Summary
在这里，为酵母的代谢标记提供 14个C-醋酸，这与薄层色谱相结合，用于中性脂质的分离。
Abstract
中性脂质 （NLs） 是一类疏水、无电荷的生物分子，在能量和脂质平衡中起着关键作用。NLs 由乙酰-CoA 合成，主要以甘油三酯 （TGs） 和固醇酯 （SEs） 的形式存在于真核生物中。负责合成NL的酶从 糖精 （酵母）高度保存到人类，使酵母成为解剖NL代谢酶的功能和调节的有用模型有机体。虽然人们对于乙酰-CoA如何转化为一组不同的NL物种还知之甚少，但调节NL代谢酶的机制，以及错误调节如何促成细胞病理学，仍在被发现。经过几十年的研究，已经开发并使用了许多分离和描述NL物种的方法：然而，尚未讨论对主要NL物种进行综合表征的定量和简单协议。在这里，提出了一个简单和适应性强的方法来量化酵母中主要NL物种的合成。我们应用 14个C-醋酸代谢标记加上薄层色谱来分离和量化各种生理上重要的NL。 此外，这种方法可以很容易地应用于研究NL酶的体内反应率或NL物种的退化随着时间的推移。
Introduction
乙酰-CoA是包括中性脂质（NLs）在内的多种生物分子的基本组成部分，它作为一种多功能的生物分子货币，用于制造膜、生成ATP和调节细胞信号1，2。将 NLs 分流到任何这些相应路径的可用性部分受其存储管理。脂质液滴（LDs），由甘油三酯（TGs）和固醇酯（SEs）的疏水核心组成的细胞质细胞器，是大多数细胞NL的主要储存室。因此，LDs封存和调节NL，它可以降解，随后用于生化和代谢过程3，4。据了解，NL和LD相关蛋白质的误调与病理学的发病有关，包括脂质萎缩和代谢综合征5、6。因此，目前的LD研究主要集中在NL合成如何在空间、时间和跨多细胞生物的不同组织中进行调节。由于 NL 的细胞作用无处不在，许多负责 NL 合成和调节的酶在整个真核生物7中都得到保存。事实上，甚至一些前卡约特人存储NLs在LDs8。因此，基因可通导模型生物，如糖核酸菌（芽酵母），对NL合成和调控的研究很有用。
NL与细胞提取物的分离和量化可以通过多种途径完成，包括气相色谱-质谱（GC-MS）、高性能液相色谱（HPLC）和超高性能液相色谱质谱（UPLC-MS）9、10、11。也许分离 NLs 的最简单方法是通过薄层色谱 （TLC）， 这允许随后的密度计量定量从标准曲线12，13.虽然 TLC 只提供 NL 的课程粒式分离，但它仍然是一种强大的技术，因为它价格低廉，并且允许 NL 同时从多个样本中快速分离。通过TLC研究NL面临的两个最重大的挑战是：1） NL物种及其中间体的细胞丰度范围广，2） NL合成通路内脂质中间体的亲水性/疏水性范围。因此，通过TLC对NL物种的量化通常仅限于最丰富的物种：然而，引入14个C-醋酸放射性标签可以显著增强NL通路内低丰度中间体的检测。乙酰酸通过乙酰-CoA合成酶ACS214迅速转化为乙酰-CoA，使14C-醋酸成为酵母15中合适的放射性标签基板。此外，TLC可以通过使用多个溶剂系统16实现疏水性NL和NL亲水中间体的分离。在这里，使用酵母中的14个 C-醋酸代谢标记提出了分离 NLs 的方法。脉冲期标记的脂质随后被一个成熟的总脂质隔离协议17隔离，然后由TLC分离NL物种。通过自传开发TLC板，可视化标记的脂质，以及化学喷雾可视化总脂质，允许多种量化方法。使用剃须刀刀片也很容易从 TLC 板中提取单个脂质带，并且可以使用闪烁计数来量化带内的放射性标签材料量。
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Protocol
1. 14C醋酸酵母细胞的生长和标记
- 通过从盘子中挑出一个菌落并将其分配到含有 2% 脱氧石的 20 mL 合成完整 （SC） 介质中，从而接种酵母培养物（参见 SC 介质配方的 补充文件 ）。在 30 °C 下孵育过夜，在 200 rpm 时摇晃。
注：生长状况、样本量和治疗将因感兴趣的脂质而异。在进行全面实验之前，应从经验上确定最佳生长条件和文化量。本协议讨论了酵母培养物的放射性标签发展到静止阶段，生物膜和细胞生长减慢的生长阶段，NL合成非常活跃。 - 使用光谱光谱仪测量隔夜培养物的OD600， 并将酵母细胞培养物稀释到含有2%脱氧层的新鲜SC介质的最终OD600 的0.2。将细胞生长24小时，或直到它们达到静止阶段（通常由细胞的平面衬里加倍OD600 测量定义）。
- 在收集单元格之前，请制作淬火缓冲（有关详细信息，请参阅 补充文件 ）。为每个样品制作两个 20 mL 的淬火缓冲器（即每个样品 40 mL 淬火缓冲器），并均匀地分成两个 50 mL 圆锥管）。将淬火缓冲液存储在 -80 °C 下，供将来使用。
- 一旦培养物达到所需的OD或生长阶段，通过离心以4，100 x g 收集细胞，持续10分钟。当样品在离心机中时，通过将[1-14C] 醋酸钠盐添加到无脱氧的 SC 介质中，最终浓度为 10 μCi/mL，从而准备无线电标签介质。
注意：使用放射性材料时，应随时佩戴适当的个人防护设备 （PPE）。始终遵循当地关于正确储存、使用和处置放射性材料的准则。
注：标签介质中 14C醋酸的浓度和放射性标签孵化时间均应根据感兴趣的代谢物进行调整。在这里，使用20分钟的无线电标签脉冲孵化，这足以标记具有一系列丰度的NL物种。 - 从颗粒细胞中取出超高分子，用 20 mL 的无葡萄糖 SC 介质用移液器重新悬浮颗粒清洗细胞颗粒一次。通过离心以 4，100 x g 的速度再次收集细胞，使用 5 分钟。
- 将细胞重新悬浮在 1 mL 的无脱氧层沉着的 SC 介质中，并将细胞转移到标记为 2 mL 的微中心管中。以 4，100 x g 的离心再次收集细胞，使用 2 分钟。
- 在 500 μL 的无脱氧层SC介质中再次重复使用细胞。预冷离心机，配备 50 mL 圆锥形管至 -10 °C 或在最低温度设置下。
- 开始无线电标签期，将 500 μL 的无线电标签介质快速添加到每 500 μL 的细胞悬浮（最终 14C-醋酸浓度 = 5 μCi/mL）。在标签期结束前 20 分钟，在 30 °C 的旋转孵化器中孵育管子，将每个样品的 20 mL 淬火缓冲器从 -80 °C 冰柜转移到一桶冰上
- 一旦无线电标签期结束，使用移液器将整个 1 mL 样品投入 20 mL 的冷淬火缓冲器。漩涡锥形管为5-10s，以确保样品已彻底与淬火缓冲混合。在冰上将样品在淬火缓冲器中孵化2分钟。
- 通过在离心机中旋转 5，000 x g 收集细胞颗粒，3 分钟设置为 -10 °C 或在最低温度设置下旋转。当样品管旋转时，将另一组淬火缓冲液从 -80 °C 冰柜转移到装满冰的桶中（即每个样品一个 20 mL 的淬火缓冲管）。
- 从细胞颗粒中取出淬火缓冲超高剂，代之以 20 mL 新鲜、冷、淬火缓冲器。漩涡和摇动样品，直到颗粒从锥形管底部脱落，并在淬火缓冲器中完全重新悬浮。在 -10 °C 下以 5，000 x g 再次离心样品 3 分钟以收集细胞。
- 一旦细胞被颗粒化，彻底去除所有淬火缓冲从样品中倒出超强的和去除多余的移液器。将管子存放在 -80 °C 下，以便进一步加工。
2. 从酵母中分离出总脂质
注：以下脂质隔离协议基于一种成熟且常用的方法，可有效提取大多数中性脂质物种17、18。
注意：使用有机溶剂时，请始终佩戴适当的 PPE，并尽可能在烟气罩内工作。在脂质提取过程中，避免使用与有机溶剂不相容的塑料。聚丙烯管适用于以下协议。
- 每个样品重0.3克酸洗玻璃珠，并储存在冰上2毫升微中心管中。从 -80 °C 冰柜中取出细胞颗粒，并将其放在冰上。在每个样品中加入 350 μL 甲醇和 700 μL 氯仿，重新使用并转移到含有预称重玻璃珠的微中心管中。
- 通过在漩涡上搅拌管 3x 来搅拌细胞 1 分钟，在搅拌之间在冰上孵化 30 个细胞。或者，细胞可以使用迷你珠子搅拌机进行三个1分钟周期的解解。将整个细胞解解剂的 25-30 μL 保存在单独的管中进行闪烁计数。
注：保存的解质将用于确定每个样本在脉冲期间所摄取的放射性同位素的相对量，这将影响每个样品加载到TLC板上的量。第3.2步进一步讨论了这个问题。 - 将 2 mL 微中心管的全部内容倒入 15 mL 玻璃离心机管 [管 A]中。通过添加 1 mL 甲醇和涡流 10-15 s 来清洗 2 mL 微中心管。将 1 mL 甲醇洗涤液转移到 A 管中，将 2 mL 的氯仿添加到 A 管中，然后再将 400 μL 的水输送到 A 管中，最终样本量为 4.45 mL。
- 漩涡样品1分钟，然后5分钟离心在1000× 克。离心后，水（上）和有机（下）相应清晰地视觉分离，电池碎片位于接口。
- 使用玻璃巴斯德移液器，从 A 管收集有机相，然后移动到新的 15 mL 玻璃离心机管 （管 B）。将 1M KCl 的 1 mL 添加到 B 管中。要管A，加入1mL甲醇和2mL氯仿，和200微升米利克水。重复 A 管上的涡流和离心步骤。
- 再次从 A 管收集有机相，并将其添加到管 B 中。 将管 A 处理在适当的容器中。漩涡管B为1分钟，然后是5分钟的离心，1000×g。
- 从 B 管中取出上部的起层并处理。将 1 mL 的新鲜 1 M KCl 添加回管 B 并重复涡流/离心步骤。一旦层分开，小心地将整个底部有机层收集到标记为 4 mL 的玻璃瓶中。
注：在此步骤中，脂质提取物可以存储在 -80 °C 下，或者可以继续处理 TLC 脂质分离协议。
3. 通过薄层色谱法分离和量化放射性同位素标记的 NLs
- 如果脂质提取物被放置在-80°C下，通过在冰上孵育，然后在台面上慢慢达到室温。通过真空干燥或使用温和的惰性气体流（例如砷或氮气），从脂质提取物中完全蒸发溶剂。同时，将烤箱预热至 145 °C，以加热 TLC 板。
- 在将样品加载到 TLC 板之前，确定细胞占用的放射性标签的相对数量。Pipette 10 μL 的整个细胞从第 2.2 步解酯到 6 mL 玻璃闪烁瓶，加入 6 毫升闪烁液，并将小瓶放在机架中。使用闪烁计数器使用设置为 1 分钟计数时间的 计数单机架 选项测量每个样本的 cpm 或 dpm。测量每个整个细胞的解剖重复，以获得每个样本的平均值。根据野生类型或参考样本调整加载量
注：每个样品加载到TLC板上的量可以使用以下方程来确定：（平均样本计数）/（平均参考计数）x 所需的加载量。例如，如果要将 20 μL 的参考样品加载到 TLC 板上，并且平均计数为 1，000，则平均计数为 2，000 的实验样本将加载到 TLC 板上 10 μL。 - 通过涡流 5 分钟，将样品脂质在 1：1 （v/v%） 氯仿 40-50 μL 下重新形成。在玻璃分级气缸中准备 101 mL 的移动相溶剂（请参阅 代表结果 部分，以 50：40：10：1 （v/v/v/v%） 六烷：石油乙醚：二乙醚：醋酸溶剂）为主要 NL 物种分离示例）。
- 将溶剂倒入玻璃 TLC 室中，玻璃室内装有 20 x 20 TLC 饱和垫和紧贴盖子。使用铅笔轻轻标记板底上方 1.5 厘米的线条，准备导入的 20 x 20 硅胶 60 G 板。该线指定来源和将加载脂质的位置。在生产线下面，轻轻标记每个车道上将装载的样品。一旦TLC板已准备就，在145°C的烤箱中孵育板至少30分钟，以预加热板并去除任何多余的水分。
- 一旦板加热充分，TLC饱和垫充满溶剂，将 TLC 板从烤箱中取出，然后立即开始加载 TLC 板。在加热时加载板，确保溶剂快速蒸发。对于每个感兴趣的脂质物种，将 5-20 μg 的纯化脂质标准加载到 TLC 板的车道上，以跟踪分离和预期迁移距离。使用移液器，将 5μL 的样品点到位于 TLC 板底部上方 1.5 厘米的每个车道的原点上。重复加载 5 μL 点，直到 20-40 μL 的样品已加载到每个车道。
注：每个样品通道可添加 5-20 μg 未标记的纯脂，作为示踪剂，在 TLC 脂质分离后可进行染色和可视化。染色标准的存在允许轻松跟踪和切除放射性标签脂质带，以便随后进行闪烁计数。哪些净化标准被加载到板上将由感兴趣的 NL 物种决定。请参阅 代表结果部分，了解在样本车道附近的车道上分离油酸 （FFA）、1，2 二二醇 （DG）、三叶素 （TG）、胆固醇 （胆固醇）、胆碱亚油酸盐 （SE） 和污秽的示例。 - 一旦加载了标准和实验样品，将板放在开发室中，等待溶剂到达板的顶部（40-60 分钟）。完全开发后，将其从腔室中取出，使其在烟气罩中干燥 20 分钟。
- 盘子干燥后，用塑料薄膜盖住它，然后用自传屏幕把它放入一个正在开发的盒式磁带中。允许板与屏幕一起发展 24-48 小时。
4. TLC 分离脂质的可视化和量化
- 从正在开发的盒式磁带中取出屏幕，并放置在荧光成像仪内。选择磷成像选项，在 800-1000 V 下发展。
注： 磷成像 可定性地查看 TLC 板上的放射性标签脂质。然而，放射性标签脂质的量化最好通过闪烁计数来实现，随后进行了描述。 - 混合100毫升的p-甲醛试剂（见 补充文件），并存放在玻璃喷雾瓶中。用p-甲醛试剂喷洒TLC板，直到二氧化硅饱和。在 145 °C 烤箱中烘烤盘子 5 分钟，或直到带出现。
- 要使用放射性标签闪烁计数来量化单个脂质物种，请使用剃须刀刀片从玻璃 TLC 板中刮出二氧化硅凝胶。将每个与单个放射性标签脂质物种对应的二氧化硅凝胶带转移到玻璃闪烁小瓶中，并添加 6 毫升闪烁液。大力漩涡，直到硅带已减少到小块。
- 或者，也可以使用第 3 节中的脂质提取协议从二氧化硅凝胶带中提取脂质。如果从二氧化硅凝胶中提取脂质，则完全蒸发溶剂，就像第 3.1 步一样，并在干燥的脂质中加入 6 mL 闪烁液。将装有闪烁小瓶的机架放入闪烁计数器中。选择 计数单机架 选项，并将计数时间调整到每瓶 2 分钟。闪烁计数器的结果将被打印出来，并可以可视化为条形图。
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Representative Results
在此协议中，我们已经证明，NL 物种的标签、检测和量化可以通过14个 C-醋酸代谢标记来实现。主要NL物种可在溶剂系统中分离，50：40：10：1（v/v/v/v%） 六烷：石油乙醚：二乙醚：醋酸（图1A，B）。磷成像允许可视化标记的自由脂肪酸 （FFA）、三乙基甘油 （TG）、二乙酰甘油 （DG）、胆固醇 （胆汁） 和污秽 （SQ） （图 1A）。虽然这种溶剂中 SEs 可以与其他 NL 物种分离，但在 20 分钟的脉冲后，自动放射图中未检测到任何 SES。这可归因于酵母生长的静止阶段的缓慢SE合成。还证明，纯化脂质物种可以用这种方法分离，然后通过喷洒P-非甲醛试剂（图1B）来可视化。虽然NL物种在这个溶剂中相隔很远，但像磷脂酰胆碱（PC）这样的极地物种仍然停留在原点（图1B）。通过在脉冲后的无无线电标签介质中应用追逐期，可以测量通过 NL 通路的相对通量（图 1C）。经过10分钟的追逐，SQ的主要池已经消失，总乔尔被提升。同样，DG 在追逐期的外观与 FFA 信号的减少相关。
图1： 14C-醋酸放射性标签允许检测多个NL物种。 （A） TLC 分离的脂质的自动放射图，从酵母放射性标签中分离出来，在静止阶段带有 14种 C 醋酸。可明显检测的物种包括自由脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）、二乙酰甘油（DG）、胆固醇（胆汁）和污秽（SQ）。未标记的带是不明 NL 物种。（B） 由 TLC 分离的纯脂质物种，并可视化 p-甲醛染色。可视化物种包括 （A） 中提及的所有脂质，以及固醇酯 （SE） 和磷脂胆碱 （PC）。（C） TLC分离的脂质自动放射图，从酵母脉冲中分离出来，在静止阶段与 14-醋酸分离，然后在无放射性标签介质中分离10分钟的追逐期。SQ的消失与乔尔的增加有关。在追逐期，DG 的上升伴随着 FFA 物种的减少。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件： 缓冲器、媒体和解决方案的配方。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
在这里，提出了一个通用的无线电标签协议，以定量监测酵母中NL物种的合成。此协议非常模块化，允许在 3-6 天内完成该程序。此外，有丰富的文献存在使用TLC分离脂质物种和代谢物，这应该允许用户检测几个脂质物种的兴趣与TLC溶剂系统16，19的简单变化。此协议有利于放射性标签脂质的分离、检测和量化。它还可以与无标签介质中的追逐期相结合，以检测标记 NL 的周转时间。 总的来说，此过程为开始探索 NL 物种的无线电标签提供了有用的结构。
其他方法，如 HPLC、GC-MS 和 UPLC-MS 提供更高的脂质分离和量化分辨率;但是，通常不是通过 MS 运行放射性标记样品的最佳选择，尽管这可以通过使用稳定同位素来克服。然而，这种放射性标签方法为许多脂质物种提供了高检测灵敏度和多功能性。与 MS 相比，此协议的另一个优点是其可负担性。TLC的脂质分离相对简单，不需要奢侈的设备，并且依赖于常见的实验室材料。关于限制：某些低丰度物种，如利索脂，即使在加入 14C标签后，也无法检测到。此外，大多数 TLC 方法不适合"脂质"特征，因为给定溶剂中脂质物种的分类分离。
酵母为通过放射性标签生化方法研究脂质提供了一个方便、可遗传的模型系统。然而，应当指出，在特定的遗传背景中，或在特定代谢生长条件下，放射性标签醋酸或其他放射性实验室的细胞吸收量可能会减少。在没有葡萄糖的情况下，用 14个C-醋酸标记细胞可以有力地增加放射性标签的吸收。在没有葡萄糖的情况下长期孵化会按比例增加放射性标签的吸收：然而，这也可能影响有关路径。因此，在完全遵循 14个 C 醋酸放射性标签协议之前，应确定特定生长条件的标签效率。特别要注意无线电标签周期的长度。应尽可能缩短标签时间，以检测感兴趣的脂质物种。总之，这个程序允许研究重要的脂质合成反应，并应允许在完整的细胞中研究NL调节。
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Disclosures
作者宣称，在编写这份手稿时没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
作者要感谢亨尼实验室的成员在完成这项研究时提供帮助和概念建议。W.M.H.得到韦尔奇基金会（I-1873）、NIH NIGMS（GM119768）、阿拉·帕雷斯吉安医学研究基金和UT西南资助学者项目的资金支持。S.R 得到了 T32 计划赠款 （5T32GM008297） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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