Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

Abstract

Primaire trilharen (PC) zijn niet-beweeglijke dynamische op microtubuli gebaseerde organellen die uitsteken uit het oppervlak van de meeste zoogdiercellen. Ze komen uit de oudere centriole tijdens de G1 / G0-fase van de celcyclus, terwijl ze uiteenvallen als de cellen opnieuw de celcyclus binnenkomen op de G2 / M-fasegrens. Ze functioneren als signaalhubs, door extracellulaire signalen te detecteren en te transduceren die cruciaal zijn voor veel celprocessen. Net als bij de meeste celtypen is aangetoond dat alle neocorticale neurale stam- en voorlopercellen (NSPC's) een PC herbergen waardoor ze specifieke signalen kunnen waarnemen en transduceren die nodig zijn voor de normale cerebrale corticale ontwikkeling. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren en karakteriseren van tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) celgebaseerde modellen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSCs) om de betrokkenheid van PC tijdens neocorticale ontwikkeling verder te ontleden. In het bijzonder presenteren we protocollen om de PC-biogenese en -functie in 2D neurale rozet-afgeleide NSPC's te bestuderen, inclusief de transductie van de Sonic Hedgehog (SHH) -route. Om te profiteren van de driedimensionale (3D) organisatie van cerebrale organoïden, beschrijven we een eenvoudige methode voor 3D-beeldvorming van in toto immunostained cerebrale organoïden. Na optische clearing maakt snelle acquisitie van volledige organoïden detectie van zowel centrosomen als PC op neocorticale voorlopers en neuronen van de hele organoïde mogelijk. Ten slotte beschrijven we de procedure voor immunostaining en clearing van dikke vrij zwevende organoïde secties die een aanzienlijke mate van 3D ruimtelijke informatie behouden en de hoge resolutie acquisitie mogelijk maken die nodig is voor de gedetailleerde kwalitatieve en kwantitatieve analyse van PC-biogenese en -functie.

Introduction

Primaire trilharen (PC) zijn op microtubuli gebaseerde organellen die een overvloed aan chemische en mechanische signalen uit de extracellulaire omgeving waarnemen en transduceren. In het bijzonder is PC het centrale organel voor de transductie van de egelsignaleringsroute bij gewervelde dieren1,2. Hoewel de meeste neurale cellen al lang een PC herbergen, is de bijdrage van dit organel aan het vormgeven van het centrale zenuwstelsel lang ondergewaardeerd. Studies naar neocorticale ontwikkeling hebben geleid tot de ontdekking van meerdere neurale stam- en voorlopercellen (NSPC's), die allemaal een PC herbergen, waarvan de locatie is voorgesteld als cruciaal voor de bepaling van het lot van de voorloper3,4,5,6,7. Pc is cruciaal gebleken voor celmechanismen die nodig zijn voor normale cerebrale corticale ontwikkeling, waaronder NSPC-expansie en commitment8,9,10,11,12, evenals apicobasale polariteit van radiale gliale scaffold die neuronale migratie ondersteunt13. Bovendien is PC vereist tijdens interneuronen tangentiële migratie naar de corticale plaat14,15. Ten slotte is een rol voor de PC voorgesteld bij het tot stand brengen van synaptische verbindingen van neuronen in de hersenschors16,17. Al met al pleiten deze bevindingen voor een cruciale rol van PC bij belangrijke stappen van cerebrale corticale ontwikkeling18,19 en verhogen ze de noodzaak om hun betrokkenheid bij de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan anomalieën van cerebrale corticale ontwikkeling te onderzoeken.

Recente studies hebben ons begrip van belangrijke cellulaire en moleculaire verschillen tussen corticale ontwikkeling in menselijke en dierlijke modellen grotendeels verbeterd, met de nadruk op de noodzaak om menselijke modelsystemen te ontwikkelen. In deze visie vertegenwoordigen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSCs) een veelbelovende benadering om ziektepathogenese te bestuderen in een relevante genetische en cellulaire context. Adherenante tweedimensionale (2D) celgebaseerde modellen of neurale rozetten bevatten NSPC's die vergelijkbaar zijn met die in de zich ontwikkelende hersenschors, die worden georganiseerd in rozetvormige structuren met de juiste apicobasale polariteit20,21,22. Bovendien maakt het driedimensionale (3D) kweeksysteem de generatie van dorsale voorhersenenorganoïden mogelijk die veel kenmerken van de menselijke cerebrale corticale ontwikkeling samenvatten23,24,25,26. Die twee complementaire celgebaseerde modelleringsbenaderingen bieden opwindende perspectieven om de betrokkenheid van PC tijdens de normale en pathologische ontwikkeling van de hersenschors te ontleden.

Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren en karakteriseren van neurale rozetten en afgeleide NSPC's en dorsale voorhersenenorganoïden. We bieden ook gedetailleerde protocollen om de biogenese en functie van PC aanwezig op NSPC's te analyseren door de transductie van de Sonic Hedgehog-route te testen en de dynamiek van cruciale moleculen die betrokken zijn bij deze route te analyseren. Om te profiteren van de 3D-organisatie van de cerebrale organoïden, hebben we ook een eenvoudige en kosteneffectieve methode opgezet voor 3D-beeldvorming van in toto immunostained cerebrale organoïden die snelle acquisitie mogelijk maken, dankzij een lichtbladmicroscoop, van de hele organoïde, met hoge resolutie waardoor PC kan worden gevisualiseerd op alle soorten neocorticale voorlopers en neuronen van de hele organoïde. Ten slotte hebben we de immunohistochemie aangepast op 150 μm vrij zwevende secties met daaropvolgende clearing en acquisitie met behulp van resonant scanning confocale microscoop die beeldacquisitie met hoge resolutie mogelijk maakt, wat nodig is voor de gedetailleerde analyse van PC-biogenese en -functie. In het bijzonder maakt 3D-beeldvormingssoftware 3D-reconstructie van pc mogelijk met daaropvolgende analyse van morfologische parameters, waaronder lengte, aantal en oriëntatie van pc, evenals signaalintensiteitsmeting van ciliaire componenten langs het axoneme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generatie van 2D hIPS-celgebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling

  1. Neurale rozetvorming
    1. Begin met hIPSC-culturen met grote reguliere kolonies, met minder dan 10% differentiatie en niet meer dan 80% samenvloeiing.
    2. Spoel de hIPSCs af met 2 ml PBS.
    3. Voeg 2 ml NSPC-inductiemedium toe, aangevuld met de Rock-remmer (NIM + 10 μM Y-27632).
    4. Ontleed elke hIPSC-kolonie handmatig uit één schaal van 35 mm met behulp van een naald om elke kolonie precies in horizontale en verticale richtingen te snijden om een dambordpatroon te creëren dat elke kolonie in gelijke clusters verdeelt.
    5. Maak de kolonie los met behulp van een celschraper en breng ze over op een schaal van 35 mm met ultralaag opzetstuk.
    6. Laat ze een nacht (ON) drijven in een bevochtigde couveuse bij 37 °C en 5% CO2, zodat ze embryoïde lichamen (EB's) kunnen vormen.
      OPMERKING: Embryoïde lichamen (EB's) worden gedefinieerd als zwevende sferoïde clusters of aggregaten van hIPSCs.
    7. Breng de EB's over in poly-L-ornithine/laminine (PO/lam)-gecoate 35 mm schotels in 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Ververs dagelijks NSPC-inductiemedium (NIM zonder Y-27632) tot de vorming van neurale rozetten die ongeveer 12 tot 14 dagen duurt. Controleer onder de microscoop.
      OPMERKING: Na deze stap kunnen neurale rozetten worden uitgebreid, gedifferentieerd en verwerkt voor immunostaininganalyse of gedissocieerd om geïsoleerde neurale stam- en voorlopercellen (NSPC's) te krijgen.
  2. Neurale rozetexpansie en vroege differentiatie
    1. Knip neurale rozetten in een rasterachtig patroon met een naald en verwijder de clusters met behulp van een celschraper.
    2. Breng de rozetten over in een 4-well plaat met PO/lam-coated glazen coverslip (4-5 rozetten/put) in 0,5 ml NSPC onderhoudsmedium (NMM).
    3. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
    4. Ververs NMM om de dag tot dag 20.
    5. Vanaf dag 20 raakten kweekneurale rozetten in 0,5 ml cytokine NMM uitgeput om differentiatie mogelijk te maken. Ververs het medium om de 2-3 dagen.
    6. Op dag 30 en dag 40 (10 of 20 dagen differentiatie), fixeer de rozetten met 0,5 ml van 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC-biogenese en functieanalyse op geïsoleerde NSPC's
    1. NSPC-dissociatie
      1. Knip neurale rozetten uit stap 1.1.8 in een rasterachtig patroon met een naald en maak de clusters los met behulp van een celschraper. Breng de cellen over in PO/lam-coated 35 mm schotels in 2 ml NMM en incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
      2. Ververs NMM om de andere dag tot confluentie (ongeveer 5-7 dagen).
      3. Nadat je de grote, heldere cellen rond neurale rozetten hebt weggeschraapt, pluk je ze handmatig en breng je ze over op verse PO / lam-coated 35 mm-schotels om te verrijken voor NSPC's en niet-neurale celtypen uit te putten.
      4. Na een of twee handmatige passages (herhaal stap 1.3.1.3 indien nodig) die nodig zijn om alle verontreinigende celtypen te verwijderen, verwijdert u het medium en spoelt u het met PBS.
      5. Voeg 300 μL 0,05% trypsine toe en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C totdat de meeste cellen loskomen.
      6. Voeg 2 ml van het medium met 10% FBS (DMEM + 10% FBS) toe om het trypsine te inactiveren. Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 ml. Pipetteer de celsuspensie drie keer voorzichtig op en neer om de celklonten te breken.
      7. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
      8. Adem het supernatant zorgvuldig op en resuspend de cellen in NMN.
      9. Zaai de gedissocieerde NSPC's als afzonderlijke cellen (1 x 105 cellen/cm2) in NMM op PO/lam-coated schotels en incubeer ze in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
      10. Breid NSPC's in NMM uit door het medium om de dag te vervangen.
        OPMERKING: NSPC's worden met hoge dichtheid gezaaid om differentiatie te voorkomen.
    2. PC biogenese analyse
      1. Zaad dissocieerde NSPC's bij 100.000 cellen/cm2 en incubeer ze in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 in NMM gedurende 2 dagen.
      2. Zuig het medium op en verhonger NSPC's in cytokine-uitgeput medium (NSPC-uithongeringsmedium, aanvullende tabel 1) gedurende 48 uur.
      3. Fix NSPC's met 4% PFA gedurende 20 minuten bij RT.
      4. Tweemaal wassen met PBS gedurende 5 minuten bij RT voordat u immunostaining gebruikt.
    3. PC-functieanalyse: SHH-signaleringspad
      1. Zaad dissocieerde NSPC's bij 100.000 cellen/cm2 op PO/lam-coated 8-well Chamber Slides (300 μL) of T25 schotels (5 ml) en incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 in NMM gedurende 2 dagen.
      2. Verhonger NSPC's in NSPC-uithongeringsmedium (300 μL per put van 8-putkamerschuif en 5 ml in T25-kolf) gedurende 48 uur.
      3. Om de SHH-route te induceren, incubeert u de NSPC's met het uithongeringsmedium aangevuld met recombinant SHH (100 ng / ml) of SAG (500 nM); (150 μL per put van een 8-putkamerschuif en 2 ml in T25-kolf) gedurende 24 uur.
      4. Fix NSPC's gekweekt op 8-well Chamber Slides in 250 μL van 4% PFA per put gedurende 20 minuten bij RT en was ze tweemaal met 250 μL PBS gedurende 5 minuten bij RT vóór immunostaininganalyse.
      5. Verwijder het medium en was NSPC's gekweekt in T25-gerechten met PBS.
      6. Voeg 500 μL 0,05% trypsine toe en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C totdat de cellen loskomen.
      7. Voeg 2 ml medium met 10% FBS (DMEM + 10% FBS) toe om het trypsine te inactiveren en verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 ml.
      8. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en zuig het supernatant zorgvuldig op om NSPC-pellets te verkrijgen die kunnen worden gecryopreserveerd bij -80 °C vóór RNA-extractie en RT-PCR-analyse.

2. Generatie van dorsale voorhersenenorganoïden

  1. Eencellige kweek van hIPSC's
    1. Begin met hIPSC-culturen met grote reguliere kolonies die minder dan 10% differentiatie vertonen en die bijna één keer zijn gepasseerd. Zorg ervoor dat de cellen niet meer dan 80% confluent zijn.
    2. Was de kolonies met 2 ml PBS.
    3. Voeg 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) toe en incubeer gedurende 5 tot 7 minuten bij 37 °C.
    4. Zuig de GCDR op en voeg 2 ml mTeRS1 medium toe, aangevuld met 5 μM Y-27632.
    5. Pipetteer de cellen 10 keer zachtjes op en neer om alle kolonies in afzonderlijke cellen te dissociëren.
    6. Breng de cellen over op met vitronectine beklede schotels en incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Voer ten minste 1 passage van de hIPSC's uit met behulp van GCDR voorafgaand aan het differentiatie-experiment om de hIPSC's aan te passen aan eencellige kweekomstandigheden.
  2. Laat op dag 0 hIPSC's embryonale lichamen vormen in EB-medium met een lage concentratie FGF2 en een hoge concentratie steenremmer die nodig is voor hIPSC-overleving. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
    1. Was de kolonies met 2 ml PBS.
    2. Voeg 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) toe en incubeer gedurende 5 tot 7 minuten bij 37 °C.
    3. Zuig de GCDR op en voeg 1 ml EB-medium toe, aangevuld met 50 μM Y-27632; Gebruik een pipet van 1 ml om de cellen voorzichtig los te maken en over te brengen naar een conische buis van 15 ml.
    4. Spoel nogmaals met 2 ml EB-medium aangevuld met 50 μM Y-27632, breng de resterende cellen over naar de conische buis van 15 ml. Voeg onmiddellijk 3 ml EB-medium aangevuld met 50 μM Y-27632 toe aan de conische buis en homogeniseer de oplossing voorzichtig met een pipet van 5 ml.
    5. Centrifugeer de gedissocieerde cellen gedurende 5 minuten bij 100 x g .
    6. Adem het supernatant voorzichtig op en resuspend de cellen in 6 ml EB-medium aangevuld met 50 μM Y-27632.
    7. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 100 x g .
    8. Adem het supernatant op en resuspend de cellen in 1 ml EB-medium aangevuld met 50 μM Y-27632. Gebruik een pipet van 1 ml om de cellen voorzichtig te dissociëren in een eencellige suspensie.
    9. Onmiddellijk na het resuspendiëren van de cellen, verdun en tel ze.
    10. Verdun het juiste volume celsuspensie (met 900.000 cellen) tot 30 ml EB-medium aangevuld met 50 μM Y-27632 en 4 ng /ml bFGF en meng de oplossing voorzichtig.
    11. Plaat 9.000 cellen/put in een ultra-lage bevestiging 96U plaat (300 μL/put). Om verstoring van ebvorming te voorkomen, incubeert u de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 tot dag 3 zonder medium verandering.
  3. Neurale inductie (Dubbele SMAD-remming)
    1. Zorg er op dag 3 voor dat EB's 300-400 μm meten en regelmatige grenzen aangeven. Als beide criteria zijn bereikt, vervangt u de helft van het medium (150 μL) door inductiemedium-1 met dubbele SMAD-remmers, wat leidt tot verheldering van de contouren van de EB's door dag 6 tot dag 7, wat wijst op neuro-ectodermale differentiatie (aanvullende tabel 2).
    2. Vervang op dag 4 3/4 van het medium (225 μL) door inductiemedium-1.
    3. Op dag 6 en dag 8: Ververs de helft van het inductiemedium-1 (150 μL).
  4. Organoïde inbedding in keldermembraanmatrix (dag 10)
    1. Op dag 10, embed EB's in groeifactor gereduceerde keldermembraan matrix (BMM).
      OPMERKING: Gebruik vanaf deze stap altijd een steriele schaar om de opening van de pipetpunten te knippen om te voorkomen dat de organoïden worden beschadigd door herhaaldelijk pipetteren.
    2. Eerste overdracht rond 15-17 organoïden in conische buizen. Laat de EB's bezinken en verwijder het medium. Voeg 50 μL inductiemedium-2 toe en breng ze over in een microcentrifugebuis met 100 μL BMM.
    3. Verspreid het matrix-EB-mengsel over het midden van een put van een ultralaag bevestigde plaat en scheid de EB's om te voorkomen dat ze samensmelten.
    4. Laat de BMM stollen in de couveuse bij 37 °C gedurende 45 minuten.
    5. Voeg 3 ml van het inductiemedium-2 toe in elke put en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat deze procedure zo snel mogelijk wordt uitgevoerd, omdat BMM stolt bij kamertemperatuur.
  5. Stationaire cultuur van organoïden ingebed in keldermembraanmatrix
    1. Dag 12, 14: Ververs inductie medium-2.
    2. Dag 16: Ververs inductiemedium-2 en controleer onder een microscoop de uitzetting van neuro-epitheliale lussen.
  6. Keldermembraanmatrixdissociatie en cultuur op een orbitale shaker
    1. Dissociëren organoïden op dag 17 van BMM door 10 keer op en neer te pipetteren met een pipet van 5 ml en breng ze over in differentiatiemedium-1 (zonder vitamine A). Incubeer op een orbitale shaker bij 80 tpm in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de voedingsabsorptie te verbeteren.
      OPMERKING: Gebruik een andere incubator voor stationaire cultuur en cultuur op een orbitale shaker om trillingen te voorkomen die schadelijk zijn voor de aanhangende hIPS-celgroei.
    2. Dag 19: Ververs differentiatie medium-1.
    3. Dag 21: Verander differentiatie medium-1 naar differentiatie medium-2 (met vitamine A).
    4. Van dag 23 tot dag 35: Ververs medium met differentiatie medium-2 om de 2-3 dagen.
    5. Van dag 35 tot dag 70: Ververs differentiatie medium-2 met 1% BMM en ververs elke 2-3 dagen.
    6. Verzamel de organoïden na 28, 42 en 70 +/- 2 dagen differentiatie en fixeer ze 's nachts bij 4 °C, in 5 ml 4% PFA op een conische buis van 15 ml.
    7. Voor verdere in toto - of vrij zwevende immunostaininganalyse worden organoïden vervolgens tweemaal in PBS gespoeld en bij 4 °C geconserveerd in PBS + 0,05% natriumazide.
    8. Voor immunostaininganalyse op bevroren secties, dompel 4% PFA-vaste organoïden onder in 10 ml 30% sucrose bij +4 °C AAN (of totdat organoïden zinken). Sluit ze in een bevroren inbeddingsmatrix in en bewaar ze bij -80 °C tot cryosectie.

3. In toto immunolabeling, clearing en lightsheet acquisitie van dorsale voorhersenenorganoïden

  1. Fixatie
    1. Verzamel de organoïden in 6-well platen, verwijder het medium en fixeer ze met 2 ml van 4% PFA, bij 4 °C, 's nachts.
    2. Voer drie wasbeurten uit in 2 ml PBS bij kamertemperatuur.
    3. Breng de organoïden over in buizen van 2 ml en bewaar bij 4 °C in 2 ml PBS + 0,05% natriumazide.
  2. Permeabilisatie
    1. Incubeer organoïden in 1 ml PBS met 0,2% Triton X100 bij RT gedurende 1 uur. Doe dit twee keer.
    2. Incubeer in 1 ml PBS met 0,2% Triton X100 en 20% DMSO, bij 37 °C, gedurende de nacht.
    3. Incubeer in 1 ml PBS met 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% deoxycholaat, 0,1% NP40 en 20% DMSO, bij 37 °C, gedurende de nacht.
    4. Incubeer in 1 ml PBS met 0,2% Triton-X100, bij RT, gedurende 1 uur. Doe dit twee keer.
  3. Blokkeren en immunolabelen
    1. Blok in 1 ml blokkerende oplossing (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum, 10% DMSO), bij 37 °C, AAN.
    2. Incubeer met primaire antilichamen verdund in 250 μL PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml heparine, 5% DMSO en 3% ezelserum, bij 37 °C, gedurende 2 dagen.
    3. Was gedurende 1 uur 1 ml PBS met 0,2% Tween20 en 0,1 μg/ml heparine bij 37 °C. Doe dit vier keer.
    4. Wassen in 1 ml PBS met 0,2% Tween20 en 0,1 μg/ml heparine, 's nachts, bij 37 °C.
    5. Incubeer met secundaire antilichamen verdund in 250 μL PBS met 0,2% Tween 20, 0,1 μg/ml heparine en 3% Donkey Serum, bij 37 °C, gedurende 2 dagen.
    6. Was in 1 ml PBS met 0,2% Tween 20 en 0,1 μg/ml heparine gedurende 1 uur op een wiel bij RT. Doe dit vier keer.
    7. Wassen in 1 ml PBS met 0,2% Tween 20 en 0,1 μg/ml heparine, 's nachts, op een wiel, bij RT.
    8. Wassen in 1 ml PBS, gedurende 24 uur, bij RT.
    9. Voorraad bij +4 °C in 1 ml PBS en 0,05% natriumazide tot het klaar is.
  4. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Incubeer de organoïden in 1 ml van 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS), gedurende 24 uur, bij RT.
    2. Incubeer in 1 ml van 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS), gedurende 24 uur, bij RT.
    3. Incubeer in 1 ml van 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS), gedurende 24 uur, bij RT.
  5. Organoïde inbedding voorafgaand aan de verwerving van lichtplaten
    OPMERKING: Gebruik een op maat gemaakt systeem; gemaakt met een spuit van 1 ml met de punt gesneden met een scalpel.
    1. Bereid 100 ml 4% laagsmeltende agarose in 60% TDE-oplossing en aliquot in buizen van 2 ml. Bewaren bij +4 °C.
    2. Verwarm voorafgaand aan de organoïde-inbedding een buis met 1,5 ml 4% laagsmeltende agarose in 60% TDE voor in een waterbad bij 37 °C totdat deze vloeibaar wordt.
    3. Bereid ondertussen een op maat gemaakt vormsysteem voor dat is gemaakt van een spuit van 1 ml waarvan de punt wordt afgesneden met behulp van een scalpel.
    4. Pomp in de spuit 600 μL van de geloplossing met behulp van de zuiger.
    5. Plaats het monster met behulp van een vergrote pipetpunt waarvan de opening met een steriele schaar is gesneden.
    6. Vul de spuit met 400 μL geloplossing zodat het monster zich in het onderste derde deel van de spuit bevindt.
    7. Laat de gel polymeriseren en bewaar in 80% TDE-oplossing bij 4 °C beschermd tegen licht tot aan de verwerving.
    8. Gebruik voor de verwerving van lichte platen een 20x-objectief ondergedompeld in een 80% TDE-oplossing die in de monsterkamer is toegevoegd om nauwkeurig aan te passen aan de brekingsindex van de clearingmethode.
    9. Plaats de spuit met de in agarose ingebedde organoïde in de grootste monsterhouder die is ontworpen voor een spuit van 1 ml waarvan de zuiger kan worden bediend om de organoïde voor het objectief te plaatsen.
      OPMERKING: Lichte plaatverwerving van een hele organoïde duurt ongeveer 5 tot 10 minuten.

4. Immunostaining en clearing van vrij zwevende delen van dorsale voorhersenenorganoïden

  1. Fixatie, agarose inbedding en sectie van de organoïden
    1. Verzamel organoïden na 28, 42 en 70 +/- 2 dagen differentiatie in een 6-well plaat en fixeer 's nachts bij 4 °C in 2 ml van 4% PFA.
    2. Spoel tweemaal in 2 ml PBS en bewaar bij 4 °C in 2 ml PBS + 0,05% natriumazide.
    3. Integreer de vaste organoïden in 4% laagsmeltende agarose in een plastic inbeddingsvorm (7 x 7 mm). Verwijder voorzichtig het agaroseblok uit de plastic mal en lijm het op het vibratome-stadium.
    4. Sectie de ingebedde organoïden met behulp van een vibratoom om 150 μm vrij zwevende secties te verkrijgen die worden overgebracht in een put van een 24-putplaat met 500 μL PBS met behulp van een verfkwast om beschadiging van de secties te voorkomen.
      OPMERKING: Laagsmeltende agarose wordt aanbevolen omdat de smelttemperatuur slechts ongeveer 60 °C is. Bereid 4% laagsmeltende agarose in PBS-oplossing en laat het net boven 37 °C afkoelen in een waterbad voordat organoïden worden ingesloten.
  2. Permeabilisatie, blokkering en immunostaining
    1. Incubeer de secties in 500 μL PBS met 0,3% Triton X100, bij RT, onder roeren, gedurende 20 minuten. Doe dit drie keer.
    2. Incubeer de secties in 500 μL PBS met 0,3% Triton X100 en 5% magere melk, bij RT, onder roeren, gedurende 2 uur.
    3. Incubeer de secties in 250 μL primaire antilichaamoplossing (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% magere melk), onder agitatie, bij +4 °C, 's nachts.
    4. Was de secties in 500 μL PBS, bij RT, onder roeren, gedurende 20 minuten. Doe dit vier keer.
    5. Incubeer de secties in 250 μL secundaire antilichaamoplossing (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% magere melk), bij RT, onder agitatie, gedurende 2 uur.
    6. Was de secties in 500 μL PBS, bij RT, onder roeren, gedurende 20 minuten. Doe dit vier keer.
    7. Bewaar de secties in 500 μL PBS, bij +4°C totdat ze zijn opgeruimd.
  3. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Incubeer de secties in 500 μL van 30% en 60% TDE gedurende 1 uur elk bij RT, en vervolgens in 500 μL van 80% TDE 's nachts, bij RT.
    2. Bewaar de vrijgemaakte secties in 500 μL van 80% TDE tot de verwerving bij +4 °C.
  4. Montage van vrij zwevende secties voorafgaand aan de verwerving met resonant scanning confocal
    1. Monteer een vrij zwevend gedeelte in een afgesloten kamer om het monster in 80% TDE-oplossing te houden en ontworpen om zich aan te passen aan een gemotoriseerd XY-stadium van confocale microscopen.
    2. Plaats een ronde afdekplaat in het kamersysteem.
    3. Breng het vrijgemaakte immunogekleurde gedeelte voorzichtig over met een penseel.
    4. Vul de kamer met 80% TDE-oplossing.
    5. Voeg twee standaard coverslips toe plus een tweede ronde coverslip en een siliconen afdichting.
    6. Schroef de schroefring van de kamer vast om het systeem perfect af te sluiten.

5. Lichtblad en resonante scanning confocale analyse

  1. Verwerk lichtblad- en resonante scanacquisitie met behulp van software die 3D-visualisatie en analyse van het volledige immunostained-monster mogelijk maakt.
    OPMERKING: Dergelijke software maakt het mogelijk om snel enorme gegevens te openen om eenvoudig snapshots en animaties te maken. Het maakt het mogelijk om het monster in verschillende richtingen te verplaatsen en 2D-weergaven te genereren dankzij een 2D-slicertool in verschillende oriëntaties, bijvoorbeeld XY en YZ.
  2. Voor automatische detectie van zowel centrosomen als primaire trilharen, gebruikt u een spotwizard waarmee u hun aantal kunt kwantificeren in pathologische versus controleomstandigheden.
  3. Voor 3D-reconstructie van de pc die een nauwkeurige meting van hun lengte mogelijk maakt, gebruikt u een filamentwizard om het startpunt van de pc handmatig te fixeren en de software gebruikt het fluorescentiesignaal om de pc nauwkeurig te reconstrueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2D hIPS-celgebaseerde modellen om primaire ciliumbiogenese en -functie te bestuderen
Het hier beschreven protocol is aangepast van eerder gepubliceerde studies20,21,22. Dit protocol maakt het mogelijk om neurale rozetstructuren te genereren die neocorticale voorlopers en neuronen bevatten die vergelijkbaar zijn met die in de zich ontwikkelende neocortex. Gedetailleerde validatie kan worden uitgevoerd door conventionele immunostaininganalyse met behulp van specifieke makers3. Apicale voorlopercellen (AP) moeten bijvoorbeeld dubbel gekleurd zijn met SOX2 en PAX6, intermediaire voorlopercellen (IP) worden onthuld door TBR2 / EOMES-kleuring en vroeggeboren neocorticale neuronen worden onthuld door CTIP2-kleuring (figuur 1A-C). Dergelijke neurale rozetachtige structuren modelleren interkinetische nucleaire migratie (INM) van AP die kan worden gevisualiseerd door immunostaining met antilichamen tegen fosfo-vimentine, dat mitotische kernen en TPX2 kleurt dat de mitotische spindel kleurt. Deze markers maken het daarom mogelijk om verschillende kenmerken van AP te analyseren, waaronder de INM met celdeling die acual rond het centrale lumen plaatsvindt (figuur 1D, D'), evenals de delingsmodus die wordt bepaald door de hoek tussen het scheidingsvlak en het apicale oppervlak te meten. Ten slotte kan ciliogenese worden geanalyseerd door immunostaining met antilichamen tegen PCNT, die het basale lichaam van PC kleurt, en ARL13B die het axoneme kleurt. Op dergelijke rozetstructuren strekt PC zich uit van de apicale pool van AP's naar het centrale lumen van elk ventrikelachtig gebied (figuur 1E, E'), terwijl ze ook uitsteken uit CTIP2 + -neuronen (figuur 1E '').

Dissociatie van deze rozetstructuren maakt het mogelijk om geïsoleerde NSPC's te verkrijgen die zijn gekweekt op poly-L-ornithine / laminine-gecoate cultuurplaten in NMM met een hoge dichtheid om een stabiele en uitbreidbare populatie van NSPC's gedurende ten minste 15 passages mogelijk te maken zonder karyotypeafwijkingen te accumuleren21,27. Om pc-biogenese te analyseren, worden gedissocieerde NSPC's gekweekt tot samenvloeiing en uitgehongerd gedurende 48 uur. Immunostaininganalyses met antilichamen tegen PC-markers tonen aan dat die NSPC's PC herbergen (figuur 2A). Door twee complementaire open-source tools te combineren, Ilastik, een op machine learning gebaseerde beeldanalysetool die nuttig is voor pc-segmentatie28 en CiliaQ, een Fiji / ImageJ-plug-inpakket29, die 3D-reconstructie van pc van 3D confocale beeldstapels mogelijk maken, kunnen verschillende structurele parameters eenvoudig worden geëvalueerd, waaronder het aantal pc's en hun lengte.

Pc-functie van NSPC's kan ook worden geëvalueerd door de transductie van de egelsignaleringsroute te testen. Om de transductie van de SHH-signaalroute te beoordelen, worden NSPC's gedurende 48 uur uitgehongerd en gedurende 24 uur behandeld met recombinant SHH (rSHH) of een gladgestreken agonist (SAG). Met behulp van antilichamen tegen GPR161, SMO en GLI2, immunofluorescentie (IF) analyse maakt het mogelijk om de handel van deze belangrijke SHH-signaalacteurs langs de PC te testen, waarbij GPR161 normaal gesproken de PC verlaat terwijl GLI2 en SMO zich ophopen in de PC als reactie op SHH-routeactivering (Figuur 2C-D). Analyse van 3D confocale beeldstapels met behulp van CiliaQ-tools maakt het kwantificeren van GPR161-exit van de pc en GLI2- en SMO-accumulatie binnen de pc na activering van de SHH-route (figuur 2F-G). Bovendien toont semi-kwantitatieve RT-PCR-analyse op mRNA geëxtraheerd uit rSHH- of SAG-behandelde NSPC's de inductie van twee SHH-doelgenen, GLI1 en PTCH1, wat getuigt voor normale SHH-signaaltransductie in NSPC's afgeleid van controle-hIPSC's (figuur 2B).

Over het algemeen reproduceren 2D-celgebaseerde modellen van het ontwikkelen van dorsale voorhersenen duidelijk verschillende aspecten van de normale ontwikkeling van de hersenschors en vertegenwoordigen ze veelbelovende hulpmiddelen om PC-geassocieerde mechanismen te ontleden die ten grondslag liggen aan anomalieën van neocortica met behulp van controle versus patiënt hIPSCs die mutaties herbergen in genen die verantwoordelijk zijn voor menselijke ontwikkelingsanomalieën van de hersenschors.

3D hIPS-celgebaseerde modellen om primaire betrokkenheid van cilium tijdens neocorticale ontwikkeling te bestuderen
Het hier beschreven protocol (figuur 3A) is aangepast van eerder gepubliceerde protocollen23,24,25,26,30 en met succes getest op vijf verschillende controle hIPSC-lijnen. Het maakt het genereren van hIPSC-afgeleide dorsale voorhersenenorganoïden mogelijk die in de loop van de tijd in omvang toenemen terwijl ze grote neuro-epitheliale lussen vormen (figuur 3B). Immunolabelinganalyse op organoïde cryosecties (cryostaat, 20 μm), vrij zwevende secties (vibratome, 150 μm) of in toto kan worden uitgevoerd voor kwaliteitscontroles. Op dag 28 ± 2 bestaan organoïden uit gestratificeerde neuro-epitheliale lussen die de neurale voorlopermarker SOX2 en de dorsale voorhersenenmarker PAX6 tot expressie brengen, wat de identiteit van de dorsale voorhersenen bevestigt. Op dag 42 ± 2 (6 weken differentiatie) zouden die lussen een complexere gelaagde organisatie moeten vertonen. Van het apicale tot het basale oppervlak van deze lusstructuren kan een ventriculaire zone (VZ)-achtig gebied met SOX2/PAX6-positieve apicale radiale gliale voorlopercellen (aRG) worden afgebakend, evenals een subventriculaire zone (SVZ)-achtig gebied met TBR2-positieve intermediaire voorlopers (IP's) en een corticale plaat (CP)-achtig gebied met CTIP2-positieve vroeggeboren neocorticale neuronen (figuur 3C, E). De apicale moleculaire polariteit van aRG kan worden geëvalueerd door de apicale verrijking aan het ventriculaire oppervlak van ZO-1 en N-CADH (Figuur 4A, Video 1). De eigenschappen van de aRG-voorloperverdeling kunnen worden geëvalueerd met behulp van TP2X- en P-VIM-markers om INM te analyseren dat normaal gesproken leidt tot de uitlijning van aRG-mitotische kernen aan het ventriculaire oppervlak van de corticale lussen (figuur 4B, video 2). Een dergelijke immunolabeling maakt het ook mogelijk om de delingshoek te meten om de symmetrische versus asymmetrische delingsmodus van aRG te evalueren. P-Vim positieve voorlopers kunnen ook worden waargenomen in het SVZ-achtige gebied, met een uniek basaal proces dat zich uitstrekt tot het basale oppervlak dat doet denken aan buitenste radiale glia (oRG of basale radiale glia, figuur 4C, video 2). Hoewel ze afwezig zijn vanaf dag 42 organoïden, moeten SATB2-positieve laatgeboren neuronen worden gedetecteerd vanaf dag 70 (10 weken differentiatie) (figuur 3D, F), wat getuigt van in vivo-achtige timing van neocorticale neuronale differentiatie.

Immunolabeling experimenten met behulp van het basale lichaam (gamma Tubulin) en axoneme (ARL13B) markers maken visualisatie van PC op 20 μm cryosecties mogelijk (Figuur 3G,H). Om te profiteren van de 3D-organisatie van dorsale voorhersenenorganoïden, kan whole-mount immunostaining worden uitgevoerd. Lichtbladacquisitie van dergelijke in toto-immunogekleurde en geklaarde organoïden maakt detectie van zowel centrosomen als PC mogelijk op alle NSPC-typen en op neocorticale neuronen (video 3). Om nauwkeurigere analyses van pc-biogenese uit te voeren, kan bovendien immunohistochemische analyse worden uitgevoerd op vrij zwevende dikke secties (150 μm) van dorsale voorhersenenorganoïden. Na het opruimen kunnen dergelijke secties worden verkregen met behulp van een 40x (NA 1.3) of 63x (NA 1.4) olieobjectief van een omgekeerde resonerende confocale lasermicroscoop, waardoor de resolutie kan worden verbeterd met behoud van de 3D ruimtelijke informatie van organoïden. Een dergelijke confocale laserscanmicroscoop maakt snelle verwerving van dikke secties mogelijk, met een nauwkeurige en flexibele excitatie en detectie zonder enige interferentie (Video 4). Verschillende structurele parameters van pc kunnen worden geëvalueerd, waaronder pc-nummer, lengte en oriëntatie, met behulp van 3D-beeldvormingssoftware. Speciale open-source, vrij beschikbare tools zoals Ilastik28, een op machine learning gebaseerde beeldanalysetool en het CiliaQ-plug-inpakket op Fiji / ImageJ29 zijn zeer nuttig voor automatische pc-segmentatie die daaropvolgende kwalitatieve en kwantitatieve analyse van pc-biogenese en functie in controle versus pathologische omstandigheden mogelijk maakt.

Figure 1
Figuur 1: Generatie en karakterisering van 2D neurale rozetten. Immunohistochemische karakterisering van neurale rozetstructuren met behulp van (A) SOX2- en PAX6-antilichamen om AP te detecteren, (B) TBR2 / EOMES om IP te onthullen en (C) CTIP2 om vroeg geboren neocorticale neuronen te kleuren. Prolifererende AP worden gedetecteerd met fosfo-vimentine- en TPX2-antilichamen en bevinden zich aan het apicale oppervlak (D,D'). PC worden onthuld door dubbele immunostaining met PCNT- en ARL13B-antilichamen. PC strekt zich uit van elk AP naar het centrale lumen van elke rozet, terwijl ze ook worden gedetecteerd op IP en vroeggeboren neuronen (E, E ', E ''). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Geïsoleerde NSPC's afgeleid van 2D neurale rozetten herbergen functionele PC. Dissociatie van 2D-neurale rozetten geeft aanleiding tot geïsoleerde NSPC's met PC na uithongering gedurende 48 uur, zoals onthuld door ARL13B en PCNT immunostaining (A). NSPC's herbergen functionele PC zoals onthuld door RT-PCR-kwantificering van twee SHH-doelgenen GLI1 en PTCH1 na uithongering gedurende 48 uur en daaropvolgende activering van de route door behandeling met recombinant SHH (rSHH) gedurende 24 uur. GLI1 - en PTCH1-expressiegegevens werden uitgevoerd in drievoud en genormaliseerd naar ACTB-expressiegegevens . Gegevens werden geanalyseerd met de 2−ΔΔCt-methode en gepresenteerd als relatieve expressie ± SEM (Mann Whitney-test) (B). IF-analyse op uitgehongerde NSPC's met (D) of zonder (C) rSHH-behandeling om de dynamiek te testen van twee cruciale actoren van de SHH-signaleringsroute, GLI2 en GPR161, die respectievelijk de PC accumuleren of verlaten na activering van de SHH-route. Door Ilastik- en CiliaQ-tools te combineren voor de analyse van confocale beelden, werd GPR161 (F) en GLI2 (G) signaalintensiteit binnen PC vergeleken in +/- rSHH behandelde NSPC's. ARL13B-kleuring werd gebruikt voor PC-segmentatie en zoals verwacht was de PC-lengte ongewijzigd in +/- rSHH behandelde NSPC's (E). De gegevens worden samengevat in box- en whiskerplots (gemiddelde waarden ± SEM). p < 0,0001 (Mann Whitney-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Generatie en karakterisering van dorsale voorhersenenorganoïden. (A) Schematisch overzicht van het protocol om dorsale voorhersenenorganoïden te genereren. (B) Representatieve heldere veldbeelden van organoïden op dag 1, 3, 7, 24 en 42 van differentiatie. Confocale beelden van 20 μm cryosecties van organoïden op dag 42 (C) en 70 (D) na immunostaining met SOX2-, TBR2- en CTIP2-antilichamen die respectievelijk de ventriculaire zone (VZ), de subventriculaire zone (SVZ) met TBR2-positieve IP en het preplate-achtige gebied (CP) met CTIP2-positieve vroeggeboren neocorticale neuronen afbakenen. Confocale beelden van 20 μm cryosecties van organoïden op dag 42 (E) en 70 (F) na immunostaining met PAX6-, CTIP2- en SATB2-antilichamen die het uiterlijk van SATB2-positieve laatgeboren neuronen op dag 70 laten zien. Confocale beelden van 20 μm cryosecties van een organoïde op dag 42 na immunostaining met ARL13B- en PCNT-antilichamen die PC onthullen aan de apicale pool van radiale gliale voorlopers (G), terwijl ze ook aanwezig zijn op CTIP2-positieve neuronen (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: 3D-beeldvorming van dorsale voorhersenenorganoïden. (A) Lichte bladacquisitie van een volledige dorsale voorhersenenorganoïde (dag 42) gekleurd met PAX6-, N-CADH- en CTIP2-antilichamen die de meerdere neuro-epitheliale lussen vertonen met PAX6-positieve radiale gliale voorlopers die de juiste apicobasale polariteit vertonen, zoals blijkt uit de accumulatie van N-Cadherine aan hun apicale zijde en CTIP2-positieve vroeggeboren neocorticale neuronen die een voorplaatachtig gebied afbakenen. (B) Lichte bladverwerving van een volledige dorsale voorhersenenorganoïde (dag 42) gekleurd met TPX2-, P-Vim- en CTIP2-antilichamen die interkinetische nucleaire migratie van ventriculaire radiale gliale voorlopercellen illustreren. (C) Zoom in op de lichtplaatverwerving van een volledige dorsale voorhersenenorganoïde (dag 42) gekleurd met TPX2- en P-Vim-antilichamen die een voorloper tonen die een uniek basaal proces uitbreidt en gelokaliseerd in de subventriculaire zone, die doet denken aan een buitenste radiale gliale voorloper. (D) Resonante scanneracquisitie van een 150 μm-sectie van een dorsale voorhersenenorganoïde (dag 42) gekleurd met PCNT- en ARL13B-antilichamen die PC vertonen in NSPC's en neocorticale neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Generatie en karakterisering van 2D- en 3D hIPS-celgebaseerde modellen van de ontwikkeling van dorsale voorhersenen om pc-betrokkenheid bij de pathofysiologie van cerebrale corticale anomalieën te ontleden. hIPS-cellen mogen embryoïde lichamen (EB's) vormen in cultuurplaten met lage adhesie en worden vervolgens geïncubeerd in een inductiemedium met dubbele SMAD-remmers om neuro-ectodermale differentiatie te induceren. Adhesie van EB's in PO / lam-coated schotels maakt het genereren van 2D neurale rozetstructuren mogelijk, terwijl de vrij zwevende cultuur van EB's met daaropvolgende inbedding in BMM de generatie van dorsale voorhersenenorganoïden mogelijk maakt. Terugtrekking van mitogene factoren uit het aanhangende neurale rozetmedium bevordert het begin van neurogenese die kan worden getest door IF-analyse. Dissociatie van adherente neurale rozetten maakt het genereren van geïsoleerde NSPC-culturen mogelijk die nuttig zijn voor PC-biogenese en functieanalyse. Dorsale voorhersenenorganoïden worden verzameld na 4, 6 of 10 weken differentiatie en gefixeerd voor daaropvolgende immunostaininganalyse, hetzij in toto, op 150 μm dikke secties, of 20 μm cryosecties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Lichte sheet acquisitie van een volledige dorsale voorhersenen organoïde (Dag 42) immunostained met PAX6, CTIP2 en NCADH antilichamen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Lichte sheet acquisitie van een volledige dorsale voorhersenen organoïde (Dag 42) immunostained met TPX2, P-VIM en CTIP2 antilichamen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Lichte sheet acquisitie van een gehele dorsale voorhersenen organoïde (Dag 42) immunostained met PCNT en ARL13B antilichamen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Resonante scanning confocale acquisitie van een 150 μm sectie van een dorsale voorhersenen organoïde (dag 42) immunostained met ARL13B en PCNT antilichamen. Klik hier om deze video te downloaden.

AANVULLENDE BESTANDEN: Klik hier om de tabellen te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Recept van de media die worden gebruikt voor het genereren van 2D-neurale rozetten en NSPC's.

Aanvullende tabel 2: Recept van de media die worden gebruikt voor de generatie van dorsale voorhersenenorganoïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PC worden nu beschouwd als belangrijke organellen die cruciale stappen reguleren tijdens de normale cerebrale corticale ontwikkeling18,19,31 inclusief NSPC-expansie en commitment8,9,10,11,12, evenals neuronale migratie13,14 en synaptogenese16,17 . Naast analyse in diermodellen of menselijke foetale cerebrale weefsels, is het genereren van zeer innovatieve en relevante patiënt-afgeleide hIPSC-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling essentieel om de rol van PC te ontleden tijdens zowel normale als pathologische cerebrale corticale ontwikkeling.

Het hier beschreven 2D hIPSC-gebaseerde modelleringsprotocol is aangepast uit drie belangrijke publicaties20,21,22. Neuro-epitheliale differentiatie wordt geïnduceerd door dubbele SMAD-remming met behulp van kleine molecuulremmers van de activine/nodale (SB-431542) en BMP (LDN-193189) pathways22. Cellen zijn georganiseerd in rozetvormige structuren die NSPC's bevatten, evenals neocorticale dieplaagneuronen na 20 dagen differentiatie. Bovendien vertonen deze rozetachtige structuren de juiste apicobasale polariteit, interkinetische nucleaire migratie van apicale voorlopercellen en PC die zich uitstrekt van alle NSPC's en neuronen. Na dissociatie van deze rozetstructuren wordt een homogene en stabiele populatie van corticale voorlopers verkregen21. Wanneer gekweekt tot samenvloeiing en uitgehongerd gedurende 48 uur, herbergen die corticale voorlopers PC waarvoor de morfologie, het aantal en de lengte gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd door Ilastik28 en CiliaQ28,29 plugin-pakket op Fiji / ImageJ te combineren. Bovendien, door cytokines te gebruiken om de SHH-signaalroute te induceren, kan de PC-functie ook door IF worden gebruikt om de dynamiek van cruciale signaalwegactoren langs de PC te testen, zoals GLI2, SMO en GPR161. Bovendien maken semi-kwantitatieve RT-PCR-assays het testen van de inductie van SHH-doelgenexpressie mogelijk, inclusief GLI1 en PTCH1, als reactie op activering van de SHH-route. Andere signaalroutes die afhankelijk zijn van de PC-functie moeten ook worden getest, waaronder WNT- en IGF-routes2,32,33. Om af te sluiten over deze 2D-modelleringsbenadering, die duidelijk verschillende aspecten van de normale ontwikkeling van de hersenschors reproduceert, vertegenwoordigt het een nuttig en relevant hulpmiddel voor het testen van PC-biogenese en -functie in normale versus pathologische omstandigheden en zou het moeten bijdragen aan het verkrijgen van verder inzicht in de betrokkenheid van PC tijdens neocorticale ontwikkeling.

Complementair aan 2D hIPSC-gebaseerde modelleringsbenaderingen, bieden dorsale voorhersenenorganoïden ongekende mogelijkheden om normale en pathologische cerebrale ontwikkeling in vitro te onderzoeken, omdat ze veel kenmerken en kenmerken van de vroeg ontwikkelende menselijke hersenschors samenvatten. Er worden momenteel twee hoofdtypen protocollen gebruikt: de intrinsieke en de geleide methoden. Het intrinsieke protocol ontwikkeld door Lancaster en collega's23 is gebaseerd op het intrinsieke vermogen van IPSC's om zichzelf te organiseren met minimale externe factoren en geeft aanleiding tot cerebrale organoïden die rudimenten van verschillende hersengebieden bevatten en een unieke kans bieden om de interacties tussen verschillende hersengebieden te modelleren. De hoge variabiliteit en heterogeniteit die inherent zijn aan een dergelijke modelleringsstrategie vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor reproduceerbaarheid. Geleide organoïde differentiatieprotocollen maken het mogelijk om hersengebiedspecifieke organoïden te genereren met minimale heterogeniteit24,25,26. Deze aanpak stelde ons in staat om met succes dorsale voorhersenenorganoïden te genereren met ventrikelachtige structuren die belangrijke processen van vroege menselijke cerebrale corticale ontwikkeling samenvatten. Het eerste kritieke probleem is om te beginnen met hoogwaardige hIPSC-culturen met grote reguliere kolonies met minder dan 10% differentiatie en die bijna één keer als monolaag zijn gepasseerd om de hIPCs aan te passen aan eencellige kweekomstandigheden. Inderdaad, om organoïde heterogeniteit te beperken, een van de grootste uitdagingen in het veld, is de vorming van EB's met een homogene grootte een voorwaarde die de noodzaak impliceert van dissociatie van hIPSC-kolonies in eencellige suspensie die zaaien met de gedefinieerde celdichtheid mogelijk maakt. Een andere cruciale stap is BMM-opname van EB's, nodig om de 3D-structuur en neuro-epitheliale expansie te ondersteunen. We gaven de voorkeur aan de groepsopname van ongeveer vijftien organoïden boven individuele inclusie, zelfs als het een extra stap betreft, de BMM-dissociatie. Van BMM-dissociatie voorafgaand aan schudcultuur is aangetoond dat het de variabiliteit binnen en tussen organoïde batches vermindert, wat resulteert in een hogere reproduceerbaarheid34. Bovendien maakt het het mogelijk om celprocessen die zich uitstrekken tot in de BMM te verwijderen die niet schadelijk zijn voor de volgende differentiatiestappen, maar die het moeilijk maken om organoïden te observeren voor kwaliteitsinspectie tijdens volgende stappen van de procedure. Om de voedingsabsorptie en zuurstofuitwisseling te verbeteren, vergeleken we organoïderijping op orbitale shakers en draaiende bioreactoren die tot vergelijkbare resultaten leidden. We kozen daarom voor de orbitale shakeroptie, omdat deze het mogelijk maakt om de gemiddelde volumes en dus de totale kosten van de experimenten aanzienlijk te verminderen. Belangrijk is dat u een andere incubator gebruikt voor stationaire en schuddende cultuur op een orbitale shaker om trillingen te voorkomen die schadelijk zijn voor de aanhangende hIPSC-groei. We hebben dit protocol met succes toegepast op vijf verschillende controle hIPSC-lijnen35 die aanleiding geven tot homogene resultaten die de robuustheid van deze procedure garanderen.

Karakterisering van dergelijke organoïden kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. Om de 3D ruimtelijke informatie in organoïden te behouden, hebben we een protocol opgezet dat immunostaining en opruiming van hele organoïden mogelijk maakt met daaropvolgende lichtplaatacquisitie. Er zijn verschillende opruimingsmethoden ontstaan met efficiëntie, afhankelijk van de herkomst en dikte van het monster36,37. Hier hebben we een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve clearingmethode opgezet die afhankelijk is van TDE (2,2'-thiodiethanol), een glycolderivaat dat eerder werd gebruikt om muizenhersenen en darmorganoïden te zuiveren38,39. Acquisitie van immunostained en geklaarde organoïden werd uitgevoerd op een lichtbladmicroscoop met behulp van een 20x objectief ondergedompeld in 80% TDE. In vergelijking met andere 3D-beeldvormingsacquisitiemethoden is lichtplaatmicroscopie om verschillende redenen van belang: snelle acquisitie, goede penetratie en verminderde fotobleaching. Optimalisatie van de permeabilisatiestap maakt het mogelijk om efficiënte en homogene antilichaampenetratie te bereiken, waardoor basale lichamen en axonemen van PC kunnen worden gevisualiseerd die zich uitstrekken van alle voorloper- en neuronale celtypen van de hele organoïde. Bovendien maakt de verwerving van vrij zwevende 150 μm dikke secties met behulp van een omgekeerde resonante scanning confocale microscoop met 40x (NA 1.3) of 63x (NA 1.4) oliedoelstellingen het mogelijk om verder in resolutie te komen, met behoud van een aanzienlijke mate van 3D ruimtelijke informatie, en maakt kwalitatieve en kwantitatieve analyse van PC-biogenese en -functie mogelijk.

Het combineren van dergelijke 2D- en 3D-celgebaseerde modellen en 3D-beeldvormingsanalyse (figuur 5) op hIPSC's die worden gegenereerd door ciliopathie-patiëntcellen te herprogrammeren of door CRISPR / CAS9-technologie te gebruiken om specifiek centrosomale of ciliaire genen te bewerken, zou aanzienlijke vooruitgang mogelijk moeten maken in het begrip van de bijdrage van de PC tijdens de normale en pathologische ontwikkeling van de hersenschors. Belangrijk is dat genoombewerkingstechnologie het ook mogelijk maakt om specifiek patiëntmutaties te redden om isogene controle-hIPSC's te verkrijgen om genetische heterogeniteit te overwinnen die de detectie van ziektemechanismen uitdaagt. Bovendien worden eencellige genomische benaderingen nu op grote schaal gebruikt in het hele veld en vertegenwoordigen ze relevante en complementaire benaderingen voor immunostaininganalyse. Dus, ondanks enkele beperkingen en moeilijkheden die inherent zijn aan alle opkomende technologieën, en die uitgebreid worden aangepakt, bieden dergelijke 2D- en 3D hIPSC-gebaseerde modellen en de karakteriseringsmethoden die we hier hebben gepresenteerd krachtige en relevante hulpmiddelen om pc-betrokkenheid te ontleden in de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan neocorticale anomalieën van de menselijke ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR) aan S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) en N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 en ANR-19-CE16-0002-01). LB wordt ondersteund door de ANR in het kader van het Investissements d'avenir-programma (ANR-10-IAHU-01) en de Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programma). Het Imagine Institute wordt ondersteund door overheidsfinanciering van de ANR in het kader van het Investissements d'avenir-programma (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projecten) en als onderdeel van het tweede Investissements d'Avenir-programma (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 181 primair cilium door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen hIPSCs neurale stam- en voorlopercellen menselijke cerebrale corticale ontwikkeling neurale rozetten dorsale voorhersenenorganoïden 2D- en 3D hIPSC-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling cerebrale organoïden Sonic hedgehog whole-mount immunostaining optische clearing lichtbladmicroscoop
2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter