Summary
タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。
Abstract
タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、RNAプロセシング、シグナル伝達、DNA損傷応答、miRNA生合成、翻訳など、いくつかの細胞経路の調節に関与する広範なタンパク質翻訳後修飾(PTM)です。
近年、生化学的および分析的開発のおかげで、質量分析(MS)ベースのプロテオミクスが、単一部位分解能で細胞のメチルプロテオームを特徴付けるための最も効果的な戦略として浮上しています。しかし、MSによる in vivo タンパク質R-メチル化の同定とプロファイリングは、主にこの修飾の化学量論的性質と、さまざまなアミノ酸置換の存在、およびメチル化に同重な酸性残基の化学的メチルエステル化のために、依然として困難でエラーが発生しやすいままです。したがって、R-メチルペプチドの同定を強化するための濃縮法と、メチルプロテオミクス研究における偽発見率(FDR)を低減するための直交検証戦略が必要です。
ここでは、細胞サンプルからの高信頼性R-メチルペプチドの同定と定量のために特別に設計されたプロトコルについて説明し、細胞の代謝標識を重同位体コードメチオニン(hmSILAC)および二重プロテアーゼ溶液中消化で全細胞抽出物に結合し、その後、オフライン高pH逆相(HpH-RP)クロマトグラフィー分画と抗汎-R-メチル抗体を使用したR-メチルペプチドのアフィニティー濃縮を行います。高分解能MS分析では、生データはまずMaxQuantソフトウェアパッケージで処理され、その結果はMaxQuant出力ファイル内の軽メチルペプチドと重メチルペプチドに対応するMSピークペアの詳細な検索用に設計されたソフトウェアであるhmSEEKERによって分析されます。
Introduction
アルギニン(R)-メチル化は、哺乳類プロテオームの約1%を修飾する翻訳後修飾(PTM)です1。タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)は、Rの側鎖のグアニジノ基の窒素(N)原子に1つまたは2つのメチル基を対称的または不斉に沈着させることによってR-メチル化反応を触媒する酵素です。哺乳動物では、PRMTは、モノメチル化(MMA)と不斉ジメチル化(ADMA)、MMAと対称ジメチル化(SDMA)の両方を沈着させる能力に応じて、タイプI、タイプII、およびタイプIIIの3つのクラスに分類でき、それぞれMMAのみである2,3。PRMTは主に、GARモチーフとして知られるグリシンおよびアルギニンリッチ領域内に位置するR残基を標的としていますが、PRMT5やCARM1などの一部のPRMTは、プロリン-グリシン-メチオニンリッチ(PGM)モチーフをメチル化することができます4。R-メチル化は、RNAスプライシング5、DNA修復6、miRNA生合成7、翻訳2など、いくつかの生物学的プロセスのタンパク質調節因子として浮上しており、このPTMの研究を促進しています。
質量分析(MS)は、タンパク質、ペプチド、および部位分解能での全体的なR-メチル化を体系的に研究するための最も効果的な技術として認識されています。ただし、このPTMは、MSによる信頼性の高い識別のためにいくつかの特別な予防措置を必要とします。第一に、R-メチル化は化学量論的であり、修飾されていないペプチドは修飾されたペプチドよりもはるかに豊富であるため、データ依存取得(DDA)モードで動作する質量分析計は、低強度のメチル化ペプチドよりも高強度の非修飾ペプチドを断片化する頻度が高くなります8。さらに、R-メチル化部位同定のためのほとんどのMSベースのワークフローは、バイオインフォマティクス解析レベルでの制限に悩まされています。実際、メチルペプチドの計算同定は、このPTMが様々なアミノ酸置換(例えば、グリシンからアラニンへ)およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のメチルエステル化などの化学修飾に同重体であるため、高い偽発見率(FDR)を起こしやすい9。したがって、細胞培養中のアミノ酸による重メチル安定同位体標識(hmSILAC)などのメチル基の同位体標識に基づく方法は、 in vivo メチル化の信頼性の高いMS同定のための直交戦略として実装されており、偽陽性アノテーションの割合を大幅に低減しています10。
最近、R-メチル化タンパク質を研究するためのさまざまなプロテオームワイドプロトコルが最適化されています。R-メチルペプチドの免疫親和性濃縮のための抗体ベースの戦略の開発は、ヒト細胞における数百のR-メチル化部位のアノテーションをもたらした11,12。さらに、多くの研究3,13では、抗体ベースの濃縮をHpH-RPクロマトグラフィー分画などのペプチド分離技術と結合させることで、同定されたメチルペプチドの総数を増やすことができると報告されています。
この記事では、さまざまな生化学的および分析ステップに基づいて、ヒト細胞のR-メチル化部位を体系的かつ信頼性の高い同定のために設計された実験戦略について説明します:hmSILAC標識細胞からのタンパク質抽出、トリプシンおよびリサルギナーゼプロテアーゼによる並行二重酵素消化、それに続く消化ペプチドのHpH-RPクロマトグラフィー分画、MMA-、SDMA-の抗体ベースの免疫親和性濃縮と組み合わせた、 およびADMA含有ペプチド。次に、すべてのアフィニティーが豊富なペプチドをDDAモードの高分解能液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MSで分析し、生のMSデータをMaxQuantアルゴリズムで処理してR-メチルペプチドを同定します。最後に、MaxQuantの出力結果は、重金属ペプチドと軽メチルペプチドのペアを検索するために自社開発のバイオインフォマティクスツールであるhmSEEKERで処理されます。簡単に言うと、hmSEEKERはmsmsファイルからメチルペプチドの同定を読み取ってフィルタリングし、各メチルペプチドをallPeptidesファイル内の対応するMS1ピークと照合し、最後に重/軽ペプチドのピークを検索します。推定される重照度ペアごとに、Log2 H/L比(LogRatio)、保持時間差(dRT)、および質量誤差(ME)パラメータが計算され、ユーザー定義のカットオフ内にあるダブレットが真陽性としてラベル付けされます。生化学的プロトコルのワークフローを 図1に示します。
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Protocol
1.細胞培養とタンパク質抽出(時間:3〜4週間必要)
- HeLa細胞を、それぞれ軽(L)または重(H)メチオニンのいずれかを供給された培地で並行して増殖させる(培地組成については 表1 を参照)。少なくとも8回の細胞分裂を行ったら、各SILACチャネルから細胞のアリコートを収集し、取り込み試験を実行します。
注:取り込み効率を確認するには、LC-MS / MS分析によって、ヘビーチャネル内の重いメチオニン(Met-4)の割合が可能な限り100%に近いことをテストします。LC-MS/MSで重標識細胞のアリコートを分析し(設定については表 2を参照)、 表3に示すパラメーターを使用してMaxQuantでMSデータを処理します。Met-4の組み込みを確認するには、社内で開発されたスクリプトを https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ で入手できます。 - メチオニンの大量取り込みは、>97%に達したら完了したと考えてください。各チャネルが全数約60×10に達すると、6 個の細胞(HeLa細胞については85%コンフルエントでそれぞれ15cmの約40皿に相当し、細胞型によって変動する)を採取する。それらを注意深く数え、1:1の比率で混合し、335 x g で4°Cで5分間遠心分離することによりペレット化します。
注:適切な1:1 L / H混合を評価するには、アリコートを保持し、豊富でR-メチル化タンパク質(フィブリラリンなど)を含むことが知られているゲルのスライスで実行します。標識が成功し、1:1の混合が達成された場合、サンプル中に存在するR-メチル化ペプチドの軽質バージョンと重バージョンの比率は1:1になるはずです。あるいは、LC-MS/MSで分析する混合サンプルのアリコートを保持し、 表3 に示すパラメータを使用してMaxQuantでMSデータを処理し、 図2Cに示すようにLog2 H / L比の分布をプロットします。プロトコルは、ペレットを急速凍結し、-80°Cで保存することでここで停止できます。 - 細胞ペレット体積に対して4容量のLysis Buffer(Lysis Buffer組成については表1を参照されたい)に細胞ペレットを再懸濁する。例えば、1.5 mLの容量に対応する120 x 10 6 Hela細胞(60 x 106 Light + 60 x 10 6Heavy)のペレットには、6 mLの溶解バッファーを使用します。
注:溶解バッファーには氷温度で沈殿するカオトロピック剤9 M尿素が含まれているため、タンパク質抽出は室温(RT)で実行する必要があります。したがって、広域スペクトルのセリンおよびシステインプロテアーゼ阻害剤の添加は重要であり、ならびにホスファターゼ阻害剤は、タンパク質分解および脱リン酸化からタンパク質を同時に保護するために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルが小型錠剤として市販されている、表 1 および 表の材料を参照されたい。 - 細胞膜の効率的な破壊とDNA放出および剪断を確実にするために、15秒オンおよび30秒オフの少なくとも5サイクルのためにマイクロチップ細胞破壊器超音波処理器でサンプルを超音波処理する。溶液を上下にピペッティングして抽出物の粘度を確認します。不完全なDNAせん断と膜可溶化のために粘性が高すぎる場合は、超音波処理サイクルを繰り返します。
注:高温はタンパク質を損傷する可能性があるため、超音波処理中にサンプルが過熱しないようにしてください。しかし、超音波処理サイクルの間に氷の上にサンプルを置くことはできません, 9M尿素の存在のため;したがって、異なる超音波処理サイクルの間に60秒オフのために一時停止することをお勧めします。さらに、超音波処理の有効性を低下させるため、超音波処理中に気泡の形成を避けてください。 - 抽出液を3,000 x g でRTで10分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新しい15 mLチューブに移します。
- ブラッドフォードやビシンコニン酸(BCA)などの比色アッセイで抽出物のタンパク質含有量を測定します14,15。このプロトコルのタンパク質抽出物の最適な開始量は20〜30 mgです。
注:高濃度尿素を含む溶解バッファーは、ブラッドフォードおよびBCA定量アッセイの両方と互換性があります。高濃度のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むものなど、他のタイプの溶解バッファーはブラッドフォードと互換性がありません。
2. ライセート消化(目安時間2時間)
- 終濃度4.5mMの超純水に溶解したジチオスレイトール(DTT)の原液を用いてタンパク質のチオール基(-SH)の還元を行い、55°Cで30分間反応させた。
注:1 MストックDTT溶液を調製し、各実験に必要なアリコートだけを解凍して、-20°Cで最大1か月間保存することができます。あるいは、スルフヒドリル還元剤トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン(TCEP)を使用して、-SH基の還元を行うことができます。特にタンパク質の長期保存の場合、TCEPはバッファー中にEGTAなどの金属キレートがない場合のDTTよりも有意に安定ですが、DTTは金属キレートが存在する場合により安定です16。 - ヨードアセトアミド(IAA)を10 mMの濃度で添加してタンパク質のチオール基(-SH)のアルキル化を行い、暗所でRTで15分間インキュベートします。IAAは感光性であるため、暗闇の中でIAA溶液で抽出したタンパク質のインキュベーションを行います。
注:100 mMのIAAストック溶液は、各実験の前に新鮮な状態で調製する必要があります。あるいは、IAA誘導アーティファクトがユビキチン化を模倣するため、特に実験の目的がメチル化とユビキチン化の間のクロストークを分析することである場合、クロロアセトアミドを使用して-SH基のアルキル化を行うことができます17。 - タンパク質消化ステップに進む前に、SDS-PAGEクーマシー染色ゲルでのその後の分析および消化時の対応する量のサンプルとの比較のために、タンパク質抽出物のアリコート(開始未消化ライセートの1/1,000)を保存します。この試験は、タンパク質分解効率を検証するのに役立ちます(ポイント4を参照)。
- 残りのタンパク質抽出物を4倍量の20 mM HEPES pH 8.0で希釈し、最終尿素濃度2 M(プロテアーゼの酵素活性に適合する濃度)に到達します。サンプルを2つの部分に分けます:最初にシーケンシンググレードの修飾トリプシンを追加し、2番目にLysargiNaseプロテアーゼ( 材料の表を参照)を出発物質のmgに対して1:100(w / w)の比率で追加します。37°C、600rpmのサーモミキサーに一晩放置し、酵素消化を可能とした。
注:プロテオミクスで最も一般的な消化酵素であるトリプシンは、Rとリジン(K)のC末端で切断し、衝突誘起解離(CID)時にy型イオンが支配的なフラグメンテーションスペクトルをもたらす電荷分布を持つペプチドを生成します。したがって、リサルギナーゼはRおよびKのN末端で切断するため、トリプシン切断特異性を反映し、CIDフラグメンテーション時に主にb型イオンを放出するペプチドを生成します。この組み合わせた分析により、ペプチド配列のカバレッジが大幅に向上し、R-メチル化の部位特異的同定の信頼性が高まります18。
3. ペプチド精製(目安時間1時間)
- 両方の反応から消化されたペプチドのアリコートを保持し、プロテアーゼ消化効率を評価するためにSDS-PAGEクーマシー染色ゲルで比較するためにポイント2.3と同じ量を収集します(ポイント4を参照)。
- トリフルオロ酢酸(TFA)を最終濃度5%まで添加してサンプルを酸性化することにより、消化を停止します。よく混ぜて、リトマス紙でサンプルのpHを測定します(pHは約3である必要があります)。酸性化されたサンプルを短時間ボルテックスしてスピンダウンしてから、新しい15 mLチューブに移します。
- 2つのC18 vacカートリッジ(吸着剤重量1 g、 材料表を参照)を介してサンプルをクリーンアップし、1つはトリプシンで消化したサンプル用、もう1つはLysargiNaseで消化したサンプル用です。溶媒A、溶媒B、および洗浄バッファーを調製します(バッファー組成については 表1 を参照してください)。
- ガラスピペットを使用して、各カートリッジを6 mLのACN 100%で3回再水和します。その後、各カートリッジを3-9-18 mLの溶剤Aで順番に平衡化します。 サンプルをロードします(樹脂は黄色になります)。3-9-18 mLの溶媒Aで順次洗浄し、次に6 mLの洗浄バッファーを追加します。各カラムを清潔な15 mLチューブに移し、7 mLの溶媒Bでサンプルを溶出します。 7 mLの溶媒Bで溶出ステップを繰り返し、最終容量は14 mLになります。
注:バッファーと溶液を重力によってカラムを通過させることにより、これらすべての手順を実行します。カラムを通るバッファーの流れを促進するには、シリンジで各溶液をゆっくりと押して、真空を模倣します。 - 溶出ペプチド50 μL、フロースルー(FT)50 μL、溶媒Aによる洗浄液50 μL、および最後の洗浄液50 μLをSDS-PAGEによる後続のペプチド評価のために保存してください(ポイント4を参照)。
4.クーマシー染色SDS-PAGEゲル(目安時間2時間)
- 収集したアリコートを17.5%SDS-PAGEゲルで実行し、インスタントブルークーマシー染色で染色します( 材料の表を参照)。期待される結果を 図2Aに示します。
5.ペプチド凍結乾燥(指標時間2日)
- 溶出したペプチドを含む15 mLチューブをパラフィンフィルムで覆い、20 Gの針で打ち抜いて3〜5個の穴を開けます。サンプルが完全に凍結するまで、チューブをドライアイスに少なくとも30分間入れます。
- 凍結フラクションを48時間凍結乾燥しますが、これは、凍結乾燥機の性能により、多少のばらつきが発生する可能性がある場合でも、サンプルの完全な凍結乾燥を確実にするのに通常十分な時間間隔です。
注:ここで実験を一時停止し、凍結乾燥サンプルを-80°Cで保存できます。
6.ペプチドのオフラインHpH-RPクロマトグラフィー分画(指示時間4日)
- ペプチドを60フラクションに分画するには、C12-RP HPLCカラム(250 x 4.6 mm、4 μm Proteo 90A)を備えたHPLCシステムを使用して、HpH-RP液体クロマトグラフィーを使用します。
- 実行前に、新しいバッファーAとバッファーBを準備します(バッファーの構成は 表1に記載されています)。
- 0.22μmフィルターですべての溶液をろ過し、超音波破砕槽で少なくとも30分間脱気します。
- 凍結乾燥ペプチドを1 mLのバッファーAに溶解し、シリンジを使用してポリテトラフルオロエチレン(PTFE)0.45 μmフィルターでペプチドをろ過します。
- 分画速度を1 mL/分のフローに設定し、次のクロマトグラフィーグラジエントを使用して1 mLの画分を収集します:60分で5%Bから30%B;2分で30%Bから60%。70%Bで3分間。
- この時点でフラクション収集を停止し、グラジエントを70%バッファーBで5分間保持してから、100%バッファーBまでの迅速なグラジエントでカラムを広範囲に洗浄し、続いて最終洗浄(100%バッファーBを10分間)するようにHPLCを設定します。
注:各クロマトグラフィーランの最後に、必ずカラムを100%バッファーAで20分間平衡化します。 - ポイント6.5に記載されているように、オフラインHpH RPクロマトグラフィーグラジエントによってトリプシンとリサルギナーゼで別々に消化した両方のサンプルを分画します。
- クロマトグラフィーグラジエントごとに、すべての画分をディープ96ウェルプレートに回収します。
- 勾配の前に収集されたフラクションをPREという名前の1つのフラクションにプールします。HpH-RP液体クロマトグラフィー(LC)グラジエントからの60個のフラクションを、連続していない方法で14個の最終フラクションにプールして連結します。このような非連続連結を得るために、以下のスキームに従ってHpH−RP画分をプールする。
- フラクション1(最終容量5 mL):プール1-15-29-43-57
- フラクション2(最終容量5 mL):プール2-16-30-44-58
- フラクション3(最終容量5 mL):プール3-17-31-45-59
- フラクション4(最終容量5 mL):プール4-18-32-46-60
- フラクション5(最終容量4 mL):プール5-19-33-47
- フラクション6(最終容量4 mL):プール6-20-34-48
- フラクション7(最終容量4 mL):プール7-21-35-49
- フラクション8(最終容量4 mL):プール8-22-36-50
- フラクション9(最終容量4 mL):プール9-23-37-51
- フラクション10(最終容量4 mL):プール10-24-38-52
- フラクション11(最終容量4 mL):プール11-25-39-53
- フラクション12(最終容量4 mL):プール12-26-40-54
- フラクション13(最終容量4 mL):プール13-27-41-55
- フラクション14(最終容量4 mL):プール14-28-42-56
注:非連続連結は、初期、中期、および後期溶出画分を組み合わせることで構成され、プールされた画分内のペプチド組成の不均一性を高めることができます。その結果、各プールされた画分のペプチド混合物は、質量分析計に直接結合された後続のナノフロー低pH−RP−LCクロマトグラフィーにおいて、限られた共溶出で効率的に分離される。
- 勾配の後に収集された分数を、POSTという名前の一意の分数にプールします。
注:PREグラジエントとPOSTグラジエントのフラクションを含めることにより、15 mLチューブで合計16のフラクションが得られます( 図3Aを参照)。 - 15 mLチューブをパラフィンフィルムで覆い、20 Gの針でパンチして3〜5個の穴を開けます。各画分が完全に凍結するまで、遠心分離管をドライアイス中でインキュベートすることによってそれらを凍結する。
- 画分を約48時間凍結乾燥する。凍結乾燥機を停止する前に、各サンプルが完全に乾燥していることを確認してください。
注:ここで実験を一時停止し、凍結乾燥サンプルを-80°Cで保存できます。
7. R-メチル化ペプチド免疫親和性濃縮(指標時間2日)
- 抗汎R-メチル化抗体による修飾ペプチドの連続的な免疫親和性濃縮を並行して実行しますが、トリプシン消化とリサルギナーゼ消化からの2つのサンプルに対してそれぞれ別々に実行します。免疫親和性精製(IAP)バッファーは、修飾ペプチド親和性濃縮用の抗汎-R-メチル抗体を購入する会社によって提供されます(詳細は 表の材料 と 試薬にあります)。IAPバッファーは10倍濃縮されており、使用前に10倍に希釈する必要があります。
注:IAPバッファー1xは、-20°Cで最大1年間保存できます。 - 凍結乾燥ペプチドを2,000 x g でRTで5分間遠心分離し、ペプチドを15 mLチューブの底までスピンダウンします。凍結乾燥ペプチドを15 mLチューブあたり250 μLの1x IAPバッファーで再懸濁し、1.5 mL低結合チューブに移します。pHが>6であるかどうかをリトマス紙を使用して確認してください。
- 各フラクションの少量のアリコート(容量の約5%)を、後続のMS分析の入力として保持します。
- 非対称ジメチル化(ADMA)および対称ジメチル化(SDMA)ペプチドの免疫濃縮を並行して行うために、各画分を2つのアリコートに分割します。
- 初期タンパク質抽出物10 mgあたり、プロテインAアガロースビーズに結合した選択した抗汎-R-メチル化抗体のバイアルを3つ使用します。
- 各バイアルを2,000 x g で30秒間遠心分離し、ビーズからバッファーを除去することにより、アガロースビーズに結合した抗体の正しい量を調製します。ビーズを1 mLの1x PBSで常に2,000 x g で30秒間遠心分離して3回洗浄します。
- 最後の洗浄後、各バイアルの40 μL 1x PBSにビーズを再懸濁します。それらをプールし、最後にそれらを16の画分に均等に分割します(2.5μLの抗体ビーズが各画分に追加されます)。
- 250 μLの1x IAPバッファーを各チューブに加え、反転させて混合し、回転ホイール上で4°Cで2時間インキュベートします。
注:マイクロチップでピペッティングするのではなく、1.5 mLチューブを反転させてサンプルを混合すると、ビーズが損傷したり、ビーズが失われる可能性があります。 - 2時間のインキュベーションで、ペプチドと汎R-メチル抗体結合ビーズを含む1.5 mLチューブを2,000 x g で30秒間遠心分離し、ビーズをペレット化します。各画分からFTを清潔な1.5 mL低結合チューブに移します。
- R-モノメチル化(MMA)に対する抗体に結合したビーズをFTに加え、ステップ7.7から7.9を繰り返します。
- ペプチドサンプルとMMAビーズのインキュベーション中に、抗ADMAおよびSDMAで免疫沈降した画分を250 μL IAPバッファー(反転およびピペッティングなし)で2回洗浄し、各洗浄で上清を廃棄します。
- LC-MSグレードH2Oで洗浄を3回繰り返します。
- アガロースビーズから50 μLの0.15% TFAを添加して、アフィニティーに富んだ対称的および非対称的にR-ジメチル化ペプチドを各チューブから溶出します(実際、強酸条件ではエピトープが変性し、抗体から抗原が放出されます)。この溶液をRTで10分間放置し、2〜3分ごとにチューブを反転させます。
- 最初の溶出液を清潔な1.5 mL低結合チューブに移し、50 μL 0.15% TFAで溶出を繰り返します。1つのチューブに2つのフラクションをプールします。
- 抗MMA抗体ビーズと一緒にインキュベートしたR-モノメチル化ペプチドについて、7.11から7.14までの手順を繰り返します。
8. C18マイクロカラムによるアフィニティー濃縮メチルペプチドの脱塩と濃縮(目安時間30分)
- MS分析の前に、ペプチド脱塩および濃縮用の3M固相抽出カートリッジで作製したC18-RPマイクロカラムをメタノールで平衡化します19。
- サンプル(個別の免疫親和性濃縮画分およびインプト画分に対応)を2段階でC18マイクロカラムにロードします(各C18マイクロカラムで50 μL + 50 μL)600 x g で6分間遠心分離します。
- マイクロカラムを55 μLのバッファーA(バッファー組成については 表1 を参照)で、常に約900 x g で5分間遠心分離して洗浄します。
注:ここで実験を一時停止し、C18-RPマイクロカラムを4°Cのままにして、最大2週間保存できます。
9. 2回目の酵素消化(目安時間3時間)
- C18-RPマイクロカラムを55 μLのバッファーA(バッファー組成については 表1 を参照)で2回洗浄し、約850 x g で5分間遠心分離します。
- 20 μLのバッファーBでペプチドを2回溶出し(バッファー組成については 表1 を参照)、2つのフラクションをプールします。
- 溶出したペプチドを真空濃縮器で乾燥させます(詳細については 、表の材料と試薬 を参照してください)。一方、新しく作られた1 Mストック溶液から希釈された50 mM重炭酸アンモニウムからなる消化溶液を調製します( 表1を参照)。
- トリプシンまたはリサルギナーゼをそれぞれのサンプルに添加し、最終濃度25 ng/μLにします。 各サンプルを37°Cで2時間インキュベートします。
- 消化を止めるために1μLの5%TFAを加えます。サンプルを渦巻き、スピンダウンします。
注:トリプシンによる酵素切断は、メチル化されたRおよびKのC末端で阻害され、ペプチドの長さと電荷を増加させる切断の見逃しを引き起こし、複雑で不完全な断片化スペクトルを生成し、ペプチドの同定とメチル化部位の部位特異的な帰属を妨げます。第2の酵素消化は、配列カバレッジおよび部位帰属を改善して、そのような切断漏れの頻度を減少させる可能性があることが示されている20。
10.ペプチドの脱塩(目安時間30分)
- 酸性化ペプチド溶液を、ポイント8で説明したのと同じ手順に従って以前に平衡化された新しいC18-RPマイクロカラムにロードします。
- C18-RPマイクロカラムにロードされたペプチドは、LC-MS/MS分析のために溶出するまで4°Cで保存できます。
11.液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析(目安時間5日)
- 10μLのバッファーBを通過させ、615 x g でRTで5分間遠心分離することにより、C18-RPマイクロカラムからペプチドを溶出します。 この手順を2回繰り返し、溶出液を結合します。
- 真空濃縮器内の溶出液の量をほぼ乾かすまで減らし、過度の乾燥を避けます。
- LC-MS/MS分析用にペプチドを10 μLのバッファーAに再懸濁します。
- ナノフロー超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)システムと組み合わせた高分解能質量分析計( 材料表を参照)での液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)によってR-メチルペプチドの各画分を分析します。 表2の説明に従って機器のパラメータを設定します。
- C18-RP樹脂(粒子径2 μm)を充填したナノ分析カラム(イージースプレーカラム、内径75 μm、長さ25 cm)に各サンプル2 μLをロードします。
- サンプルは、3%-30%Bで89分間、30%-60%Bを5分間、60%-95%Bを1分間、95%Bを5分間の直線勾配で、300 RPナノカラムに流速で通過させます。
- 質量分析計はデータ依存取得(DDA)モードで動作し、フルスキャンMSとMS/MS取得を自動的に切り替えます。分析する調査フルスキャンMSを分解能R = 70,000の分光器検出器に設定します。最も強度の高い15個のペプチドイオンを目標値3 x 106 に順次単離し、28%の相対衝突エネルギーで断片化します。最大許容イオン蓄積時間をフルスキャンの場合は20ミリ秒、MS/MSの場合は50ミリ秒に設定し、MSMSのターゲット値を1 x 106に固定します。動的除外時間は 20 秒に設定されます。
12. MaxQuantおよびhmSEEKERデータ解析の実行
- LC-MS/MSの実行が完了したら、MS生データをペプチド検索エンジンにインポートして、参照データベースに対する確率ベースのアプローチによってメチルペプチドを識別します。このプロトコルでは、MaxQuantバージョン1.6.2.10が分析に使用されました。MaxQuantを実行するには、最低2GBのRAMと、すべての生データとすべての出力ファイルを保存するのに十分なディスク容量が必要です。
メモ: インストールの詳細、およびハードウェアとソフトウェアの要件については、https://www.maxquant.org の公式ドキュメントを参照してください。 - 各生データ ファイルを複製します。名前に「_light」を追加して元の名前を変更し、「_heavy」を追加してコピーの名前を変更します。
注: ダウンストリーム分析用のスクリプトである hmSEEKER では、大文字と小文字が区別されます。 - 表3に示す設定でペプチド同定のためのMaxQuant/Andromeda検索を起動します。MaxQuant によって生成されるいくつかの出力データのうち、ポスト処理ステップに必要なのは、allPeptides.txt ファイルと msms.txt ファイル (combed/txt サブフォルダーにあります) のみです。
- MaxQuant出力データの後処理は、アルゴリズムhmSEEKERによって実行されます。hmSEEKER のダウンロード元: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.このスクリプトは、Python 3.7 で記述された Jupyter ノートブックとして利用でき、テスト用のサンプル データセットが付属しています。新規ユーザーの場合は、Anacondaプラットフォームをダウンロードしてインストールすることをお勧めします(https://www.anaconda.com/products/individual)。最新のリリースには、デフォルトでPython 3.8、Jupyter、およびhmSEEKERを実行するために必要なすべてのパッケージ(Scikit-learn 0.23.1など)が含まれています。
- フォルダを作成し、MaxQuant出力からのすべてのペプチド.txtおよびmsms.txtファイルをその中に保存します。
- Jupyter を起動します (コマンドラインまたは Anaconda ナビゲーターから)。
- hmSEEKER フォルダーに移動し、hmSEEKER.ipynb を開きます。
- ノートブックの [ 入力パラメーター ] セクションで、FASTA データベースと MaxQuant テキスト ファイルを含むフォルダーへのパスを指定します。
- セルを選択し、Jupyter インターフェイスの上部にある [ 再生 ] ボタンをクリックして、各セル内でコードを実行します。
- このスクリプトは、分析されたデータセットごとにコンマ区切りの出力ファイルと、結合されたファイルを生成します。最終的なダブレットリストは、"[日付]-[時刻]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"という名前のファイルにあります。
(表 4 に、出力テーブルの列の簡単な説明を示します)。
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Representative Results
本稿では、タンパク質抽出物の酵素消化と2つの異なるプロテアーゼの並列処理、それに続くタンパク質分解ペプチドのHpH-RP液体クロマトグラフィー分画、および抗汎-R-メチル抗体によるR-メチルペプチドの免疫親和性濃縮の組み合わせに基づく、グローバルプロテインR-メチル化の高信頼性同定のワークフローについて説明します(図1)。
細胞は、天然(Light、L、Met-0)または同位体標識(Heavy、H、Met-4)のいずれかのメチオニンの存在下で増殖させた。Met-4のみの抽出物の少量のアリコートでMS分析によってテストされた完全な同位体標識時に、 図1Aに示すように、重い細胞と軽い細胞を回収し、1:1 L / Hの比率で混合しました。 13CD3-メチオニン代謝標識により、メチル基はメチル供与体S-アデノシルメチオニン(SAM)からタンパク質骨格に付加され、軽同位体または重同位体のいずれかの形で存在します21。 図1B は、S-アデノシルメチオニン(SAM)からアルギニンのグアニジノ窒素へのメチル基の転移を触媒するプロテインアルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)ファミリーによって行われるアルギニンメチル化反応を示しています。アルギニンの末端窒素原子の1つに単一のメチル基を配置すると、モノメチル化アルギニン(MMA)が得られます。グアニジノ基の同じ窒素原子に2つのメチル基が付加すると不斉ジメチル化アルギニン(ADMA)が生成され、2つのメチル基が2つの異なる窒素原子に配置されると対称ジメチル化アルギニン(SDMA)が生成されます。
軽標識細胞と重標識細胞を1:1の比率で混合した後、タンパク質を抽出し、トリプシンとリサルギナーゼによる消化を並行して行いました。図2に示すように、SDS-PAGEクーマシー染色ゲルを使用して、ペプチド中の全タンパク質の効率的な酵素消化を検証しました(レーンIとIIを比較)。さらに、C18 Sep-Pakカラムで行った精製工程の効率を評価し、C18カラムのフロースルー(図2、レーンIII)および1回目および2回目の洗浄(それぞれレーンIVおよびV)におけるペプチドの不在を確認し、溶出液中にそれらの予想される存在(図2、レーンVI)を確認した。ヘビーチャネルへの適切なMet-4の取り込み(図2B)と正しい1:1 H / L混合(図2C)が評価されました。
図3は、ペプチドのオフラインHpH-RP液体クロマトグラフィー分画とそれに続くフラクションの非連続連結からのクロマトグラムを示しています。ペプチドは215 nm UVで検出され、潜在的に残っている未消化タンパク質は280 nm UVで評価されました。クロマトグラムの下にフラクション連結戦略が図式化され、PREおよびPOSTグラジエントフラクションを含む70の出発フラクションを最終16に減らします。
抗汎-R-メチル抗体をR-メチルペプチドの濃縮に使用しました。これらの抗体は、3種類のR-メチル化(MMA、SDMA、およびADMA)を認識し、アガロースビーズに直接結合したものとして市販されています(詳細については、 表の材料および試薬 を参照してください)。 表 1 に、このプロトコルで使用されるすべてのバッファーとソリューションを示します。
取得後、各MS生データをMaxQuantで2回分析し、メチルペプチド(重質および軽質)は特定のグループでのみ同定されるという理論的根拠を持って、異なる検索グループで軽メチル化と重メチル化を同定しました。重メチル化と軽メチル化を別々に検索すると、導入される可変修飾の数を減らし、混合標識ペプチドの偽陽性のリスクを減らすことで、分析が改善されます。MaxQuantがメチルサイトを割り当てると、hmSEEKERはその出力テーブルを解析して、重い軽いピークの可能なペアを再構築します13。
図4および図5は、ペプチドFELTGIPPAPR(me)(4)およびNPPGFAFVEFEDPR(me)(5)の完全なMSスペクトルを示しており、これらはそれぞれ真陽性および偽陽性のメチルペプチドアノテーションを表しています。図4では、3つのピーク間で観察されたm/z差は、酵素的にメチル化された残基の存在と一致しています(非修飾型と軽メチル化型の間で7.0082 Th、メチルペプチドの軽型と重型の間で2.0102 Th)。結果として得られる hmSILAC ダブレットの ME は 0.40 ppm、dRT は 0.00 分、対数比は -0.41 です。これらの値は、真と偽のダブレットを区別するためにhmSEEKERが採用しているデフォルトのしきい値を下回っています。私|< 2 ppm, |dRT|< 0.5 分、および |対数比|< 1.図5に示す2番目のケースでは、軽メチル化ペプチドとその推定重ペプチドとの間に観察されたm/z差は、期待値から0.0312 Th(ME = -37.28 ppm)ずれています。さらに、このダブレットの対数比は2.50で、デフォルトの対数比予測間隔外です(これらのカットオフ値は13で定義および説明されています)。実際、MS/MSスペクトルでは、ペプチドNPPGFAFVEFEDPR(me)の配列は完全にはカバーされておらず、割り当てられたR-メチル化は、Rに近いグルタミン酸またはアスパラギン酸のメチルエステル化としても解釈できます。
hmSEEKERワークフローは図 6に図示されていますが、 表4 はこのツールによって生成された出力テーブルの説明を提供し、結果の解釈に役立ちます。最後に、ピークダブレットは3つのクラスに分けられます。 一致したダブレットは、ペプチドが断片化され、重い形態と軽い形態の両方で同定されたため、最も確実です。
図1:実験ワークフローと酵素タンパク質-R-メチル化反応のスキーム。 (A)生化学的プロトコルのワークフロー図。細胞は、軽(Met−0)および重(Met−4)メチオニン含有培地で少なくとも8倍増し、軽チャネルおよび重チャネルが1:1の比率で混合される。タンパク質を抽出し、トリプシンまたはLysargiNaseで並行して消化し、オフラインHpH-RP液体クロマトグラフィーで70の画分を収集して分画し、最終的に16の画分にまとめます。R-メチルペプチドは、アガロースビーズに結合した抗汎-R-メチル抗体によって濃縮され、2回目の酵素消化(それぞれトリプシンまたはリサルギナーゼ)を受け、LC-MS/MSによって分析されます。 生のMSデータは、ペプチドおよびPTMの同定のためにMaxQuantアルゴリズムによって処理されます。MaxQuantの出力データは、重金属および軽メチルペプチド関連のために社内で開発されたhmSEEKERバイオインフォマティクスツールによる分析のために提出されます。(b)R-メチル化反応のスキーム。アルギニンのグアニジノ基は、1つのメチル基の付加によって修飾され、モノメチル化アルギニン(MMA)を生成するか、または2つのメチル基の付加によって、対称(SDMA)または不斉(ADMA)ジメチル化アルギニンを生成する。この反応は、S-アデノシルメチオニン(SAM)からこれらのメチル基を転移するプロテインアルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)ファミリーの酵素によって触媒されます。メチル基転移後、SAMはS-アデノシルホモシステイン(SAH)に還元される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロトコルの重要なステップの制御。 (ア) タンパク質分解消化効率を評価するためのSDS-PAGEクーマシー染色ゲル。 MW:分子量マーカー。 I) BCAによって定量された消化前の20μgの総H / Lタンパク質抽出物。 II) Iと同じ割合で装填された消化ペプチド; III) レーンIと同じ割合で装填されたC18カートリッジのフロースルー。 IV−V) Iと同じ割合で装填された緩衝液AによるC18カートリッジの1回目および2回目の洗浄; VI)C18カートリッジから溶出し、Iと同じ割合でロードされます。 (B)Met-4取り込み率分析。ヘビーチャネルへのMet-4の組み込みは、社内で開発されたスクリプト(https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ で入手可能)によって評価されます。rate = 1は、1:1混合評価のためのH / L比の完全な組み込み(C)ガウス分布を示します。Log2 H/L比の正規分布は、±2σを考慮してプロットされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HpH画分連結スキームおよび代表的なR-メチル化ペプチド濃縮評価 。 (A)高pH逆相分画クロマトグラムおよび非連続画分連結のスキーム。クロマトグラムは、215 nm UVで検出されたペプチドのHpH-RP分離プロファイル(青い線)を表し、未消化タンパク質の存在は280 nmのUVチャネル(赤い線)で追跡されました。薄緑色の線は、クロマトグラフィーランに沿ったバッファーBの濃度を表します。フラクションプーリングスキームが報告され、PREおよびPOSTグラジエントフラクションを含む、70から16までの早期、中期、および後期溶出フラクションの非連続連結の戦略が示されています。(B)R-メチル化ペプチドの富化をまとめた代表的な表。この表は、ペプチドの総数と、入力上の各IPを比較したR-メチル化濃縮の相対的な割合を要約したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:真のHMSILACダブレットの例。真陽性ダブレットのマススペクトル。表示されたピークは、電荷2+を有する、未修飾の軽モノメチル化(CH3)および重モノメチル化(13CD3)形態のペプチドFELTGIPPAPRに対応する。3つのピーク間で観察されたm/z差は、酵素的にメチル化された残基の存在と一致しています。マススペクトルの下の表はhmSEEKER出力を表し、ダブレットの対数比、ME、およびdRTパラメータが含まれています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:偽のHMSILACダブレットの例。 負の in vivo メチルペプチド割り当てのマススペクトル。811.3849 m/zおよび818.3927 m/zのピークは、電荷2+のペプチドNPPGFAFVEFEDPRの未修飾および軽いモノメチル化形態に対応します。3番目のピークは、軽メチル化ペプチドの重メチル対応物として割り当てることができますが、観測されたm/zシフトは予想されるシフトと0.0312 Th異なるため、この可能性は除外されます。マススペクトルの下の表はhmSEEKER出力を表し、ダブレットの対数比、ME、およびdRTパラメータが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:データ分析ワークフローの概略図。 (A) MaxQuant は生データの MS1 ピークを検出します。(B)関連するMS2スペクトルを有するピークは、ペプチド同定を得るためにデータベース検索エンジンAndromedaによって処理される。(C)hmSEEKERはMaxQuantペプチド同定を読み取り、アンドロメダスコア>25、デルタスコア>12、および局在化確率>0.75の修飾を有するメチルペプチドを抽出する。(D) 品質フィルタリングに合格した各メチルペプチドについて、hmSEEKERはMaxQuant allPeptidesテーブルで対応するMS1ピークを見つけ、同じテーブルで対応するものを検索します。(E)ピークのダブレットは、それらの保持時間(RT)、それらの強度比(LogRatio)、および予想されるデルタ質量と観測されたデルタ質量(ME)の差によって定義されます。これらの3つのパラメータは、13で説明したように、真陽性と誤検知を区別するためにhmSEEKERによって使用されます。(F)最後に、hmSEEKERは冗長ダブレットと非冗長ダブレットのリストを作成します。1つ目はすべてのメチルペプチドの予測を含み、2つ目はペプチドが複数回同定された場合に最高得点のダブレットのみが報告されるようにフィルタリングされます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファ | 容積 | 組成 |
| L-メチオニン(L) 溶液 | 10ミリリットル | 30mg/mL ライトメチオニン 超純水中 |
| L-メチオニン(H) 溶液 | 10ミリリットル | 30mg/mL 重メチオニン 超純水中 |
| 細胞培養用培地 | 500ミリリットル | 安定グルタミンを含み、メチオニンを含まないDMEM、10%(v/v)透析FBS、1%(v/v)P/S、1:1000(v/v)L-メチオニン溶液 |
| 溶解バッファー | 50ミリリットル | 9M 尿素、20mM HEPES pH 8.0;1% (v/v) プロテアーゼ阻害剤;超純水中の1%(v/v)ホスファターゼ阻害剤 |
| 重炭酸アンモニウム(AMBIC)溶液 | 50ミリリットル | 超純水中の1M(NH4)2CO3 |
| DTTソリューション | 10ミリリットル | 超純水中の1.25M DTT |
| IAAソリューション | 5ミリリットル | 超純水中109mM |
| セパックC18のための溶媒A | 50ミリリットル | 超純水中で0.1%TFA |
| セパックC18用溶剤B | 50ミリリットル | 超純水中で0.1% TFA + 40% ACN |
| セパックC18用洗浄液 | 50ミリリットル | 超純水中で0.1% TFA + 5% ACN |
| HpH分画用バッファーA | 500ミリリットル | 超純水中で25 mM NH4OH |
| HpH分画用バッファーB | 500ミリリットル | 超純水中で25 mM NH4OH+ 90% ACN |
| IP バインディング バッファー 1x | 5ミリリットル | 市販のストック溶液10倍の超純水中で1:10(v/v)希釈 |
| IP溶出バッファ | 50ミリリットル | 超純水中で0.15%TFA |
| ステージチップ用のバッファA | 50ミリリットル | 超純水中で0.1%TFA |
| ステージチップ用のバッファB | 50ミリリットル | 超純水中で0.1% TFA + 40% ACN |
| ステージチップ用のバッファC | 50ミリリットル | 超純水中で0.1%TFA + 50%ACN |
| MS ソルベント A | 250ミリリットル | 超純水中で0.1%FA |
| MS ソルベント B | 250ミリリットル | 超純水中で0.1%FA + 80%ACN |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | 5ミリリットル | cOmplete、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤(ROCHE)は、製造説明書に従って超純水に溶解されています |
| ホスファターゼ阻害剤カクテル | 5ミリリットル | 製造説明書に従って超純水に溶解したフォストップ錠(ロシュ) |
表1:緩衝液および溶液の組成。 このプロトコルで使用されるバッファーとソリューションの一覧。
| パラメーター | 価値 |
| サンプルローディング (uL) | 2 |
| 負荷流量(uL/分) | 10 |
| グラジエント流量(nL/分) | 300 |
| 線形グラデーション | 89分間3-30%B、5分間30-60%B、1分間60-95%B、5分間95%B |
| フル スキャンの解像度 | 70,000 |
| 選択された最も強いイオンの数 | 15 |
| 相対衝突エネルギー(%)(CID) | 28 |
| 動的除外 | 20.0 |
表 2: LC-MS/MS 設定 ナノフロー超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)システムを組み合わせた高分解能四重極-Orbitrap質量分析計でのR-メチルペプチドのLC-MS/MS分析に適用されるパラメーター。
| MQパラメータ設定 (ver 1.6.2.10) | |||
| 設定 | アクション | ||
| 構成 | |||
| 変更 | メット4 | 新しい変更を追加します。組成をH(-3)Hx(3)Cx C(-1)に設定し、特異度としてMを選択します。 | |
| メチル4 (韓国) | "メチル (KR)" を複製し、名前を変更して組成を Cx H(-1) Hx(3) に変更します。 | ||
| ジメチル4 (韓国) | "ジメチル (KR)" を複製し、名前を変更してコンポジションを H(-2) Hx(6) Cx(2) に変更します。 | ||
| トリメチル4 (K) | "トリメチル(K)"を複製し、名前を変更してCx(3)H(-3)Hx(9)に組成を変更します | ||
| オックスメット4 | 「酸化(M)」を複製し、名前を変更します。 | ||
| プロテアーゼ | リサルギナーゼ | 新しいプロテアーゼを追加します。「R」列と「K」列を選択します。 | |
| 新しいPTMまたはプロテアーゼを作成するときは、[テーブルの変更]をクリックしてMaxQuant設定を変更し、[変更を保存]をクリックして変更を確定します。MaxQuantを再起動すると、新しいオプションが表示されます。 | |||
| [生ファイル]タブ | |||
| [パラメーター] | 生ファイルを2つのグループ(0と1)に分けます | ||
| グループ固有のパラメータ | |||
| 種類 | 種類 | 標準 | |
| 多様 性 | 1 | ||
| 消化 | 酵素 | トリプシンまたはリサルギナーゼ | |
| 最大逃した胸の谷間 | 3に設定 | ||
| 変更 | 変数の変更 | グループ0 | 酸化 (M), メチル (KR), ジメチル (KR), トリメチル (K) |
| グループ1 | オックスメット4, メチル4 (韓国ウォン), ジメチル4 (韓国ウォン), トリメチル4 (K) | ||
| 修正された変更 | グループ0 | カルバミドメチル化 | |
| グループ1 | カルバミドメチル化とMet4 | ||
| グローバル パラメーター | |||
| シーケンス | ファスタファイル | FASTAファイルをロードする | |
| 識別 | ティッカー | 0.01 に設定 | |
| 修飾ペプチドの最小スコア | 1 に設定 | ||
| 修飾ペプチドの最小デルタスコア | 1 に設定 | ||
| 高度な識別 | 2回目のペプチド検索 | チェックオフ | |
| テーブル | すべてペプチドテーブルを書く | 小切手 | |
| アドバンスド | ピーク特性の計算 | 小切手 | |
| 指定しない場合は、既定のパラメーターのままにします。 | |||
| 組み込みテストの MQ パラメーター設定 | |||
| グループ固有のパラメータ | |||
| 種類 | 種類 | 標準 | |
| 多様 性 | 2 | ||
| 最大ラベル付き | 5 | ||
| ヘビーラベル | Met4を選択 | ||
| 消化 | 酵素 | トリプシンまたはリサルギナーゼ | |
| 最大逃した胸の谷間 | 3に設定 | ||
| 変更 | 変数の変更 | 酸化(M) | |
| 修正された変更 | カルバミドメチル化 | ||
| 指定しない場合は、既定のパラメーターのままにします。 | |||
表 3: 最大量処理パラメータ 説明されている特定の実験に合わせて調整されたグループ固有のグローバルパラメータがリストされています。他のすべてのパラメータは、使用するプログラムのバージョンに応じてデフォルトとして設定されています。
| 列名 | 形容 |
| 生ファイル | ダブレットが識別された生データファイル |
| H-スキャン | ヘビーカウンターパートのスキャン番号 |
| L-スキャン | ライト対応物のスキャン番号 |
| .CLASS | 次の 3 つの値を指定できます。 |
| 一致 = 重ペプチドと軽ペプチドが同じ配列で同定される | |
| ミスマッチ=重いペプチドと軽いペプチドは同じaa配列を持っていますが、メチル化部位の局在にミスマッチがあります | |
| レスキュー = ダブレット中のペプチドは1つだけ同定されます。その対応物は正体不明のピークです。 | |
| ペプチド | ペプチド配列 |
| スコア | ペプチドアンドロメダスコア |
| 解像 度 | 修飾残渣 |
| 販売拠点 | 修飾残基の位置 |
| 国防省 | 修正 |
| 鉛タンパク質 | ペプチドが属するタンパク質 |
| 遺伝子 | タンパク質に対応する遺伝子名 |
| PROBABILITY_TRUE | ロジスティック回帰モデルで計算されたダブレットが真のhmSILACダブレットである確率 |
| 予測 | ダブレットが推定真の場合は1、偽の場合は0 |
| H/L対数比 | 重/軽強度比のLog2 |
| 私 | 期待質量差と観測質量差の偏差 |
| ティッカー | 保持時間の違い |
表 4: hmSEEKER 出力結果の説明。 hmSEEKER 出力テーブル内の列項目のリストとその内容の簡単な説明。
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Discussion
グローバルMSベースのプロテオミクスによる in vivo タンパク質/ペプチドメチル化の高信頼同定は、高いFDRのリスクのために困難であり、メチル化に同重体であり、直交MS検証戦略がない場合に誤った割り当てを引き起こす可能性のあるサンプル調製中にいくつかのアミノ酸置換およびメチルエステル化が発生します。このPTMの化学量論的性質は、グローバルなメチルプロテオミクスのタスクをさらに複雑にしますが、修飾ペプチドの選択的濃縮によって克服することができます10。
ここでは、HpH-RPクロマトグラフィーペプチド分画および抗汎-R-メチルペプチド抗体キットとの親和性濃縮に結合されたhmSILAC戦略の適用を通じて、R-メチルペプチドのグローバルMS分析の効率と信頼性を高めるように設計された生化学的および分析ワークフローを紹介します。前者の戦略はメチルペプチドの直交検証を可能にし、同定のFDRを強力に減少させ、後者のプロトコルは未修飾ペプチドのバックグラウンドからの検出可能性を高める22。しかしながら、このプロトコルの制限は、その後のペプチド分画およびアフィニティー濃縮のための入力として非常に大量の出発タンパク質抽出物(20〜40mgの範囲)の要件であり、これは、広範囲に拡大することができる不死化、急成長細胞株へのこの方法の適用を制限する。代わりに、現在の設定は患者由来の初代細胞または組織には適用されません。将来の研究は、この方向でプロトコルを改善するために向けられるべきである:修飾されていないものよりもメチル化ペプチドの生化学的濃縮のための追加の戦略は、抗体の使用を回避し、実験の縮小を可能にする可能性がある。別の興味深い発展は、現在の方法と同重体またはタンデム質量タグによるタンパク質分解ペプチドの化学修飾との組み合わせによって表され、2つの潜在的な利点があります:一方では、1つの実験で複数の条件を組み合わせる可能性、したがって、異なる摂動に対するメチルプロテオーム変化の相対定量を多重化します。一方、クロマトグラフィー分画およびアフィニティー濃縮の前に異なるサンプルを1つにプールすることで、個々の実験の規模を縮小できる場合があります。
このプロトコルは、トリプシンおよびリサルギナーゼと並行して、全細胞抽出物の2つの別々の消化に依存しています。トリプシンは、K残基とR残基のC末端側のペプチド結合を切断し、αアミン23からのN末端の正電荷に加えて、C末端に正電荷残基を示すペプチドを生成します。LysargiNase酵素は、ペプチジル-K結合および-R結合を選択的に加水分解し、N末端部位にKまたはRを有するペプチドを生成し、これにはK-メチル化形態が含まれる可能性がある。両方のプロテアーゼを使用すると、大規模なMS分析における全体的なプロテオームカバレッジが増加し、1回のトリプシン消化で最終的に見逃されるペプチドの同定につながります18。代わりに、二重酵素消化は、酵素切断の見逃しの数を減らすために行われます。実際、KおよびRのメチル化は、トリプシンによるタンパク質切断の効率を強く低下させる。この予防措置にもかかわらず、メチル化ペプチドはより長く、切断漏れを含むことが依然として一般的であり、CIDの断片化が不十分になります。
電子移動解離(ETD)などの別のタイプのフラグメンテーションを使用すると、この問題を解決できます。実際のところ、ETDは通常、CIDのように二重に荷電したペプチドイオンを効率的に断片化しませんが、より高い電荷状態のペプチド前駆体のかなり均一な切断を提供します(≥3)。これは、複数の隣接するR残基を含むアルギニンリッチドメインで頻繁に発生するため、R-メチル化の場合に利点となる可能性があります。ただし、ETDはCIDよりもスキャンレートが低いため、ペプチド同定の総数は減少します24,25,26。
最近、翻訳後修飾ペプチドの濃縮を伴ういくつかのプロトコルが、ペプチド混合物の複雑さを軽減するのに役立つさまざまなクロマトグラフィー分離戦略と組み合わされており、MSでの修飾ペプチド検出の全体的な効率が向上しています。ここでは、フラクションの非連続連結と結合したHpH−RPクロマトグラフィー分画が適用される。高pH逆相クロマトグラフィーに基づくオフラインペプチド分画は、LC-MS/MSラン27中に下流で実行されるオンライン低pHRP分離と直交する高分解能分離を示します。さらに、非連続連結戦略には2つの主な利点があります:第一に、ペプチド混合物の不均一性を維持しながら、初期、中期、および後期溶出画分を個々の連結画分にプールすることにより、タンパク質カバレッジを増加させます。第2に、連結は、より少ない数のサンプル画分28を取得することによって、後続のMS実行時分析を減少させる。
R-メチル化の化学量論的性質のため、修飾プロテオームのグローバルMS分析におけるメチルペプチドの検出を容易にするために、濃縮ステップが必要です。このプロトコルでは、抗SDMA抗体と抗ADMA抗体を並行して使用した免疫親和性沈殿(IAP)によってメチルペプチドが濃縮され、抗MMA抗体を使用したモノメチルペプチドの免疫沈降は、以前のIAP実験のFTで行われます。この順序は、これらの抗体の異なる効率を反映しています:抗SDMA抗体と抗ADMA抗体は、抗MMA抗体と比較して結合効率が低いです。注目すべきことに、この異なる効率はまた、実験的に注釈された修飾プロテオームにおける異なる程度のR-メチル化の表現に偏りを引き起こす可能性がある29。
抗汎-R-メチル化抗体が市販される前は、強陽イオン交換(SCX)や親水性相互作用(HILIC)クロマトグラフィーなど、MSによるR-メチル化ペプチドの検出を促進するために他の分離戦略が適用されていました。これらの技術は、MSで分析されるペプチド混合物の複雑さを軽減することができたにもかかわらず、メチルペプチドの同定を有意に改善しなかった30、31、32、33。
メチルペプチドの分離、検出、断片化、および配列アノテーションの増加を目的としたこれらすべての技術的および分析的ソリューションにもかかわらず、メチルプロテオームのカバレッジは依然として限られており、リボ核タンパク質、RNA結合ヘリカーゼなどのより豊富なメチル化タンパク質に偏っていますが、いくつかの既知の低存在量の修飾タンパク質(TP53BP1、CHTF8、MCM2など)は、複数のグローバル実験で偶然にのみ検出され、確実に検出されません34。.現在のワークフローの前に適用された細胞内分画は、そのようなタンパク質の検出を改善する可能性があります。ただし、現在必要な実験規模では、これが実行可能な代替手段にはなりません。
MSでは、生データはペプチドとPTMの同定のためにMaxQuantアルゴリズムを介して分析されます。しかし、hmSILAC実験からのデータの分析は、標準的な検索アルゴリズムでは簡単ではありません。例えば、MaxQuantは、同位体コード化されたKおよびRによる代謝標識に基づく標準的なSILAC実験を効率的に分析できますが、同位体標識が可変PTMにコードされている場合、重メチル化につながる重メチル標識の場合のように効率的に機能しません。したがって、ここで採用されている戦略は、最初にMaxQuantでhmSILACデータを解析し、組み込みのダブレット検索機能を使用せずに、軽いペプチドと重いペプチドを独立して識別できるようにすることです。次に、後処理ソフトウェアと照合されます。このバイオインフォマティクスワークフローには、MaxQuantの可変修飾パネルで重い形式と軽い形式の両方でメチル化を指定する必要があり、メチオニン酸化(重いものと軽いもの)も含まれると、合計8つの変数修飾が行われるため、独自の落とし穴もあります。MaxQuant/Andromedaなどのデータベース検索エンジンであまりにも多くのPTMを検索することは、アルゴリズムがテストしなければならない理論ペプチドの指数関数的増加につながるため、実用的ではありません:私たちの解決策は、(MaxQuantのパラメータグループ機能を使用して)可変PTMの異なるセットを使用して、各MS生データを2回分析することでした。ペプチド検索後、自社開発のツールhmSEEKERを使用して、MaxQuantによって生成された出力テーブルからの重軽ペプチドペアの割り当てをサポートします。hmSEEKERアルゴリズムの最初のリリースは最近公開されており13、hmSEEKERがFDR<1%のhmSILACダブレットを識別できることが示されました。偽陽性は、偶然にも質量差が4.02Daの倍数を持つピークのペアから発生する可能性がありますが、次の事実に照らして、一致または不一致に分類されるダブレットでは非常にありそうにありません:一致または不一致のダブレットが偽であるためには、アンドロメダは重いものと軽いものの両方のシーケンスを誤って決定する必要があります。検索エンジンがデフォルトのパラメータで実行されていると仮定すると、各識別の確率は1%の確率で正しくありません。したがって、hmSILACの対応物も正しくない確率は0.01%です。
hmSILACの落とし穴の1つは、骨格にメチオニンを含むペプチドも、メチルペプチドによって生成されるダブレットと区別がつかないダブレットを生成することです。それにもかかわらず、私たちの経験から、これは大きな問題を表すべきではありません、第一に、メチル化のないペプチドはMaxQuant出力から簡単に廃棄できるため、第二に、hmSEEKERは予想される質量差を計算するときにメチルペプチド中のメチオニン残基を自動的に考慮するためです。最後に、このリスクは、重い修飾と軽い修飾が別々のパラメータグループで検索されるため、検索エンジンが重いモノメチル化(+18.03 Da)を軽いモノメチル化と重いメチオニン(14.01 + 4.02 Da)に分割できないという事実によっても除外されます。
この問題に対するより正式で実験的な解決策は、イソメチオニンメチル-SILAC(iMethyl-SILAC)22という名前のhmSILACの変異体を開発したOreste Acutoと彼の共同研究者によって提案されました。この代替代謝標識プロトコルでは、自然光メチオニンは[13C 4]-メチオニンに置き換えられ、[13CD3]-メチオニン(Met-4)と同じ質量を持ちますが、分子タグ内の重同位体の分布が異なるため、安定な同位体コードメチル基を生成しません。したがって、iMethyl-SILAC実験では、未修飾のメチオニン含有ペプチドはダブレットを生成しません。ただし、AcutoらがiMethyl-SILACと従来のhmSILACの性能を比較したところ、2つの方法は依然として非常に類似したFDRを示したことに注意する必要があります。
hmSEEKERの考えられる制限は、MaxQuant出力テーブルで直接動作するように設計されているため、ソースコードが出力ファイルの構造が異なる他の検索エンジンと互換性がないことです。この意味で、MethylQuant35は、hmSILACタイプの実験からのMS生データの直接分析のために アドホック に調整され、提供される入力ファイルに関してより柔軟な、優れた代替バイオインフォマティクスツールを提供します。ユーザー定義の閾値に依存せずに真と偽のメチルペプチドH/Lダブレットを区別するために、機械学習モデルが開発中です。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
MMとEMは、欧州分子医学学校(SEMM)の博士課程の学生です。EMは、3年間のFIRC-AIRC奨学金(プロジェクトコード:22506)の受領者です。結核グループのR-メチルプロテオームのグローバル分析は、AIRC IGグラント(プロジェクトコード:21834)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
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