Summary
В данной рукописи описывается внутрипузырное введение уропатогенных бактерий с помощью люкс-оперона для индуцирования инфекции мочевыводящих путей у мышей и последующий продольный in vivo анализ бактериальной нагрузки с использованием биолюминесцентной визуализации.
Abstract
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к числу наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей и обычно лечатся эмпирическими антибиотиками. Однако из-за повышения микробной резистентности эффективность наиболее часто используемых антибиотиков снизилась. Чтобы найти альтернативные варианты лечения, существует большая потребность в лучшем понимании патогенеза ИМП и механизмов, определяющих восприимчивость к ИМП. Чтобы исследовать это на животной модели, необходим воспроизводимый, неинвазивный анализ для изучения течения ИМП.
В течение многих лет золотым стандартом для перечисления бактериальной нагрузки было определение колониеобразующих единиц (КОЕ) для конкретного объема образца. Этот метод требует посмертных гомогенатов органов и последовательных разбавлений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. В качестве альтернативы набирает популярность биолюминесцентная визуализация (BLI) для определения бактериальной нагрузки. Маркировка патогенов с помощью люкс-оперона позволяет осуществлять чувствительное обнаружение и количественную оценку неинвазивным способом, тем самым обеспечивая продольное наблюдение. До сих пор принятие BLI в исследованиях ИМП остается ограниченным.
Эта рукопись описывает практическую реализацию BLI в мышиной модели инфекции мочевыводящих путей. Здесь приведено пошаговое руководство по культивированию бактерий, внутрипузырной инстилляции и визуализации. Исследуется корреляция in vivo с КОЕ и обеспечивается доказательство концепции путем сравнения бактериальной нагрузки необработанных инфицированных животных с животными, обработанными антибиотиками. Кроме того, обсуждаются преимущества, ограничения и соображения, характерные для реализации BLI в модели in vivo UTI. Внедрение BLI в области исследований ИМП значительно облегчит исследования патогенеза ИМП и открытие новых способов профилактики и лечения ИМП.
Introduction
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей. Почти половина всех женщин будут испытывать симптоматическую ИМП в течение своей жизни1. Инфекции, ограниченные мочевым пузырем, могут привести к мочевым симптомам, таким как увеличение частоты мочеиспускания, срочность, гематурия, недержание мочи и боль. Когда инфекция поднимается в верхние мочевые пути, у пациентов развивается пиелонефрит, с недомоганием, лихорадкой, ознобом и болями в спине. Кроме того, до 20% пациентов с ИМП страдают от рецидивирующих инфекций, что приводит к резкому снижению чувствительности к антибиотикам2,3,4. В последние годы наблюдается растущий интерес к новым методам лечения и профилактики рецидивирующих ИМП. Несмотря на лучшее понимание врожденного и адаптивного иммунитета нижних мочевых путей и факторов бактериальной вирулентности, необходимых для инвазии и колонизации, никаких радикальных изменений в режиме лечения не было переведено в ежедневную урологическую практику2. Для изучения патогенеза ИМП и восприимчивости in vivoнеобходим воспроизводимый и неинвазивный анализ.
Было описано несколько моделей ИМП на животных, начиная от нематод и заканчивая приматами, но мышиная модель преимущественно используется5,6. Эта модель состоит из трансуретральной катетеризации (самок) мышей и последующей инстилляции бактериальной суспензии, чаще всего уропатогенной кишечной палочки (УПЭК), непосредственно в просвет мочевого пузыря7. После инокуляции бактериальная нагрузка традиционно количественно определяется путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот метод требует жертвоприношения животных для получения посмертных гомогенатов органов и последовательных разведений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. Кроме того, продольное наблюдение за бактериальной нагрузкой у отдельных животных невозможно с использованием этой методики.
В 1995 году Contag etal. предложили использовать биолюминесцентно-меченые патогены для мониторинга процессов заболевания у живых животных8,9. С тех пор биолюминесцентная визуализация (BLI) была применена к многочисленным моделям инфекций, таким как менингит, эндокардит, остеомиелит, инфекции кожи и мягких тканей и т. Д.10,11,12. В мышиной модели ИМП может быть использован штамм УПЭК с полным люкс-опероном (luxCDABE)от Photorhabdus luminescens 13. Ферментативная реакция катализируется бактериальной люциферазой, которая зависит от окисления длинноцепочечных альдегидов, реагирующих с восстановленным мононуклеотидом флавина в присутствии кислорода, в результате чего образуется окисленный флавин, длинноцепочечная жирная кислота и свет12. Люкс оперон кодирует люциферазу и другие ферменты, необходимые для синтеза субстратов. Поэтому все метаболически активные бактерии будут непрерывно излучать сине-зеленый (490 нм) свет без необходимости введения экзогенного субстрата12. Фотоны, испускаемые бактериями сметками люкс, могут быть захвачены с помощью высокочувствительных камер с охлаждаемой связью с зарядом (CCD).
Использование биолюминесцентных бактерий в модели ИМП позволяет проводить продольную, неинвазивную количественную оценку бактериальной нагрузки, исключая необходимость жертвоприношения животных в фиксированные моменты времени во время последующего наблюдения за определением КОЕ. Несмотря на широкий спектр возможностей, аккумулирующих доказательств надежности данной методики МПЖ в других областях и ее преимущества перед классическими моделями ИМП, она не получила широкого применения в исследованиях ИМП. Протокол, представленный здесь, предоставляет подробное пошаговое руководство и подчеркивает преимущества BLI для всех будущих исследований ИМП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Совета Сообщества Европейского Союза и были одобрены Комитетом по этике животных KU Leuven (P158/2018).
1. Культивирование бактерий (адаптировано из7,13,14)
- Подготовка
- Выберите люминесцентный штамм UPEC, который наилучшим образом соответствует экспериментальным потребностям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был выбран клинический изолят цистита, UTI89(E. coli),из-за его уропатогенной способности как у людей, так и у грызунов, и его общего использования в мышиных моделях ИМП5,7,15. Биолюминесцентный изогенный штамм, несущий полный люкс-оперон (luxCDABE),далее упоминается как UTI89-lux. Этот оперон также несет гены устойчивости к сульфату канамицина (Km). Поэтому Км можно использовать для отбора биолюминесцентных колоний13. - Сделайте корреляционную кривую для КОЕ и оптической плотности в 600 нанометров (OD 600 нм) для выбранного бактериального штамма7.
- Для этого культивируют бактерии (используя приведенный ниже протокол) и делают 8 различных разведений в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Измерьте OD при 600 нм для всех этих разбавлений и нанесите их на пластины Luria-Bertani (LB), чтобы определить КОЕ.
- График значений OD 600 нм и значений КОЕ для определения корреляции и получения стандартной кривой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для будущих экспериментов измерьте OD при 600 нм и используйте эту стандартную кривую, чтобы получить мгновенную оценку КОЕ в бактериальном растворе.
ВНИМАНИЕ: УПЭК являются патогенными бактериями, обеспечивают надлежащее оснащение помещений и используют средства индивидуальной защиты.
- Выберите люминесцентный штамм UPEC, который наилучшим образом соответствует экспериментальным потребностям.
- За три дня до закапывания
- Получают одиночные колонии, вытирая запасы глицерина бактерий с помощью петли прививки на пластинах LB, дополненных 50 мкг/мл км, и культивируют в течение ночи при 37 °C. Запечатайте эти пластины парафиновой пленкой для хранения при 4 °C до 1 недели.
- За два дня до закапывания
- Наполните стерильную 14 мл полистирольной трубки круглого дна двухпозиционными защелками с 5 мл бульона LB, дополненного 50 мкг / мл км. Выберите одну бактериальную колонию с помощью петли инокуляции и добавьте ее в бульон LB. Вихрь в течение 10 с для обеспечения правильного перемешивания.
- Процедить статически с защелкой в открытом положении при 37 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статический рост кишечной палочки способствует экспрессии 1-пили типа, которые имеют решающее значение для прилипания и инвазии эпителиальных клеток мочевыводящих путей. - Приготовьте стерильный эрленмейер или колбу для культивирования.
- За день до инстилляции
- После инкубации вращайте трубку в течение 10 с, чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию бактериальной культуры. Сделайте субкультуру в Эрленмейере, добавив 25 мкл бактериальной суспензии к 25 мл свежей среды LB без антибиотиков.
- Закройте эрленмейер и процедите статически при температуре 37 °C в течение ночи.
- В день инстилляции
- Вихрь Эрленмейера в течение 10 с для обеспечения правильного перемешивания.
- Перелейте культуру из Эрленмейера в культуральную трубку 50 мл и центрифугу при 3000 х г и 4 °C в течение 5 мин. Декантировать супернатант и повторно суспендировать бактериальную гранулу в 10 мл стерильного PBS и снова вихрь в течение 10 с.
- Выберите экспериментальную концентрацию инокулята (КОЕ) и используйте стандартную кривую, полученную на шаге 1.1.2, для определения соответствующего OD 600 нм.
- Добавьте 1 мл повторно суспендированной бактериальной культуры в 9 мл стерильного PBS и проверьте OD на 600 нм. Далее корректируют, добавляя либо стерильный PBS, либо концентрированный бактериальный раствор, пока желаемый OD 600 нм не будет достигнут7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для UTI89-lux отрегулируйте культуру, добавив PBS до тех пор, пока OD 600 нм не достигнет 0,45, что соответствует 2 x 107 КОЕ/50 мкл. Чтобы проверить количество жизнеспособных КОЕ, сделайте 10-кратное последовательное разведение и пластину 50 мкл пятого и шестого 10-кратного разведения на пластинах LB в трех экземплярах для получения менее 300 колоний. Подсчитайте полученные колонии на следующий день после ночной инкубации при 37 °C. OD 600 нм дает мгновенное считывание, но используйте КОЕ в качестве контроля качества.
2. Прививка животных (адаптирована из7,16)
- Подготовка животных
- Выберите желаемый штамм (штаммы) мыши в зависимости от исследовательского вопроса и наличия нокаут-линий, экспериментальных деталей и различий в восприимчивости к ИМП5,17. Имейте в виду, что трансуретральная катетеризация легче у самок мышей. Не используйте животных моложе 8 недель, так как они иммунологически незрелые. Здесь использовались 12-недельные самки мышей C57Bl/6J.
- Заказывайте животных заранее и дайте им акклиматизироваться, в идеале в течение 7 дней. Группируйте домашних животных в индивидуально вентилируемых клетках, в стандартных 12-часовых условиях света/темноты.
- Побрейте брюшную область животных, чтобы ограничить потерю сигнала. Не используйте крем для удаления волос, так как он может быстро обжечь кожу животных. Удерживайте животное, крепко держа неряшливо и задние конечности недоминирующей рукой, в то время как бритье доминирующей рукой. В качестве альтернативы, бриться под изофлурановой анестезией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные были выбриты за 2 дня до визуализации, учитывая, что животные будут ухаживать за бритой областью еще дальше. - Обеспечьте воду и стандартную пищу ad libitum на протяжении всего эксперимента. Однако лишайте животных воды за 2 ч до закапывания, чтобы минимизировать объем мочевого пузыря во время закапывания.
- Установите стерильный наконечник ангиокатетера 24 Г на шприц объемом 100 мкл и заполните шприц бактериальным раствором, приготовленным на этапе 1.5.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить люминесценцию фона, получите базовое изображение до инстилляции (см. шаг 3 ниже).
- Закапывание животных
- Поместите животных в индукционную камеру и обезболите их с помощью вдыхания изофлурана с чистым кислородом в качестве газа-носителя (индукция на 3% и поддержание на 1,5%).
- Поместите одно животное на рабочую поверхность в лежачем положении и поддерживайте стабильную изофлурановую анестезию с помощью носового конуса во время закапывания. Нанесите глазную мазь.
- Изгоняют остаточную мочу, применяя мягкое сжатие и совершая круговые движения по надлобковой области. Очистите нижнюю часть живота 70% этанолом перед закапыванием.
- Смажьте кончик катетера обычным физиологическим раствором. Положите указательный палец недоминирующей руки на живот и осторожно протолкните его вверх. Начните катетеризацию уретры под углом 90° (по вертикали) и, как только сопротивление встретится, наклоните его горизонтально, прежде чем вставлять его дальше (0,5 см).
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не нажимайте с силой на катетер, так как это нанесет вред мочеиспускательному каналу. Мягкие поворотные движения могут быть полезны при установке катетера. С другой стороны, отсутствие сопротивления обычно указывает на ошибочное введение во влагалище. - Выполняют медленную (5 мкл/с) закапывание 50 мкл бактериальной инокуляции (2 х 107 КОЕ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие объемы или более быстрая инстилляция могут вызвать рефлюкс в почках. Во время практики техники синие чернила могут быть использованы для оценки рефлюкса. - После закапывания держите шприц и катетер на месте еще несколько секунд, а затем медленно втягивайте, чтобы предотвратить утечку. Запишите любые нарушения, такие как большое количество утечки или кровавый мяс, и исключите животных, если это необходимо.
- Поместите животное в положение лежа на спине у носового конуса камеры визуализации и повторите предыдущие шаги 2.1.1-2.1.6 для всех остальных животных. Используйте один катетер на экспериментальную группу. Обеспечьте продолжение анестезии и сведите к минимуму время между первым и последним животным.
- При необходимости вводят антибиотики или экспериментальные препараты до или после визуализации (этап 3). Например, для введения энрофлоксацина добавляют 40 мкл раствора энрофлоксацина (100 мг/мл) к 3,96 мл физиологического раствора для получения 1/100 разведения. Вводят 100 мкл /10 г подкожно в 9 утра и 5 вечера для введения 10 мг / кг энрофлоксацина два раза в день в течение 3 дней.
3. Биолюминесцентная визуализация
- Подготовка и подбор параметров визуализации
- Откройте программное обеспечение для сбора BLI (см. Таблицу материалов)и нажмите «Инициализировать» в устройстве обработки изображений (см. Таблицу материалов), чтобыпротестировать систему контроллера камеры и сцены и охладить ПЗС-камеру до -90 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса дверь запирается, и за ходом инициализации можно следить на панели управления. Зеленый свет указывает на то, что достигнута температура -90 °C. Предупреждение появится, если перед завершением инициализации будет предпринята попытка создания образа. - Убедитесь, что данные сохраняются автоматически: нажмите на получение Автосохранение и выберите правильную папку.
- Выберите Люминесценция и Фотография. Проверьте настройки люминесценции по умолчанию: Установите фильтр возбуждения в положение Блокировать, а для фильтра излучения — значение Открыть.
- Установите время экспозиции на Авто при съемке первого изображения, особенно при ожидании тусклого сигнала, чтобы обеспечить достаточное количество фотонов. Для измерений in vivo и ярких сигналов установите время экспозиции равным ~30 с. Если изображение насыщено, появится предупреждение. Если это произошло, сократите время воздействия.
- Выберите средний Binning, F/stop 1 и выберите правильное поле зрения(FOV)(D для 5 животных).
- Установите высоту объекта на 1 см при визуализации мышей.
- Нажмите кнопку Добавить три раза в панели управления приобретением, чтобы получить последовательность из трех изображений в качестве технических реплик.
- Откройте программное обеспечение для сбора BLI (см. Таблицу материалов)и нажмите «Инициализировать» в устройстве обработки изображений (см. Таблицу материалов), чтобыпротестировать систему контроллера камеры и сцены и охладить ПЗС-камеру до -90 °C.
- Отображение
- Поместите мышей в камеру визуализации в лежачем положении и используйте многообразный носовой конус для поддержания анестезии (изофлуран 1,5%) на протяжении всего эксперимента. Визуализируйте до 5 мышей одновременно и разделяйте животных, используя световую перегородку, чтобы предотвратить отражение.
- Закройте дверь и нажмите «Получить», чтобы начать последовательность изображений.
- Заполните подробную информацию об эксперименте (дикий тип и нокаутирующие животные, лечение, день визуализации и т.д.). Параметры изображения, такие как время экспозиции, сохраняются автоматически.
- Извлеките мышей из камеры визуализации и верните их в клетку. Проверьте полное восстановление после анестезии. В течение нескольких минут животные должны быть полностью бодрствующими и исследовательскими. Не проводите обезболивание, так как это может помешать течению ИМП18.
- Верните клетки в вентилируемые стойки до следующего цикла визуализации. После завершения эксперимента усыпляют животных асфиксиейСО2 или вывихом шейки матки. Сделайте это до восстановления изофлурановой анестезии, чтобы свести к минимуму дистресс.
- Анализ изображений
- Запустите программное обеспечение для создания образов и загрузите экспериментальный файл, нажав кнопку Обзор.
- Используйте инструментальную палитру для настройки цветовой шкалы изображения. Стандартизируйте визуальный аспект результатов, используя одинаковые настройки для всех изображений, т. е. используйте логарифмическую шкалу с минимумом от10 4 до максимум 107 фотонов. Эти корректировки не влияют на необработанные данные, а только на графическое представление.
- Используйте инструменты ROI, чтобы нарисовать интересующую область (ROI) на изображении. Убедитесь, что рентабельность инвестиций достаточно велика, чтобы покрыть всю область, и используйте одинаковые размеры для всех изображений. Здесь квадратная ROI размером 3,5 см х 4,5 см была помещена над нижней частью живота.
- Нажмите на измерение ROI, чтобы количественно оценить интенсивность света (количество или общий поток фотонов). Экспортируйте эти данные и используйте среднее значение технических реплик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчики представляют собой количество фотонов, обнаруженных камерой, и должны использоваться только для контроля качества изображения. Для передачи данных используйте общий поток фотонов. Общий поток фотонов более физиологически значим, поскольку он представляет собой свет, излучаемый поверхностью, и представляет собой калиброванную единицу, которая корректируется на время экспозиции (в секунду).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo BLI коррелирует с КОЕ инокулята в момент инстилляции.
Чтобы оценить предел обнаружения BLI in vivo и корреляцию с КОЕ инокулята, мышей заражали различными концентрациями UTI89-lux и PBS в качестве отрицательного контроля. Перед инстилляцией неинфицированных животных сканировали для определения фоновой люминесценции. Последующие изображения были получены сразу после инстилляции(рисунок 1А). После инстилляции UTI89-lux биолюминесценция была надежно обнаружена выше 2 х10 4 КОЕ и была установлена линейная корреляция между КОЕ инокуляции и биолюминесценцией(рисунок 1В). Напротив, общий поток фотонов был сопоставим с фоновыми сигналами для животных, получавших PBS, и при самой низкой бактериальной концентрации 2 x 103 КОЕ.
BLI как средство для продольного наблюдения во время лечения
Чтобы определить, может ли быть продемонстрирован лечебный эффект валидированного лечения антибиотиками с использованием продольного МПЖ, 20 животных были инфицированы инокулятом 2 х10 7 КОЕ /50 мКЛ, и 10 из этих животных лечились энрофлоксацином 10 мг / кг подкожно два раза в день в течение первых 3 дней после заражения. Как естественная эволюция в инфицированной, но нелеченной контрольной группе, так и влияние лечения антибиотиками на кинетику инфекции в группе, получавшей лечение, могут быть детально визуализированы(рисунок 2). Немедленное снижение бактериальной нагрузки, измеренное общим потоком фотонов, наблюдалось после первой дозы энрофлоксацина. Ни у одного из обработанных животных не было последующего повышения бактериальной нагрузки. Вариабельность между субъектами в инфицированной, но необработанной контрольной группе была выше, а снижение бактериальной нагрузки было медленнее. На 10-й день 8 из 10 животных контрольной группы вернулись к сигналу БЛИ, сопоставимому с их прединстилляционным фоном. Общая бактериальная нагрузка для каждого животного была рассчитана с использованием площади под кривой (AUC) логарифмически преобразованного общего потока фотонов. Существенная разница наблюдалась между животными, получавшими энрофлоксацин, и необработанными животными в течение 10 дней. Эти результаты демонстрируют, что BLI является мощным инструментом для оценки влияния потенциального лечения на течение заболевания ИМП.
Рисунок 1:In vivo BLI коррелирует с КОЕ инокулята в момент инстилляции. (A) Репрезентативные изображения, полученные с помощью IN VIVO BLI мышей, инфицированных с возрастающей концентрацией инокулята (2 x 103-2 x 108 КОЕ), изображенных сразу после закапывания бактерий в мочевой пузырь. КОЕ = колониеобразующие единицы. (B)Количественная оценка биолюминесценции, испускаемой над областью мочевого пузыря (общий поток фотонов), по сравнению с концентрацией инокулята (КОЕ). Сигнал BLI был надежно обнаружен выше 2 x 104 КОЕ (p = 0,0002 по сравнению с фоном и p = 0,015 по сравнению с контролем PBS, непарный t-тест). Корреляция Пирсона для инокул в диапазоне от 2 х 103-2 х 108 КОЕ составляла r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = фон, PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор, КОЕ = колониеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:BLI как средство для продольного наблюдения во время лечения. (A)Индивидуальные следы общего потока фотонов у животных, инфицированных 2 х 107 КОЕ UTI89-люкс и получавших энрофлоксацин 10 мг/кг два раза в день в течение 3 дней (синий) по сравнению с необработанной контрольной группой (черный), n = 10 на группу. BG = фон. (B)Анализ следов животных, показанных на панели А, сообщающий AUC логарифмически преобразованного общего потока фотонов как для энрофлоксацина (синий), так и для контрольной группы (черный). N = 10 на группу, среднее ± SD, непарное t-испытаниеp < 0,0001. AUC = Площадь под кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества BLI по сравнению с количеством КОЕ
Продольные данные
Основным недостатком традиционного метода подсчета КОЕ для количественной оценки микробной нагрузки является требование гомогенатов посмертных органов, обеспечивающих только одну точку поперечного сечения на каждое животное. И наоборот, BLI обеспечивает неинвазивное продольное наблюдение за инфицированными животными. Животных можно визуализировать от 2 до 3 раз в день, что дает подробное представление о кинетике инфекции. Кроме того, повторные меры одного и того же животного резко сокращают количество животных, необходимых для экспериментов с адекватным питанием. Кроме того, исследователи могут сосредоточиться на межиндивидуальной изменчивости, и прежде чем исследовать или лечить животных новым агентом, они могут выбрать животных с заранее определенной бактериальной нагрузкой, используя данные в режиме реального времени. С другой стороны, использование AUC эксперимента позволяет исследователям сосредоточиться на общей бактериальной нагрузке, а не на одном значении поперечного сечения. Добавленную стоимость продольных данных и данных в режиме реального времени в настройках ИМП трудно переоценить.
Выявление распространения инфекции
Пространственное разрешение изображений, полученных с помощью BLI, достаточно для идентификации других участков, которые колонизированы lux- или FLuc-помеченнымипатогенами19. Для ИМП восходящие инфекции в почки или распространение в кровь являются очень важными результатами. В этой экспериментальной обстановке не наблюдалось какого-либо распространения инфекций, индуцированных UTI89-lux за пределы нижних мочевых путей. Это было ожидаемо, учитывая, что этот штамм преимущественно вызывает цистит.
Воспроизводимость и сравнение данных
Воспроизводимость экспериментов выше при использовании BLI по сравнению с количеством КОЕ. Классически, трипликаты последовательных 10-кратных разбавлений гомогенатов покрываются, и только пластины с 30-300 КОЕ затем подсчитываются для расчета общего количества КОЕ. Этот метод громоздкий, склонный к высокой изменчивости, приводящий ко многим бесполезным пластинам и чрезвычайно подвержен человеческим ошибкам. Кроме того, нет единого мнения о том, как сообщать о КОЕ, а именно, на грамм ткани мочевого пузыря, на мочевой пузырь или на гомогенат 1 мл. Это делает сравнение результатов различных групп чрезвычайно трудным и может быть улучшено за счет использования BLI и общего потока фотонов.
Соображения и ограничения метода
Помимо классических соображений, связанных с BLI in vivo, таких как поглощение фотонов мехом или гемоглобином, есть некоторые соображения, которые следует учитывать при корреляции количества BLI и КОЕ во время жертвоприношения.
Во-первых, расхождения между обоими методами в момент жертвоприношения встречаются20,особенно при использовании антибиотикотерапии. Таким образом, корреляция между количеством BLI и КОЕ на момент жертвоприношения может быть неоптимальной и не обязательно актуальной. Для BLI общий поток фотонов может быть ниже, чем ожидалось, потому что проблемные бактерии могут перенаправить свой метаболизм на процессы восстановления и восстановления, а не на излучение света. Кроме того, измерение BLI захватывает снимок бактерий и их метаболизма в режиме реального времени in vivo, что приводит к снижению сигналов BLI, если бактерии находятся в спящем или удлиненном состоянии во время визуализации. С другой стороны, для определения КОЕ бактерии, испытывающие проблемы с лекарственными средствами, реагируют «все или ничего» после удаления из их инфекционной среды обитания (то есть биопленки) и покрытия. После нанесения на агар проблемные бактерии могут быть безвозвратно повреждены и не могут развиваться в наблюдаемые колонии, что приводит к снижению количества КОЕ21. Кроме того, проблемные бактерии могут войти в жизнеспособное, но не культивируемое состояние (VBNC). Они остаются метаболически активными и жизнеспособными, но больше не культивируются на стандартных лабораторных средах. Бактерии, которые входят в состояние VBNC или которые организованы в биопленки, могут быть легко обнаружены с помощью BLI, в то время как перечисление КОЕ требует дополнительной обработки21,22,23. В заключение, биолюминесценция и жизнеспособность измеряют различные аспекты физиологии клеток, и ни один из них не должен рассматриваться как окончательный показатель жизнеспособности клеток21.
Кроме того, определение бактериальной нагрузки, измеренной по количеству BLI или КОЕ, отличается из-за различий в обработке образцов. При использовании количества КОЕ в гомогенат включаются и подсчитываются только бактерии, которые находятся в стенке мочевого пузыря. Напротив, BLI также захватывает фотоны, испускаемые бактериями в моче и уретре. На наш взгляд, последнее является физиологически более правильным представлением общей бактериальной нагрузки, так как включает в себя все анатомически значимые отсеки (мочевой пузырь, моча, уретра).
В отличие от количества КОЕ, BLI требует генерации генетически измененных люминесцентных бактерий. В зависимости от места вставки, вероятно, что введение люкс-оперона в геном может изменить потенциал вирулентности бактериального штамма. Поэтому при разработке нового биолюминесцентного штамма его вирулентность и характеристики роста следует сравнивать с родительским штаммом10,13. Тем не менее, последние достижения в редактировании генома позволяют эффективно и без шрамов помечать все основные бактериальные патогены, тем самым ограничивая воздействие на вирулентность или реакции на лечение. Кроме того, генная инженерия открывает возможности для условной экспрессии генов-репортеров биолюминесценции и, следовательно, измерения in vivo соответствующих бактериальных субпопуляций, экспрессии генов и т. Д.24,25.
Наконец, доступ к усовершенствованному устройству визуализации и программному обеспечению для сбора данных для in vivo BLI может быть ограничивающим фактором по сравнению с базовым оборудованием, необходимым для перечисления КОЕ. Тем не менее, сотрудничество с ядрами визуализации может минимизировать расходы и инвестиции, необходимые для BLI.
Особенности реализации BLI в модели ИМП in vivo
Животная модель
Преимущества мышиной модели ИМП тройственны: она позволяет контролировать прогрессирование заболевания в мочевыводящих путях млекопитающих, животные и их содержание относительно недороги, а мутантные линии доступны. С другой стороны, индукция инфекции обычно влечет за собой трансуретральную катетеризацию и последующее закапывание высокой дозировки бактерий непосредственно в просвет мочевого пузыря, тем самым минуя естественный процесс вознесения через уретру5.
Содержание животных
Животные могут быть размещены группой во время эксперимента. Мы исследовали возникновение передачи между животными одной клетки, путем введения сторожевых животных в клетки с инфицированными животными. Ни у одного из сторожевых животных не было обнаруживаемой бактериальной нагрузки, измеренной как с помощью КОЕ, так и с помощью BLI.
Объем мочевого пузыря
При объединении мышиной модели ИМП с МПЖ исследователи должны помнить об уникальных анатомических свойствах мочевого пузыря. Мочевой пузырь представляет собой полый орган, который содержит различный объем мочи. Во время ИМП присутствие зараженной бактериями мочи теоретически может влиять на общее количество фотонов в зависимости от степени наполнения мочевого пузыря. Однако стандартизация объема мочевого пузыря непрактична и может повлиять на экспериментальную конструкцию. Кроме того, по нашему опыту, различия в объеме мочевого пузыря не приводят к статистически значимым различиям в общем потоке фотонов.
Температура образца
In vitro BLI (или, как более простая и дешевая альтернатива, измерение биолюминесценции в люминометре) также может бытьиспользовано для определения бактериальной нагрузки на гомогенаты, мочу или бактериальные суспензии, содержащие UTI89-lux. Однако температура образца важна, поскольку испускание фотонов является результатом ферментативной реакции и, следовательно, требует метаболической активности и присутствия кислорода. Следует избегать резких изменений температуры во время извлечения органов, позволяя образцу калиброваться на нагретой (37 °C) стадии за 5 минут до визуализации.
Потенциальное применение и важность
Таким образом, громоздкий метод перечисления КОЕ ограничивал воспроизводимость и эффективность исследований в области ИМП. Экспериментальная установка с BLI будет продвигать исследования имп in vivo по физиологии мочевого пузыря, патогенезу ИМП и восприимчивости, обеспечивая продольное наблюдение, одновременно уменьшая количество животных, необходимых для этих типов исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Исследовательский совет KU Leuven (C1-TRPLe; Т.В. и В.Е.) и ВИБ (до Т.В.). В.Е. является старшим клиническим научным сотрудником Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen). Штамм UTI89-lux был щедрым подарком от лаборатории профессора Сида13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
