Summary
Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.
Abstract
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en humanos y se tratan rutinariamente con antibióticos empíricos. Sin embargo, debido al aumento de la resistencia microbiana, la eficacia de los antibióticos más utilizados ha disminuido. Para encontrar opciones de tratamiento alternativas, existe una gran necesidad de una mejor comprensión de la patogénesis de la ITU y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a la ITU. Para investigar esto en un modelo animal, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo para estudiar el curso de la ITU.
Durante años, el estándar de oro para la enumeración de la carga bacteriana ha sido la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) para un volumen de muestra particular. Esta técnica requiere homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Como alternativa, las imágenes de bioluminiscencia (BLI) están ganando popularidad para determinar la carga bacteriana. El etiquetado de patógenos con un operón lux permite la detección y cuantificación sensible de una manera no invasiva, lo que permite un seguimiento longitudinal. Hasta ahora, la adopción de BLI en la investigación de itunicas urinarias sigue siendo limitada.
Este manuscrito describe la implementación práctica de BLI en un modelo de infección del tracto urinario de ratón. Aquí, se proporciona una guía paso a paso para el cultivo de bacterias, la instilación intravesical y la obtención de imágenes. Se examina la correlación in vivo con la UFCC y se proporciona una prueba de concepto comparando la carga bacteriana de los animales infectados no tratados con los animales tratados con antibióticos. Además, se discuten las ventajas, limitaciones y consideraciones específicas de la implementación de BLI en un modelo de ITU in vivo. La implementación de BLI en el campo de investigación de UTI facilitará en gran medida la investigación sobre la patogénesis de UTI y el descubrimiento de nuevas formas de prevenir y tratar UTI.
Introduction
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en los seres humanos. Casi la mitad de todas las mujeres experimentarán una infección urinaria sintomática durante su vida1. Las infecciones limitadas a la vejiga pueden dar lugar a síntomas urinarios como aumento de la frecuencia urinaria, urgencia, hematuria, incontinencia y dolor. Cuando la infección asciende al tracto urinario superior, los pacientes desarrollan pielonefritis, con malestar general, fiebre, escalofríos y dolor de espalda. Además, hasta el 20% de los pacientes con ITU sufren infecciones recurrentes que resultan en una disminución dramática de la sensibilidad a los antibióticos2,3,4. En los últimos años, ha habido un creciente interés en nuevas terapias para el tratamiento y la prevención de la ITU recurrente. A pesar de una mejor comprensión de la inmunidad innata y adaptativa del tracto urinario inferior y de los factores de virulencia bacteriana necesarios para la invasión y colonización, no se han traducido cambios radicales en el régimen de tratamiento a la práctica urológica diaria2. Para estudiar la patogénesis y la susceptibilidad in vivo delas itunicas urinarias, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo.
Se han descrito múltiples modelos de ITU animales que van desde nematodos hasta primates, pero el modelo murino se utiliza predominantemente5,6. Este modelo consiste en el cateterismo transuretral de ratones (hembras) y la posterior instilación de una suspensión bacteriana, más comúnmente uropatógena Escherichia coli (UPEC), directamente en la luz de la vejiga7. Después de la inoculación, la carga bacteriana se ha cuantificado tradicionalmente mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC). Esta técnica requiere el sacrificio de animales para obtener homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Además, el seguimiento longitudinal de la carga bacteriana en animales individuales no es posible utilizando esta técnica.
En 1995, Contag etal. sugirieron el uso de patógenos marcados con bioluminiscencia para monitorear los procesos de enfermedad en animales vivos8,9. Desde entonces, la imagen de bioluminiscencia (BLI) se ha aplicado a numerosos modelos de infección como meningitis, endocarditis, osteomielitis, infecciones de la piel y tejidos blandos, etc.10,11,12. En el modelo murino UTI, se puede utilizar una cepa UPEC con el operón lux completo(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens 13. Una reacción enzimática es catalizada por la luciferasa bacteriana que depende de la oxidación de aldehídos de cadena larga que reaccionan con el mononucleótido de flavina reducido en presencia de oxígeno, produciendo la flavina oxidada, un ácido graso de cadena larga y ligero12. El operón lux codifica para la luciferasa y otras enzimas necesarias para la síntesis de los sustratos. Por lo tanto, todas las bacterias metabólicamente activas emitirán continuamente luz verde azul (490 nm) sin necesidad de la inyección de un sustrato exógeno12. Los fotones emitidos por bacterias marcadas con luxse pueden capturar utilizando cámaras de dispositivos de carga acoplada (CCD) refrigeradas y altamente sensibles.
El uso de bacterias bioluminiscentes en un modelo para la ITU permite la cuantificación longitudinal y no invasiva de la carga bacteriana, omitiendo la necesidad de sacrificar animales en puntos de tiempo fijos durante el seguimiento para la determinación de ufc. A pesar de la amplia gama de posibilidades, la acumulación de evidencia de la robustez de esta técnica BLI en otros campos y sus ventajas sobre los modelos clásicos de ITU, no se ha implementado ampliamente en la investigación de UTI. El protocolo presentado aquí proporciona una guía detallada paso a paso y destaca las ventajas de BLI para toda la investigación futura de UTI.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo de la Comunidad de la Unión Europea y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de KU Leuven (P158/2018).
1. Cultivo de bacterias (adaptado de7,13,14)
- Preparación
- Elija una cepa UPEC luminiscente que mejor se adapte a las necesidades experimentales.
NOTA: Aquí, el aislado clínico de cistitis, UTI89(E. coli),fue seleccionado por su capacidad uropatógena tanto en humanos como en roedores, y su uso común en modelos de ITU murina5,7,15. La cepa isogénica bioluminiscente que transporta el operón lux completo(luxCDABE)se conoce además como UTI89-lux. Este operón también lleva genes de resistencia al sulfato de kanamicina (Km). Por lo tanto, Km se puede utilizar para seleccionar colonias bioluminiscentes13. - Haga una curva de correlación para la UFC y la densidad óptica a 600 nanómetros (OD 600 nm) para la cepa bacteriana elegida7.
- Para hacer esto, cultive bacterias (utilizando el protocolo a continuación) y haga 8 diluciones diferentes en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mida el OD a 600 nm para todas estas diluciones y enchapó en placas de Luria-Bertani (LB) para determinar la UFC.
- Trazar los valores de OD 600 nm y los valores de CFU para determinar la correlación y obtener una curva estándar.
NOTA: Para futuros experimentos, mida el OD a 600 nm y use esta curva estándar para obtener una estimación instantánea de la UFC en una solución bacteriana.
PRECAUCIÓN: Los UPEC son bacterias patógenas, asegúrese de que las habitaciones estén debidamente equipadas y use equipo de protección personal.
- Elija una cepa UPEC luminiscente que mejor se adapte a las necesidades experimentales.
- Tres días antes de la instilación
- Obtener colonias individuales mediante la eliminación de la cepa de glicerol de las bacterias, utilizando un bucle de inoculación, en placas LB suplementadas con 50 μg/mL Km y cultivo durante la noche a 37 °C. Selle estas placas con una película de parafina para almacenar a 4 °C hasta 1 semana.
- Dos días antes de la instilación
- Llene un tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 14 ml con tapas de doble posición con 5 ml de caldo LB suplementado con 50 μg / ml Km. Elija una sola colonia bacteriana con un lazo de inoculación y agréguelo al caldo LB. Vórtice durante 10 s para garantizar una mezcla adecuada.
- Cultivo estático con la tapa a presión en posición abierta a 37 °C durante la noche.
NOTA: El crecimiento estático de E. coli promueve la expresión del tipo 1-pili, que son críticos para la adherencia e invasión de las células epiteliales urinarias. - Prepare un Erlenmeyer estéril o un matraz de cultivo.
- Un día antes de la instilación
- Después de la incubación, vórtice el tubo durante 10 s para garantizar la homogeneización adecuada del cultivo bacteriano. Realice un subcultivo en el Erlenmeyer agregando 25 μL de la suspensión bacteriana a 25 ml de lb medio fresco sin antibióticos.
- Cierre el Erlenmeyer y cultive estáticamente a 37 °C durante la noche.
- El día de la instilación
- Vórtice el Erlenmeyer durante 10 s para garantizar una mezcla adecuada.
- Vierta el cultivo del Erlenmeyer en un tubo de cultivo de 50 ml y centrífuga a 3.000 x g y 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspendir el pellet bacteriano en 10 mL de PBS estéril y vórtice de nuevo durante 10 s.
- Elija la concentración experimental del inóculo (UFC) y utilice la curva estándar obtenida en el paso 1.1.2 para determinar el OD 600 nm correspondiente.
- Agregue 1 ml del cultivo bacteriano resuspendido en 9 ml de PBS estéril y verifique el OD a 600 nm. Ajuste aún más agregando PBS estéril o solución bacteriana concentrada, hasta que se alcance el OD 600 nm deseado7.
NOTA: Por ejemplo, para UTI89-lux ajustar el cultivo añadiendo PBS hasta que el OD 600 nm alcance 0,45, correspondiente a 2 x 107 UFC/50 μL. Para verificar el número de UFC viables, hacer diluciones en serie de 10 veces y placa 50 μL de las diluciones quinta y sexta de 10 veces en placas LB por triplicado para obtener menos de 300 colonias. Cuente las colonias obtenidas al día siguiente después de la incubación nocturna a 37 ° C. OD 600 nm proporciona una lectura instantánea, pero use CFU como control de calidad.
2. Inoculación de los animales (adaptado de7,16)
- Preparación de los animales
- Elija la(s) cepa(s) de ratón deseada(s) en función de la pregunta de investigación y la disponibilidad de líneas eliminatorias, detalles experimentales y diferencias en la susceptibilidad a la ITU5,17. Tenga en cuenta que el cateterismo transuretral es más fácil en ratones hembra. No use animales menores de 8 semanas, ya que son inmunológicamente inmaduros. Aquí, se utilizaron ratones C57Bl / 6J hembra de 12 semanas de edad.
- Ordene animales con mucha anticipación y déjelos aclimatarse, idealmente durante 7 días. Agrupe a los animales domésticos en jaulas ventiladas individualmente, en condiciones estándar de luz/oscuridad de 12 h.
- Afeitar la región abdominal de los animales para limitar la pérdida de señal. No use crema depilatoria, ya que puede quemar la piel de los animales rápidamente. Sujete al animal sosteniendo firmemente las extremidades arrugadas y traseras con la mano no dominante mientras se afeita con la mano dominante. Alternativamente, afeitarse bajo anestesia isoflurano.
NOTA: Los animales fueron afeitados 2 días antes de la toma de imágenes, considerando que los animales acicalarán aún más el área afeitada. - Proporcione agua y alimentos estándar ad libitum durante todo el experimento. Sin embargo, prive a los animales del agua 2 h antes de la instilación para minimizar el volumen de la vejiga durante la instilación.
- Monte una punta de angiocatéter estéril de 24 G en una jeringa de 100 μL y llene la jeringa con la solución bacteriana preparada en la etapa 1.5.3.
NOTA: Para determinar la luminiscencia de fondo, obtenga una imagen de referencia antes de la instilación (consulte el paso 3, a continuación).
- Instilación de los animales
- Colocar a los animales en una cámara de inducción y anestesiarlos mediante inhalación de isoflurano con oxígeno puro como gas portador (inducción al 3% y mantenimiento al 1,5%).
- Coloque un animal en una superficie de trabajo en posición supina y mantenga una anestesia estable de isoflurano utilizando un cono nasal durante la instilación. Aplique el ungüento para los ojos.
- Expulse la orina residual aplicando una compresión suave y haciendo movimientos circulares en la región suprapúbica. Limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70% antes de la instilación.
- Lubrique la punta del catéter con solución salina normal. Coloque el dedo índice de la mano no dominante sobre el abdomen y empuje suavemente hacia arriba. Comience el cateterismo de la uretra en un ángulo de 90° (verticalmente) y una vez que se encuentre resistencia, inclínelo horizontalmente antes de insertarlo más (0,5 cm).
NOTA: Nunca empuje con fuerza el catéter, ya que esto causará daño a la uretra. Los movimientos de giro suaves pueden ser útiles en la inserción del catéter. Por otro lado, la falta de resistencia suele indicar una inserción errónea en la vagina. - Realizar una instilación lenta (5 μL/s) de 50 μL del inóculo bacteriano (2 x 107 UFC).
NOTA: Los volúmenes más altos o la instilación más rápida pueden causar reflujo en los riñones. Durante la práctica de la técnica, la tinta azul se puede utilizar para evaluar el reflujo. - Después de la instilación, mantenga la jeringa y el catéter en su lugar durante unos segundos más y luego retraiga lentamente para evitar fugas. Registre cualquier irregularidad, como una gran cantidad de fugas o un meato con sangre y excluya a los animales, si es necesario.
- Coloque al animal en posición supina en el cono nasal de la cámara de imágenes y repita los pasos anteriores 2.1.1-2.1.6 para todos los animales restantes. Utilice un catéter por grupo experimental. Asegúrese de que la anestesia continúe y minimice el tiempo entre el primer y el último animal.
- Si es necesario, administre antibióticos o medicamentos experimentales, antes o después de la toma de imágenes (paso 3). Por ejemplo, para administrar enrofloxacina, agregue 40 μL de la solución de enrofloxacina (100 mg/ml) a 3,96 ml de solución salina fisiológica para obtener una dilución de 1/100. Inyecte 100 μL/10 g por vía subcutánea a las 9 am y 5 pm para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina dos veces al día durante 3 días.
3. Imágenes de bioluminiscencia
- Preparación y selección de parámetros de imagen
- Abra el software de adquisición BLI (consulte la Tabla de materiales)y haga clic en Inicializar en el dispositivo de imagen (consulte la Tabla de materiales)para probar la cámara y el sistema de controlador de escenario y enfriar la cámara CCD a -90 ° C.
NOTA: Durante este proceso, la puerta está bloqueada y el progreso de la inicialización se puede seguir en el panel de control. Una luz verde indica que se alcanza la temperatura de -90 °C. Aparecerá una advertencia si se intenta obtener imágenes antes de completar la inicialización. - Asegúrese de que los datos se guarden automáticamente: Haga clic en adquisición Guardar automáticamente y seleccione la carpeta correcta.
- Seleccione Luminiscencia y Fotografía. Compruebe la configuración de luminiscencia predeterminada: Establezca el filtro de excitación en Bloquear y el filtro de emisión en Abrir.
- Establezca el tiempo de exposición en Automático al tomar la primera imagen, especialmente cuando se espera una señal tenue para garantizar un número adecuado de recuentos de fotones. Para mediciones in vivo y señales brillantes, establezca el tiempo de exposición en ~ 30 s. Si la imagen está saturada, aparecerá una advertencia. Si esto sucede, reduzca el tiempo de exposición.
- Seleccione el medio Binning, F/stop 1 y elija el campo de visión correcto(FOV)(D para 5 animales).
- Establezca la altura del sujeto en 1 cm al obtener imágenes de ratones.
- Haga clic en Agregar tres veces en el Panel de control de adquisición para obtener una secuencia de tres imágenes, como réplicas técnicas.
- Abra el software de adquisición BLI (consulte la Tabla de materiales)y haga clic en Inicializar en el dispositivo de imagen (consulte la Tabla de materiales)para probar la cámara y el sistema de controlador de escenario y enfriar la cámara CCD a -90 ° C.
- Imagenológico
- Coloque a los ratones en la cámara de imágenes en posición supina y use el cono nasal múltiple para mantener la anestesia (isoflurano 1.5%) durante todo el experimento. Imagina hasta 5 ratones simultáneamente y separa a los animales usando el deflector de luz para evitar la reflexión.
- Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar la secuencia de imágenes.
- Complete información detallada sobre el experimento (animales salvajes y knockout, tratamientos, día de la toma de imágenes, etc.). La configuración de imágenes, como el tiempo de exposición, se guarda automáticamente.
- Retire los ratones de la cámara de imágenes y devuélvalos a su jaula. Verifique la recuperación completa después de la anestesia. En cuestión de minutos, los animales deben estar completamente despiertos y exploratorios. No proporcione analgesia ya que esto podría interferir con el curso de ITU18.
- Devuelva las jaulas a los bastidores ventilados hasta el siguiente ciclo de imágenes. Después de la finalización del experimento, sacrificar a los animales por asfixia de CO2 o dislocación cervical. Haga esto antes de la recuperación de la anestesia isoflurano para minimizar la angustia.
- Análisis de las imágenes
- Inicie el software de imágenes y cargue el archivo experimental haciendo clic en Examinar.
- Utilice la paleta de herramientas para ajustar la escala de colores de la imagen. Estandarizar el aspecto visual de los resultados utilizando la misma configuración para todas las imágenes, es decir, utilizar una escala logarítmica con un mínimo de 104 a un máximo de 107 fotones. Estos ajustes no afectan a los datos brutos, sino solo a la presentación gráfica.
- Utilice las herramientas de ROI para dibujar una región de interés (ROI) en la imagen. Asegúrese de que el ROI sea lo suficientemente grande como para cubrir el área completa y use las mismas dimensiones para todas las imágenes. Aquí, se colocó un ROI cuadrado de 3,5 cm x 4,5 cm sobre la parte inferior del abdomen.
- Haga clic en medición de ROI para cuantificar la intensidad de la luz (recuentos o flujo total de fotones). Exporte estos datos y utilice el promedio de las réplicas técnicas.
NOTA: Los recuentos representan el número de fotones detectados por la cámara y solo deben utilizarse para el control de calidad de la imagen. Para informar de los datos, utilice el flujo total de fotones. El flujo total de fotones es más relevante fisiológicamente, ya que representa la luz emitida desde la superficie y es una unidad calibrada, que se corrige para el tiempo de exposición (por segundo).
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Representative Results
El BLI in vivo se correlaciona con la UFC del inóculo en el momento de la instilación.
Para evaluar el límite de detección de BLI in vivo y la correlación con ufc del inóculo, los ratones fueron infectados con diferentes concentraciones de UTI89-lux y PBS como control negativo. Antes de la instilación, los animales no infectados fueron escaneados para determinar la luminiscencia de fondo. Las imágenes posteriores se obtuvieron inmediatamente después de la instilación(Figura 1A). Después de la instilación de UTI89-lux,la bioluminiscencia fue robustamente detectable por encima de 2 x10 4 UFC y se estableció una correlación lineal entre la UFC del inóculo y la bioluminiscencia(Figura 1B). En contraste, el flujo total de fotones fue comparable a las señales de fondo para animales inculcados con PBS y a la concentración bacteriana más baja de 2 x 103 UFC.
BLI como herramienta para el seguimiento longitudinal durante el tratamiento
Para determinar si el efecto curativo de un tratamiento antibiótico validado puede demostrarse mediante BLI longitudinal, 20 animales fueron infectados con un inóculo de 2 x 107 UFC/50 μL, y 10 de estos animales fueron tratados con enrofloxacina 10 mg/kg por vía subcutánea dos veces al día durante los primeros 3 días después de la infección. Tanto la evolución natural en el grupo control infectado pero no tratado como el efecto del tratamiento antibiótico sobre la cinética de la infección en el grupo tratado se pudieron visualizar en detalle (Figura 2). Se observó una disminución inmediata de la carga bacteriana, medida por el flujo total de fotones, después de la primera dosis de enrofloxacina. Ninguno de los animales tratados tuvo un aumento posterior de la carga bacteriana. La variabilidad entre sujetos en el grupo de control infectado pero no tratado fue mayor y la disminución de la carga bacteriana fue más lenta. En el día 10, 8 de cada 10 animales del grupo de control habían regresado a una señal BLI comparable a su fondo previo a la instilación. La carga bacteriana total para cada animal se calculó utilizando el área bajo la curva (AUC) del flujo total de fotones transformado en logarítmica. Se observó una diferencia significativa entre los animales tratados con enrofloxacina y los animales no tratados en el transcurso de 10 días. Estos resultados demuestran que el BLI es una herramienta poderosa para evaluar el efecto de un tratamiento potencial en el curso de la enfermedad de una infección urinaria.
Figura 1: El BLI in vivo se correlaciona con la UFC del inóculo en el momento de la instilación. (A) Imágenes representativas obtenidas con BLI in vivo de ratones infectados con concentraciones crecientes de inóculo (2 x 103-2 x 108 UFC) fotografiadas inmediatamente después de la instilación bacteriana en la vejiga. UFC = Unidades Formadoras de Colonias. (B) Cuantificación de la bioluminiscencia emitida sobre la región de la vejiga (flujo total de fotones) en comparación con la concentración del inóculo (UFC). La señal BLI se detectó robustamente por encima de 2 x10 4 UFC (p = 0,0002 en comparación con el fondo y p = 0,015 en comparación con el control PBS, prueba tno apareada). La correlación de Pearson para los inoculi que va de 2 x10 3-2 x10 8 UFC fue r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = fondo, PBS = solución salina tamponada con fosfato, UFC = unidades formadoras de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: BLI como herramienta para el seguimiento longitudinal durante el tratamiento. (A) Trazas individuales del flujo total de fotones para animales infectados con 2 x 107 UFC de UTI89-lux y tratados con enrofloxacina 10 mg/kg dos veces al día durante 3 días (azul) versus un grupo de control no tratado (negro), n = 10 por grupo. BG = fondo. (B) Análisis de trazas de animales que se muestran en el panel A, notificando el AUC del flujo total de fotones transformado en logaribo tanto para el grupo de enrofloxacina (azul) como para el grupo de control (negro). N = 10 por grupo, media ± DE, t-testp no apareada < 0,0001. AUC = Área bajo la curva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Ventajas de BLI en comparación con los recuentos de UFC
Datos longitudinales
Una desventaja importante del método tradicional de conteo de UFC para cuantificar la carga microbiana es el requisito de homogeneizados de órganos post mortem, que proporcionan solo un punto de datos transversal por animal. Por el contrario, el BLI permite un seguimiento longitudinal no invasivo de los animales infectados. Los animales pueden ser fotografiados de 2 a 3 veces al día, proporcionando una visión detallada de la cinética de la infección. Además, las medidas repetidas del mismo animal reducen drásticamente el número de animales necesarios para experimentos con la potencia adecuada. Además, los investigadores pueden centrarse en la variabilidad interindividual y, antes de examinar o tratar a los animales con un nuevo agente, pueden seleccionar animales con cargas bacterianas preespecificadas utilizando los datos en tiempo real. Por otro lado, el uso del AUC de un experimento permite a los investigadores centrarse en la carga bacteriana general y no en un solo valor transversal. El valor añadido de los datos longitudinales y en tiempo real en el entorno de la ITU no puede sobreestimarse.
Identificación de la diseminación de la infección
La resolución espacial de las imágenes obtenidas con BLI es adecuada para identificar otros sitios que están colonizados por patógenos marcados lux o FLuc19. Para la infección urinaria, las infecciones ascendentes a los riñones o la diseminación a la sangre son hallazgos altamente relevantes. En este entorno experimental, no se observó ninguna propagación de infecciones inducidas por UTI89-lux más allá del tracto urinario inferior. Esto se esperaba teniendo en cuenta que esta cepa causa predominantemente cistitis.
Reproducibilidad y comparación de datos
La reproducibilidad de los experimentos es mayor cuando se usa BLI en comparación con los recuentos de UFC. Clásicamente, los triplicatos de diluciones seriales de 10 veces de homogeneizados se enchapan y solo se cuentan aquellas placas con 30 a 300 UFC para calcular el número total de UFC. Este método es engorroso, propenso a una alta variabilidad, da como resultado muchas placas inútiles y es extremadamente propenso a errores humanos. Además, no hay consenso sobre cómo informar la UFC, es decir, por gramo de tejido vesical, por vejiga o por 1 ml de homogeneizado. Esto hace que la comparación de los resultados de diferentes grupos sea extremadamente difícil y podría mejorarse mediante el uso de BLI y el flujo total de fotones.
Consideraciones y limitaciones del método
Además de las consideraciones clásicas relacionadas con el BLI in vivo, como la absorción de fotones por la piel o la hemoglobina, hay algunas consideraciones que deben hacerse al correlacionar los recuentos de BLI y CFU en el momento del sacrificio.
En primer lugar, se encuentran discrepancias entre ambos métodos en el momento del sacrificio20,especialmente cuando se utilizan terapias antibióticas. Por lo tanto, la correlación entre los recuentos de BLI y CFU en el momento del sacrificio puede ser subóptima y no es necesariamente relevante. Para BLI, el flujo total de fotones puede ser menor de lo esperado, porque las bacterias desafiadas pueden redirigir su metabolismo hacia procesos de recuperación y reparación, en lugar de la emisión de luz. Además, la medición de BLI captura una instantánea de las bacterias y su metabolismo en tiempo real in vivo, lo que resulta en señales BLI más bajas si las bacterias están en un estado latente o alargado en el momento de la obtención de imágenes. Por otro lado, para la determinación de la UFC, las bacterias desafiadas por fármacos reaccionan de una manera de todo o nada después de ser retiradas de su hábitat infeccioso (es decir, una biopelícula) y chapadas. Una vez chapadas en agar, las bacterias desafiadas pueden lesionarse irremediablemente e incapaces de convertirse en colonias observables, lo que resulta en recuentos más bajos de UFC21. Además, las bacterias desafiadas pueden entrar en un estado viable pero no cultivable (VBNC). Siguen siendo metabólicamente activos y viables, pero ya no son cultivables en medios de laboratorio estándar. Las bacterias que entran en el estado VBNC o que están organizadas en biopelículas se pueden detectar fácilmente con BLI, mientras que la enumeración de CFU requiere un procesamiento adicional21,22,23. En conclusión, la bioluminiscencia y los recuentos viables miden diferentes aspectos de la fisiología celular y ninguno de los dos debe considerarse como el indicador definitivo de la viabilidad celular21.
Además, la definición de carga bacteriana medida por los recuentos de BLI o CFU es diferente debido a las diferencias en el procesamiento de la muestra. Cuando se usan recuentos de UFC, solo las bacterias que residen dentro de la pared de la vejiga se incluyen en el homogeneizado y se cuentan. Por el contrario, BLI también captura fotones emitidos por bacterias en la orina y la uretra. En nuestra opinión, este último es una representación fisiológicamente más correcta de la carga bacteriana total, ya que incluye todos los compartimentos anatómicamente relevantes (vejiga, orina y uretra).
En contraste con los recuentos de UFC, BLI requiere la generación de bacterias luminiscentes genéticamente alteradas. Dependiendo del sitio de inserción, es plausible que la introducción del operón lux en el genoma pueda alterar el potencial de virulencia de la cepa bacteriana. Por lo tanto, al desarrollar una nueva cepa bioluminiscente, sus características de virulencia y crecimiento deben compararse con la cepa parental10,13. Sin embargo, los avances recientes en la edición del genoma permiten un etiquetado eficiente y sin cicatrices de todos los principales patógenos bacterianos, lo que limita el impacto en la virulencia o las respuestas al tratamiento. Por otra parte, la ingeniería genética abre posibilidades hacia la expresión condicional de genes reporteros de bioluminiscencia y, por tanto, la medición in vivo de subpoblaciones bacterianas relevantes, la expresión génica,etc. 24,25.
Finalmente, el acceso al dispositivo de imagen avanzado y al software de adquisición para BLI in vivo podría ser un factor limitante en comparación con el equipo básico requerido para la enumeración de CFU. Sin embargo, las colaboraciones con núcleos de imágenes pueden minimizar los gastos e inversiones necesarios para BLI.
Consideraciones específicas para la implementación de BLI en un modelo de ITU in vivo
Modelo animal
Las ventajas de un modelo de ITU murino son tres: permite monitorear la progresión de la enfermedad en el tracto urinario de un mamífero, los animales y su mantenimiento son relativamente baratos y las líneas mutantes están disponibles. Por otro lado, la inducción de la infección suele conllevar el cateterismo transuretral y la posterior instilación de una alta dosis de bacterias directamente en la luz vesical, evitando así el proceso natural de ascensión a través de lauretra 5.
Alojamiento de animales
Los animales pueden ser alojados en grupo durante el experimento. Hemos examinado la ocurrencia de transmisión entre animales de la misma jaula, mediante la introducción de animales centinela en jaulas con animales infectados. Ninguno de los animales centinela tenía una carga bacteriana detectable, medida tanto con UFC como con BLI.
Volumen de la vejiga
Al combinar el modelo de ITU murina con BLI, los investigadores deben tener en cuenta las propiedades anatómicas únicas de la vejiga. La vejiga es un órgano hueco que contiene un volumen variable de orina. Durante la itunica de infección urinaria, la presencia de orina infestada de bacterias podría influir teóricamente en el recuento total de fotones dependiendo del grado de llenado de la vejiga. Sin embargo, la estandarización del volumen de la vejiga no es práctica y podría intervenir con el diseño experimental. Además, en nuestra experiencia, las diferencias en el volumen de la vejiga no resultan en diferencias estadísticamente significativas en el flujo total de fotones.
Temperatura de la muestra
In vitro BLI (o como una alternativa más simple y barata, medir la bioluminiscencia en un luminómetro) también se puede utilizar para determinarla carga bacteriana en homogeneizados, orina o suspensiones bacterianas que contienen UTI89-lux. Sin embargo, la temperatura de la muestra es importante ya que la emisión de fotones es el resultado de una reacción enzimática y, por lo tanto, requiere actividad metabólica y la presencia de oxígeno. Se deben evitar los cambios drásticos de temperatura durante la sustracción de órganos permitiendo que la muestra se calibre en la etapa calentada (37 °C) 5 minutos antes de la toma de imágenes.
Aplicaciones potenciales e importancia
En resumen, el engorroso método de enumeración de ufcianas limitaba la reproducibilidad y eficacia de la investigación en el campo de las infecciones urinarias. La configuración experimental con BLI avanzará en la investigación in vivo de la ITU sobre la fisiología de la vejiga, la patogénesis de la itunica y la susceptibilidad al permitir el seguimiento longitudinal, al tiempo que reduce el número de animales necesarios para este tipo de estudios.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO Vlaanderen; G0A6113N), el Consejo de Investigación de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. y W.E.) y el VIB (a T.V.). W.E. es investigador clínico senior de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO Vlaanderen). La cepa UTI89-lux fue un generoso regalo del laboratorio del Prof. Seed13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
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