Summary
Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.
Abstract
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos e são tratadas rotineiramente com antibióticos empíricos. No entanto, devido ao aumento da resistência microbiana, a eficácia dos antibióticos mais usados diminuiu. Para encontrar opções alternativas de tratamento, há uma grande necessidade de uma melhor compreensão da patogênese DA UTI e dos mecanismos que determinam a suscetibilidade da UTI. Para investigar isso em um modelo animal, é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo para estudar o curso da UTI.
Durante anos, o padrão-ouro para a enumeração da carga bacteriana tem sido a determinação de Unidades de Formação de Colônias (UFC) para um determinado volume amostral. Esta técnica requer homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Como alternativa, a bioluminescência (BLI) está ganhando popularidade para determinar a carga bacteriana. A rotulagem de patógenos com um operon lux permite a detecção e quantificação sensíveis de forma não invasiva, permitindo assim o acompanhamento longitudinal. Até agora, a adoção da BLI na pesquisa da UTI permanece limitada.
Este manuscrito descreve a implementação prática de BLI em um modelo de infecção do trato urinário do rato. Aqui, é fornecido um guia passo-a-passo para a cultura de bactérias, instilação intravesical e imagem. A correlação in vivo com a UFC é examinada e uma prova de conceito é fornecida comparando a carga bacteriana de animais infectados não tratados com animais tratados com antibióticos. Além disso, são discutidas as vantagens, limitações e considerações específicas para a implementação da BLI em um modelo in vivo UTI. A implantação da BLI no campo de pesquisa da UTI facilitará muito a pesquisa sobre a patogênese da UTI e a descoberta de novas formas de prevenir e tratar a ITU.
Introduction
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos. Quase metade de todas as mulheres experimentarão uma UTI sintomática durante sua vida1. Infecções limitadas à bexiga podem dar origem a sintomas urinários como aumento da frequência urinária, urgência, hematuria, incontinência e dor. Quando a infecção sobe para o trato urinário superior, os pacientes desenvolvem pyelonephritis, com mal-estar, febre, calafrios e dor nas costas. Além disso, até 20% dos pacientes com UTI sofrem de infecções recorrentes, resultando em uma redução drástica na sensibilidade a antibióticos2,3,4. Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse por novas terapias para o tratamento e prevenção da UTI recorrente. Apesar de uma melhor compreensão da imunidade inata e adaptativa do trato urinário inferior e dos fatores de virulência bacteriana necessários para invasão e colonização, nenhuma mudança radical no regime de tratamento foi traduzida para a prática urológica diária2. Para estudar a patogênese e a suscetibilidade da UTI in vivo,é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo.
Vários modelos de UTI animal foram descritos variando de nematoides a primatas, mas o modelo murino é predominantemente usado5,6. Este modelo consiste em cateterismo transuretral de camundongos (femininos) e posterior instilação de suspensão bacteriana, mais comumente uropatogênica Escherichia coli (UPEC), diretamente no lúmen da bexiga7. Após a inoculação, a carga bacteriana tem sido tradicionalmente quantificada por determinação de unidades formadoras de colônias (UFC). Esta técnica requer sacrificar animais para obter homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Além disso, o acompanhamento longitudinal da carga bacteriana em animais individuais não é possível usando essa técnica.
Em 1995, Contag et al. sugeriram o uso de patógenos bioluminescentes marcados para monitorar processos de doenças em animais vivos8,9. Desde então, a bioluminescência (BLI) tem sido aplicada a inúmeros modelos de infecção, como meningite, endocardite, osteomielite, pele e infecções por tecidos moles, etc.10,11,12. No modelo murine UTI, pode ser utilizada uma cepa UPEC com o lux operon completo(luxCDABE)da Photorhabdus luminescens 13. Uma reação enzimática é catalisada pela luciferase bacteriana que depende da oxidação de aldeídos de cadeia longa reagindo com mononucleotídeo de flavin reduzido na presença de oxigênio, produzindo flavin oxidado, um ácido graxo de cadeia longa e luz12. Os códigos lux operon para a luciferase e outras enzimas necessárias para a síntese dos substratos. Portanto, todas as bactérias metabolicamente ativas emitirão luz verde azul (490 nm) sem a necessidade da injeção de um substrato exógeno12. Fótons emitidos por bactérias lux-taggedpodem ser capturados usando câmeras de dispositivo (CCD) altamente sensíveis e resfriadas.
O uso de bactérias bioluminescentes em um modelo para UTI permite a quantificação longitudinal e não invasiva da carga bacteriana, omitindo a necessidade de sacrificar animais em pontos de tempo fixos durante o acompanhamento para determinação da UFC. Apesar da ampla gama de possibilidades, acumulando evidências para a robustez desta técnica BLI em outros campos e suas vantagens sobre modelos clássicos de UTI, ela não foi amplamente implementada na pesquisa da UTI. O protocolo aqui apresentado fornece um guia passo a passo detalhado e destaca as vantagens da BLI para todas as futuras pesquisas da UTI.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Comunitário da União Europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da KU Leuven (P158/2018).
1. Bactérias de cultivo (adaptadas a partir de7,13,14)
- Preparação
- Escolha uma cepa UPEC luminescente que melhor se encaixe nas necessidades experimentais.
NOTA: Aqui, o isolado da cistite clínica, UTI89 (E. coli), foi selecionado por causa de sua capacidade uropatogênica tanto em humanos quanto em roedores, e seu uso comum nos modelos murina UTI5,7,15. A cepa isogênica bioluminescente que carrega o lux operon completo (luxCDABE) é ainda referida como UTI89-lux. Este operon também carrega genes de resistência de sulfato de kanamicina (Km). Portanto, o Km pode ser usado para selecionar colônias bioluminescentes13. - Faça uma curva de correlação para a UFC e densidade óptica a 600 nanômetros (OD 600 nm) para a cepa bacteriana escolhida7.
- Para isso, as bactérias da cultura (usando o protocolo abaixo) e fazem 8 diluições diferentes em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS). Meça o OD a 600 nm para todas essas diluições e emplaque-as em placas de Luria-Bertani (LB) para determinar a UFC.
- Plote os valores de 600 nm e os valores da UFC para determinar a correlação e obter uma curva padrão.
NOTA: Para experimentos futuros, meça o OD em 600 nm e use esta curva padrão para obter uma estimativa instantânea da UFC em uma solução bacteriana.
ATENÇÃO: UPEC são bactérias patogênicas, garantem que as salas estejam adequadamente equipadas e usem equipamentos de proteção individual.
- Escolha uma cepa UPEC luminescente que melhor se encaixe nas necessidades experimentais.
- Três dias antes da instilação
- Obtenha colônias únicas, espalhando o estoque de glicerol de bactérias, usando um laço de inoculação, em placas LB suplementadas com 50 μg/mL Km e cultura durante a noite a 37 °C. Sele essas placas com um filme de parafina para armazenar a 4 °C até 1 semana.
- Dois dias antes da instilação
- Encha um tubo inferior redondo de poliestireno de 14 mL estéril com tampas de encaixe de dupla posição com 5 mL de caldo LB complementado com 50 μg/mL Km. Escolha uma única colônia bacteriana com um laço de inoculação e adicione isso ao caldo LB. Vórtice para 10 s para garantir a mistura adequada.
- Cultura estaticamente com a tampa de estalo na posição aberta a 37 °C durante a noite.
NOTA: O crescimento estático de E. coli promove a expressão do tipo 1-pili, que são fundamentais para a adesão e invasão de células epiteliais urinárias. - Prepare um Erlenmeyer estéril ou um frasco de cultura.
- Um dia antes da instilação
- Após a incubação, vórtice do tubo para 10 s para garantir a homogeneização adequada da cultura bacteriana. Faça uma subcultura no Erlenmeyer adicionando 25 μL da suspensão bacteriana a 25 mL de meio LB fresco sem antibióticos.
- Feche o Erlenmeyer e a cultura estaticamente a 37 °C durante a noite.
- No dia da instilação
- Vórtice o Erlenmeyer por 10 s para garantir a mistura adequada.
- Despeje a cultura do Erlenmeyer em um tubo de cultura de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g e 4 °C por 5 min. Decante o supernatante e resuspenque a pelota bacteriana em 10 mL de PBS e vórtice e vórtice novamente por 10 s.
- Escolha a concentração experimental do inóculo (UFC) e utilize a curva padrão obtida na etapa 1.1.2 para determinar o OD correspondente de 600 nm.
- Adicione 1 mL da cultura bacteriana resuspended em 9 mL de PBS estéril e verifique o OD a 600 nm. Ajuste ainda mais adicionando PBS estéril ou solução bacteriana concentrada, até que o OD 600 nm desejado seja atingidopor 7.
NOTA: Por exemplo, para UTI89-lux ajuste a cultura adicionando PBS até que o OD 600 nm atinja 0,45, correspondendo a 2 x 107 CFU/50 μL. Para verificar o número de CFUs viáveis, faça diluições seriais de 10 vezes e a placa 50 μL do quinto e sexto diluições de 10 vezes em placas LB em triplicado para obter menos de 300 colônias. Conte as colônias obtidas no dia seguinte após a incubação durante a noite a 37 °C. OD 600 nm dá uma leitura instantânea, mas usa CFU como controle de qualidade.
2. Inoculação dos animais (adaptada a partir de7,16)
- Preparação dos animais
- Escolha a cepa do mouse desejada dependendo da questão da pesquisa e disponibilidade de linhas de knock-out, detalhes experimentais e diferenças na suscetibilidade de UTI5,17. Tenha em mente que o cateterismo transuretral é mais fácil em camundongos fêmeas. Não use animais com menos de 8 semanas, pois são imunologicamente imaturos. Aqui, foram usados camundongos C57Bl/6J femininos de 12 semanas de idade.
- Peça os animais com bastante antecedência e deixe-os se aclimatar, idealmente por 7 dias. Animais domésticos em gaiolas ventiladas individualmente, sob condições padrão de luz/escuridão de 12 horas.
- Raspe a região abdominal dos animais para limitar a perda de sinal. Não use creme para depilação, pois pode queimar a pele dos animais rapidamente. Contenha o animal segurando firmemente os membros traseiros e desajeitados com a mão não dominante enquanto se barbeia com a mão dominante. Alternativamente, raspe sob anestesia isoflurane.
NOTA: Os animais foram raspados 2 dias antes da imagem, considerando que os animais irão preparar ainda mais a área raspada. - Forneça água e ad libitum alimentar padrão durante todo o experimento. No entanto, privar os animais da água 2h antes da instilação para minimizar o volume da bexiga durante a instilação.
- Monte uma ponta de angiocateter de 24 G estéril em uma seringa de 100 μL e encha a seringa com a solução bacteriana preparada na etapa 1.5.3.
NOTA: Para determinar a luminescência de fundo, obtenha uma imagem de linha de base antes da instilação (ver passo 3, abaixo).
- Instilação dos animais
- Coloque os animais em uma câmara de indução e anestesia-os usando inalação de isoflurane com oxigênio puro como gás transportador (indução a 3% e manutenção em 1,5%).
- Coloque um animal em uma superfície de trabalho na posição supina e mantenha uma anestesia isoflurane estável usando um cone de nariz durante a instilação. Aplique a pomada ocular.
- Expulse a urina residual aplicando compressão suave e fazendo movimentos circulares na região suprapúbica. Limpe o abdômen inferior com 70% de etanol antes da instilação.
- Lubrifique a ponta do cateter com soro fisiológico normal. Coloque o dedo indicador da mão não dominante no abdômen e empurre-o suavemente para cima. Inicie o cateterismo da uretra em um ângulo de 90° (verticalmente) e uma vez que a resistência seja encontrada, incline-a horizontalmente antes de inseri-la ainda mais (0,5 cm).
NOTA: Nunca empurre com força o cateter, pois isso causará danos à uretra. Movimentos de giro suaves podem ser úteis na inserção de cateter. Por outro lado, a falta de resistência geralmente indica inserção errônea na vagina. - Realize uma instilação lenta (5 μL/s) de 50 μL do inóculo bacteriano (2 x 107 CFU).
NOTA: Volumes mais altos ou instilação mais rápida podem causar refluxo aos rins. Durante a prática da técnica, a tinta azul pode ser usada para avaliar o refluxo. - Após a instilação, mantenha a seringa e o cateter no lugar por mais alguns segundos e, em seguida, retraia lentamente para evitar vazamentos. Regissuas irregularidades, como uma alta quantidade de vazamento ou um meatus ensanguentado e exclua animais, se necessário.
- Posicione o animal em posição supina no cone do nariz da câmara de imagem e repita as etapas anteriores 2.1.1-2.1.6 para todos os animais restantes. Use um cateter por grupo experimental. Certifique-se de que a anestesia seja continuada e minimize o tempo entre o primeiro e o último animal.
- Se necessário, administre antibióticos ou medicamentos experimentais, antes ou depois da imagem (etapa 3). Por exemplo, para administrar enrofloxacina, adicione 40 μL da solução enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL de soro fisiológico para obter uma diluição de 1/100. Injete 100 μL/10 g subcutâneamente às 9:00 e 17:00 para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina duas vezes por dia durante 3 dias.
3. Imagem de bioluminescência
- Preparação e seleção de parâmetros de imagem
- Abra o software de aquisição da BLI (ver Tabela de Materiais) e clique em Initialize no dispositivo de imagem (ver Tabela de Materiais) para testar a câmera e o sistema de controlador de palco e resfriar a câmera CCD a -90 °C.
NOTA: Durante esse processo, a porta está trancada, e o progresso da inicialização pode ser seguido no painel de controle. Uma luz verde indica que a temperatura de -90 °C é atingida. Um aviso aparecerá se a imagem for tentada antes da conclusão da inicialização. - Certifique-se de que os dados são salvos automaticamente: Clique na aquisição de auto-salvamento e selecione a pasta correta.
- Selecione Luminescência e Fotografia. Verifique as configurações padrão de luminescência: Defina filtro de excitação para bloquear e filtro de emissão para abrir.
- Defina o tempo de exposição ao Auto ao tirar a primeira imagem, especialmente quando se espera um sinal fraco para garantir um número adequado de contagem de fótons. Para medições in vivo e sinais brilhantes, ajuste o Tempo de Exposição para ~30 s. Se a imagem estiver saturada, um aviso será exibido. Se isso acontecer, reduza o tempo de exposição.
- Selecione o binning médio, F/stop 1 e escolha o campo de visão correto(FOV) (D para 5 animais).
- Ajuste a altura do sujeito para 1 cm ao fotografar ratos.
- Clique em Adicionar três vezes no Painel de Controle de Aquisição para obter uma sequência de três imagens, como replicação técnica.
- Abra o software de aquisição da BLI (ver Tabela de Materiais) e clique em Initialize no dispositivo de imagem (ver Tabela de Materiais) para testar a câmera e o sistema de controlador de palco e resfriar a câmera CCD a -90 °C.
- Imagiologia
- Coloque os camundongos na câmara de imagem na posição supina e use o cone do nariz múltiplo para manter a anestesia (isoflurane 1,5%) durante todo o experimento. Imagem de até 5 ratos simultaneamente e separe os animais usando o defletor de luz para evitar o reflexo.
- Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar a sequência de imagens.
- Preencha informações detalhadas sobre o experimento (animais selvagens e animais de nocaute, tratamentos, dia de imagem, etc.). As configurações de imagem, como o tempo de exposição, são salvas automaticamente.
- Remova os ratos da câmara de imagem e devolva-os para a gaiola. Verifique se há recuperação completa após a anestesia. Em poucos minutos, os animais devem estar totalmente acordados e explorativos. Não forneça analgesia, pois isso pode interferir no cursoUTI 18.
- Devolva as gaiolas aos racks ventilados até o próximo ciclo de imagem. Após a conclusão do experimento, eutanize os animais por asfixia de CO2 ou luxação cervical. Faça isso antes da recuperação da anestesia isoflurane para minimizar a angústia.
- Análise das imagens
- Inicie o software de imagem e carregue o arquivo experimental clicando em Procurar.
- Use a Paleta de ferramentas para ajustar a escala de cores da imagem. Padronize o aspecto visual dos resultados utilizando as mesmas configurações para todas as imagens, ou seja, use uma escala logarítmica com um mínimo de 104 a um máximo de 107 fótons. Esses ajustes não afetam os dados brutos, mas apenas a apresentação gráfica.
- Use as ferramentas do ROI para desenhar uma região de interesse (ROI) na imagem. Certifique-se de que o ROI é grande o suficiente para cobrir a área completa e usar as mesmas dimensões para todas as imagens. Aqui, um ROI quadrado de 3,5 cm x 4,5 cm foi colocado sobre o abdômen inferior.
- Clique na medição do ROI para quantificar a intensidade da luz (contagens ou fluxo total de fótons). Exporte esses dados e utilize a média das réplicas técnicas.
NOTA: As contagens representam o número de fótons detectados pela câmera e só devem ser usados para o controle de qualidade da imagem. Para relatar dados, use fluxo total de fótons. O fluxo total de fótons é mais fisiologicamente relevante, pois representa a luz emitida da superfície e é uma unidade calibrada, que é corrigida para o tempo de exposição (por segundo).
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Representative Results
In vivo BLI correlaciona-se com a UFC do inóculo no momento da instilação.
Para avaliar o limite de detecção do BLI in vivo e a correlação com a UFC do inóculo, os camundongos foram infectados com diferentes concentrações de UTI89-lux e PBS como controle negativo. Antes da instilação, animais não infectados eram escaneados para determinar a luminescência de fundo. As imagens subsequentes foram obtidas imediatamente após a instilação(Figura 1A). Após a instilação da UTI89-lux,a bioluminescência foi robustamente detectável acima de 2 x 104 UFC e foi estabelecida uma correlação linear entre a UFC do inóculo e a bioluminescência (Figura 1B). Em contraste, o fluxo total de fótons foi comparável aos sinais de fundo para animais instilados com PBS e na menor concentração bacteriana de 2 x 103 UFC.
BLI como ferramenta para acompanhamento longitudinal durante o tratamento
Para determinar se o efeito curativo de um tratamento antibiótico validado pode ser demonstrado usando bli longitudinal, 20 animais foram infectados com um inóculo de 2 x 107 UFC/50 μL, e 10 desses animais foram tratados com enrofloxacina 10 mg/kg subcutânea duas vezes por dia durante os primeiros 3 dias pós-infecção. Tanto a evolução natural do grupo controle infectado, mas não tratado, quanto o efeito do tratamento antibiótico na cinética da infecção no grupo tratado puderam ser visualizados em detalhes(Figura 2). Uma diminuição imediata da carga bacteriana, medida pelo fluxo total de fótons, foi observada após a primeira dose de enrofloxacina. Nenhum dos animais tratados teve um aumento subsequente na carga bacteriana. A variabilidade entre os sujeitos no grupo de controle infectado, mas não tratado, foi maior e a diminuição da carga bacteriana foi mais lenta. No dia 10, 8 em cada 10 animais do grupo controle haviam retornado a um sinal bli comparável ao seu fundo de pré-instilação. A carga bacteriana global para cada animal foi calculada utilizando-se a área sob a curva (AUC) do fluxo total de fótons transformado em tronco. Observou-se diferença significativa entre animais tratados com enrofloxacina e animais não tratados ao longo de 10 dias. Esses resultados demonstram que a BLI é uma ferramenta poderosa para avaliar o efeito de um tratamento potencial no curso da doença de uma UTI.
Figura 1: In vivo BLI correlaciona-se com a UFC do inóculo no momento da instilação. (A) Imagens representativas obtidas com in vivo BLI de camundongos infectados com concentrações crescentes de inóculo (2 x 103-2 x 108 CFU) imagens imediatamente após a instilação bacteriana na bexiga. CFU = Unidades formadoras de colônias. (B) Quantificação da bioluminescência emitida sobre a região da bexiga (fluxo total de fótons) em comparação com a concentração do inóculo (UFC). O sinal BLI foi detectado robustamente acima de 2 x 104 UFC (p = 0,0002 em comparação com o fundo e p = 0,015 em comparação com o controle pbs, t-test não pago). A correlação de Pearson para o inoculi variando de 2 x 103-2 x 108 UFC foi r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = fundo, PBS = Salina Tampão fosfato, CFU = Unidades de Formação de Colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: BLI como ferramenta para acompanhamento longitudinal durante o tratamento. (A) Traços individuais do fluxo total de fótons para animais infectados com 2 x 107 UFC de UTI89-lux e tratados com enrofloxacina 10 mg/kg duas vezes por dia durante 3 dias (azul) versus um grupo de controle não tratado (preto), n = 10 por grupo. BG = fundo. (B) Análise dos traços dos animais mostrados no painel A, relatando o AUC de fluxo total de fótons transformados em troncos tanto para o grupo enrofloxacin (azul) quanto para o grupo controle (preto). N = 10 por grupo, média ± SD, t-testnão remunerado p < 0,0001. AUC = Área sob a curva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vantagens da BLI em relação às contagens de UFC
Dados longitudinais
Uma grande desvantagem do método tradicional de contagem da UFC para quantificar a carga microbiana é a exigência de homogeneizações de órgãos post-mortem, fornecendo apenas um ponto de dados transversais por animal. Por outro lado, a BLI permite o acompanhamento longitudinal não invasivo de animais infectados. Os animais podem ser imagens de 2 a 3 vezes por dia, fornecendo uma visão detalhada da cinética da infecção. Além disso, medidas repetidas do mesmo animal reduzem drasticamente o número de animais necessários para experimentos adequadamente alimentados. Além disso, os pesquisadores podem se concentrar na variabilidade inter-individual e antes de examinar ou tratar animais com um novo agente, eles podem selecionar animais com cargas bacterianas pré-especificadas usando os dados em tempo real. Por outro lado, o uso do AUC de um experimento permite que os pesquisadores se concentrem na carga bacteriana global e não em um único valor transversal. O valor agregado dos dados longitudinais e em tempo real na configuração DAU não pode ser superestimado.
Identificação da disseminação da infecção
A resolução espacial das imagens obtidas com bli é adequada para identificar outros locais que são colonizados por patógenos lux ou FLucmarcados19. Para a UTI, as infecções ascendentes aos rins ou a disseminação no sangue são achados altamente relevantes. Neste cenário experimental, não foi observada qualquer propagação de infecções induzidas pela UTI89-lux além do trato urinário inferior. Isso era esperado considerando que essa cepa predominantemente causa cistite.
Reprodutibilidade e comparação de dados
A reprodutibilidade dos experimentos é maior ao usar bli em comparação com as contagens de UFC. Classicamente, os triplicados das diluições de 10 vezes de homogeneidades são emplacados e apenas as placas com 30 a 300 UFC são então contadas para calcular o número total de UFC. Este método é complicado, propenso a alta variabilidade, resulta em muitas placas fúteis, e é extremamente propenso a erros humanos. Além disso, não há consenso sobre como denunciar a UFC, ou seja, por grama de tecido bexiga, por bexiga ou por 1 mL homogeneizar. Isso torna a comparação dos resultados de diferentes grupos extremamente difícil e pode ser amenizada pelo uso de BLI e fluxo total de fótons.
Considerações e limitações do método
Além das considerações clássicas relacionadas à BLI in vivo, como a absorção de fótons por pele ou hemoglobina, existem algumas considerações a serem feitas ao correlacionar as contagens de BLI e CFU no momento do sacrifício.
Em primeiro lugar, as discrepâncias entre ambos os métodos no momento do sacrifício são encontradas20, especialmente quando as terapias com antibióticos são usadas. Portanto, a correlação entre a BLI e a CFU no momento do sacrifício pode ser subótima e não é necessariamente relevante. Para a BLI, o fluxo total de fótons pode ser menor do que o esperado, porque bactérias desafiadas podem redirecionar seu metabolismo para processos de recuperação e reparo, em vez de emissão de luz. Além disso, a medição bli captura um instantâneo das bactérias e seu metabolismo em tempo real in vivo, resultando em sinais bli mais baixos se as bactérias estão em um estado dormente ou alongado no momento da imagem. Por outro lado, para determinação da UFC, as bactérias desafiadas por drogas reagem de forma tudo ou nada depois de serem removidas de seu habitat infeccioso (ou seja, um biofilme) e banhadas. Uma vez banhadas no ágar, as bactérias desafiadas podem ser irremediavelmente feridas e incapazes de se desenvolver em colônias observáveis, resultando em menores contagens de UFC21. Além disso, bactérias desafiadas podem entrar em um estado viável, mas não culturalável (VBNC). Eles permanecem metabolicamente ativos e viáveis, mas não são mais culturais em mídias de laboratório padrão. Bactérias que entram no estado VBNC ou que são organizadas em biofilmes podem ser detectadas facilmente com BLI, enquanto a enumeração da UFC requer processamento adicional21,22,23. Em conclusão, a bioluminescência e as contagens viáveis medem diferentes aspectos da fisiologia celular e nem devem ser considerados como o indicador definitivo de viabilidade celular21.
Além disso, a definição de carga bacteriana medida pela contagem de BLI ou CFU é diferente devido a diferenças no processamento amostral. Ao usar a contagem de UFC, apenas as bactérias que residem dentro da parede da bexiga são incluídas no homogeneado e contadas. Em contrapartida, a BLI também captura fótons emitidos por bactérias na urina e na uretra. Em nossa opinião, esta última é uma representação fisiologicamente mais correta da carga bacteriana total, pois inclui todos os compartimentos anatomicamente relevantes (bexiga, urina e uretra).
Em contraste com as contagens de UFC, a BLI requer a geração de bactérias luminescentes geneticamente alteradas. Dependendo do local de inserção, é plausível que a introdução do lux operon no genoma possa alterar o potencial de virulência da cepa bacteriana. Portanto, ao desenvolver uma nova cepa bioluminescente, suas características de virulência e crescimento devem ser comparadas com a cepa parental10,13. No entanto, os recentes avanços na edição do genoma permitem uma marcação eficiente e assustadora de todos os principais patógenos bacterianos, limitando assim o impacto sobre a virulência ou as respostas ao tratamento. Além disso, a engenharia genética abre possibilidades para a expressão condicional dos genes repórteres de bioluminescência e, portanto, a medição in vivo de subpopulações bacterianas relevantes, expressão genética, etc24,25.
Finalmente, o acesso ao dispositivo avançado de imagem e ao software de aquisição para in vivo BLI pode ser um fator limitante em comparação com o equipamento básico necessário para a enumeração da UFC. No entanto, colaborações com núcleos de imagem podem minimizar os gastos e investimentos necessários para a BLI.
Considerações específicas para a implantação da BLI em um modelo in vivo UTI
Modelo animal
As vantagens de um modelo de UTI murina são três vezes maiores: permite o monitoramento da progressão da doença em um trato urinário mamífero, os animais e sua manutenção são relativamente baratos, e linhas mutantes estão disponíveis. Por outro lado, a indução da infecção geralmente implica cateterismo transuretral e subsequente instilação de uma alta dosagem de bactérias diretamente no lúmen da bexiga, contornando assim o processo natural de ascensão através da uretra5.
Habitação animal
Animais podem ser agrupados durante o experimento. Examinamos a ocorrência de transmissão entre animais da mesma gaiola, introduzindo animais sentinelas em gaiolas com animais infectados. Nenhum dos animais sentinelas tinha uma carga bacteriana detectável, medida tanto com UFC quanto com BLI.
Volume da bexiga
Ao combinar o modelo de UTI murina com bli, os pesquisadores devem manter em mente as propriedades anatômicas únicas da bexiga. A bexiga é um órgão oco que contém um volume variado de urina. Durante a UTI, a presença de urina infestada de bactérias poderia teoricamente influenciar a contagem total de fótons dependendo do grau de enchimento da bexiga. No entanto, a padronização do volume da bexiga é impraticável e pode intervir com o desenho experimental. Além disso, em nossa experiência, as diferenças no volume da bexiga não resultam em diferenças estatisticamente significativas no fluxo total de fótons.
Temperatura da amostra
In vitro BLI (ou como uma alternativa mais simples e barata, medindo bioluminescência em um luminômetro) também pode ser usado para determinar a carga bacteriana em homogeneizadores, urina ou suspensões bacterianas contendo UTI89-lux. No entanto, a temperatura da amostra é importante, pois a emissão de fótons resulta de uma reação enzimática e, portanto, requer atividade metabólica e presença de oxigênio. Mudanças drásticas na temperatura durante a colheita de órgãos devem ser evitadas permitindo que a amostra se calibrar no estágio aquecido (37 °C) 5 min antes da imagem.
Aplicações potenciais e importância
Em resumo, o método complicado de enumeração da UFC limitava a reprodutibilidade e eficácia da pesquisa no campo da UTI. A configuração experimental com a BLI avançará na pesquisa vivo UTI sobre fisiologia da bexiga, patogênese UTI e suscetibilidade, permitindo o acompanhamento longitudinal, ao mesmo tempo em que reduz o número de animais necessários para esses tipos de estudos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), o Conselho de Pesquisa de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e o VIB (para T.V.). W.E. é um pesquisador clínico sênior da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). A cepaUTI89-lux foi um presente generoso do laboratório13do Prof. Seed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
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