Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

الأجسام النانوية هي أدوات هامة في البيولوجيا الهيكلية وتشكل إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات. ومع ذلك ، فإن اختيار الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة يمكن أن يكون تحديا. هنا نظهر استخدام الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على علم الفيزيولوجيا الكهربية لتصنيف الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقلات الأغشية الكهربائية.

Abstract

وقد استخدمت الأجسام المضادة مجال واحد (الأجسام النانوية) على نطاق واسع في الدراسات الميكانيكية والهيكلية للبروتينات وأنها تشكل إمكانات هائلة كأدوات لتطوير العلاجات السريرية، وكثير منها يعتمد على تثبيط البروتينات الغشائية مثل الناقلين. ومع ذلك، فإن معظم الأساليب المستخدمة لتحديد تثبيط نشاط النقل يصعب تنفيذها في إجراءات عالية الإنتاجية وتعتمد على توافر الركائز المسماة وبالتالي تعقيد فحص مكتبات الأجسام النانوية الكبيرة. الغشاء المدعوم بصلابة (SSM) علم الفيزيولوجيا الكهربية هو وسيلة عالية الإنتاجية، وتستخدم لوصف الناقلين الكهربائي وقياس الحركية النقل وتثبيط. هنا نعرض تنفيذ الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لاختيار الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقل ثانوي كهربائي لحساب الثوابت المثبطة للأجسام النانوية. قد تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لاختيار الأجسام النانوية المثبطة التي تستهدف الناقلين والتي لا تتوفر لها ركائز تحمل علامة.

Introduction

تتكون الأجسام المضادة من سلسلتين ثقيلتين متطابقتين وسلاسل خفيفة مسؤولة عن ربط المستضد. Camelids والأجسام المضادة الثقيلة السلسلة فقط التي تظهر تقارب مماثلة لمضاد cognate مقارنة مع الأجسام المضادة التقليدية1،2. المجال المتغير واحد (VHH) من الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة فقط الاحتفاظ الكامل مستضد ملزمة المحتملة، وقد ثبت أن تكون مستقرة جدا1،2. وقد تم تنفيذ هذه الجزيئات VHH معزولة أو "الأجسام النانوية" في الدراسات المتعلقة البروتينات الغشاء الكيمياء الحيوية كأدوات لتثبيت الهيئات3،4، ومثبطات5،6، وعوامل تثبيت7، وكأدوات لتحديد هيكل8،9،10 . يمكن توليد الأجسام النانوية عن طريق تحصين camelids للتخصيب المسبق للخلايا B التي تشفر الأجسام النانوية الخاصة بالهدف والعزلة اللاحقة للخلايا B ، يليها استنساخ مكتبة الأجسام النانوية والاختيار عن طريق عرض phage11و12و13. ويستند وسيلة بديلة لتوليد الأجسام النانوية على أساليب اختيار في المختبر التي تعتمد على بناء المكتبات والاختيار عن طريق عرض phage، عرض الريبوسوم، أو عرض الخميرة14،15،16،17،18،19،20. تتطلب هذه الطرق في المختبر أحجام مكتبة كبيرة ولكنها تستفيد من تجنب تحصين الحيوانات وتفضل اختيار الأجسام النانوية التي تستهدف البروتينات ذات الاستقرار المنخفض نسبيا.

صغر حجم الأجسام النانوية، واستقرارها العالي وقابليتها للذوبان، وتقارب مستضد قوي، وانخفاض المناعة، وإنتاج سهل نسبيا، وجعلها مرشحة قوية لتطوير العلاجات21،22،23. على وجه الخصوص ، الأجسام النانوية التي تمنع نشاط بروتينات الأغشية المتعددة هي أصول محتملة للتطبيقات السريرية5،24،25،26. في حالة ناقلات الأغشية ، لتقييم ما إذا كان الجسم النانوي لديه نشاط مثبط ، من الضروري تطوير فحص يسمح بالكشف عن الركائز المنقولة و / أو الركائز المشتركة. وعادة ما تنطوي هذه المقايسات على جزيئات تحمل علامات أو تصميم أساليب كشف خاصة بالركيزة، والتي قد تفتقر إلى تطبيق عالمي. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد الأجسام النانوية المثبطة يتطلب عموما فحص أعداد كبيرة من الموثقات. وبالتالي، أسلوب يمكن استخدامه في وضع الإنتاجية العالية و التي لا تعتمد على الركائز المسماة ضروري لهذا التحديد.

الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM هي تقنية حساسة للغاية ، تم حلها زمنيا للغاية تسمح باكتشاف حركة الشحنات عبر الأغشية (على سبيل المثال ، ربط / نقل الأيونات)27،28. وقد تم تطبيق هذه التقنية لتوصيف الناقلين الكهربائي، والتي يصعب دراستها باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الأخرى بسبب الدوران المنخفض نسبيا لهذه البروتينات29و30و31و32و33و34و35. لا يتطلب علم الفيزيولوجيا الكهربية SSM استخدام الركائز المسماة ، بل هو مناسب لفحص عالي الإنتاجية ، ويمكن استخدام البروتيوليبوبوسومات أو الحويصلات الغشائية التي تحتوي على الناقل المثير للاهتمام. هنا، ونحن نثبت أن الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM يمكن استخدامها لتصنيف الأجسام النانوية الموجهة للنقل مع خصائص مثبطة وغير مثبطة. كدليل على المبدأ, ونحن نصف إعادة تشكيل ناقل الكولين البكتيرية في الليبوسومات, تليها خطوات مفصلة لشل حركة البروتيوليبوسومات على أجهزة الاستشعار SSM. ونحن بعد ذلك وصف كيفية أداء القياسات الكهربية القائمة على SSM للنقل الكولين وكيفية تحديد تركيز فعال نصف القصوى (EC50). ثم نعرض كيفية استخدام الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لفحص الأجسام النانوية المتعددة وتحديد مثبطات نقل الكولين. وأخيرا، فإننا نصف وصف كيفية تحديد تركيزات المثبطة نصف القصوى (IC50)من الأجسام النانوية المثبطة مختارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعادة تشكيل بروتين الغشاء

  1. مزيج 3 مل من الدهون القطبية الإشريكية القولونية مع 1 مل من فوسفاتيديلكولين في قارورة أسفل مستديرة تحت غطاء محرك السيارة التهوية.
  2. جفف خليط الدهون لمدة 20 دقيقة تحت الفراغ باستخدام المبخر الدوار وحمام مائي عند 37 درجة مئوية لإزالة الكلوروفورم. إذا لزم الأمر، تجف أكثر تحت النيتروجين أو غاز الأرجون.
  3. باستخدام مخزن TS المؤقت (20 مللي متر تريس-HCl pH 8.0، 150 mM NaCl) يحتوي على 2 mM β-mercaptoethanol، إعادة إنفاق الدهون إلى 25 ملغم/مل.
  4. Aliquot الدهون في 500 μL aliquots، تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  5. تذوب واحدة 500 ميكرولتر aliquot من الدهون وتمييع 1:1 باستخدام مخزن TS المؤقت الذي يحتوي على 2 mM β ميركابتوثانول.
  6. قذف تعليق الدهون 15 مرة باستخدام غشاء 400 نانومتر.
  7. تمييع تعليق الدهون ليكون تركيز الدهون النهائي من 4.4 ملغ / مل.
  8. إضافة ن-دودسيل-β-D-مالتوسايد (DDM) أن يكون تركيز النهائي من 0.2٪ وتركها تدور لمدة 1 ساعة في 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. أضف البروتين المنقى إلى الدهون باستخدام نسبة الدهون إلى البروتين بين 1:10 و 1:100 (ث:ث).
    ملاحظة: يجب تعديل النسبة اعتمادا على قوة الإشارة المكتشفة في قياسات الفيزيولوجيا الكهربية SSM لنقل الركيزة (انظر أدناه). للحصول على إشارات أكبر، استخدم نسب الدهون إلى البروتين الأصغر.
  10. احتضان الخليط الدورية في 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في RT.
  11. إضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الممتزة، وغسلها مسبقا في مخزن TS المؤقت.
    ملاحظة: إضافة حبات البوليسترين خطوة بخطوة.
  12. احتضان خليط الخرز والدهون لمدة 30 دقيقة في RT تحت التحريك البطيء.
  13. لإزالة الخرز، دع خليط الخرز والدهون يقف حتى تستقر الخرز. نقل الحل إلى أنبوب جديد وترك الخرز وراء. إضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الممتزة الطازجة إلى خليط الدهون المنفصلة.
  14. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية تحت اثارة بطيئة.
  15. فصل الخرز من الخليط كما هو موضح في الخطوة 1.13 وإضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الطازجة الممتزة.
  16. احتضان الخليط لمدة 16 ساعة في 4 درجة مئوية.
  17. فصل الخرز من الخليط كما هو موضح في الخطوة 13 وإضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الطازجة الممتزة.
  18. احتضان الخليط لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية لغسل الرابع والأخير.
  19. جهاز طرد مركزي عند 110,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  20. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من العازلة TS التي تحتوي على 2 mM β ميركابتوثانول.
  21. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى في 110،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  22. إعادة إنفاق بيليه إلى تركيز الدهون النهائي من 25 ملغم / مل في مخزن TS المؤقت مع 2 mM β ميركابتوثانول.
  23. تقدير تركيز البروتين باستخدام في هلام أو أميدو الأسود المقايسة36.
  24. Aliquot البروتيوليبوسومات، تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد رقاقة

  1. ملء رقاقة استشعار واحد مع 50-100 ميكرولتر من 0.5 mM 1-أوكتاديكانثيول الحل (resuspended في ايزوبروبانول).
  2. احتضان رقاقة مع الحل لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. إزالة محلول ثيول عن طريق النقر على رقاقة على الأنسجة.
  4. شطف جهاز الاستشعار 3 مرات مع 5 مل من ايزوبروبانول نقية.
  5. شطف جهاز الاستشعار 3 مرات مع 5 مل من الماء المقطر مزدوجة.
  6. جفف المستشعر عن طريق النقر على ورق نسيجي.
  7. تطبيق 1.5 ميكرولتر من 7.5 ميكروغرام / ميكرولتر 1،2-diphytanoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (الدهون المجففة في المبخر الدورية وإعادة الإنفاق في ن ديكان).
  8. بعد ذلك مباشرة، قم بتعبئة المستشعر ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SSM غير المنشط، والذي لا يحتوي على الركيزة. وهذا سيؤدي إلى تشكيل عفوية من طبقة SSM.
    ملاحظة: يجب تحسين المخزن المؤقت SSM مسبقا لتحديد الحالات المثلى التي تحتوي على ضوضاء خلفية منخفضة. يمكن استخدام المخزن المؤقت العام الذي يحتوي على 30 mM HEPES pH 7.4 و 5 mM MgCl2و 140 mM NaCl كنقطة بداية. يتم استخدام المخزن المؤقت SSM بدون الركيزة للغسيل قبل وبعد القياس (المخزن المؤقت غير المنشط). لتجنب عدم تطابق المخزن المؤقت، استخدم المخزن المؤقت غير المنشط لإعداد المخزن المؤقت الذي يحتوي على الركيزة (تنشيط المخزن المؤقت). يمكن إضافة الركيزة إما مباشرة كمسحوق أو بحجم صغير من مخزون عالي التركيز لتجنب التخفيف.
  9. تذوب البروتيوليبوسومات من الخطوة 1.24 في RT.
  10. تمييع البروتيوليبوسومات بين 1:5 و 1:100 (البروتيوليبوسومات: عازلة، (v:v)) في المخزن المؤقت SSM غير المنشط (هنا 1:20).
  11. سونيكاتي بروتيوليبوسومات لمدة 20-30 ق أو 3 مرات لمدة 10 ق، ووضع على الجليد بين سونيكيشن، إذا لزم الأمر. هنا تم استخدام sonicator حمام المياه في 45 كيلوهرتز.
  12. تطبيق 5-10 ميكرولتر من عينة البروتيوليبوسومات سونيكاتيد المخفف على سطح جهاز الاستشعار دون لمسها.
  13. طرد مركزي رقائق مع الحل في RT لمدة 30 دقيقة باستخدام سرعة بين 2000 و 3000 × ز.
    ملاحظة: استخدم أنابيب 50 مل مع قاع مسطح. ضع رقائق الاستشعار بعناية بشكل مستقيم باستخدام ملاقط. كما يمكن استخدام لوحات 6-well و الطرد المركزي مع حامل لوحة.
  14. استخدام رقائق الاستشعار في نفس اليوم.

3. قياس النقل المذاب: تحديد ظروف التشبع

ملاحظة: كدليل على المبدأ, تم تنفيذ هذه التجارب باستخدام ناقل الكولين البكتيرية إعادة تشكيلها في الليبوسومات التالية البروتوكول المذكور أعلاه. تظهر هنا عملية خطوة بخطوة لتحديد ظروف التشبع من الكولين الركيزة قبل قياس تثبيط بواسطة الأجسام النانوية.

  1. تحضير 1-2 L المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
    ملاحظة: تحضير واستخدام نفس المخزون المخزن المؤقت SSM لكافة المخازن المؤقتة التنشيط و غير تنشيط خلال كافة القياسات.
  2. خذ 10 أنابيب نظيفة ونقل 10 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى كل منها.
  3. إضافة الركيزة في الأنابيب من الخطوة 3.2 باستخدام سلسلة من التركيزات حول تركيز نصف الحد الأقصى المتوقع (هنا 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM من الكولين) لإعداد المخازن المؤقتة SSM تنشيط. استخدام مخزون تركيز عال لتجنب التخفيف.
  4. قم بتشغيل جهاز SSM.
  5. بدء تشغيل برنامج SSM والسماح للجهاز تهيئة تلقائيا. تعيين مسار الحفظ للبيانات وتأكيد عن طريق الضغط على زر موافق. حدد بروتوكول التنظيف الأولي القياسي في خيارات سير العمل وانقر فوق تشغيل.
  6. جبل رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم على المقبس، وتحريك الذراع لقفل رقاقة، وإغلاق رقاقة محمولة مع الغطاء.
  7. حدد CapCom البرنامج في سير العمل والسماح لها تشغيل لتحديد الموصلية والسعة. تأكد من أن الموصلية أقل من 5 nS والسعة بين 15 و 35 nF قبل استخدامه للقياس.
    ملاحظة: يوصى الشركة المصنعة بقيمة سعة 15-35 nF والتوصيلات أقل من 5 nS عند استخدام رقاقة 3 مم.
  8. نقل حلول التنشيط إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في العينات التحقيق.
  9. نقل العازلة عدم تفعيلها في خزان ووضعها بجانب حامل رقاقة في موقف الخزان على اليمين.
  10. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من غير تنشيط (B) ، تنشيط (A) وحلول (B) غير تنشيط (تسلسل B-A-B) و حلقة التي تقوم بإجراء ثلاثة قياسات و ينتقل إلى المخزن المؤقت تنشيط التالي لكافة المخازن المؤقتة 10 المعدة في الخطوة 3.3. استخدم معدل التدفق الافتراضي بمعدل 200 ميكرولتر/ثانية باستخدام 1 ثانية - 1 ثانية - 1 ثانية من أوقات التدفق لتسلسل B-A-B. انقر فوق تشغيل لبدء القياس.
    ملاحظة: تتكون التجربة النموذجية من التدفق التسلسلي للحلول غير المنشطة (B) والتنشيفعل (A) وحلول عدم التنشيط (B) (مكتوبة باسم B-A-B؛ انظر الشكل 1A). سيتم غسل البروتيوليبوسومات المشلولة على المستشعر بالحلول. لذلك ، يولد تبادل محلول B-A تدرج تركيز ركيزة ، مما يدفع تفاعل النقل الكهربائي.
  11. حفظ البروتوكول والسماح سير العمل تشغيل بالنقر على زر التشغيل. قم بإجراء نفس النوع من التجارب ولكن باستخدام الليبوسومات الخالية من البروتين. وهذا أمر بالغ الأهمية لأنه سيظهر كثافة التيارات الخلفية. وينبغي النظر في ذلك عند تحليل بيانات النقل الكهربائي المقيس بالبروتيوليبوبوسومات(الشكل 1C).
  12. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كنت تستخدم البرنامج، فاستخدم الدالة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت المنشط.
  13. رسم التيار الذروة ضد تركيز الركيزة لتحديد EC50 من الركيزة عن طريق الانحدار غير الخطي (الشكل 1B، C). اقرأ أدنى تركيز يصل فيه تيار الذروة إلى قيمة قصوى، وهذا التركيز يتوافق مع ظروف التشبع.
    ملاحظة: من المهم أن تعتبر أن عدد البروتيوليبوسومات التي تبقى معطلة يختلف من رقاقة إلى رقاقة. ويتجلى هذا الاختلاف لأن التيارات القصوى في ظروف قياس متطابقة سوف تظهر اتساعات مختلفة. لذلك ، من الضروري تطبيع السعة الحالية للقياسات التي يتم إجراؤها على كل رقاقة بشكل منفصل قبل مقارنة القياسات بين مستحضرات الرقائق المختلفة.

4. التصنيف التسلسلي للأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة

ملاحظة: يوضح هذا القسم كيفية قياس نقل الكولين في وجود أجسام نانوية ترتبط خصيصا بنقل الكولين البكتيري. أصغر التيارات الذروة في وجود الأجسام النانوية تشير إلى تثبيط النقل. لن تؤثر الأجسام النانوية غير المثبطة على نقل الركيزة ، أي عدم انخفاض إشارة ذروة التيار.

  1. إعداد 1-2 L من المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
  2. نقل 50 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). استخدم هذا لقياس عنصر تحكم موجب.
  3. نقل 10 مل من العازلة SSM غير المنشطة في أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 MM (شروط التشبع) وإضافة نانوبود إلى تركيز النهائي من 500 نانومتر.
  4. كرر الخطوة 4.3 لكل نانوبود لإعداد حلول التنشيط.
    ملاحظة: إذا تم إعادة إنفاق الأجسام النانوية المنقى في مخزن مؤقت مختلف عن المخزن المؤقت SSM، فإن إضافة الأجهزة إلى المخازن المؤقتة التنشيطية وغير المنشطة ستؤدي إلى عدم تطابق المخزن المؤقت. يجب تجنب عدم تطابق المخزن المؤقت لأنه يمكن أن يؤدي إلى ضوضاء عالية. تبادل المخزن المؤقت للأجسام النانوية المنقى مع المخزن المؤقت SSM يمكن أن يساعد على تجنب هذه المشكلة. وعلاوة على ذلك، ينصح باستخدام تركيزات الأجسام النانوية التي تسمح للوصول إلى ظروف التشبع. وبالنظر إلى أن الثوابت الملزمة للأجسام النانوية هي عموما أقل من 100 نانومتر، ينصح بتركيز جسم نانوي من 500 نانومتر لهذه التجربة. ومع ذلك، من المهم أن ما قبل الشاشة لتركيزات الأمثل.
  5. بدء تشغيل الجهاز SSM وقياس سعة والتوصيلية من رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.7.
  6. نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضع المخزن المؤقت في العينات التحقيق. نقل العازلة عدم تفعيل دون nanobody في خزان ووضعها في أخذ عينات التحقيق.
  7. نقل حلول التنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية في قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات التحقيق. نقل المخازن المؤقتة غير المنشطة التي تحتوي على أجسام نانوية إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات المسبار.
  8. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من الحلول غير المنشطة (B) وحلول التنشيط (A) وحلول عدم التنشيط (B-A-B).
  9. إنشاء حلقة التي تؤدي ما يلي: ثلاثة قياسات للتسلسل B-A-B باستخدام مخازن عازلة دون nanobody، قياسين من تسلسل B-A-B مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على متناهي الصغر، 120 ق تأخير الوقت لاحتضان مع nanobody، ثم 3 قياسات تسلسل B-A-B مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على نانوبودي.
  10. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله بالنقر فوق الزر تشغيل.
    ملاحظة: سيقوم سير العمل هذا بقياس الشروط الأولية للنقل دون تثبيط عن طريق تشغيل بروتوكول B-A-B 3 مرات باستخدام عدم التنشيط (B) وتفعيل المخازن المؤقتة (A) بدون الأجسام النانوية(الشكل 1B، C)، يليه قياس تأثير النانوبودي على النقل عن طريق تشغيل بروتوكول B-A-B 5 مرات مع المخازن المؤقتة غير المنشطة والتنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية(الشكل 2A ). النظام الثاني ربط الحركية تملي التفاعل بين الأجسام النانوية والبروتينات المستهدفة. لذلك ، من المهم استخدام تأخير الوقت في خطوة B-A من أجل إعطاء ما يكفي من الوقت للأجسام النانوية لربط الناقلين في البروتيوليبوسومات على الشريحة. تعتمد الأوقات المثلى على تركيز الأجسام النانوية أي، في تركيزات أقل يلزم أوقات أطول. ويلزم إجراء القياسين الأول والثاني لتكييف النظام مع الظروف الجديدة، وينبغي إجراء الشوط الثاني بعد تأخير قدره 120 ثانية. وينبغي استخدام القياسات الثلاثة التالية فقط لتحليل البيانات.
  11. إنشاء بروتوكول جديد لسير العمل باستخدام تسلسل من عدم تنشيط (ب) ، وتفعيل (أ) ، وعدم تنشيط (باء) حلول (تسلسل B - A - باء) وحلقة من 5 قياسات لغسل نانوبودي منضم عكس ذلك.
    ملاحظة: اختياريا، وتشمل خطوة حضانة للسماح فصل الأجسام النانوية مع الحركية بطيئة.
  12. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله بالنقر فوق الزر تشغيل.
  13. قارن آخر تيار ذروة للقياسات مع القياس الأولي للركيزة فقط في الخطوة 4.10. تم غسل الأجسام النانوية بنجاح وتم إعادة تأسيس الظروف الأولية إذا وصل تيار الذروة إلى القيمة الأولية ، أو كرر الخطوات 4.12-4.13 أو قم بالتغيير إلى رقاقة جديدة.
  14. كرر الخطوات 4.6-4.13 واستخدام رقائق الفردية لكل شاشة نانوبود(الشكل 2C)أو تكرار مع الهيئات النانوية متعددة باستخدام نفس الشريحة (الشكل 2D).
  15. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كان متوفرا، في البرنامج المستخدم، حدد تلقائيا وظيفة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت التنشيط.
  16. تطبيع التيار الذروة في وجود nanobody، استنادا إلى القياس الركيزة السابقة فقط. رسم التيارات الذروة في المدرج التكراري ومقارنة التيارات الذروة من القياسات الركيزة فقط إلى التيارات الذروة التي تقاس في وجود الأجسام النانوية (الشكل 2C، D) لتحديد الأجسام النانوية المثبطة.
    ملاحظة: يجب إجراء تطبيع التيارات الذروة المحددة لكل تشغيل فردي مع الأجسام النانوية بالنظر إلى ذروة التيار في غياب الأجسام النانوية من القياس السابق. أيضا، منذ عدد من البروتيوليبوسومات التي لا تزال معطلة تختلف من رقاقة إلى رقاقة، من المهم تطبيع السعة الحالية للقياسات التي أجريت على كل رقاقة على حدة قبل مقارنة القياسات بين الاستعدادات رقاقة مختلفة.

5. IC50 قياس مع الأجسام النانوية المثبطة

ملاحظة: بعد تحديد الأجسام النانوية المثبطة، فمن الممكن تحديد تركيزها المثبط نصف الأقصى (IC50). ويتم ذلك عن طريق قياس نقل الكولين بتركيز مستمر, في حين تركيزات متفاوتة من الأجسام النانوية المثبطة.

  1. تحضير 1-2 L المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
  2. نقل 50 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). استخدم هذا كحل تنشيط للتحكم الإيجابي.
  3. خذ 8 أنابيب نظيفة وأضف 5 مل من محلول عدم التنشيط إلى كل منها. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). إضافة نانوبودي المثبطة إلى أنابيب بتركيزات في نطاقIC 50 المتوقع (هنا 500 نانومتر - 1 نانومتر).
  4. خذ 8 أنابيب نظيفة وأضف 10 مل من محلول عدم التنشيط إلى كل منها. إضافة نانوبود مثبطة إلى كل أنبوب على حدة في نفس التركيز كما هو الحال في الخطوة 5.3. وهذا يتوافق مع المخزن المؤقت غير تنشيط.
    ملاحظة: هذا سوف تولد سلسلة من تنشيط و غير تنشيط أزواج العازلة بتركيزات مختلفة من نفس نانوبودي المثبطة.
  5. بدء الإعداد SSM وقياس سعة والتوصيلية من رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.7.
  6. نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضعه في العينات التحقيق. نقل العازلة عدم تفعيل دون nanobody في خزان ووضعها في موقف الخزان بجانب حامل رقاقة على اليمين.
  7. نقل حلول التنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية في قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات التحقيق. نقل المخازن المؤقتة غير المنشطة التي تحتوي على أجسام نانوية إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات المسبار.
  8. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من الحلول غير المنشطة (B) وحلول التنشيط (A) وحلول عدم التنشيط (B-A-B). وتشمل حلقة لقياس كل تركيز 2 مرات، واحتضان لمدة 120 ق وقياس 3 مرات أخرى. سيبدأ سير العمل بالتحكم الإيجابي في الركيزة فقط يليه أقل تركيز للأجسام النانوية. وسيتبع كل قياس للأجسام النانوية قياس لاحق للتحكم الإيجابي باستخدام الركيزة فقط لاستعادة سعة الذروة الأولية، قبل الانتقال إلى تركيز النانوبود الأعلى التالي.
    ملاحظة: الحركة من الدرجة الثانية تملي ربط الأجسام النانوية. لذلك، من المهم استخدام تأخير الوقت في الخطوة B-A. تعتمد الأوقات المثلى على تركيز الأجسام النانوية، أي أن هناك حاجة إلى تركيزات أقل مرات أطول؛ هنا 120 S تم استخدامها مع نتائج مرضية.
  9. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كنت تستخدم البرنامج، حدد دالة تقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت للتنشيط(الشكل 3A). رسم التيارات الذروة ضد تركيز نانوبود لتحديد IC50 عن طريق الانحدار غير الخطي(الشكل 3B).
    ملاحظة: تطبيع السعة الحالية للقياسات التي يتم إجراؤها لكل شريحة على حدة قبل مقارنة القياسات بين مستحضرات الرقائق المختلفة.

6. تنظيف أجهزة الاستشعار

  1. شطف رقائق استشعار واحد بعد استخدامها مع 10 مل من الماء المقطر.
  2. جفف الشريحة عن طريق النقر عليها على ورق نسيجي.
  3. ملء تجويف استشعار رقاقة مع 100 ميكرولتر من ايزوبروبانول نقية واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. وضع مسحة القطن في ايزوبروبانول نقية واحتضان لمدة 1-3 دقائق.
  5. استخدم مسحات القطن الجاهزة وتناوب بلطف على سطح المستشعر دون ضغط لإزالة المخلفات.
  6. شطف جهاز الاستشعار مع 5 مل من ايزوبروبانول نقية.
  7. شطف جهاز الاستشعار مع 10 مل من الماء المقطر.
  8. جفف المستشعر عن طريق النقر على الشريحة على نسيج.
  9. دع المستشعر يجف بين عشية وضحاها في RT، وخزنه في RT في ظل ظروف جافة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام أجهزة الاستشعار حتى 4-5 مرات عند تنظيفها وتخزينها بشكل صحيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت على نطاق واسع SSM القائمة على الفيزيولوجيا الكهربائية لتوصيف الناقلين الكهربائي. في البروتوكول المعروض هنا، نعرض كيفية استخدام الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لتصنيف الأجسام النانوية التي تستهدف ناقلا ثانويا (هنا سيمبورتر الكولين البكتيري) استنادا إلى خصائصها المثبطة وغير المثبطة. واحدة من أكثر الميزات المفيدة لهذه التقنية هو أنه يسمح لفحص الإنتاجية العالية من ظروف المخزن المؤقت متعددة. هذه الخاصية الخاصة مفيدة لتحليل مكتبات الأجسام النانوية ، والتي بعد اختيار الموثقات يمكن تشكيلها من بضعة إلى عشرات الأجسام النانوية. في تجربة قياسية ، يتم تجميع أحادي الدهون مستقرة على رقاقة استشعار. بعد تطبيق إعداد البروتيوليبوسومات التي تحتوي على الناقل الكولين, يتم إجراء فحص لموصلية جيدة والسعة لأن هذا أمر ضروري لنجاح التجربة. في حالة تعرض سلامة الغشاء للخطر أثناء التجربة ، والتي تتم ملاحظتها بسهولة بسبب التيارات الخلفية العالية للضوضاء ، يوصى بتغيير إلى رقاقة جديدة لأن استرداد ظروف الضوضاء المنخفضة أمر صعب إلى حد ما. بشكل عام ، لاحظنا استنساخ جيد جدا بين قياسات النقل والتثبيط بواسطة الأجسام النانوية عند استخدام رقائق مختلفة.

لاتخاذ قرار بشأن تركيز الركيزة لاستخدامها أثناء فحص الأجسام النانوية، تم قياس النقل الكهربائي لأول مرة تحت تركيزات ركيزة مختلفة لتحديد EC50 (الشكل 1B، C). تم اختيار تركيز الركيزة الذي يتوافق مع ظروف التشبع(الشكل 1C). ثم تم الاحتفاظ بتركيز الركيزة هذا ثابتا في جميع المخازن المؤقتة المنشطة. لهذا المثال بالذات, اخترنا 5 mM الكولين.

لفحص الأجسام النانوية ، يجب إضافة جسم النانو إلى كل من المخازن المؤقتة غير المنشطة والتنشيط. عندما أضيفت الأجسام النانوية إلى المخزن المؤقت المنشط فقط ، لم يكن من الممكن مراقبة تثبيط النقل الكهربائي. ونحن نتكهن بأن هذا يرجع إلى احتلال غير مكتمل لجميع المواقع الملزمة للأجسام النانوية في مجموعة الناقلين على الشريحة ، مما يكشف عن أهمية ما قبل الحضانة مع الأجسام النانوية في ظروف عدم التنشيط. ولضمان احتمال شغل جميع المواقع، أدرجت خطوة تأخير زمني أثناء تطبيق الخطوة العازلة الأولى غير المنشطة للسماح بتشبع مواقع ربط الأجسام النانوية على مجموعة الناقلين. وقد تم اختبار أوقات الحضانة التي تتراوح بين 2-60 دقيقة مع نتائج قابلة للاستنساخ. ضع في اعتبارك أن الأوقات المثلى للحضانة تعتمد على طبيعة الموثق النانوي وتركيزه أثناء التجربة (وكذلك تركيز الناقل في البروتيوليبوسومات على الشريحة). لذلك ، يوصى بتجربة أوقات حضانة مختلفة. على أي حال ، كقاعدة عامة ، كلما انخفض تركيز الجسم النانوي ، كلما طال وقت الحضانة المطلوب. اختبرنا أوقات الحضانة من 2 دقيقة و 20 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة للأجسام النانوية المختلفة ولكن لم نكتشف المزيد من تثبيط النقل.

يتم تصور تأثير الأجسام النانوية المثبطة على النقل الكهربائي من انخفاض سعة التيارات الذروة(الشكل 2A، C ، D). من ناحية أخرى، لا تؤثر الأجسام النانوية غير المثبطة على التيارات القصوى. بعد تشغيل بروتوكول الغسيل للسماح للأجسام النانوية غير ملزمة ، لوحظ انتعاش من 80 إلى 95 ٪ من ذروة السعة الحالية الأولية(الشكل 2A، C ، D). لقد قمنا بتجربة مماثلة ولكن في وجود الليبوسومات دون بروتين الناقل. عند تغيير من عدم تفعيل لتفعيل الظروف، لم يتم إدخال التيارات القطع الأثرية الهامة من قبل الأجسام النانوية الموجودة في هذه المخازن المؤقتة(الشكل 2B). يوصى بتشغيل تجربة التحكم هذه لأنه من المهم معرفة ما إذا كانت التغييرات في التيارات الذروة تنشأ من القطع الأثرية أم لا.

بعد اختيار الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة ، حددنا قيم IC50 للأجسام النانوية الفردية(الشكل 3A، B). لهذه التجربة بالذات ، يوصى بالبدء بتركيز منخفض من الأجسام النانوية ثم التحرك نحو تركيز عال أثناء الفحص. ثم تم حساب تثبيط لكل تركيز من خلال مقارنة التيارات الذروة التي تقاس قبل وبعد تطبيق الأجسام النانوية. لتجنب الربط غير المحدد للأجسام النانوية بالأسطح ، والتي يمكن أن تكون إشكالية بشكل خاص عند استخدام تركيزات الأجسام النانوية المنخفضة ، ينصح باتباع بروتوكول مماثل لتلك التي وصفها Kermani وآخرون37، حيث تمت إضافة 50 ميكروغرام / مل من ألبوم مصل البقر إلى المخازن المؤقتة ، ومنع هذا التأثير الضار. إضافة المنظفات مثل توين أو تريتون لهذا الغرض ينبغي تجنبها لأن هذه من شأنها أن تذوب الأغشية الدهنية.

Figure 1
الشكل 1: الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM. (أ) بروتوكول لقياس التيارات العابرة. يتم استبدال حل عدم التنشيط بحل تنشيط يتبعه تدفق حل غير نشط لاستعادة الظروف الأولية. خلال الخطوة الأولى ، ترتبط الأجسام النانوية بالناقل. عند التبديل إلى حل التنشيط، يدفع تدرج الركيزة النقل الكهربائي (منحنى برتقالي). في وجود أجسام نانوية مثبطة ، يظهر تيار الذروة سعة أصغر (منحنى أزرق). بعد الانتهاء من البروتوكول وتشغيل الحلول دون nanobody (غسل) ، يحدث فك ربط الأجسام النانوية. في التخطيطي، يتم شل حركة البروتيوليبوبوسومات ذات البروتين المعاد تشكيله (الأزرق) على مستشعر SSM. تمثل المثلثات والدوائر الحمراء أجساما نانوية وركيزة، على التوالي. (ب) نقل الكولين الكهربائي في غياب الأجسام النانوية. تظهر تيارات الذروة التي تقاس أثناء ظروف التنشيط لتركيزات الركيزة المختلفة. (ج)قياس تمثيلي للتيارات أثناء ظروف التنشيط في غياب بروتين الناقل بتركيزات ركيزة مختلفة. (د) مؤامرة من تركيز الركيزة مقابل ذروة التيارات السعة. وكان تحديد EC50 95 ± 11 ميكرومتر الكولين. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n= 3 نسخ بيولوجية متماثلة، n=3 نسخ متماثلة تقنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:فحص وتصنيف الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة. (أ) نقل الكولين الكهربائي في وجود جسم نانوي. تظهر التيارات الذروة التي تقاس أثناء ظروف التنشيط في غياب الأجسام النانوية (الأزرق) ، في وجود أجسام نانوية مثبطة (حمراء) ، وبعد عدم ربط الأجسام النانوية (الخضراء). (ب)قياس التيارات أثناء تنشيط الظروف في غياب بروتين الناقل. تظهر الآثار تسجيلات في غياب الأجسام النانوية (الزرقاء) ، في وجود أجسام نانوية مثبطة (خضراء) ، وفي وجود أجسام نانوية غير مثبطة (حمراء). (C, D). تظهر المدرجات التكرارية ذروة التيارات التي تقاس أثناء تنشيط الظروف في وجود أجسام نانوية وبعد فك الأجسام النانوية (الانتعاش). تظهر اللوحة C نتائج القياسات باستخدام رقائق فردية لكل نانوبود. تعرض اللوحة D النتائج من قياس تسلسلي باستخدام شريحة واحدة. ويشار إلى الأجسام النانوية كما Nb. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري (ن = 3 النسخ المتماثلة البيولوجية، n = 2 النسخ المتماثلة التقنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد IC50 من الأجسام النانوية المثبطة. (أ) نقل الكولين الكهربائي وتثبيط بواسطة الأجسام النانوية. تظهر تيارات الذروة التي تقاس أثناء ظروف التنشيط لتركيزات الأجسام النانوية المختلفة. (ب) مؤامرة من ذروة التيارات السعة مقابل تركيز نانوبود من قياس تسلسلي مع nanobody المثبطة. تم تحديد IC50 18 ± 2 nM. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n= 3 نسخ بيولوجية متماثلة، n=3 نسخ متماثلة تقنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتصنف التقنية المعروضة هنا الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف الناقلين الكهربائيين. تقييم النقل الركيزة ممكن بسبب الكشف عن حركة الشحنات من خلال الناقل جزءا لا يتجزأ من غشاء البروتيوليبوسومات. بعض الخطوات الحاسمة أثناء إعداد تجربة هي إعادة تشكيل البروتين النشط في الليبوسومات ، وإعداد طبقات أحادية مستقرة على رقائق SSM ، واستعادة الظروف الأولية بعد تطبيق بروتوكول الغسيل لإزالة جزيئات الأجسام النانوية المقيدة. بمجرد إعادة تشكيل بروتين الغشاء بنسبة الدهون إلى البروتين المناسبة ، يمكن إنشاء بروتوكول SSM عام باستخدام الركيزة الأصلية. من الأهمية بمكان إجراء تجارب التحكم باستخدام الليبوسومات الخالية من البروتين للكشف عن تيارات الضوضاء التي تحتاج إلى طرحها من التيارات التي تقاس باستخدام البروتيوليبوسومات. ومع ذلك، إذا كانت تيارات الضوضاء كبيرة جدا، نوصي بتجربة إعادة تشكيل البروتين باستخدام الدهون المختلفة، أو شاشة للظروف العازلة التي تقلل من هذه الإشارات الضارة. بعد النجاح في تهيئة الظروف لإجراء فحص SSM ، يمكن إجراء فحص الأجسام النانوية. وهناك خيار مفيد جدا التي قد تساعد في فحص أسرع من الأجسام النانوية هو إجراء عمليات الفحص عالية الإنتاجية باستخدام رقاقة استشعار SSM واحد. وهذا يقلل من وقت التلاعب من رقائق والمخازن المؤقتة ويقلل من التكاليف. ومع ذلك ، لأنه خلال هذا النوع من الأجسام النانوية المتعددة يتم تطبيقها بشكل متسلسل ، من المهم التأكد من أنه يمكن غسل الأجسام النانوية التطبيقية بعد القياس. قد تحتاج دورة غسيل صارمة إلى تنفيذها لفك ربط بعض الأجسام النانوية في حالة اكتشاف السعة الحالية المنخفضة في حالة عدم وجود جسم نانوي. نوصي باستخدام شروط الغسيل الموضحة هنا كنقطة انطلاق. إذا لم تساعد زيادة حجم الغسيل أو عدد الدورات ، فستحتاج الرقائق الفردية إلى استخدامها لفحص كل نانوبود بشكل منفصل. وفي جميع الحالات التي تم فحصها هنا، كان ربط الأجسام النانوية قابلا للعكس ويمكن تطبيق بروتوكول عالي الإنتاجية. في الإعداد التجريبي لدينا، لم نتمكن من استرداد السعة الكاملة للتيار الذروة الأولية بعد القياسات مع الأجسام النانوية (الشكل 1A؛ الشكل 2C، D. ومع ذلك، في معظم الحالات، تراوح حجم التيارات الذروة المستردة بين 80 و 95٪ من السعة التي تم قياسها قبل تطبيق الأجسام النانوية(الشكل 2C، D). ونحن نتكهن بأن هذا يمكن أن يكون نتيجة لغسل جزء صغير من البروتيوليبوبوسومات انضمت إلى رقاقة، أو بسبب الحركية بطيئة من unbinding من بعض الأجسام النانوية المثبطة، أو مزيج من كليهما. وفي كلتا الحالتين، لا يزال من الممكن مواصلة قياس المزيد من الأجسام النانوية لأن النقل الكهربائي قابل للقياس. يظهر هذا في الشكل 2D، حيث قمنا بفحص ستة أجسام نانوية باستخدام إعداد رقاقة واحدة.

الخاصية عالية الإنتاجية هي واحدة من أهم التطورات في الطريقة المعروضة. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من النهج الأخرى، تسمح هذه الطريقة باختيار الأجسام النانوية المثبطة التي تستهدف الناقلات الكهربائية التي لا تتوفر لها ركائز تحمل علامات. يمكن أن يساعد التحديد السريع للأجسام النانوية المثبطة في تسريع البحث الذي يهدف إلى تحديد التطبيقات الجديدة للأجسام النانوية كعقاقير. مزاياها الواضحة مقارنة بعلاجات مماثلة مثل علاجات الأجسام المضادة عديدة ، بدءا من حجم أصغر مما يساعدها على الانتشار بشكل أكبر في الأنسجة أو الخلايا ، إلى تكاليف إنتاجها المنخفضة والاستقرار العالي.

وقد استخدمت SSM القائم على الكهربية في الماضي لتوصيف الناقلين الكهربائي في الحويصلات غشاء29،38. هذه الأنواع من التجارب مفيدة لأنها لا تعتمد على بروتوكولات تنقية البروتين وإعادة تشكيله. ونحن نتكهن بأن أداء اختيار الأجسام النانوية المثبطة باستخدام الحويصلات الغشاء أمر ممكن. وهذا من شأنه أن يساعد على خفض التكاليف وتجنب التلاعب بالبروتينات النقية.

الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM هي تقنية قوية لفحص مثبطات الأجسام النانوية من بروتينات الأغشية المتعددة التي تظهر النقل الكهربائي. ونحن نتصور أن الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM سوف تصبح أداة هامة لاختيار الأجسام النانوية المثبطة وغيرها من الأجسام المضادة مع التطبيقات السريرية المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر سيدريك أ. ج. هوتر وماركوس أ. سيغر من معهد علم الأحياء المجهرية الطبية في جامعة زيوريخ، وغونزالو سيبريرو من Biozentrum من جامعة بازل للتعاون في توليد الأجسام النانوية الاصطناعية (الأجسام). نشكر ماريا بارتمز وأندريه بازون من شركة نانيون تكنولوجيز على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (PP00P3_170607 ومبادرة منحة البحوث التي قدمتها مؤسسة نانيون إلى مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 171، ناقل الأغشية، بروتينات الأغشية، الأغشية الصلبة المدعومة بالفيزيولوجيا الكهربية، الأجسام النانوية، الأجسام النانوية المثبطة، اختيار الأجسام النانوية
اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter