i tubi dopo aver inserito i campioni, quindi invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali batteri dispersi o vagamente aderenti e rimuovere il PBS. Aggiungere 1 mL di PBS fresco.
  4. Per raccogliere le milza, posizionare i topi in una posizione anatomica supina e fissare fissando le estremità a una superficie di dissezione. Immergere l'area da sezionare con il 70% di etanolo per disinfettare l'area e evitare che la pelliccia contamini il campione.
  5. Fare con cura una piccola incisione perpendicolare alla linea mediana con forbici chirurgiche nel derma dell'addome inferiore, assicurandosi di tirare la pelle su e lontano dagli organi interni. Proseguire l'incisione interiormente, lungo la linea mediana, fino a raggiungere lo sterno. Una volta esposta la cavità peritoneale e visibili gli organi interni, separare delicatamente la milza dal tessuto connettivo e posizionarla in un tubo di omogeneizzazione separato.
  6. Pesare milza e risciacquare con PBS, come descritto per il tessuto del letto della ferita.
    NOTA: Altri organi di interesse possono essere raccolti in modo simile.
    1. Quando si effettua l'incisione iniziale, fare attenzione a evitare di forare l'intestino o altri organi.
  7. Omogeneizzare i campioni in tubi di mulino di perline preriempito da 2 ml utilizzando un omogeneizzatore da banco a 5 m/s per 60 s, due volte.
  8. Per enumerare la CFU, diluire in serie campioni e spot-plate su agar selettivo. Per la diluizione seriale, pipettare 100 μL del campione in 900 μL di PBS in un tubo, vortice e ripetere 5 volte 1,5 ml. Pipetta 10 μL di ogni diluizione su una piastra di agar, come illustrato nella figura 3.
    NOTA: Se è richiesta una quantificazione CFU più precisa, distribuire 100 μL di ogni diluizione del campione su piastre di agar separate.

8. Valutazione ex vivo della dispersione(figura 4)

  1. Ferire i topi e infettare con circa 104 PAO1 come descritto sopra, quindi eutanasiare 48 ore dopo l'infezione.
  2. Rimuovere con cura la medicazione con le alessa, utilizzando una tecnica sterile e senza disturbare il letto della ferita.
  3. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il perimetro del letto della ferita lontano dalla pelle non infetta utilizzando le forcelle per sollevare un'estremità del letto della ferita e delle forbici per asportare il tessuto della ferita infetto dallo strato muscolare sottostante e dal tessuto non infetto circostante. Dividere i campioni del letto avvolto in parti uguali o utilizzare interi.
  4. Posizionare il tessuto avvolto in tubi omogeneizzanti di mulino perline da 2 ml pre pesati e pre-pesati. Quindi pesare di nuovo i tubi dopo aver aggiunto il campione. Calcolare il peso del campione:
    peso dopo l'aggiunta del campione - peso prima di aggiungere il campione.
  5. Aggiungere 1 ml di PBS e invertire delicatamente il tubo 3-5 volte per risciacquare il campione e rimuovere eventuali cellule planctoniche. Rimuovere ed eliminare il PBS.
  6. Aggiungere 1 mL di trattamento gh (o PBS come controllo negativo) al campione e incubare per 2 ore a 37 °C con scuotimento a 80 giri/min.
  7. Rimuovere la soluzione di dispersione del biofilm e posizionarsi in un tubo separato da 1,5 ml. Contiene le celle disperse.
  8. Aggiungere 1 mL di PBS al campione di tessuto rimanente e invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali cellule disperse rimanenti. Rimuovere ed eliminare il PBS.
  9. Aggiungere 1 mL di PBS al tessuto rimanente e omogeneizzare a 5 m/s per 60 s utilizzando un omogeneizzatore da banco.
  10. Diluire serialmente la soluzione di cellule disperse e il campione di tessuto omogeneizzato posizionando 100 μL di campione in 900 μL di PBS in un tubo da 1,5 ml e ripetendo cinque volte per un totale di 6 diluizioni.
  11. La piastra spot 10 μL di ogni diluizione su agar selettivo multimediale (ad esempio, Pseudomonas Isolation Agar per P. aeruginosa)e incubare le piastre a 37 °C durante la notte.
  12. Contare il CFU e calcolare la 'percentuale dispersa' come (CFU in supernatante/ (CFU in supernatante+ CFU nel tessuto biofilm)) x 100.

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Representative Results

In questo esperimento, topi Webster svizzeri di 8-10 settimane sono stati infettati da 104 CFU di PAO1 che trasportavano il pQF50-lux plasmide a luminescenza. Come descritto sopra, è stato permesso di stabilire un'infezione per 48 ore prima di somministrare trattamenti 3 x 30 minuti di PBS (controllo del veicolo) o 10% GH (trattamento) per digerire il biofilm EPS. I topi sono stati fotofazione pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento (0 h) e a 10 h e 20 h dopo il trattamento. La figura 2A e la figura supplementare 1 mostrano un'infezione accertata all'interno del letto della ferita che genera un segnale bioluminescente luminoso. La dispersione dei batteri fuori dal letto della ferita può essere visualizzato immediatamente dopo il trattamento con GH (0 h), ma non dopo il trattamento PBS. Va notato che in studi precedenti, abbiamo rilevato batteri nel sangue e milza già 5 ore dopo il trattamento gh7. La diffusione batterica negli organi può anche essere vista posizionando il topo su un lato per l'imaging, come mostrato nel pannello inferiore della figura 2A.

Le immagini dei topi trattati con PBS e GH hanno dimostrato un aumento del segnale luminescente a 20 ore dopo il trattamento rispetto al pretrattamento (Figura 2B). Ipotitiamo che ciò sia dovuto all'interruzione meccanica del biofilm causata dall'irrigazione della soluzione. A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati e i letti delle ferite e le milza sono stati raccolti per enumerare CFU / grammo di tessuto. Mentre i carichi batterici nei letti delle ferite erano simili (Figura 2C), i batteri sono stati rilevati solo nelle milza dei topi trattati con GH (Figura 2D), suggerendo la diffusione diffusa dei batteri dispersi.

In precedenza, abbiamo dimostrato che il trattamento con GH può rompere gli aggregati di batteri, migliorando il numero di CFU21. Ciò può spiegare il leggero aumento della carica batterica nei letti delle ferite dei topi trattati con GH. Infine, sebbene i letti avvolti trattati con GH avessero cfu/grammo leggermente più alti, c'è stato un cambiamento bioluminescente di percentuale inferiore. Questi risultati suggeriscono l'importanza di confermare la luminescenza con i conteggi CFU. Questi risultati rappresentativi danno un esempio di dati che possono essere raccolti utilizzando i protocolli sopra descritti.

Figure 1
Figura 1. Stabilire infezioni da ferite associate al biofilm e valutare l'efficacia dell'agente dispersivo in vivo. Le medicazioni sono state controllate per le lacrime o la perdita di adesione alla pelle del topo prima del trattamento. Le medicazioni compromesse sono state sostituite. I topi sono stati posti in anestesia immediatamente prima della somministrazione del trattamento. 200 μL di soluzione enzimatica, o controllo del veicolo, sono stati iniettati nello spazio tra il letto della ferita e la medicazione. La medicazione è stata delicatamente sollevata con forcep per garantire che l'intera ferita fosse satura in soluzione. Il trattamento è stato lasciato sul letto della ferita per 30 minuti. Dopo 30 minuti, il trattamento è stato aspirato con una siringa e sono stati aggiunti altri 200 μL di trattamento. Questo è stato ripetuto per un totale di 3 trattamenti. Per misurare la dispersione in tempo reale, i topi sono stati fotoistruiti usando IVIS prima del trattamento, immediatamente dopo il trattamento (0 h), 10 ore e 20 h dopo il trattamento. A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati e sono stati raccolti i letti delle ferite e le milza. I campioni sono stati risciacquati in PBS e poi omogeneizzati in PBS fresco due volte a 5 m/s per 60 s. I campioni sono stati quindi diluiti in serie e placcati a punti. CFU sono stati enumerati e cfu/grammo sono stati calcolati. Il livello di dispersione dei batteri dalla ferita può essere valutato dall'IVIS o determinando il numero di CFU che si diffondono sistemicamente alla milza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. I dati rappresentativi dimostrano come valutare la dispersione in vivo. Le ferite infettate da 104 PAO1 (pQF50-lux) per 48 ore sono state trattate con PBS o 10% GH (soluzione enzimatica di dispersione biofilm). Il trattamento PBS è stato utilizzato come controllo del veicolo. I letti delle ferite sono stati trattati con trattamenti 3 x 30 minuti. I topi sono stati fotoindo usando IVIS prima del trattamento, immediatamente dopo il trattamento, 10 ore dopo il trattamento e 20 ore dopo il trattamento. Va notato che le immagini con vista laterale provengono da mouse pbs e gh trattati con GH diversi da quelli mostrati nelle immagini in visualizzazione aerea (A). Sono stati registrati i ROM per ogni letto avvolto pre-trattamento e ogni letto avvolto post-trattamento di 20 ore. La variazione percentuale rispetto al pretrattamento è stata calcolata come (ROI pre-trattamento-ROI post-trattamento/ ROI pre-trattamento) x 100 (B). A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati. I letti e le milza avvolti sono stati raccolti e pesati per determinare CFU /grammo (C e D, rispettivamente). N=3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Diluizione seriale e placcatura a punti. Il campione omogeneizzato è stato vortexato e 100 μL è stato trasferito in un tubo Eppendorf da 1,5 ml contenente 900 μL di PBS. Il campione è stato vortexato e 100 μL è stato trasferito in un altro tubo Eppendorf da 1,5 ml con 900 μL di PBS. Questo processo è stato ripetuto 5 volte. A partire dall'ultimo tubo di diluizione, 10 μL di campione sono stati spot placcati sulla piastra di agar nel punto10-8. Questo è stato continuato fino alla diluizione 10-3. In genere, ladiluizione 10 -3 si traduce in un prato di batteri all'interno del punto. Alcuni organi, che hanno bassi carichi batterici, possono richiedere placcatura spot fino alla diluizione10-1. Ripetere per ogni campione di tessuto. Posizionare la piastra di agar in un'incubatrice a 37 °C per 24-48 ore o crescere in condizioni ottimali per le specie batteriche di interesse. Per enumerare la CFU, contare le singole colonie alla diluizione più bassa possibile e moltiplicare per il fattore di diluizione appropriato per determinare CFU/mL o utilizzare il peso dei tessuti per calcolare la CFU/g del tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Misurazione della dispersione dal tessuto infetto ex vivo. I topi sono stati eutanasiati e il tessuto della ferita infetto è stato rimosso aseticamente. Il tessuto infetto è stato posto in un tubo omogeneizzante del mulino perline da 2 ml e risciacquato brevemente con PBS. Sono stati aggiunti 1 mL di agente di dispersione e il campione è stato incubato per 2 ore a 37 °C con scuotimento a 80 giri/min. Dopo l'incubazione, la soluzione contenente le cellule disperse è stata rimossa e posta in un tubo separato da 1,5 ml. Il tessuto rimanente è stato risciacquato con 1 mL di PBS. 1 mL di PBS fresco è stato aggiunto al tessuto e omogeneizzato a 5 m/s per 60 s. La soluzione enzimatica e il tessuto omogeneizzato sono stati poi diluiti serialmente e spot placcati su agar selettivo. La CFU è stata enumerata e la dispersione è stata calcolata come: CFU dalla soluzione enzimatica/ (CFU dalla soluzione enzimatica + CFU dal tessuto) x 100. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1. Misurazione della dispersione in vivo. Le ferite sono state infettate da10 4 PAO1 (pQF50-lux) per 48 ore e quindi trattate con PBS, o 10% GH (soluzione enzimatica di dispersione biofilm). Il trattamento PBS è stato utilizzato come controllo del veicolo. I letti ferita sono stati trattati con trattamenti di irrigazione 3 x 30 minuti. I topi sono stati fotoindo usando IVIS prima del trattamento, immediatamente dopo il trattamento, 10 ore dopo il trattamento e 20 h dopo il trattamento (A). A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati. I letti e le milza avvolti sono stati raccolti e pesati per determinare cfu/grammo (B e C, rispettivamente). N=3. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Qui descriviamo protocolli che possono essere utilizzati per studiare l'efficacia degli agenti di dispersione del biofilm. Questi protocolli possono essere facilmente adattati all'uso con diversi tipi di agenti dispersivi, specie batteriche o campioni ex vivo, inclusi campioni clinici di debridement. Questo protocollo fornisce anche un modello clinicamente rilevante per raccogliere e studiare cellule batteriche disperse. I fenotipi delle cellule batteriche disperse si sono dimostrati distinti da quelli delle cellule planctoniche o biofilm 5,24,25,26; tuttavia, i fenotipi di batteri dispersi in vivo devono ancora essere descritti. Se gli agenti di dispersione devono essere usati terapeuticamente, è importante determinarne l'efficacia, nonché comprendere il fenotipo che queste cellule adottano. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare come le variazioni nella struttura EPS o l'alterazione delle vie di segnalazione influenzano la dispersione. Ad esempio, la dispersione di ceppi di P. aeruginosa con mutazioni in diversi componenti dell'esopolisaccaride (ad esempio Pel, Psl, Alginato) potrebbe essere paragonata a quella dei ceppi di tipo selvatico.

Nel complesso, questo protocollo può essere suddiviso in quattro sezioni principali: (1) stabilire un'infezione (2) somministrare un trattamento o (3) raccogliere tessuti infetti per il trattamento ex vivo e (4) determinare l'efficacia della dispersione. La parte critica della sezione 1 è il successo dell'istituzione dell'infezione nel letto della ferita. Se vengono utilizzati ceppi luminescenti, che richiedono antibiotici per mantenere la stabilità del plasmide, è imperativo aggiungere gli antibiotici appropriati quando si coltivano i ceppi in preparazione all'infezione. Va anche considerato che i plasmidi non possono essere mantenuti durante l'infezione nell'animale (senza pressione antibiotica), quindi la valutazione della carica batterica non dovrebbe basarsi completamente sull'imaging IVIS, ma essere confermata dalla CFU. La dose inoculata è anche un passo critico per iniziare l'infezione. Per P. aeruginosa e S. aureus, viene tipicamente utilizzata una dose infettiva di 104-5 CFU, ma la dose ottimale può variare a seconda delle specie batteriche e topo utilizzate.

La parte critica della sezione 2 è garantire che il letto della ferita sia coperto dalla medicazione durante lo sviluppo di infezione e trattamento. Se la medicazione non viene rispettata correttamente, il trattamento può fuoriuscire dal letto della ferita e può essere inefficace. La medicazione è anche importante per mantenere il letto della ferita protetto da potenziali contaminanti e compromettere la guarigione contrattile da parte del topo, che è essenziale per imitare la guarigione delle ferite umane. Infine, la parte critica della sezione 3 è quella di gestire correttamente i campioni raccolti. Per enumerare la CFU, il tessuto infetto deve essere risciacquato con 1 mL di PBS prima dell'aggiunta di altri 1 mL di PBS per l'omogeneizzazione. Organi più fibrosi, come i polmoni, possono richiedere un'omogeneizzazione più approfondita.

I limiti primari di questi protocolli includono il necessario monitoraggio ravvicinato della medicazione e l'utilizzo di IVIS per la dispersione delle immagini e fare ipotesi sull'efficacia della dispersione. Per studi a lungo termine, la ri-crescita della pelliccia può essere problematica perché può impedire l'aderenza alla medicazione al sito della ferita. Le medicazioni spesso richiedono la sostituzione e la loro rimozione può portare a debridementi accidentali della ferita e opportunità di contaminazione. Per visualizzare la dispersione dal letto della ferita, è necessario utilizzare un ceppo batterico bioluminescente. Se le specie batteriche di interesse mancano di un reporter bioluminescente, questa opzione non è fattibile. Un'altra limitazione è il potenziale del trattamento di dispersione per indurre la batteriemia, che può portare alla morte del topo. Tuttavia, abbiamo visto che le cellule disperse possono essere efficacemente uccise dagli antibiotici in vivo7.

I risultati rappresentativi descritti nella figura 2 illustrano una limitazione dell'IVIS per misurare l'efficacia della dispersione. In primo luogo, deve essere utilizzato un ceppo luminescente delle specie batteriche di interesse. Il ceppo deve produrre un segnale luminescente abbastanza luminoso da rilevare attraverso più strati di tessuto al fine di visualizzare la dispersione dal letto della ferita ad altre parti del corpo. È stato suggerito che un minimo di circa 106 batteri sono necessari per produrre un segnale luminescente abbastanza forte da essere rilevato da IVIS27. Una diminuzione del segnale luminescente è stata descritta anche quando i batteri entrano nella fasestazionaria 28. Ciò può causare una disconnessione tra le ROM misurate e la CFU enumerata29. Questa limitazione può portare a false ipotesi quando non c'è un segnale abbastanza forte per il rilevamento, ma i batteri sono ancora presenti. Come mostrato nella figura 2B,i trattamenti PBS e 10% GH hanno comportato un aumento della luminescenza dopo il trattamento. Si tratta di un'osservazione curiosa e coerente, che è stata vista anche dopo aver disperdere cellule in vitro (CláudiaMarques, Binghamton University, comunicazione personale). È possibile che l'interruzione fisica del biofilm dalla somministrazione del trattamento diffonda semplicemente le cellule che erano ben imballate, con conseguente aumento del segnale luminoso. In alternativa, il trattamento di dispersione potrebbe "risvegliare" le cellule del biofilm precedentemente metabolicamente inattive, con conseguente aumento della bioluminescenza. In entrambi i modi, è fondamentale confermare i risultati dell'imaging IVIS con i dati CFU. Infine, esiste una distribuzione eterogenea di batteri all'interno del tessuto della ferita infetta30,31. Pertanto, se il tessuto è diviso ex vivo per fornire più campioni, non si deve presumere che la carica batterica in ogni sezione della ferita sia identica.

Esistono modifiche e risoluzione dei problemi che possono essere condotti per superare i limiti di questi modelli. In primo luogo, potrebbe essere necessario regolare il tempo assegnato per l'esposizione della crema depilatoria a seconda delle specie di topo utilizzate. Ad esempio, 7 min sono in genere utilizzati per i topi Webster svizzeri, mentre i topi C57BL/6 potrebbero aver bisogno di fino a 10 minuti di esposizione per rimuovere con successo la pelliccia. Questo ovviamente dipende anche dal prodotto utilizzato e i tempi di esposizione non dovrebbero mai superare le istruzioni del produttore. Se è in corso un lungo studio (oltre 4 giorni), potrebbe essere necessario riapplicare la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia ricresciuta e garantire un corretto sigillo della medicazione. Successivamente, se un segnale luminescente è difficile da rilevare, il tempo di esposizione può essere aumentato durante l'imaging IVIS. Anche la dose inoculata e il tempo di infezione possono essere regolati. È importante utilizzare una dose infettiva che non sia troppo alta da sopraffare il topo, ma non sia troppo bassa che i batteri siano immediatamente cancellati dalla risposta immunitaria.

In questo protocollo, descriviamo il trattamento di infezioni da ferite vecchie di 48 ore con agenti di dispersione, poiché questo è un momento in cui abbiamo mostrato infezioni causate da P. aeruginosa e / o S. aureus sono stabilite e associate a biofilm 12,15,16. Tuttavia, a seconda delle specie batteriche, altri punti di tempo possono essere più ottimali. Idealmente, la carica batterica nella ferita dovrebbe stabilizzarsi una volta stabilita un'infezione. Ad esempio, abbiamo visto che sia con P. aeruginosa che con S. aureus, la carica batterica nella ferita raggiunge circa 108 CFU/g di tessuto per 48 h dopo l'infezione e rimane a quel livello fino alla chiusura della ferita. La figura 1 illustra il trattamento con una soluzione che richiede lavaggi da 3 x 30 minuti. Tuttavia, se l'agente di dispersione fosse in un'altra forma, i lavaggi non sarebbero necessari. Ad esempio, una crema, un gel o una medicazione ingegnerizzata potrebbero semplicemente essere posizionati sopra il letto della ferita. Infine, la ferita può essere infettata in vari modi tra cui l'inoculazione di cellule batteriche planctoniche, biofilm preformati12o persino tessuto di debridemento infetto da un altro animale oumano 19,32. Abbiamo visto che il trapianto di un biofilm preformato o di un campione di debridement sul letto della ferita si traduce in infezioni polimicrobiche di maggior successo rispetto a quando più specie sono inoculate nella loro forma planctonica12.

Nel complesso, questi protocolli descrivono metodi per studiare la dispersione del biofilm e la valutazione degli agenti di dispersione del biofilm terapeutico. Questi modelli consentono lo sviluppo di complesse infezioni associate al biofilm polimicrobico che imitano infezioni umane clinicamente rilevanti. La nostra speranza è che questi protocolli siano utilizzati e perfezionati per promuovere lo sviluppo di agenti di dispersione anti-biofilm per uso terapeutico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), della Ted Nash Long Life Foundation, della Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation e del Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

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References

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Immunologia e Infezione Numero 174 Ex vivo, In vivo,biofilm dispersione infezione da ferita agente anti-biofilm Pseudomonas aeruginosa
Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine
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Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

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