一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

摘要

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。

摘要

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控多种细胞通路，包括RNA加工、信号转导、DNA损伤应答、miRNA生成以及翻译过程。

近年来，得益于生物化学与分析技术的进步，基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为以单一位点分辨率表征细胞甲基化蛋白质组的最有效策略。然而，甲基化蛋白的鉴定与分析仍面临挑战。 体内 由于这种修饰具有亚化学计量性质，且存在多种氨基酸替换以及酸性残基的化学甲基酯化（与甲基化具有相同质荷比），因此通过质谱法检测蛋白质R-甲基化仍具有挑战性且容易出错。因此，在甲基化蛋白质组学研究中，需要采用富集方法以提高R-甲基化肽段的鉴定效率，并结合正交验证策略以降低假发现率（FDR）。

本文描述了一种专门用于从细胞样品中高置信度鉴定和定量R-甲基化肽的实验方案，该方案结合了使用重同位素编码的甲硫氨酸（hmSILAC）对细胞进行代谢标记，以及对全细胞裂解液进行双蛋白酶溶液内消化，随后通过离线高pH反相（HpH-RP）色谱分离，并利用抗广谱R-甲基化抗体对R-甲基化肽进行亲和富集。经过高分辨率质谱分析后，原始数据首先使用MaxQuant软件包进行处理，然后利用hmSEEKER软件对MaxQuant输出文件中对应的轻链与重链甲基化肽的质谱峰对进行深度搜索分析。

引言

精氨酸（R）甲基化是一种翻译后修饰（PTM），存在于约1%的哺乳动物蛋白质组中¹。蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是一类催化R-甲基化反应的酶，通过将一个或两个甲基基团以对称或不对称的方式添加到精氨酸侧链胍基上的氮（N）原子上。在哺乳动物中，根据其催化单甲基化（MMA）和不对称二甲基化（ADMA）、MMA和对称二甲基化（SDMA），或仅催化MMA的能力，PRMTs可分为三类：I型、II型和III型^2,3。PRMTs主要靶向富含甘氨酸和精氨酸的区域（称为GAR基序）中的R残基，但某些PRMTs（如PRMT5和CARM1）也可甲基化富含脯氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸（PGM基序）的区域⁴。R-甲基化已被证实可调控多种生物学过程，例如RNA剪接⁵、DNA修复⁶、miRNA生成⁷以及翻译²，从而推动了对该PTM的深入研究。

质谱（MS）被公认为是在蛋白质、肽段和位点水平上系统研究全基因组R-甲基化的最有效技术。然而，该翻译后修饰在通过质谱进行高置信度鉴定时需要采取一些特殊预防措施。首先，....

方案

1. 细胞培养与蛋白质提取（所需时间：3 - 4 周）

1. 分别在添加轻链（L）或重链（H）甲硫氨酸的培养基中平行培养 HeLa 细胞（培养基成分见表1）。在细胞至少经历八次分裂后，分别从每种 SILAC 通道中取样，并进行掺入效率检测。
   注意：为检测掺入效率，需通过 LC-MS/MS 分析确认重链通道中重甲硫氨酸（Met-4）的掺入比例尽可能接近 100%。使用重同位素标记的细胞样品进行 LC-MS/MS 分析（仪器参数见表2），然后使用 MaxQuant 软件处理质谱数据，参数设置见表3。为检测 Met-4 的掺入情况，可使用位于 https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ 的自研脚本。
2. 当重甲硫氨酸的掺入率达到>97% 时，认为掺入已完成。当每种通道的细胞总数达到约 60 × 10⁶ 个（相当于约 40 个直径 15 cm 的培养皿，HeLa 细胞汇合度约 85%，具体数量因细胞类型而异）时，收集细胞。仔细计数后按 1:1 比例混合，并在 4 °C 条件下以 335 × g 离心 5 分钟形成细胞沉淀。
   注意：为验证 L/H 混合比例是否准确为 1:1，可保留部分混合样品，将其上样至含有高丰度且高度 R-甲基化蛋白（例如 fibrillarin）的凝胶切片....

结果

本文描述了一种高置信度鉴定全局蛋白质精氨酸甲基化的工作流程，该流程基于将蛋白质提取物平行地用两种不同的蛋白酶进行酶解消化，随后对蛋白水解肽段进行HpH反相液相色谱分级，并利用抗广谱精氨酸甲基化抗体对精氨酸甲基化肽段进行免疫亲和富集（图1）。

细胞在甲硫氨酸存在条件下培养，甲硫氨酸包括天然形式（轻型，L，Met-0）或同位素标记形式（重型，H，Met-4）。通过仅对少量Met-4提取物进行质谱（MS）分析，验证了完全的同位素标记后，收集重链和轻链细胞，并按1:1的轻/重（L/H）比例混合，如图1A所示。在¹³CD₃-甲硫氨酸代谢标记过程中，甲基通过甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）添加到蛋白质骨架上，且将以轻或重同位素形式存在²¹。图1B描述了由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）家族催化的精氨酸甲基化反应，该反应将.......

讨论

高置信度鉴定 体内 基于质谱的蛋白质组学中，蛋白质/肽段甲基化的全局分析具有挑战性，因为在样品制备过程中可能发生多种氨基酸替代以及甲基酯化反应，这些修饰与甲基化具有相同的质荷比，若缺乏正交质谱验证策略，易导致错误指认和较高的假发现率（FDR）。该翻译后修饰的亚化学计量特性进一步增加了全局甲基化蛋白质组学的难度，但可通过修饰肽段的选择性富集加以克服。¹⁰.

本文介绍了一种生化与分析工作流程，该流程旨在通过结合重甲基稳定同位素标记（hmSILAC）策略、高pH反相色谱（HpH-RP）肽段分级分离以及抗广谱R-甲基化肽抗体试剂盒的亲和富集，提高全局质谱分析R-甲基化肽的效率与可靠性。前一种策略可实现对甲基化肽的正交验证，并显著降低鉴定的假发现率（FDR）；而后一方案则可增强甲基化肽在未修饰肽背景中的可检测性²²。然而，该方案的一个局限性在于需要大量起始蛋白提取物（输入量在20–40 mg范围内），以进行后续的肽段分级分离和亲和富集，这限制了该方法仅适用于可大规模扩增的永生化、.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碳酸氢铵 (AMBIC)	Sigma-Aldrich	09830
过硫酸铵（APS）	Sigma-Aldrich	497363
C18 Sep-Pak 柱，真空 6 cc（1 g）	沃特斯	WAT036905
胶体考马斯亮蓝染色即用型	Sigma-Aldrich	ISB1L-1L
cOmplete Mini，无EDTA	罗氏-西格玛奥德里奇	11836170001	蛋白酶抑制剂
透析胎牛血清（FBS）	GIBCO ThermoFisher	26400-044
DL-二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	3483-12-3
DMEM培养基	GIBCO ThermoFisher	请求的	含稳定型谷氨酰胺且不含甲硫氨酸
EASY-nano LC 1200 色谱系统	ThermoFisher
EASY-Spray 高效液相色谱柱	赛默飞世尔科技	ES907
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
HeLa 细胞	ATCC	ATCC CCL-2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
碘乙酰胺（IAA）	Sigma-Aldrich	144-48-9
Jupiter C12-RP 色谱柱	Phenomenex	00G-4396-E0
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich	M5308	轻（L）甲硫氨酸
L-甲硫氨酸-(甲基-13C,d3)	Sigma-Aldrich	299154	重（H）甲硫氨酸
LysargiNase	默克密理博	EMS0008
Microtip 细胞破碎仪 Sonifier 250	布拉松
N,N,N′，N′四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	T9281
青霉素-链霉素	GIBCO ThermoFisher	15140122
PhosSTOP	罗氏-西格玛奥德里奇	4906837001	磷酸酶抑制剂
Pierce C18 Tips	ThermoFisher	87782
皮尔斯  乙腈中0.1%甲酸（v/v），LC-MS级	赛默飞世尔科技	85175	LC-MS 溶剂 B
皮尔斯  水（LC-MS级）中的0.1%甲酸（v/v）	赛默飞世尔科技	85170	LC-MS 溶剂 A
皮尔斯  乙腈（ACN），液相色谱-质谱级	赛默飞世尔科技	51101
皮尔斯  水，液相色谱-质谱级	ThermoFisher	51140
聚丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	92560
Precision Plus Protein  所有蓝色预染蛋白质标准品	伯乐（Bio-Rad）	1610373
PTMScan 抗体 α-ADMA	细胞信号技术公司	13474
PTMScan 抗体 α-甲基丙烯酸甲酯	细胞信号技术公司	12235
PTMScan 抗体 α-SDMA	细胞信号技术公司	13563
Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪	赛默飞世尔科技
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5113
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508
Ultimate 3000 高效液相色谱仪	Dionex
尿素	Sigma-Aldrich	U5378
真空浓缩仪 5301	Eppendorf		真空浓缩仪