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Biochemistry

वैश्विक और उच्च आत्मविश्वास प्रोटीन आर-मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/62409
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटीन आर्गिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक व्यापक प्रसार पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई जैविक मार्गों को विनियमित करता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री संशोधित पेप्टाइड संवर्धन के लिए जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ युग्मित होने पर आर-मिथाइल-प्रोटिओम को विश्व स्तर पर प्रोफाइल करने के लिए सबसे अच्छी तकनीक है। मानव कोशिकाओं में वैश्विक आर-मिथाइलेशन की उच्च आत्मविश्वास पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया वर्कफ़्लो यहां वर्णित है।

Abstract

प्रोटीन आर्गिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक व्यापक प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो आरएनए प्रसंस्करण, सिग्नल ट्रांसडक्शन, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया, एमआईआरएनए बायोजेनेसिस और अनुवाद सहित कई सेलुलर मार्गों के विनियमन में शामिल है।

हाल के वर्षों में, जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक विकास के लिए धन्यवाद, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स एकल-साइट संकल्प के साथ सेलुलर मिथाइल-प्रोटिओम को चिह्नित करने के लिए सबसे प्रभावी रणनीति के रूप में उभरा है। हालांकि, एमएस द्वारा विवो प्रोटीन आर-मिथाइलेशन में पहचान और प्रोफाइलिंग चुनौतीपूर्ण और त्रुटि-प्रवण बनी हुई है, मुख्य रूप से इस संशोधन की सबस्टोइकोमेट्रिक प्रकृति और विभिन्न अमीनो एसिड प्रतिस्थापन और अम्लीय अवशेषों के रासायनिक मिथाइल-एस्टरीफिकेशन की उपस्थिति के कारण जो मिथाइलेशन के लिए आइसोबेरिक हैं। इस प्रकार, मिथाइल-प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में झूठी खोज दर (एफडीआर) को कम करने के लिए आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स और ऑर्थोगोनल सत्यापन रणनीतियों की पहचान को बढ़ाने के लिए संवर्धन विधियों की आवश्यकता है।

यहां, विशेष रूप से सेलुलर नमूनों से उच्च आत्मविश्वास वाले आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स की पहचान और मात्रा के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो भारी आइसोटोप-एन्कोडेड मेथिओनिन (एचएमएसआईएलएएसी) और पूरे सेल अर्क के दोहरे प्रोटीज इन-सॉल्यूशन पाचन के साथ कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग को जोड़ता है, इसके बाद ऑफ-लाइन हाई-पीएच रिवर्स्ड फेज (एचपीएच-आरपी) क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन और एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी का उपयोग करके आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स का आत्मीयता संवर्धन होता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस विश्लेषण पर, कच्चे डेटा को पहले मैक्सक्वांट सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ संसाधित किया जाता है और परिणामों का विश्लेषण एचएमएसईईकेईआर द्वारा किया जाता है, जो मैक्सक्वांट आउटपुट फाइलों के भीतर हल्के और भारी मिथाइल-पेप्टाइड के अनुरूप एमएस पीक जोड़े की गहन खोज के लिए डिज़ाइन किया गया एक सॉफ्टवेयर है।

Introduction

आर्जिनिन (आर) -मिथाइलेशन एक पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो स्तनधारी प्रोटिओम 1 के लगभग1% को सजाता है। प्रोटीन आर्जिनिन मेथिलट्रांसफेरेज़ (पीआरएमटी) एक सममित या असममित तरीके से आर की साइड चेन के गुआनिडिनो समूह के नाइट्रोजन (एन) परमाणुओं के लिए एक या दो मिथाइल समूहों के जमाव द्वारा आर-मिथाइलेशन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने वाले एंजाइम हैं। स्तनधारियों में, पीआरएमटी को तीन वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है- टाइप I, टाइप II, और टाइप III- मोनो-मिथाइलेशन (एमएमए) और असममित डाइ-मिथाइलेशन (एडीएमए), एमएमए और सममित डाय-मिथाइलेशन (एसडीएमए) या केवल एमएमए, क्रमशः 2,3 दोनों को जमा करने की उनकी क्षमता के आधार पर। पीआरएमटी मुख्य रूप से ग्लाइसिन- और आर्जिनिन-समृद्ध क्षेत्रों के भीतर स्थित आर अवशेषों को लक्षित करते हैं, जिन्हें जीएआर रूपांकनों के रूप में जाना जाता है, लेकिन कुछ पीआरएमटी, जैसे कि पीआरएमटी 5 और सीएआरएम 1, प्रोलाइन-ग्लाइसिन-मेथिओनिन-समृद्ध (पीजीएम) रूपांकनोंको मिथाइलेट कर सकते हैं। आर-मिथाइलेशन कई जैविक प्रक्रियाओं के प्रोटीन मॉड्यूलेटर के रूप में उभरा है, जैसे कि आरएनए स्प्लिसिंग5, डीएनए मरम्मत6, मिआरएनए बायोजेनेसिस7, और अनुवाद2, इस पीटीएम पर शोध को बढ़ावा देते हुए।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) को प्रोटीन-, पेप्टाइड-और साइट-रिज़ॉल्यूशन पर वैश्विक आर-मिथाइलेशन का व्यवस्थित रूप से अध्ययन करने के लिए सबसे प्रभावी तकनीक के रूप में मान्यता प्राप्त है। हालांकि, इस पीटीएम को एमएस द्वारा इसकी उच्च आत्मविश्वास पहचान के लिए कुछ विशेष सावधानियों की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, आर-मिथाइलेशन सबस्टोइकोमेट्रिक है, जिसमें पेप्टाइड्स का असंशोधित रूप संशोधित लोगों की तुलना में बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में है, इसलिए डेटा डिपेंडेंट एक्विजिशन (डीडीए) मोड में संचालित मास स्पेक्ट्रोमीटर अपने कम तीव्रता वाले मिथाइलेटेड समकक्षोंकी तुलना में अधिक बार उच्च तीव्रता वाले असंशोधित पेप्टाइड्स को विभाजित करेंगे। इसके अलावा, आर-मिथाइलेटेड साइट पहचान के लिए अधिकांश एमएस-आधारित वर्कफ़्लोज जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण स्तर पर सीमाओं से ग्रस्त हैं। दरअसल, मिथाइल-पेप्टाइड्स की कम्प्यूटेशनल पहचान उच्च झूठी खोज दर (एफडीआर) से ग्रस्त है, क्योंकि यह पीटीएम विभिन्न अमीनो एसिड प्रतिस्थापन (जैसे, एलानिन में ग्लाइसिन) और रासायनिक संशोधन, जैसे कि एस्पार्टेट और ग्लूटामेट9 के मिथाइल-एस्टरीफिकेशन के लिए आइसोबेरिक है। इसलिए, मिथाइल समूहों के आइसोटोप लेबलिंग पर आधारित विधियां, जैसे सेल कल्चर में अमीनो एसिड के साथ भारी मिथाइल स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (एचएमएसआईएलएएसी), को विवो मिथाइलेशन में आत्मविश्वास एमएस-पहचान के लिए ऑर्थोगोनल रणनीतियों के रूप में लागू किया गया है, जिससे झूठे सकारात्मक एनोटेशन10 की दर में काफी कमी आई है।

हाल ही में, आर-मिथाइलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रोटिओम-वाइड प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है। आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन के लिए एंटीबॉडी-आधारित रणनीतियों के विकास ने मानव कोशिकाओं11,12 में कई सैकड़ों आर-मिथाइलेटेड साइटों के एनोटेशन को जन्म दिया है। इसके अलावा, कईअध्ययनों 3,13 ने बताया कि एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन जैसी पेप्टाइड पृथक्करण तकनीकों के साथ युग्मन एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन पहचाने गए मिथाइल-पेप्टाइड्स की समग्र संख्या को बढ़ावा दे सकता है।

यह लेख विभिन्न जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक चरणों के आधार पर मानव कोशिकाओं में आर-मिथाइलेटेड साइटों की व्यवस्थित और उच्च-आत्मविश्वास पहचान के लिए डिज़ाइन की गई एक प्रयोगात्मक रणनीति का वर्णन करता है: एचएमएसआईएलएएसी-लेबल कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण, ट्रिप्सिन और लिसार्गिनेस प्रोटीज के साथ समानांतर डबल एंजाइमेटिक पाचन, इसके बाद पचे हुए पेप्टाइड्स के एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफिक फ्रैक्शनेशन, एमएमए-, एसडीएमए-के एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन के साथ युग्मित। और एडीएमए युक्त पेप्टाइड्स। सभी आत्मीयता-समृद्ध पेप्टाइड्स का विश्लेषण डीडीए मोड में उच्च-रिज़ॉल्यूशन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी)-एमएस / एमएस द्वारा किया जाता है, और कच्चे एमएस डेटा को आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स की पहचान के लिए मैक्सक्वांट एल्गोरिदम द्वारा संसाधित किया जाता है। अंत में, मैक्सक्वांट आउटपुट परिणामों को भारी और हल्के मिथाइल-पेप्टाइड्स के जोड़े की खोज के लिए एक इन-हाउस विकसित जैव सूचना विज्ञान उपकरण एचएमएसईकेईआर के साथ संसाधित किया जाता है। संक्षेप में, hmSEEKER MSMS फ़ाइल से मिथाइल-पेप्टाइड्स पहचान को पढ़ता है और फ़िल्टर करता है, फिर प्रत्येक मिथाइल-पेप्टाइड को ऑलपेप्टाइड्स फ़ाइल में इसके संबंधित MS1 शिखर से मेल खाता है, और अंत में, भारी / हल्के पेप्टाइड समकक्ष के शिखर की खोज करता है। प्रत्येक कथित भारी-प्रकाश जोड़ी के लिए, लॉग 2 एच / एल अनुपात (लॉगरेशियो), अवधारण समय अंतर (डीआरटी), और मास एरर (एमई) मापदंडों की गणना की जाती है, और उपयोगकर्ता-परिभाषित कट-ऑफ के भीतर स्थित डबल्स को सच्चे सकारात्मक के रूप में लेबल किया जाता है। जैव रासायनिक प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्रा 1 में वर्णित है।

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Protocol

1. सेल संवर्धन और प्रोटीन निष्कर्षण (समय: 3 - 4 सप्ताह की आवश्यकता)

  1. क्रमशः लाइट (एल) या हेवी (एच) मेथिओनिन के साथ आपूर्ति किए गए मीडिया में समानांतर में हेला कोशिकाओं को उगाएं (मीडिया संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। कम से कम आठ सेल डिवीजनों पर, प्रत्येक एसआईएलएसी चैनल से कोशिकाओं का एक एलिकोट एकत्र करें और निगमन परीक्षण करें।
    नोट: निगमन दक्षता की जांच करने के लिए, एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण द्वारा परीक्षण करें कि भारी चैनल में भारी मेथिओनिन (मेट -4) का प्रतिशत 100% के करीब है। एमएस द्वारा भारी लेबल वाली कोशिकाओं के एक एलिकोट का विश्लेषण करें (सेटिंग्स के लिए तालिका 2 देखें), फिर तालिका 3 में इंगित मापदंडों का उपयोग करके मैक्सक्वांट के साथ एमएस डेटा को संसाधित करें। मेट -4 निगमन की जांच करने के लिए https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ पर एक इन-हाउस विकसित स्क्रिप्ट उपलब्ध है।
  2. भारी मेथिओनिन निगमन को पूर्ण मानें जब यह >97% तक पहुंच जाता है। जब प्रत्येक चैनल लगभग 60 x 106 कोशिकाओं की कुल संख्या तक पहुंचता है (15 सेमी के लगभग 40 व्यंजनों के अनुरूप, हेला कोशिकाओं के लिए 85% संयोजन पर, सेल प्रकार के आधार पर भिन्नताओं के साथ) उन्हें काटते हैं। ध्यान से उनकी गणना करें, 1: 1 अनुपात में मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 335 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली चलाएं।
    ध्यान दें: उचित 1: 1 एल / एच मिश्रण का आकलन करने के लिए, एक एलिकोट रखें और इसे एक जेल के टुकड़े पर चलाएं जिसमें उच्च प्रचुरता और भारी आर-मिथाइलेटेड प्रोटीन (जैसे, फाइब्रिलरिन) होता है। यदि लेबलिंग सफल रही है और 1: 1 मिश्रण हासिल किया गया है, तो नमूने में मौजूद आर-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स के हल्के और भारी संस्करणों का 1: 1 अनुपात होना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, एलसी-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किए जाने के लिए मिश्रित नमूने का एक एलिकोट रखें, फिर तालिका 3 में इंगित मापदंडों का उपयोग करके मैक्सक्वांट के साथ एमएस डेटा को संसाधित करें और चित्रा 2 सी में दर्शाए गए लॉग 2 एच / एल अनुपात के वितरण को प्लॉट करें। प्रोटोकॉल को गोली को स्नैप-फ्रीज करके और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करके यहां रोका जा सकता है।
  3. सेल पेलेट वॉल्यूम के संबंध में लाइसिस बफर के चार खंडों में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें (लाइसिस बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। उदाहरण के लिए, 1.5 एमएल मात्रा के अनुरूप 120 x 106 हेला कोशिकाओं (60 x 10 6 प्रकाश +60 x 10 6 भारी) से गोली के लिए लाइसिस बफर के6 एमएल का उपयोग करें।
    नोट: प्रोटीन निष्कर्षण कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाना चाहिए क्योंकि लाइसिस बफर में चाओट्रोपिक एजेंट 9 एम यूरिया होता है जो बर्फ के तापमान पर अवक्षेपित होता है; इसलिए, सेरीन और सिस्टीन प्रोटीज इनहिबिटर के व्यापक स्पेक्ट्रम के अलावा महत्वपूर्ण है, साथ ही फॉस्फेटेस अवरोधक, एक साथ प्रोटीन को प्रोटियोलिटिक गिरावट और डीफॉस्फोराइलेशन से बचाने के लिए, प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर का कॉकटेल व्यावसायिक रूप से छोटी गोलियों के रूप में उपलब्ध है, तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें।
  4. कोशिका झिल्ली के कुशल टूटने और डीएनए रिलीज और कतरन सुनिश्चित करने के लिए, नमूने को 15 एस ऑन और 30 एस ऑफ के कम से कम पांच चक्रों के लिए माइक्रोटिप सेल डिस्टर्बर सोनिकेटर के साथ सोनिकेट करें। घोल को ऊपर और नीचे करके अर्क की चिपचिपाहट की जांच करें। यदि यह अपूर्ण डीएनए कतरन और झिल्ली घुलनशीलता के कारण बहुत चिपचिपा है, तो सोनिकेशन चक्र ों को दोहराएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सोनिकेशन के दौरान नमूना अधिक गर्म नहीं होता है, क्योंकि उच्च तापमान प्रोटीन को नुकसान पहुंचा सकता है। हालांकि, 9 एम यूरिया की उपस्थिति के कारण, सोनिकेशन चक्रों के बीच बर्फ पर नमूना डालना संभव नहीं है; इसलिए, विभिन्न सोनिकेशन चक्रों के बीच 60 सेकंड के लिए विराम देने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, सोनिकेशन के दौरान हवा के बुलबुले के गठन से बचें क्योंकि वे सोनिकेशन प्रभावकारिता को कम करते हैं।
  5. मलबे को पेलेट करने और सुपरनैटेंट को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए आरटी में 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर अर्क को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. एक रंगीन परख के साथ अर्क की प्रोटीन सामग्री को मापें, जैसे ब्रैडफोर्ड या बिसिंकोनिक एसिड (बीसीए) 14,15। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रोटीन निकालने की एक इष्टतम प्रारंभिक मात्रा 20-30 मिलीग्राम के बीच है।
    नोट: उच्च सांद्रता यूरिया युक्त लाइसिस बफर ब्रैडफोर्ड और बीसीए परिमाणीकरण परख दोनों के साथ संगत हैं; अन्य प्रकार के लाइसिस बफर, जैसे सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की उच्च सांद्रता सहित, ब्रैडफोर्ड के साथ संगत नहीं हैं।

2.  लाइसेट पाचन (सांकेतिक समय 2 घंटे की आवश्यकता होती है)

  1. 4.5 एमएम की अंतिम सांद्रता पर अल्ट्राप्योर पानी में घुलने वाले डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के स्टॉक समाधान का उपयोग करके प्रोटीन के थिओल समूह (-एसएच) की कमी करें और प्रतिक्रिया को 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक चलने दें।
    नोट: 1 एम स्टॉक डीटीटी समाधान तैयार करना और इसे 1 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना संभव है, प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक एलिकोट को पिघलाना। वैकल्पिक रूप से, सल्फहाइड्रील रिडक्टेंट ट्राइस-(2-कार्बोक्सीथिल)-फॉस्फीन (टीसीईपी) का उपयोग -एसएच समूहों की कमी करने के लिए किया जा सकता है; विशेष रूप से प्रोटीन के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, टीसीईपी बफर में ईजीटीए जैसे धातु चेलेट्स के बिना डीटीटी की तुलना में काफी अधिक स्थिर है, जबकि डीटीटी अधिक स्थिर है यदि धातु चेलेट्स मौजूद हैं।
  2. 10 एमएम की एकाग्रता पर आयोडोसिटामाइड (आईएए) जोड़कर प्रोटीन के थिओल समूह (-एसएच) का क्षारीकरण करें और अंधेरे में आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अंधेरे में आईएए समाधान के साथ निकाले गए प्रोटीन की इनक्यूबेशन करें क्योंकि आईएए फोटोसेंसिटिव है।
    नोट: 100 mM पर IAA स्टॉक समाधान प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, क्लोरोएसेटामाइड का उपयोग -एसएच समूहों के अल्काइलेशन करने के लिए किया जा सकता है, खासकर अगर प्रयोग का लक्ष्य मिथाइलेशन और सर्वव्यापी के बीच क्रॉस-टॉक का विश्लेषण करना है क्योंकि आईएए-प्रेरित कलाकृतियांसर्वव्यापी 17 की नकल करती हैं।
  3. प्रोटीन पाचन चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले, एसडीएस-पेज कूमासी-दाग वाले जेल पर बाद के विश्लेषण के लिए प्रोटीन अर्क (बिना पचे लाइसेट शुरू करने का 1/1,000) का एक एलिकोट सहेजें और पाचन पर नमूने की इसी मात्रा के साथ तुलना करें; यह परीक्षण प्रोटियोलिसिस दक्षता को सत्यापित करने के लिए कार्य करता है (बिंदु 4 देखें)।
  4. 2 एम की अंतिम यूरिया एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 20 एमएम एचईपीईएस पीएच 8.0 के चार संस्करणों के साथ शेष प्रोटीन अर्क को पतला करें (जो प्रोटीज की एंजाइमेटिक गतिविधि के साथ संगत एकाग्रता है)। नमूने को दो भागों में विभाजित करें: पहले में अनुक्रमण ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन जोड़ें और दूसरे में प्रारंभिक सामग्री के मिलीग्राम के सापेक्ष 1: 100 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अनुपात पर लिसर्गीनेस प्रोटीज (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। एंजाइमैटिक पाचन की अनुमति देने के लिए, 600 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
    नोट: ट्रिप्सिन, प्रोटिओमिक्स में सबसे आम पाचन एंजाइम, आर और लाइसिन (के) के सी-टर्मिनस पर क्लीवर होता है, जो चार्ज वितरण के साथ पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है जिसके परिणामस्वरूप टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) पर वाई-प्रकार के आयनों के प्रभुत्व वाले विखंडन स्पेक्ट्रा होते हैं। इसलिए, आर और के के एन-टर्मिनस पर लाइसर्गीनेस क्लीवर, ट्रिप्सिन दरार विशिष्टता को प्रतिबिंबित करता है और पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है जो सीआईडी विखंडन पर मुख्य रूप से बी-प्रकार के आयन जारी करते हैं। यह संयुक्त विश्लेषण पेप्टाइड अनुक्रम कवरेज में बहुत वृद्धि करता है और आर-मिथाइलेशन18 की साइट-विशिष्ट पहचान में उच्च आत्मविश्वास की ओर जाता है।

3. पेप्टाइड शुद्धिकरण (सांकेतिक समय 1 घंटे की आवश्यकता)

  1. प्रोटीज पाचन दक्षता का आकलन करने के लिए एसडीएस-पेज कूमासी-दाग वाले जेल पर तुलना के लिए बिंदु 2.3 में समान मात्रा एकत्र करते हुए दोनों प्रतिक्रियाओं से पचे हुए पेप्टाइड्स का एक एलिकोट रखें (बिंदु 4 देखें)।
  2. 5% की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए) के अतिरिक्त नमूनों को अम्लीय करके पाचन को रोकें। अच्छी तरह से मिलाएं और एक लिटमस पेपर के साथ नमूने पीएच को मापें (पीएच लगभग 3 होना चाहिए)। भंवर संक्षेप में और नए 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करने से पहले अम्लीय नमूनों को घुमाता है।
  3. दो सी 18 वैक कारतूस (शर्बत वजन 1 ग्राम, सामग्री की तालिका देखें) के माध्यम से नमूनों को साफ करें, एक ट्रिप्सिन के साथ पचने वाले नमूने के लिए और दूसरा लिसारगीनेस के साथ पचने वाले नमूने के लिए। सॉल्वेंट ए, सॉल्वेंट बी और वॉश बफर तैयार करें (बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें)।
  4. ग्लास पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कारतूस को 6 एमएल एसीएन 100% के साथ 3 बार फिर से हाइड्रेट करें। उसके बाद, प्रत्येक कारतूस को सॉल्वेंट ए के 3-9-18 एमएल के साथ क्रमिक रूप से बराबर करें। सॉल्वेंट ए के 3-9-18 एमएल के साथ क्रमिक रूप से फिर से धोएं और फिर 6 एमएल वॉश बफर जोड़ें। प्रत्येक स्तंभ को साफ 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 7 एमएल सॉल्वेंट बी के साथ नमूने को हटा दें। 14 एमएल के अंतिम आयतन के लिए सॉल्वेंट बी के 7 एमएल के साथ क्षालन चरण दोहराएं।
    नोट: बफर और समाधान को गुरुत्वाकर्षण द्वारा स्तंभों से गुजरने देकर इन सभी चरणों को निष्पादित करें। स्तंभ के माध्यम से बफर के प्रवाह का पक्ष लेने के लिए, वैक्यूम की नकल करने के लिए, प्रत्येक समाधान को सिरिंज के साथ धीरे-धीरे धक्का दें।
  5. एसडीएस-पेज द्वारा बाद के पेप्टाइड मूल्यांकन के लिए 50 μL इल्यूटेड पेप्टाइड्स, 50 μL फ्लो-थ्रू (FT), सॉल्वेंट A के साथ धोने के 50 μL और अंतिम वॉश के 50 μL को सहेजें (बिंदु 4 देखें)।

4. कूमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज जेल (सांकेतिक समय 2 घंटे की आवश्यकता)

  1. एकत्र किए गए एलिकोट को 17.5% एसडीएस-पेज जेल पर चलाएं और इंस्टेंट-ब्लू कूमासी स्टेनिंग के साथ दाग लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। अपेक्षित परिणाम चित्रा 2 ए में दर्शाया गया है।

5. पेप्टाइड लियोफिलाइजेशन (सांकेतिक समय 2 दिन)

  1. पैराफिन फिल्म के साथ इल्यूटेड पेप्टाइड्स युक्त 15 एमएल ट्यूबों को कवर करें, जिसे फिर 3-5 छेद बनाने के लिए 20 जी सुई के साथ छिद्रित किया जाता है। ट्यूबों को कम से कम 30 मिनट के लिए सूखी बर्फ में रखें, जब तक कि नमूने पूरी तरह से जमे हुए न हों।
  2. 48 घंटे के लिए जमे हुए अंशों को लियोफिलाइज़ करें, एक समय अंतराल जो आमतौर पर नमूनों के पूर्ण लियोफिलाइजेशन को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त होता है, भले ही फ्रीज ड्रायर प्रदर्शन के कारण कुछ परिवर्तनशीलता हो सकती है।
    नोट: प्रयोग को यहां रोका जा सकता है, लियोफिलाइज्ड नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. पेप्टाइड्स के ऑफ-लाइन एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफिक फ्रैक्शनेशन (सांकेतिक समय 4 दिन)

  1. पेप्टाइड्स को 60 अंशों में विभाजित करने के लिए, सी 12-आरपी एचपीएलसी कॉलम (250 x 4.6 मिमी, 4 μm Proteo 90A) द्वारा सुसज्जित एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके एचपीएच-आरपी तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें।
  2. दौड़ने से पहले, ताजा बफर ए और बफर बी तैयार करें (बफर की संरचना तालिका 1 में वर्णित है)।
  3. सभी घोल को 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और उन्हें कम से कम 30 मिनट के लिए सोनिकेटर स्नान में डिगैस करें।
  4. एक सिरिंज का उपयोग करके पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से पेप्टाइड्स को फ़िल्टर करें।
  5. 1 एमएल /मिनट प्रवाह पर फ्रैक्शनेशन दर सेट करें और निम्नलिखित क्रोमैटोग्राफिक ढाल का उपयोग करके 1 एमएल अंश एकत्र करें: 60 मिनट में 5% बी से 30% बी; 2 मिनट में 30% बी से 60%; 3 मिनट के लिए 70% B.
  6. एचपीएलसी को सेट करें ताकि, इस बिंदु पर, अंश संग्रह रुक जाए, और 100% बफर बी तक त्वरित ढाल के साथ कॉलम के व्यापक धोने से पहले 5 मिनट के लिए 70% बफर बी पर ढाल रखी जाए, इसके बाद अंतिम धोने (10 मिनट के लिए 100% बफर बी)।
    नोट: प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक रन के अंत में, हमेशा कॉलम को 20 मिनट के लिए 100% बफर ए के साथ बराबर करें।
  7. ऑफ-लाइन एचपीएच आरपी क्रोमैटोग्राफिक ग्रेडिएंट्स द्वारा ट्रिप्सिन और लिसर्गीनेस के साथ अलग-अलग पचाए गए दोनों नमूनों को अलग-अलग करें, जैसा कि बिंदु 6.5 पर वर्णित है।
  8. प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक ढाल के लिए, सभी अंशों को एक गहरी 96 वेल प्लेट में इकट्ठा करें।
  9. ढाल से पहले एकत्र किए गए अंशों को प्री नामक एक एकल अंश में पूल करें। एचपीएच-आरपी तरल क्रोमैटोग्राफिक (एलसी) ढाल से 60 अंशों को 14 अंतिम अंशों में गैर-सन्निहित तरीके से एकत्र करके संयोजित करें। इस तरह के गैर-सन्निहित संयोजन प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित योजना के अनुसार एचपीएच-आरपी अंशों को पूल करें।
    1. अंश 1 (अंतिम मात्रा 5 एमएल): पूल 1-15-29-43-57
    2. अंश 2 (अंतिम मात्रा 5 एमएल): पूल 2-16-30-44-58
    3. अंश 3 (अंतिम मात्रा 5 एमएल): पूल 3-17-31-45-59
    4. अंश 4 (अंतिम मात्रा 5 एमएल): पूल 4-18-32-46-60
    5. अंश 5 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 5-19-33-47
    6. अंश 6 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 6-20-34-48
    7. अंश 7 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 7-21-35-49
    8. अंश 8 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 8-22-36-50
    9. अंश 9 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 9-23-37-51
    10. अंश 10 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 10-24-38-52
    11. अंश 11 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 11-25-39-53
    12. अंश 12 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 12-26-40-54
    13. अंश 13 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 13-27-41-55
    14. अंश 14 (अंतिम मात्रा 4 एमएल): पूल 14-28-42-56
      नोट: गैर-सन्निहित संयोजन में प्रारंभिक, मध्य और देर से एल्यूटिंग अंशों का संयोजन होता है, जो पूल किए गए अंशों के भीतर पेप्टाइड संरचना में विषमता को बढ़ाने की अनुमति देता है। नतीजतन, प्रत्येक पूल किए गए अंश के पेप्टाइड मिश्रण को बाद के नैनो-प्रवाह कम पीएच-आरपी-एलसी क्रोमैटोग्राफी में सीमित सह-क्षालन के साथ कुशलतापूर्वक अलग किया जाता है, सीधे मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित किया जाता है।
  10. ढाल के बाद एकत्र किए गए अंशों को एक अद्वितीय अंश में पूल करें, जिसका नाम पोस्ट है।
    नोट: अंशों को शामिल करके पूर्व और पोस्ट ढाल, 15 एमएल ट्यूबों में कुल 16 अंश प्राप्त किए जाते हैं ( चित्र 3 ए देखें)।
  11. पैराफिन फिल्म के साथ 15 एमएल ट्यूबों को कवर करें और 3-5 छेद उत्पन्न करने के लिए इसे 20 जी सुई के साथ पंच करें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सूखी बर्फ में इंजेक्ट करके उन्हें फ्रीज करें जब तक कि प्रत्येक अंश पूरी तरह से जम न जाए।
  12. लगभग 48 घंटे के लिए अंशों को लियोफिलाइज़ करें। सुनिश्चित करें कि फ्रीज-ड्रायर को रोकने से पहले प्रत्येक नमूना पूरी तरह से सूख गया है।
    नोट: प्रयोग को यहां रोका जा सकता है, लियोफिलाइज्ड नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. आर-मिथाइलेटेड पेप्टाइड इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन (सांकेतिक समय 2 दिन)

  1. समानांतर में एंटी-पैन-आर-मिथाइलेशन एंटीबॉडी के साथ संशोधित पेप्टाइड के अनुक्रमिक इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन का प्रदर्शन करें, लेकिन क्रमशः ट्रिप्सिन और लिसारगीनेस पाचन से दो नमूनों के लिए अलग-अलग। इम्यूनो-एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (आईएपी) बफर को कंपनी द्वारा संशोधित पेप्टाइड आत्मीयता संवर्धन के लिए एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी खरीदने द्वारा प्रदान किया जाता है (विवरण तालिका सामग्री और अभिकर्मकों में हैं)। आईएपी बफर 10x केंद्रित है और उपयोग से पहले 10 बार पतला किया जाना चाहिए।
    नोट: आईएपी बफर 1 एक्स को -20 डिग्री सेल्सियस से 1 वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. आरटी में 5 मिनट के लिए 2,000 x g पर लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड्स को सेंट्रीफ्यूज करें ताकि पेप्टाइड्स को 15 एमएल ट्यूब के निचले हिस्से में स्पिन किया जा सके। प्रति 15 एमएल ट्यूब में 1x आईएपी बफर के 250 μL के साथ लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें और 1.5 एमएल कम-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें। लिटमस पेपर का उपयोग करके जांचें कि क्या पीएच >6 है।
  3. बाद के एमएस विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में प्रत्येक अंश का एक छोटा एलिकोट (मात्रा का लगभग 5%) रखें।
  4. समानांतर में असममित-डी-मिथाइलेटेड (एडीएमए) और सममित-डी-मिथाइलेटेड (एसडीएमए) पेप्टाइड्स के इम्यूनो-संवर्धन को करने के लिए प्रत्येक अंश को दो एलिकोट में विभाजित करें।
  5. चयनित एंटी-पैन-आर-मिथाइलेटेड एंटीबॉडी की तीन शीशियों का उपयोग करें जो प्रोटीन ए अगारोस मोतियों से संयुग्मित होते हैं, प्रति 10 मिलीग्राम प्रारंभिक प्रोटीन अर्क।
  6. प्रत्येक शीशी को 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके और मोतियों से बफर को हटाकर अगारोस मोतियों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी की सही मात्रा तैयार करें। मोतियों को 1x PBS के 1 mL के साथ तीन बार धोएं, उन्हें 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके।
  7. अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक शीशी के लिए 40 μL 1x PBS में मोतियों को फिर से निलंबित करें; उन्हें पूल करें और अंत में उन्हें 16 अंशों में समान रूप से विभाजित करें (ताकि प्रत्येक अंश में एंटीबॉडी-मोतियों का 2.5 μL जोड़ा जा सके)।
  8. प्रत्येक ट्यूब में 1x IAP बफर का 250 μL जोड़ें, इनवर्ट करके मिलाएं और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए घूर्णन पहिया पर इनक्यूबेट करने दें।
    नोट: नमूनों को माइक्रोटिप्स के साथ पाइप करने के बजाय 1.5 एमएल ट्यूबों को उलटकर मिलाएं, जो मोतियों को नुकसान पहुंचा सकता है या परिणामस्वरूप उन्हें खो सकता है।
  9. 2 घंटे इनक्यूबेशन पर, मोतियों को पेलेट करने के लिए 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर पेप्टाइड्स और पैन-आर-मिथाइल-एंटीबॉडी-संयुग्मित मोतियों वाले 1.5 एमएल ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें; प्रत्येक अंश से एफटी को साफ 1.5 एमएल कम-बाइंडिंग ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  10. एफटी में आर-मोनो-मिथाइलेशन (एमएमए) के खिलाफ एंटीबॉडी में संयुग्मित मोतियों को जोड़ें और चरण 7.7 से 7.9 तक दोहराएं।
  11. एमएमए-मोतियों के साथ पेप्टाइड नमूनों के इनक्यूबेशन के दौरान, उन अंशों को दो बार धोएं जो पहले एंटी-एडीएमए और एसडीएमए के साथ इम्यूनो-अवक्षेपित थे, 250 μL आईएपी बफर (इनवर्टिंग और पाइपिंग नहीं) के साथ, और प्रत्येक धोने पर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  12. एलसी-एमएस ग्रेड एच 2 ओ के साथधोनेको तीन बार दोहराएं।
  13. प्रत्येक ट्यूब में 0.15% टीएफए के 50 μL जोड़कर अगारोस मोतियों से आत्मीयता-समृद्ध आर-डाई-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स को अलग करें (मजबूत एसिड की स्थिति, वास्तव में, एंटीबॉडी से एंटीजन की रिहाई के लिए एपिटोप को विकृत करती है)। इस घोल को आरटी पर 10 मिनट छोड़ दें, ट्यूबों को हर 2-3 मिनट में उलट दें।
  14. पहले क्षालन को साफ 1.5 एमएल कम-बाइंडिंग ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 50 μL 0.15% TFA के साथ क्षालन को दोहराएं; एक ट्यूब में 2 अंशों को पूल करें।
  15. आर-मोनो-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स के लिए 7.11 से 7.14 तक के चरणों को दोहराएं जिन्हें एंटी-एमएमए एंटीबॉडी-बीड्स के साथ इनक्यूबेट किया गया था।

8. सी 18 माइक्रोकॉलम द्वारा आत्मीयता-समृद्ध मिथाइल-पेप्टाइड्स की डीसाल्टिंग और एकाग्रता (सांकेतिक समय 30 मिनट की आवश्यकता)

  1. एमएस विश्लेषण से पहले पेप्टाइड डीसाल्टिंग और एकाग्रता के लिए 3 एम ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस के साथ बनाए गए सी 18-आरपी माइक्रोकॉल को मेथनॉल के साथ बराबर करें।
  2. नमूनों (अलग-अलग इम्यूनो-एफिनिटी समृद्ध अंशों और इनपुट अंशों के अनुरूप) को सी 18 माइक्रोकॉलम पर दो चरणों में लोड करें (प्रत्येक सी 18 माइक्रोकॉलम पर 50 μL + 50 μL) 6 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके।
  3. माइक्रोकॉलम को 55 μL बफर A (बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें) के साथ धोएं, हमेशा 5 मिनट के लिए लगभग 900 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा।
    नोट: प्रयोग को यहां रोका जा सकता है, सी 18-आरपी माइक्रोकॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जा सकता है, जहां उन्हें 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।

9. दूसरा एंजाइमेटिक पाचन (सांकेतिक समय 3 घंटे की आवश्यकता होती है)

  1. सी 18-आरपी माइक्रोकॉलम को 55 μL बफर ए के साथ धोएं (बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें) दो बार, 5 मिनट के लिए लगभग 850 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा।
  2. पेप्टाइड्स को दो बार बफर बी के 20 μL के साथ मिलाएं (बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें) और दो अंशों को पूल करें।
  3. एक वैक्यूम कंसंट्रेटर में इल्यूटेड पेप्टाइड्स को सुखाएं (विवरण के लिए तालिका सामग्री और अभिकर्मक देखें)। इस बीच, पाचन समाधान तैयार करें जिसमें 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट होता है जो ताजा बने 1 एम स्टॉक समाधान से पतला होता है ( तालिका 1 देखें)।
  4. संबंधित नमूनों में ट्रिप्सिन या लिसर्गीनेस जोड़ें, 25 ng/μL की अंतिम सांद्रता के लिए। प्रत्येक नमूने को 2 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
  5. पाचन को रोकने के लिए 5% टीएफए का 1 μL जोड़ें; भंवर और नमूने को नीचे घुमाएं।
    नोट: ट्रिप्सिन द्वारा एंजाइमैटिक दरार को मिथाइलेटेड आर और के के सी-टर्मिनस पर बाधित किया जा सकता है, जिससे मिस्ड क्लीवेज होते हैं जो पेप्टाइड लंबाई और चार्ज को बढ़ाते हैं, जो बदले में पेप्टाइड पहचान और मिथाइलेशन साइटों के साइट-विशिष्ट एट्रिब्यूशन में बाधा डालने वाले जटिल और अपूर्ण विखंडन स्पेक्ट्रा का उत्पादन करते हैं। यह दिखाया गया है कि एक दूसरा एंजाइमेटिक पाचन बेहतर अनुक्रम कवरेज और साइट-एट्रिब्यूशन20 के साथ ऐसे मिस्ड क्लीवेज की आवृत्ति को कम कर सकता है।

10. डीसाल्टिंग पेप्टाइड्स (सांकेतिक समय 30 मिनट की आवश्यकता होती है)

  1. अम्लीय पेप्टाइड समाधानों को नए सी 18-आरपी माइक्रोकॉलम में लोड करें जिन्हें पहले बिंदु 8 में वर्णित समान चरणों का पालन करते हुए समतुल्य किया गया है।
  2. सी 18-आरपी माइक्रोकॉलम पर लोड किए गए पेप्टाइड को एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए क्षालन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

11. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण (सांकेतिक समय 5 दिन)

  1. C18-RP माइक्रोकॉलम से पेप्टाइड्स को 10μL बफर B को पास करके, RT पर 5 मिनट के लिए 615 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके निकालें। इस चरण को दो बार दोहराएं और एलुएट्स को मिलाएं।
  2. वैक्यूम कंसंट्रेटर में एलुएट्स की मात्रा को कम करें जब तक कि वे लगभग सूख न जाएं, सूखने से बचें।
  3. एमएस विश्लेषण के लिए बफर ए के 10 μL में पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें।
  4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) में तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) द्वारा आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के प्रत्येक अंश का विश्लेषण करें, जो नैनो-प्रवाह अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (यूएचपीएलसी) प्रणाली के साथ युग्मित है। तालिका 2 में वर्णित उपकरण पैरामीटर सेट करें।
  5. एक नैनो-विश्लेषणात्मक कॉलम (आसान स्प्रे कॉलम 75 μm आंतरिक व्यास, 25 सेमी लंबाई) पर प्रत्येक नमूने का 2 μL लोड करें, जो C18-RP राल (2 μm कण आकार) के साथ पैक किया गया है।
  6. नमूने सी 18 आरपी नैनो-कॉलम के माध्यम से 300 nL / min की प्रवाह दर पर पारित किए जाते हैं, जिसमें निम्नलिखित रैखिक ढाल होती है: 89 मिनट के लिए 3% -30% B, 5 मिनट के लिए 30% -60% B, 1 मिनट के लिए 60% -95% B, और 5 मिनट के लिए 95% B।
  7. मास स्पेक्ट्रोमीटर डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड में संचालित होता है ताकि स्वचालित रूप से पूर्ण स्कैन एमएस और एमएस / एमएस अधिग्रहण के बीच स्विच किया जा सके। रिज़ॉल्यूशन आर = 70,000 के साथ स्पेक्ट्रोमीटर डिटेक्टर में विश्लेषण किए जाने के लिए सर्वेक्षण पूर्ण स्कैन एमएस सेट करें। पंद्रह सबसे तीव्र पेप्टाइड आयनों को क्रमिक रूप से 3 x 106 के लक्ष्य मान से अलग किया जाता है और 28% की सापेक्ष टकराव ऊर्जा द्वारा खंडित किया जाता है। पूर्ण स्कैन के लिए अधिकतम अनुमत आयन संचय समय को 20 एमएस और एमएस / एमएस के लिए 50 एमएस पर सेट करें और एमएसएमएस के लिए लक्ष्य मूल्य 1 x 10 6 पर तयकरें। गतिशील बहिष्करण समय 20 सेकंड पर सेट है।

12. मैक्सक्वांट और एचएमएसईकेईआर डेटा विश्लेषण चलाना

  1. एमएस रन के पूरा होने पर, संदर्भ डेटाबेस के खिलाफ संभाव्यता-आधारित दृष्टिकोण द्वारा मिथाइल-पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए पेप्टाइड खोज इंजन में एमएस कच्चे डेटा को आयात करें। इस प्रोटोकॉल में, MaxQuant संस्करण 1.6.2.10 हमारे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। MaxQuant को चलाने के लिए न्यूनतम 2 जीबी रैम की आवश्यकता होती है, साथ ही सभी कच्चे डेटा और सभी आउटपुट फ़ाइलों को संग्रहीत करने के लिए पर्याप्त डिस्क स्थान की आवश्यकता होती है।
    नोट: स्थापना और हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर आवश्यकताओं के बारे में सभी विवरणों के लिए https://www.maxquant.org में आधिकारिक दस्तावेज देखें।
  2. प्रत्येक कच्चे डेटा फ़ाइल को डुप्लिकेट करें। मूल को उनके नाम के साथ "_light" जोड़कर नाम बदलें, फिर "_heavy" जोड़कर प्रतियों का नाम बदलें।
    नोट: एचएमएसईकेईआर, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट, मामले संवेदनशील है।
  3. तालिका 3 में दर्शाई गई सेटिंग्स के साथ पेप्टाइड पहचान के लिए मैक्सक्वांट / एंड्रोमेडा खोज शुरू करें। MaxQuant द्वारा उत्पादित कई आउटपुट डेटा में से, पोस्ट प्रोसेसिंग चरण के लिए केवल ऑलपेप्टाइड्स.txt और एमएसएम.txt फाइलें (संयुक्त / txt सबफ़ोल्डर में स्थित) की आवश्यकता होती है।
  4. MaxQuant आउटपुट डेटा का पोस्ट प्रोसेसिंग एल्गोरिथ्म hmSEEKER द्वारा किया जाता है। से hmSEEKER डाउनलोड करें: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. स्क्रिप्ट पायथन 3.7 में लिखी गई एक जुपीटर नोटबुक के रूप में उपलब्ध है और परीक्षण उद्देश्यों के लिए एक नमूना डेटासेट के साथ आता है। नए उपयोगकर्ताओं के लिए, एनाकोंडा प्लेटफ़ॉर्म (https://www.anaconda.com/products/individual) को डाउनलोड और इंस्टॉल करना उचित है। नवीनतम रिलीज़ में डिफ़ॉल्ट रूप से पायथन 3.8, Jupyter और सभी पैकेज शामिल हैं जो hmSEEKER (जैसे, Scikit-learn 0.23.1) चलाने के लिए आवश्यक हैं।
  5. एक फ़ोल्डर बनाएं और मैक्सक्वांट आउटपुट से सभी पेप्टाइड्स.txt और एमएसएम.txt फ़ाइलों को संग्रहीत करें।
  6. लॉन्च Jupyter (कमांड लाइन से या एनाकोंडा नेविगेटर से)।
  7. hmSEEKER फ़ोल्डर पर नेविगेट करें और hmSEEKER.ipynb खोलें।
  8. नोटबुक के इनपुट पैरामीटर अनुभाग में, FASTA डेटाबेस और MaxQuant पाठ फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर (ओं) के पथ इंगित करें।
  9. सेल का चयन करके और जुपीटर इंटरफ़ेस के शीर्ष पर प्ले बटन पर क्लिक करके प्रत्येक सेल के अंदर कोड चलाएं।
  10. स्क्रिप्ट प्रत्येक डेटासेट के लिए एक अल्पविराम-अलग आउटपुट फ़ाइल का उत्पादन करती है जिसका विश्लेषण किया गया था, साथ ही एक संयुक्त फ़ाइल भी। अंतिम डबल्स सूची "[दिनांक]-[समय]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv" नामक फ़ाइल में पाई जा सकती है
    (तालिका 4 में आउटपुट तालिका में कॉलम का संक्षिप्त विवरण शामिल है)।

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Representative Results

लेख वैश्विक प्रोटीन आर-मिथाइलेशन की उच्च-आत्मविश्वास पहचान के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो समानांतर में दो अलग-अलग प्रोटीज के साथ प्रोटीन निकालने के एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन पर आधारित है, इसके बाद एचपीएच-आरपी तरल क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स का फ्रैक्शनेशन और एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी के साथ आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स का इम्यूनो-आत्मीयता संवर्धन (चित्रा 1)।

कोशिकाओं को मेथिओनिन की उपस्थिति में उगाया गया था, या तो प्राकृतिक (लाइट, एल, मेट -0) या आइसोटोपिक रूप से लेबल (भारी, एच, मेट -4)। पूर्ण आइसोटोपिक लेबलिंग पर, जिसे एमएस विश्लेषण द्वारा मेट -4 केवल अर्क के एक छोटे से एलिकोट पर परीक्षण किया गया था, भारी और हल्की कोशिकाओं को काटा गया और 1: 1 एल / एच अनुपात मिलाया गया, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है। 13सीडी 3-मेथिओनिन चयापचय लेबलिंग पर, मिथाइल समूहों को मिथाइल-डोनर एस-एडेनोसिल-मेथिओनिन (एसएएम) से प्रोटीन बैकबोन में जोड़ा जाता है और यह प्रकाश या भारी-आइसोटोप फॉर्म21 में मौजूद होगा। चित्रा 1 बी प्रोटीन आर्जिनिन मेथिलट्रांसफेरेज़ (पीआरएमटी) परिवार द्वारा किए गए आर्जिनिन मिथाइलेशन प्रतिक्रिया का वर्णन करता है जो एस-एडेनोसिल मेथिओनिन (एसएएम) से आर्जिनिन के गुआनिडिनो नाइट्रोजन में मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है। यदि आर्जिनिन के टर्मिनल नाइट्रोजन परमाणुओं में से एक पर एक एकल मिथाइल समूह रखा जाता है, तो मोनो-मिथाइलेटेड आर्जिनिन (एमएमए) प्राप्त होता है। यदि गुआनिडिनो समूह के एक ही नाइट्रोजन परमाणु पर दो मिथाइल समूहों को जोड़ा जाता है, तो असममित डी-मिथाइलेटेड आर्जिनिन (एडीएमए) उत्पन्न होता है, जबकि यदि दो मिथाइल समूहों को दो अलग-अलग नाइट्रोजन परमाणुओं पर रखा जाता है, तो सममित डी-मिथाइलेटेड आर्जिनिन (एसडीएमए) का उत्पादन होता है।

1: 1 अनुपात हल्के और भारी लेबल वाली कोशिकाओं में मिश्रण करने के बाद, प्रोटीन निकाला गया और समानांतर में ट्रिप्सिन और लिसारगीनेस द्वारा पाचन के अधीन किया गया। जैसा कि चित्रा 2 में प्रदर्शित किया गया है, एसडीएस-पेज कूमासी-सना हुआ जेल पेप्टाइड्स में कुल प्रोटीन के कुशल एंजाइमेटिक पाचन को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया गया था ( लेन I और II की तुलना करें)। इसके अलावा, C18 Sep-Pak स्तंभ द्वारा किए गए शुद्धिकरण चरण की दक्षता का मूल्यांकन किया गया था, जो C18 स्तंभ (चित्रा 2, लेन III) और पहले और दूसरे धोने (चित्रा 2 लेन IV और V, क्रमशः) के प्रवाह-माध्यम में पेप्टाइड्स की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है, जिसमें एलुएट (चित्रा 2, लेन VI) में उनकी अपेक्षित उपस्थिति होती है। भारी चैनल (चित्रा 2 बी) में उचित मेट -4 निगमन और सही 1: 1 एच / एल मिश्रण (चित्रा 2 सी) का मूल्यांकन किया गया था।

चित्रा 3 पेप्टाइड्स के ऑफ-लाइन एचपीएच-आरपी तरल क्रोमैटोग्राफी फ्रैक्शनेशन और बाद में अंशों के गैर-सन्निहित संयोजन से क्रोमैटोग्राम को प्रदर्शित करता है। पेप्टाइड्स का पता 215 एनएम यूवी द्वारा लगाया गया था, जबकि संभावित रूप से शेष अनपचे हुए प्रोटीन का मूल्यांकन 280 एनएम यूवी द्वारा किया गया था। क्रोमैटोग्राम के नीचे अंश संयोजन रणनीति को स्कीमाइज़ किया जाता है, ताकि 70 शुरुआती अंशों को अंतिम 16 तक कम किया जा सके, जिसमें प्री और पोस्ट ग्रेडिएंट अंश शामिल हैं।

आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के संवर्धन के लिए एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। ये एंटीबॉडी तीन प्रकार के आर-मिथाइलेशन (एमएमए, एसडीएमए और एडीएमए) को पहचानते हैं और वे व्यावसायिक रूप से सीधे अगारोस मोतियों के संयुग्मित के रूप में उपलब्ध हैं (विवरण के लिए तालिका सामग्री और अभिकर्मक देखें)। तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी बफर और समाधानों को सूचीबद्ध करती है।

अधिग्रहण के बाद, प्रत्येक एमएस कच्चे डेटा का मैक्सक्वांट के साथ दो बार विश्लेषण किया गया था, ताकि विभिन्न खोज समूहों में प्रकाश और भारी मिथाइलेशन की पहचान की जा सके, इस तर्क के साथ कि मिथाइल-पेप्टाइड्स (भारी और हल्के) को केवल एक विशिष्ट समूह में पहचाना जाएगा। भारी और हल्के मिथाइलेशन को अलग-अलग खोजकरने से पेश किए गए परिवर्तनीय संशोधनों की संख्या को कम करके और झूठे सकारात्मक मिश्रित लेबल पेप्टाइड्स के जोखिम को कम करके विश्लेषण में सुधार होता है। एक बार मैक्सक्वांट ने मिथाइल-साइटों को सौंप दिया है, एचएमएसईईकेईआर भारी-प्रकाश चोटियों13 के संभावित जोड़े के पुनर्निर्माण के लिए अपनी आउटपुट तालिका को पार्स करता है।

आंकड़े 4 और 5 पेप्टाइड्स फेल्टजीआईपीपीएपीआर (एमई) (4) और एनपीपीजीएफएएफवीईफेडपीआर (एमई) (5) के पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा को दर्शाते हैं, जो क्रमशः एक ट्रू पॉजिटिव और एक फाल्स पॉजिटिव मिथाइल-पेप्टाइड एनोटेशन का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 4 में, तीन चोटियों के बीच देखा गया एम / जेड अंतर एक एंजाइमेटिक रूप से मिथाइलेटेड अवशेष (असंशोधित और हल्के-मिथाइलेटेड के बीच 7.0082 Th; मिथाइल-पेप्टाइड के हल्के और भारी रूपों के बीच 2.0102 Th) की उपस्थिति के अनुरूप है। परिणामी hmSILAC डबल्स में 0.40 पीपीएम का एमई, 0.00 मिनट का डीआरटी और -0.41 का लॉगरेशियो है; ये मान सही और झूठे डबल्स को अलग करने के लिए hmSEEKER द्वारा नियोजित डिफ़ॉल्ट थ्रेसहोल्ड से नीचे हैं, जो पहले निम्नानुसार होने का अनुमान लगाया गया था: मैं | < 2 पीपीएम, | < 0.5 मिनट, और | LogRatio | < 1. चित्रा 5 में चित्रित दूसरे मामले में, प्रकाश-मिथाइलेटेड पेप्टाइड और इसके कथित भारी समकक्ष के बीच देखा गया एम / जेड अंतर अपेक्षित मान से 0.0312 टीएच (एमई = -37.28 पीपीएम) से विचलित हो जाता है। इसके अलावा, इस डबलट में 2.50 का लॉगरेशियो है, जो डिफ़ॉल्ट लॉगरेशियो पूर्वानुमान अंतराल के बाहर है (इन कट-ऑफ मानों को13 में परिभाषित और चर्चा की गई है)। वास्तव में, एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम में, पेप्टाइड एनपीपीजीएफएएफवीईफेडपीआर (एमई) के अनुक्रम के परिणामस्वरूप पूरी तरह से कवर नहीं किया गया था और असाइन किए गए आर-मिथाइलेशन को ग्लूटामेट या एस्पार्टेट पर मिथाइल-एस्टरीफिकेशन के रूप में भी व्याख्या किया जा सकता है।

hmSEEKER वर्कफ़्लो को चित्रा 6 में स्कीमाइज़ किया गया है, जबकि तालिका 4 परिणामों की व्याख्या में मदद करने के लिए इस उपकरण द्वारा उत्पादित आउटपुट तालिका का विवरण प्रदान करता है: पेप्टाइड्स जो कई संशोधनों को ले जाते हैं, कई बार दिखाई देते हैं, प्रत्येक प्रविष्टि किसी दिए गए पेप्टाइड पर एक अलग मिथाइलेशन घटना के अनुरूप होती है; अंत में, पीक डबल्स को तीन वर्गों में विभाजित किया गया है: मिलान किए गए डबल्स सबसे अधिक आश्वस्त हैं, क्योंकि पेप्टाइड को खंडित किया गया था और भारी और हल्के दोनों रूपों में पहचाना गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो और एंजाइमेटिक प्रोटीन-आर-मिथाइलेशन प्रतिक्रियाओं की योजना। (ए) जैव रासायनिक प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो आरेख। कोशिकाओं को प्रकाश (मेट -0) और भारी (मेट -4) मेथिओनिन युक्त माध्यम में कम से कम 8 दोगुना और हल्के और भारी चैनलों को 1: 1 अनुपात में मिलाया जाता है। प्रोटीन को निकाला जाता है और समानांतर में ट्रिप्सिन या लिसारगीनेस के साथ पाचन के अधीन किया जाता है और 70 अंशों को एकत्र करके ऑफ-लाइन एचपीएच-आरपी तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अंशित किया जाता है, अंत में 16 अंशों में जोड़ा जाता है। आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स को अगारोस मोतियों से संयुग्मित एंटी-पैन-आर-मिथाइल एंटीबॉडी द्वारा समृद्ध किया जाता है, जो क्रमशः दूसरे एंजाइमेटिक पाचन (ट्रिप्सिन या लिसर्गीनेस) से गुजरते हैं, और एलसी-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया जाता है। मैक्सक्वांट आउटपुट डेटा को तब एचएमएसईईकेईआर जैव सूचना विज्ञान उपकरण द्वारा विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जिसे भारी और हल्के मिथाइल-पेप्टाइड एसोसिएशन के लिए इन-हाउस विकसित किया जाता है। (बी) आर-मिथाइलेशन प्रतिक्रिया की योजना। आर्जिनिन के गुआनिडिनो समूह को एक मिथाइल-समूह के अलावा संशोधित किया जा सकता है, मोनो-मिथाइलेटेड आर्जिनिन (एमएमए) का उत्पादन करके या दो मिथाइल-समूहों को जोड़कर, या तो सममित (एसडीएमए) या असममित (एडीएमए) डाई-मिथाइलेटेड आर्जिनिन का उत्पादन करता है। प्रतिक्रिया प्रोटीन आर्जिनिन मेथिलट्रांसफेरेज़ (पीआरएमटी) परिवार के एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित होती है, जो इन मिथाइल समूहों को एस-एडेनोसिल-मेथिओनिन (एसएएम) से स्थानांतरित करते हैं। मिथाइल समूह हस्तांतरण के बाद, एसएएम को एस-एडेनोसिलहोमोसिस्टीन (एसएएच) में कम कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण चरणों के नियंत्रण। (ए) प्रोटियोलिटिक पाचन दक्षता के मूल्यांकन के लिए एसडीएस-पेज कूमासी-सना हुआ जेल। एमडब्ल्यू: आणविक भार मार्कर। I) बीसीए द्वारा निर्धारित पाचन से पहले कुल एच / एल प्रोटीन अर्क का 20 μg; II) पचने वाले पेप्टाइड्स उसी अनुपात में लोड किए गए हैं जैसे I में; III) लेन I के समान अनुपात में लोड किए गए सी 18 कारतूस का प्रवाह; IV-V) बफर A के साथ C18 कारतूस का पहला और दूसरा धोना, I के समान अनुपात में लोड किया गया; VI) C18 कारतूस से एलुएट्स, जो I. (B) Met-4 निगमन दर विश्लेषण के समान अनुपात में लोड किया गया है। भारी चैनल में मेट -4 निगमन का मूल्यांकन इन-हाउस विकसित स्क्रिप्ट (https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ पर उपलब्ध) द्वारा किया जाता है; दर = 1 पूर्ण निगमन (सी) गॉसियन वितरण को 1: 1 मिश्रण मूल्यांकन के लिए एच / एल अनुपात को इंगित करता है। लॉग 2 एच / एल अनुपात का एक सामान्य वितरण ±2 को ध्यान में रखते हुए प्लॉट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एचपीएच अंश संयोजन योजना और प्रतिनिधि आर-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स संवर्धन मूल्यांकन। (ए) उच्च पीएच-रिवर्सेड चरण फ्रैक्शनेशन क्रोमैटोग्राम और गैर-सन्निहित अंश संयोजन की योजना। क्रोमैटोग्राम 215 एनएम यूवी (नीली रेखा) पर पाए गए पेप्टाइड्स के एचपीएच-आरपी पृथक्करण प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 280 एनएम यूवी चैनल (लाल रेखा) में बिना पचे प्रोटीन की उपस्थिति को ट्रैक किया गया था। हल्की हरी रेखा क्रोमैटोग्राफिक रन के साथ बफर बी की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करती है। अंश पूलिंग योजना की सूचना दी गई है, जिसमें प्री और पोस्ट ग्रेडिएंट अंशों सहित 70 से 16 तक प्रारंभिक, मध्य और देर से एल्यूटिंग अंशों के गैर-सन्निहित संयोजन की रणनीति को दर्शाया गया है। (बी) आर-मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स के संवर्धन को सारांशित करने वाली प्रतिनिधि तालिका। तालिका पेप्टाइड्स की कुल संख्या और आर-मिथाइलेशन संवर्धन के सापेक्ष प्रतिशत को उसके इनपुट पर प्रत्येक आईपी की तुलना में पुन: परिभाषित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: सच्चे hmSILAC डबलट का उदाहरण। एक सच्चे सकारात्मक दोहरे का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। प्रदर्शित चोटियां चार्ज 2 + के साथ अपरिवर्तित, हल्के मोनो-मिथाइलेटेड (सीएच 3) और भारी मोनो-मिथाइलेटेड (13 सीडी3) रूपों में पेप्टाइड फेल्टजीआईपीपीआर के अनुरूप हैं। तीन चोटियों के बीच देखे गए एम / जेड अंतर एक एंजाइमेटिक रूप से मिथाइलेटेड अवशेष की उपस्थिति के अनुरूप हैं। द्रव्यमान स्पेक्ट्रम के तहत तालिका hmSEEKER आउटपुट का प्रतिनिधित्व करती है और इसमें Doublet के LogRatio, ME और dRT पैरामीटर शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: झूठे hmSILAC डबलट का उदाहरण। विवो मिथाइल-पेप्टाइड असाइनमेंट में एक नकारात्मक का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। 811.3849 मीटर/जेड और 818.3927 मीटर/जेड पर चोटियां चार्ज 2+ के साथ पेप्टाइड एनपीपीजीएफएएफवीईफेडपीआर के असंशोधित और हल्के मोनो-मिथाइलेटेड रूपों के अनुरूप हैं। तीसरी चोटी को हल्के मिथाइलेटेड पेप्टाइड के भारी-मिथाइल-समकक्ष के रूप में सौंपा जा सकता है, लेकिन देखा गया एम / जेड शिफ्ट अपेक्षित बदलाव से 0.0312 टीएच से भिन्न होता है, जो इस संभावना को खारिज करता है। द्रव्यमान स्पेक्ट्रम के तहत तालिका hmSEEKER आउटपुट का प्रतिनिधित्व करती है और इसमें Doublet के LogRatio, ME और dRT पैरामीटर शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A) MaxQuant कच्चे डेटा में MS1 चोटियों का पता लगाता है। (बी) पेप्टाइड पहचान प्राप्त करने के लिए डेटाबेस सर्च इंजन एंड्रोमेडा द्वारा संबद्ध एमएस 2 स्पेक्ट्रम वाले चोटियों को संसाधित किया जाता है। (सी) एचएमएसईकेईआर मैक्सक्वांट पेप्टाइड पहचानों को पढ़ता है और एंड्रोमेडा स्कोर > 25, डेल्टा स्कोर > 12 के साथ मिथाइल-पेप्टाइड्स को निकालता है, और स्थानीयकरण संभाव्यता > 0.75 के साथ संशोधन करता है। (डी) गुणवत्ता फ़िल्टरिंग से गुजरने वाले प्रत्येक मिथाइल-पेप्टाइड के लिए, एचएमएसईकेईआर मैक्सक्वांट ऑलपेप्टाइड्स तालिका में अपने संबंधित एमएस 1 शिखर को ढूंढता है और फिर उसी तालिका में अपने समकक्ष की खोज करता है। (ई) चोटियों के एक दोहरे को उनके प्रतिधारण समय (आरटी), उनकी तीव्रता अनुपात (लॉगरेशियो), और अपेक्षित और देखे गए डेल्टा द्रव्यमान (एमई) के बीच विचलन में अंतर से परिभाषित किया जाता है; इन तीन मापदंडों का उपयोग एचएमएसईकेईआर द्वारा वास्तविक सकारात्मक और झूठे सकारात्मक को अलग करने के लिए किया जाता है, जैसा कि चर्चा की गईहै। (एफ) अंत में, एचएमएसईकेईआर अनावश्यक और गैर-निरर्थक डबल्स की सूची तैयार करता है; पहले में सभी मिथाइल-पेप्टाइड्स के लिए भविष्यवाणियां शामिल हैं, जबकि दूसरे को फ़िल्टर किया जाता है ताकि जब पेप्टाइड को कई बार पहचाना जाता है, तो केवल सबसे अच्छा स्कोरिंग डबलट रिपोर्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफ़र आयतन संयोजन
एल-मेथिओनिन (एल) समाधान 10 mL अल्ट्राप्योर पानी में 30 मिलीग्राम / एमएल लाइट-मेथिओनिन
एल-मेथिओनिन (एच) समाधान 10 mL अल्ट्राप्योर पानी में 30 मिलीग्राम / एमएल भारी-मेथिओनिन
सेल संस्कृति के लिए माध्यम 500 mL स्टैबिल ग्लूटामाइन के साथ और मेथिओनिन के बिना डीएमईएम, 10% (वी / वी) डायलाइज्ड एफबीएस, 1% (वी / वी) पी / एस, 1: 1000 (वी / वी) एल-मेथिओनिन समाधान
लाइसिस बफर 50 mL 9 एम यूरिया, 20 एमएम एचईपीईएस पीएच 8.0;1% (वी / वी) प्रोटीज अवरोधक; अल्ट्राप्योर पानी में 1% (वी / वी) फॉस्फेट अवरोधक
अमोनियम बाइकार्बोनेट (AMBIC) समाधान 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 1 एम (एनएच4)2सीओ3
डीटीटी समाधान 10 mL अल्ट्राप्योर पानी में 1.25 एम डीटीटी
IAA समाधान 5 mL अल्ट्राप्योर पानी में 109 मीटर
सितंबर-पाक सी 18 के लिए सॉल्वेंट ए 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए
सितंबर-पाक C18 के लिए सॉल्वेंट B 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए + 40% एसीएन
Sep-Pak C18 के लिए घोल धो लें 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए + 5% एसीएन
एचपीएच फ्रैक्शनेशन के लिए बफर ए 500 mL अल्ट्राप्योर पानी में 25 एमएम एनएच4ओएच
एचपीएच फ्रैक्शनेशन के लिए बफर बी 500 mL अल्ट्राप्योर पानी में 25 mM NH4OH + 90% ACN
आईपी बाइंडिंग बफर 1x 5 mL 10x व्यावसायिक रूप से स्टॉक समाधान से अल्ट्राप्योर पानी में डिल्यूइट 1:10 (v/v)
IP क्षालन बफर 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.15% टीएफए
स्टेज-टिप्स के लिए बफर ए 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए
स्टेज-टिप्स के लिए बफर बी 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए + 40% एसीएन
स्टेज-टिप्स के लिए बफर सी 50 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% टीएफए + 50% एसीएन
एमएस सॉल्वेंट ए 250 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% एफए
एमएस सॉल्वेंट बी 250 mL अल्ट्राप्योर पानी में 0.1% एफए + 80% एसीएन
प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल 5 mL निर्माण निर्देश के अनुसार अल्ट्राप्योर पानी में घुलने वाले ओप्लेट, ईडीटीए-मुक्त प्रोटीज इनहिबिटर टैबलेट (आरओसीएचई)
फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल 5 mL फॉसस्टॉप टैबलेट (आरओसीएचई) निर्माण निर्देश के अनुसार अल्ट्राप्योर पानी में घुल जाता है

तालिका 1: बफर और समाधान संरचना। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए बफर और समाधानों की सूची।

पैरामीटर मूल्य
नमूना लोडिंग (uL) 2
लोडिंग प्रवाह दर (uL/min) 10
प्रवणता प्रवाह दर (nL/min) 300
रैखिक प्रवणता 89 मिनट के लिए 3-30% B, 5 मिनट के लिए 30-60% B, 1 मिनट के लिए 60-95% B, 5 मिनट के लिए 95% B
पूर्ण स्कैन समाधान 70,000
चयनित सबसे तीव्र आयनों की संख्या 15
सापेक्ष टकराव ऊर्जा (%) (सीआईडी) 28
गतिशील बहिष्करण (ओं) 20.0

तालिका 2: LC-MS/MS सेटिंग. उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्वाड्रोपोल-ऑर्बिट्राप मास स्पेक्ट्रोमीटर पर आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए लागू पैरामीटर, नैनो-फ्लो अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूएचपीएलसी) प्रणाली के साथ युग्मित।

MQ पैरामीटर सेटिंग्स (ver 1.6.2.10)
सेटिंग क्रिया
संरूपण
संशोधन Met4 नया संशोधन जोड़ें. संरचना को H(-3) Hx(3) Cx C(-1) पर सेट करें और विशिष्टता के रूप में M चुनें।
मिथाइल 4 (केआर) डुप्लिकेट "मिथाइल (केआर)", इसका नाम बदलें और संरचना को सीएक्स एच (-1) एचएक्स (3) में बदलें
डाइमिथाइल 4 (केआर) डुप्लिकेट "डाइमिथाइल (KR)", इसका नाम बदलें और संरचना को H(-2) Hx(6) Cx(2) में बदलें
Trimethyl4 (K) डुप्लिकेट "Trimethyl (K)", इसका नाम बदलें और संरचना को Cx(3) H(-3) Hx(9) में बदलें
OxMet4 डुप्लिकेट "ऑक्सीकरण (एम)" और इसका नाम बदलें।
प्रोटीज Lysarginase नया प्रोटीज जोड़ें। 'R' और 'K' स्तंभों का चयन करें.
नया PTM या प्रोटीज बनाते समय, MaxQuant सेटिंग्स को बदलने के लिए "तालिका संशोधित करें" पर क्लिक करें और फिर परिवर्तनों की पुष्टि करने के लिए "परिवर्तन सहेजें"। MaxQuant को पुनरारंभ करें और नए विकल्प दिखाई देंगे।
कच्ची फ़ाइलें टैब
पैरामीटर समूह कच्ची फ़ाइलों को 2 समूहों में अलग करें (0 और 1)
समूह विशिष्ट पैरामीटर
प्रकार प्रकार मानक
बहुलता 1
पाचन किण्वक ट्रिप्सिन या लिसारगिनेज
मैक्स. मिस्ड क्लीवेज 3 पर सेट करें
संशोधन परिवर्तनीय संशोधन समूह 0 ऑक्सीकरण (एम), मिथाइल (केआर), डाइमिथाइल (केआर), ट्राइमिथाइल (केआर), ट्राइमिथाइल (के)
समूह 1 ऑक्समेट 4, मिथाइल 4 (केआर), डाइमिथाइल 4 (केआर), ट्राइमिथाइल 4 (केआर), ट्राइमिथाइल 4 (के)
निश्चित संशोधन समूह 0 कार्बामिडोमिथाइलेशन
समूह 1 कार्बामिडोमिथाइलेशन और मेट 4
वैश्विक पैरामीटर
दृश्यों Fasta files FASTA फ़ाइल लोड करें
पहचान पीएसएम एफडीआर 0.01 पर सेट करें
संशोधित पेप्टाइड्स के लिए न्यूनतम स्कोर 1 पर सेट करें
संशोधित पेप्टाइड्स के लिए न्यूनतम डेल्टा स्कोर 1 पर सेट करें
उन्नत पहचान दूसरा पेप्टाइड खोज चेक ऑफ करें
तालिकाओं सभी पेप्टाइड्स तालिका लिखें जाँच
उन्नत चरम गुणों की गणना करें जाँच
यदि निर्दिष्ट नहीं है, तो डिफ़ॉल्ट पैरामीटर छोड़ दें।
निगमन परीक्षण के लिए एमक्यू पैरामीटर सेटिंग्स
समूह विशिष्ट पैरामीटर
प्रकार प्रकार मानक
बहुलता 2
अधिकतम लेबल 5
भारी लेबल Met4 का चयन करें
पाचन किण्वक ट्रिप्सिन या लिसारगिनेज
मैक्स. मिस्ड क्लीवेज 3 पर सेट करें
संशोधन परिवर्तनीय संशोधन ऑक्सीकरण (एम)
निश्चित संशोधन कार्बामिडोमिथाइलेशन
यदि निर्दिष्ट नहीं है, तो डिफ़ॉल्ट पैरामीटर छोड़ दें।

तालिका 3: मैक्सक्वांट प्रसंस्करण पैरामीटर। वर्णित विशिष्ट प्रयोग के लिए समायोजित समूह-विशिष्ट और वैश्विक पैरामीटर सूचीबद्ध हैं। उपयोग किए गए प्रोग्राम संस्करण के आधार पर अन्य सभी पैरामीटर डिफ़ॉल्ट रूप से सेट किए गए हैं।

स्तंभ का नाम वर्णन
Rawfile कच्ची डेटा फ़ाइल जिसमें डबलट की पहचान की गई थी
एच-स्कैन भारी समकक्ष की संख्या स्कैन करें
L-Scan प्रकाश समकक्ष की संख्या स्कैन करें
.CLASS 3 मान हो सकते हैं:
मिलान = भारी और हल्के पेप्टाइड्स को एक ही अनुक्रम के साथ पहचाना जाता है
बेमेल = भारी और हल्के पेप्टाइड्स में एक ही एए अनुक्रम होता है लेकिन मिथाइलेटेड साइट के स्थानीयकरण में बेमेल होता है
बचाए गए = डबलट में केवल एक पेप्टाइड की पहचान की जाती है; इसका समकक्ष एक अज्ञात शिखर है।
पेप्टाइड पेप्टाइड अनुक्रम
अंक पेप्टाइड एंड्रोमेडा स्कोर
आरईएस संशोधित अवशेष
स्थिति संशोधित अवशेषों की स्थिति
मॉड सुधार
लीड प्रोटीन पेप्टाइड प्रोटीन किससे संबंधित है?
जीन प्रोटीन के अनुरूप जीन का नाम
PROBABILITY_TRUE डबलेट के एक सच्चे hmSILAC doublet होने की संभावना, जिसकी गणना लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल द्वारा की जाती है
पूर्वानुमान 1 यदि डबलट कथित रूप से सत्य है, 0 यदि यह गलत है
H/L LOGRATIO भारी/हल्की तीव्रता अनुपात का लॉग 2
मुझको अपेक्षित और देखे गए द्रव्यमान अंतर के बीच विचलन
डीआरटी अवधारण समय में अंतर

तालिका 4: hmSEEKER आउटपुट परिणाम विवरण। hmSEEKER आउटपुट तालिका में कॉलम प्रविष्टियों की सूची, उनकी सामग्री के संक्षिप्त विवरण के साथ।

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Discussion

वैश्विक एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स द्वारा विवो प्रोटीन / पेप्टाइड मिथाइलेशन में उच्च आत्मविश्वास की पहचान चुनौतीपूर्ण है, उच्च एफडीआर के जोखिम के कारण, नमूना तैयारी के दौरान होने वाले कई एमिनो एसिड प्रतिस्थापन और मिथाइल-एस्टरीफिकेशन के साथ जो मिथाइलेशन के लिए आइसोबेरिक हैं और ऑर्थोगोनल एमएस सत्यापन रणनीतियों की अनुपस्थिति में गलत असाइनमेंट का कारण बन सकते हैं। इस पीटीएम की सबस्टोइकोमेट्रिक प्रकृति वैश्विक मिथाइल-प्रोटिओमिक्स के कार्य को और जटिल बनाती है, लेकिन संशोधित पेप्टाइड्स10 के चयनात्मक संवर्धन के साथ दूर किया जा सकता है।

यहां, एक जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है, जिसे एचएमएच-आरपी क्रोमैटोग्राफी पेप्टाइड फ्रैक्शनेशन और एंटी-पैन-आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स एंटीबॉडी किट के साथ आत्मीयता-संवर्धन के साथ युग्मित एचएमएसआईएलएएसी रणनीति के आवेदन के माध्यम से आर-मिथाइल-पेप्टाइड्स के वैश्विक एमएस-विश्लेषण की दक्षता और विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पूर्व रणनीति मिथाइल-पेप्टाइड्स के ऑर्थोगोनल सत्यापन की अनुमति देती है और पहचान के एफडीआर को दृढ़ता से कम करती है, जबकि बाद वाला प्रोटोकॉल असंशोधित पेप्टाइड्स22 की पृष्ठभूमि से उनकी पता लगाने की क्षमता को बढ़ाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा बाद के पेप्टाइड फ्रैक्शनेशन और आत्मीयता संवर्धन के लिए इनपुट के रूप में बहुत बड़ी मात्रा में प्रोटीन निकालने (20-40 मिलीग्राम की सीमा में) की आवश्यकता है, जो अमर, तेजी से बढ़ती सेल लाइनों के लिए विधि के आवेदन को सीमित करता है जिसे बड़े पैमाने पर विस्तारित किया जा सकता है। इसके बजाय, वर्तमान सेटअप रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं या ऊतकों पर लागू नहीं होता है। भविष्य की जांच को इस दिशा में प्रोटोकॉल में सुधार करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए: असंशोधित लोगों पर मिथाइलेटेड पेप्टाइड के जैव रासायनिक संवर्धन के लिए अतिरिक्त रणनीतियां एंटीबॉडी के उपयोग को दरकिनार करने की अनुमति दे सकती हैं, जिससे प्रयोगों के स्केलिंग को कम किया जा सकता है। एक और दिलचस्प विकास को आइसोबेरिक या टेंडम मास टैग के साथ प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स के रासायनिक संशोधन के साथ वर्तमान तरीकों के संयोजन से दर्शाया जा सकता है, जिसमें दो गुना संभावित फायदे हैं: एक तरफ, एक एकल प्रयोग में कई स्थितियों के संयोजन की संभावना, इस प्रकार विभिन्न गड़बड़ी पर मिथाइल-प्रोटिओमिक परिवर्तनों के सापेक्ष परिमाणीकरण को मल्टीप्लेक्स करना; दूसरी ओर, क्रोमैटोग्राफिक फ्रैक्शनेशन और आत्मीयता संवर्धन से पहले विभिन्न नमूनों को एक में पूल करने से व्यक्तिगत प्रयोगों के पैमाने को कम करने की अनुमति मिल सकती है।

यह प्रोटोकॉल ट्रिप्सिन और लिसारगीनेस के समानांतर पूरे सेल अर्क के दो अलग-अलग पाचन पर निर्भर करता है। ट्रिप्सिन के और आर अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर पेप्टाइड बॉन्ड को छोड़ देता है, जिससे पेप्टाइड्स उत्पन्न होते हैं जो α-अमाइन23 से एन-टर्मिनल पॉजिटिव चार्ज के अलावा सी-टर्मिनस पर सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अवशेष पेश करते हैं। लिसार्गीनेस एंजाइम चुनिंदा रूप से पेप्टिडिल-के और -आर बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है, जिससे पेप्टाइड्स उत्पन्न होते हैं जो एन-टर्मिनल साइट पर के या आर को सहन करते हैं, जिसमें के-मिथाइलेटेड रूप शामिल हो सकते हैं। दोनों प्रोटीज का उपयोग बड़े पैमाने पर एमएस-विश्लेषण में समग्र प्रोटिओम कवरेज को बढ़ाता है, जिससे पेप्टाइड्स की पहचान अंततः एकल ट्रिपेटिक पाचन18 पर छूट जाती है। इसके बजाय, डबल एंजाइमेटिक पाचन, संभावित छूटे हुए एंजाइमेटिक क्लीवेज की संख्या को कम करने के लिए किया जाता है। वास्तव में, के और आर का मिथाइलेशन ट्रिप्सिन द्वारा प्रोटीन दरार की दक्षता को दृढ़ता से कम करता है। इस सावधानी के बावजूद, मिथाइलेटेड पेप्टाइड्स का लंबा होना और छूटे हुए क्लीवेज होना अभी भी आम है, जिससे खराब सीआईडी विखंडन होता है।

एक अन्य प्रकार के विखंडन का उपयोग, जैसे इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर डिसोसिएशन (ईटीडी), इस मुद्दे को हल कर सकता है। वास्तव में, ईटीडी आमतौर पर सीआईडी की तरह दोगुना चार्ज पेप्टाइड आयनों को कुशलता से विभाजित नहीं करता है, लेकिन यह उच्च चार्ज राज्यों के पेप्टाइड अग्रदूतों के काफी समान दरार प्रदान करता है (≥3). यह आर-मिथाइलेशन के मामले में एक लाभ हो सकता है, क्योंकि यह अक्सर आर्जिनिन युक्त डोमेन में होता है जिसमें कई और पड़ोसी आर अवशेष होते हैं। हालांकि, ईटीडी में सीआईडी की तुलना में कम स्कैन दर है, इसलिए पेप्टाइड पहचान की कुल संख्या24,25,26 कम हो गई है।

हाल ही में, कई प्रोटोकॉल जिनमें पोस्ट-ट्रांसलेशनल रूप से संशोधित पेप्टाइड्स का संवर्धन शामिल है, को विभिन्न क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण रणनीतियों के साथ जोड़ा गया है जो पेप्टाइड मिश्रण की जटिलता को कम करने में मदद करते हैं, इस प्रकार एमएस में संशोधित पेप्टाइड्स का पता लगाने की समग्र दक्षता में वृद्धि होती है। यहां, एचपीएच-आरपी क्रोमैटोग्राफिक फ्रैक्शनेशन को अंशों के गैर-सन्निहित संयोजन के साथ जोड़ा जाता है। एक उच्च पीएच रिवर्सेड फेज क्रोमैटोग्राफी पर आधारित ऑफ-लाइन पेप्टाइड फ्रैक्शनेशन एक उच्च समाधान शक्ति पृथक्करण प्रदर्शित करता है जो एलसी-एमएस / एमएस रन27 के दौरान डाउनस्ट्रीम किए गए ऑन-लाइन कम पीएच आरपी-पृथक्करण के लिए ऑर्थोगोनल है। इसके अलावा, गैर-सन्निहित संयोजन रणनीति के दो मुख्य लाभ हैं: पहला, यह प्रारंभिक, मध्य-और देर से एल्यूटिंग अंशों को अलग-अलग शंकुधारी अंशों में इकट्ठा करके प्रोटीन कवरेज को बढ़ाता है, जिससे पेप्टाइड मिश्रण की विविधता को संरक्षित किया जाता है। दूसरा, संयोजन नमूना अंशों की कम संख्या प्राप्त करके, बाद के एमएस रन-टाइम विश्लेषण को कम करताहै।

आर-मिथाइलेशन की सबस्टोइकोमेट्रिक प्रकृति के कारण, संशोधन प्रोटिओम के वैश्विक एमएस-विश्लेषण में मिथाइल-पेप्टाइड्स का पता लगाने की सुविधा के लिए एक संवर्धन कदम आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, मिथाइल-पेप्टाइड्स को समानांतर में एंटीबॉडी एंटी-एसडीएमए और एंटी-एडीएमए का उपयोग करके इम्यूनो-एफिनिटी वर्षा (आईएपी) द्वारा समृद्ध किया जाता है, जबकि एंटी-एमएमए एंटीबॉडी का उपयोग करके मोनो-मिथाइल-पेप्टाइड्स की इम्यूनो-वर्षा पिछले आईएपी प्रयोगों से एफटी पर की जाती है। यह आदेश इन एंटीबॉडी की विभिन्न दक्षता को दर्शाता है: एंटी-एसडीएमए और एंटी-एडीएमए एंटीबॉडी में एंटी-एमएमए एंटीबॉडी की तुलना में कम बाध्यकारी दक्षता होती है। उल्लेखनीय है, यह अलग-अलग दक्षता संशोधन-प्रोटिओम में आर-मिथाइलेशन की विभिन्न डिग्री के प्रतिनिधित्व में पूर्वाग्रह पैदा कर सकतीहै।

एंटी-पैन-आर-मिथाइलेशन एंटीबॉडी की व्यावसायिक उपलब्धता से पहले, एमएस द्वारा आर-मिथाइलेटेड पेप्टाइड का पता लगाने के लिए अन्य पृथक्करण रणनीतियों को लागू किया गया था, जैसे कि मजबूत केशन एक्सचेंज (एससीएक्स) और हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन (एचआईएलआईसी) क्रोमैटोग्राफी। इन तकनीकों के बावजूद एमएस में विश्लेषण किए गए पेप्टाइड मिश्रण की जटिलता को कम कर सकते हैं, उन्होंने मिथाइल-पेप्टाइड्स30,31,32,33 की पहचान में काफी सुधार नहीं किया।

मिथाइल-पेप्टाइड पृथक्करण, पहचान, विखंडन और अनुक्रम एनोटेशन को बढ़ाने के उद्देश्य से इन सभी तकनीकी और विश्लेषणात्मक समाधानों के बावजूद, मिथाइल-प्रोटिओम कवरेज अभी भी अधिक प्रचुर मात्रा में मिथाइलेटेड प्रोटीन, जैसे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन, आरएनए-बाइंडिंग हेलिकेस के प्रति सीमित और पक्षपाती है, जबकि कई ज्ञात कम-प्रचुर मात्रा में संशोधित प्रोटीन (जैसे, टीपी 53 बीपी 1, सीएचटीएफ 8, एमसीएम 2) केवल आकस्मिक रूप से पता लगाए जाते हैं और कई वैश्विक प्रयोगों पर विश्वसनीय रूप से नहीं। . वर्तमान वर्कफ़्लो से पहले लागू उपकोशिकीय विभाजन ऐसे प्रोटीन का पता लगाने में सुधार कर सकता है; हालांकि, आवश्यक वर्तमान प्रयोगात्मक पैमाने इसे एक व्यवहार्य विकल्प नहीं बनाते हैं।

एमएस पर, कच्चे डेटा का विश्लेषण पेप्टाइड और पीटीएम पहचान के लिए मैक्सक्वांट एल्गोरिदम के माध्यम से किया जाता है। हालांकि, एचएमएसआईएलएएसी प्रयोगों से डेटा का विश्लेषण मानक खोज एल्गोरिदम के साथ सीधा नहीं है। उदाहरण के लिए, जबकि मैक्सक्वांट आइसोटोपिक रूप से एन्कोडेड के और आर के साथ चयापचय लेबलिंग के आधार पर मानक एसआईएलएसी प्रयोगों का कुशलतापूर्वक विश्लेषण कर सकता है, यह कुशलता से काम नहीं करता है जब आइसोटोप-लेबलिंग को एक चर पीटीएम में एन्कोड किया जाता है, जैसा कि भारी-मिथाइल लेबलिंग के मामले में होता है जो भारी-मिथाइलेशन की ओर जाता है। इसलिए, यहां अपनाई गई रणनीति में पहले मैक्सक्वांट के साथ एचएमएसआईएलएएसी डेटा का विश्लेषण करना शामिल है, बिना इसकी अंतर्निहित डबल-सर्च कार्यक्षमता का उपयोग किए ताकि प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स को स्वतंत्र रूप से पहचाना जा सके; फिर उन्हें पोस्ट-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ मिलान किया जाता है। इस जैव सूचना विज्ञान वर्कफ़्लो के अपने नुकसान भी हैं, क्योंकि किसी को मैक्सक्वांट के परिवर्तनीय संशोधन पैनल में भारी और हल्के दोनों रूपों में मिथाइलेशन निर्दिष्ट करना पड़ता है, जब मेथिओनिन ऑक्सीकरण (भारी और हल्का) भी शामिल होता है तो कुल आठ चर संशोधनों के साथ समाप्त होता है। एंड्रोमेडा जैसे डेटाबेस खोज इंजन के साथ बहुत सारे पीटीएम खोजना अव्यावहारिक है, क्योंकि इससे सैद्धांतिक पेप्टाइड्स की घातीय वृद्धि होती है, जिसे एल्गोरिदम को परीक्षण करना पड़ता है: हमारा समाधान प्रत्येक एमएस कच्चे डेटा का दो बार विश्लेषण करना था, चर पीटीएम के विभिन्न सेटों के साथ (मैक्सक्वांट के पैरामीटर समूह फ़ंक्शन के माध्यम से)। पेप्टाइड खोज के बाद, इन-हाउस विकसित टूल hmSEEKER को मैक्सक्वांट द्वारा उत्पादित आउटपुट तालिकाओं से भारी-प्रकाश पेप्टाइड जोड़े के असाइनमेंट का समर्थन करने के लिए नियोजित किया जाता है। hmSEEKER एल्गोरिथ्म की पहली रिलीज हाल ही में13 प्रकाशित की गई है, जहां यह दिखाया गया था कि hmSEEKER 1% < एफडीआर के साथ hmSILAC डबल्स की पहचान कर सकता है। झूठी सकारात्मकता अभी भी चोटियों के जोड़े से उत्पन्न हो सकती है, जिनमें संयोग से 4.02 डीए का द्रव्यमान अंतर गुणक होता है, लेकिन निम्नलिखित तथ्यों के प्रकाश में मिलान या बेमेल के रूप में वर्गीकृत डबल्स के लिए यह बहुत संभावना नहीं है: मिलान या बेमेल डबलट को गलत होने के लिए, एंड्रोमेडा को भारी और हल्के समकक्ष दोनों के अनुक्रम को गलत तरीके से निर्धारित करना होगा। यह मानते हुए कि खोज इंजन को इसके डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ चलाया गया है, प्रत्येक पहचान में गलत होने की 1% संभावना है। इस प्रकार, hmSILAC समकक्ष के भी गलत होने की संभावना 0.01% है।

HMSILAC का एक दोष यह है कि उनकी रीढ़ में मेथिओनिन युक्त पेप्टाइड्स भी डबल्स उत्पन्न करते हैं जो मिथाइल-पेप्टाइड्स द्वारा उत्पन्न लोगों से अप्रभेद्य होते हैं। फिर भी, हमारे अनुभव से, यह एक प्रमुख मुद्दे का प्रतिनिधित्व नहीं करना चाहिए, पहला क्योंकि मिथाइलेशन के बिना पेप्टाइड्स को मैक्सक्वांट आउटपुट से बस छोड़ दिया जा सकता है और दूसरा, क्योंकि एचएमएसईईकेईआर स्वचालित रूप से अपेक्षित द्रव्यमान अंतर की गणना करते समय मिथाइल-पेप्टाइड में किसी भी मेथिओनिन अवशेषों को ध्यान में रखता है; अंत में, इस जोखिम को इस तथ्य से भी बाहर रखा गया है कि भारी और हल्के संशोधनों को अलग-अलग पैरामीटर समूहों में खोजा जाता है, ताकि खोज इंजन एक भारी मोनो-मिथाइलेशन (+18.03 डीए) को हल्के मोनो-मिथाइलेशन प्लस भारी मेथिओनिन (14.01 + 4.02 डीए) में विभाजित न कर सके।

इस समस्या का एक और औपचारिक और प्रयोगात्मक समाधान ओरेस्टे एक्यूटो और उनके सहयोगियों द्वारा प्रस्तावित किया गया था, जिन्होंने एचएमएसीएलएसी का एक संस्करण विकसित किया था, जिसका नाम आइसोमेथिओनिन मिथाइल-एसआईएलएसी (आईमेथिल-एसआईएलएसी) 22 था। इस वैकल्पिक चयापचय लेबलिंग प्रोटोकॉल में, प्राकृतिक प्रकाश मेथिओनिन को [13सी4]-मेथिओनिन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसका द्रव्यमान [13सीडी3]-मेथिओनिन (मेट -4) के समान होता है, फिर भी यह आणविक टैग के भीतर भारी आइसोटोप के विभिन्न वितरण के कारण स्थिर आइसोटोपिक रूप से एन्कोडेड मिथाइल-समूहों का उत्पादन नहीं करता है। इस प्रकार, iMethyl-SILAC प्रयोगों में, असंशोधित मेथिओनिन युक्त पेप्टाइड्स डबल्स उत्पन्न नहीं करते हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब एक्यूटो और सहकर्मियों ने आईमेथिल-एसआईएलएसी और पारंपरिक एचएमएसीएलएसी के प्रदर्शन की तुलना की, तो दो विधियों ने अभी भी बहुत समान एफडीआर प्रदर्शित किए।

hmSEEKER की एक संभावित सीमा यह है कि इसे MaxQuant आउटपुट तालिकाओं पर सीधे काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि इसका स्रोत कोड अन्य खोज इंजनों के साथ संगत न हो, जिनकी आउटपुट फाइलें अलग-अलग संरचित हों; इस अर्थ में, मिथाइलक्वांट35 एक अच्छा वैकल्पिक जैव सूचना विज्ञान उपकरण प्रदान करता है जो एचएमएसआईएलएएसी-प्रकार के प्रयोगों से एमएस कच्चे डेटा के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए तदर्थ है और प्रदान की गई इनपुट फ़ाइलों के संदर्भ में अधिक लचीला है। उपयोगकर्ता-परिभाषित थ्रेसहोल्ड पर भरोसा किए बिना सही और झूठे मिथाइल-पेप्टाइड एच / एल डबल्स को अलग करने के लिए एक मशीन लर्निंग मॉडल विकसित किया जा रहा है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एमएम और ईएम यूरोपीय स्कूल ऑफ मॉलिक्यूलर मेडिसिन (एसईएमएम) के भीतर पीएचडी छात्र हैं। ईएम 3 साल के FIRC-AIRC बर्सरी (प्रोजेक्ट कोड: 22506) का प्राप्तकर्ता है। टीबी समूह में आर-मिथाइल-प्रोटिओम के वैश्विक विश्लेषण एआईआरसी आईजी ग्रांट (प्रोजेक्ट कोड: 21834) द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC) Sigma-Aldrich 09830
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich 497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) Waters WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant Sigma-Aldrich ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free Roche-Sigma Aldrich 11836170001 Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO ThermoFisher 26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 3483-12-3
DMEM Medium GIBCO ThermoFisher requested  with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns ThermoFisher ES907
Glycerolo Sigma-Aldrich G5516
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich 144-48-9
Jupiter C12-RP column Phenomenex 00G-4396-E0
L-Methionine Sigma-Aldrich M5308 Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3) Sigma-Aldrich 299154 Heavy (H) Methionine
LysargiNase Merck Millipore EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Penicillin-Streptomycin GIBCO ThermoFisher 15140122
PhosSTOP Roche-Sigma Aldrich 4906837001 Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips ThermoFisher 87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade ThermoFisher 85175 LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade ThermoFisher 85170 LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade ThermoFisher 51101
Pierce  Water, LC-MS Grade ThermoFisher 51140
Polyacrylamide Sigma-Aldrich 92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610373
PTMScan antibodies α-ADMA Cell Signaling Technology 13474
PTMScan antibodies α-MMA Cell Signaling Technology 12235
PTMScan antibodies α-SDMA Cell Signaling Technology 13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5113
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Urea Sigma-Aldrich U5378
Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Speed vac

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References

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

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Maniaci, M., Marini, F., Massignani, … More

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis. J. Vis. Exp. (182), e62409, doi:10.3791/62409 (2022).

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