Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D и 3D индуцированные человеком плюрипотентные модели на основе стволовых клеток для рассечения первичного поражения ресничек во время неокортикального развития

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Мы представляем подробные протоколы для генерации и характеристики 2D и 3D моделей неокортикального развития на основе 2D и 3D индуцированных человеком стволовых клеток (hIPSC), а также дополнительные методологии, позволяющие качественно и количественно анализировать биогенез и функцию первичной реснички (ПК).

Abstract

Первичные реснички (ПК) представляют собой неподвижные динамические органеллы на основе микротрубочек, которые выступают из поверхности большинства клеток млекопитающих. Они выходят из более старой центриолы во время фазы G1 / G0 клеточного цикла, в то время как они разбираются, когда клетки возвращаются в клеточный цикл на границе фазы G2 / M. Они функционируют как концентраторы сигналов, обнаруживая и преобразуя внеклеточные сигналы, имеющие решающее значение для многих клеточных процессов. Как и в большинстве типов клеток, все неокортикальные нервные стволовые и прогениторные клетки (НСПК) содержат ПК, позволяющий им ощущать и передавать специфические сигналы, необходимые для нормального развития коры головного мозга. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для создания и характеристики двумерных (2D) и трехмерных (3D) клеточных моделей из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC) для дальнейшего анализа участия ПК во время неокортикального развития. В частности, мы представляем протоколы для изучения биогенеза и функции ПК в 2D-нейронных розетках NFPC, включая трансдукцию пути Sonic Hedgehog (SHH). Чтобы воспользоваться преимуществами трехмерной (3D) организации церебральных органоидов, мы опишем простой метод 3D-визуализации иммуноструктурированных церебральных органоидов. После оптической очистки быстрое получение целых органоидов позволяет обнаруживать как центросомы, так и ПК на неокортикальных предшественниках и нейронах всего органоида. Наконец, мы подробно описываем процедуру иммуноокрашения и очистки толстых свободно плавающих органоидных срезов, сохраняющих значительную степень пространственной 3D-информации и позволяющих получать данные с высоким разрешением, необходимые для детального качественного и количественного анализа биогенеза и функции ПК.

Introduction

Первичные реснички (ПК) представляют собой органеллы на основе микротрубочек, которые чувствуют и передают множество химических и механических сигналов из внеклеточной среды. В частности, ПК является центральной органеллой для трансдукции сигнального пути Ежа у позвоночных1,2. В то время как большинство нервных клеток уже давно имеют ПК, вклад этой органеллы в формирование центральной нервной системы уже давно недооценен. Исследования неокортикального развития привели к открытию нескольких нервных стволовых и прародительных клеток (НСПК), все из которых содержат ПК, местоположение которого, как было предложено, имеет решающее значение для определения судьбы прародителя3,4,5,6,7. Было показано, что ПК имеет решающее значение для клеточных механизмов, которые необходимы для нормального развития коры головного мозга, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также апикобазальную полярность радиального глиального каркаса, поддерживающего миграцию нейронов13. Кроме того, ПК требуются при тангенциальной миграции интернейронов на кортикальную пластину14,15. Наконец, предложена роль ПК в установлении синаптических связей нейронов в коре головного мозга16,17. В целом, эти результаты доказывают решающую роль ПК на основных этапах развития коры головного мозга18,19 и повышают необходимость исследования их участия в патологических механизмах, лежащих в основе аномалий развития коры головного мозга.

Недавние исследования в значительной степени улучшили наше понимание важных клеточных и молекулярных различий между развитием коры в моделях человека и животных, подчеркнув необходимость разработки модельных систем человека. С этой точки зрения, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC) представляют собой многообещающий подход к изучению патогенеза заболеваний в соответствующем генетическом и клеточном контексте. Адгезивные двумерные (2D) клеточные модели или нейронные розетки содержат НСПК, аналогичные тем, которые наблюдаются в развивающейся коре головного мозга, которые организуются в розеткообразные структуры, показывающие правильную апикобазальную полярность20,21,22. Кроме того, трехмерная (3D) система культивирования позволяет генерировать органоиды дорсального переднего мозга, которые повторяют многие особенности развития коры головного мозга человека23,24,25,26. Эти два комплементарных подхода к моделированию на основе клеток предлагают захватывающие перспективы для препарирования участия ПК во время нормального и патологического развития коры головного мозга.

Здесь мы предоставляем подробные протоколы для генерации и характеристики нейронных розеток и производных НСПК, а также органоидов дорсального переднего мозга. Мы также предоставляем подробные протоколы для анализа биогенеза и функции ПК, присутствующего на НСПК, путем тестирования трансдукции пути Sonic Hedgehog и анализа динамики ключевых молекул, участвующих в этом пути. Чтобы воспользоваться преимуществами 3D-организации церебральных органоидов, мы также создали простой и экономически эффективный метод 3D-визуализации иммуноокрашенных церебральных органоидов, позволяющий быстро получать, благодаря световому листовому микроскопу, весь органоид с высоким разрешением, позволяющим визуализировать ПК на всех типах неокортикальных предшественников и нейронов всего органоида. Наконец, мы адаптировали иммуногистохимию на свободно плавающих участках 150 мкм с последующей очисткой и получением с помощью резонансного сканирующего конфокального микроскопа, позволяющего получать изображения с высоким разрешением, что необходимо для детального анализа биогенеза и функции ПК. В частности, программное обеспечение для 3D-визуализации позволяет осуществлять 3D-реконструкцию ПК с последующим анализом морфологических параметров, включая длину, количество и ориентацию ПК, а также измерение интенсивности сигнала цилиарных компонентов вдоль аксонемы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Генерация 2D hIPS клеточных моделей неокортикального развития

  1. Формирование нейронных розеток
    1. Начните с культур hIPSC, содержащих большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и не более 80% слияния.
    2. Промывайте hIPSC 2 мл PBS.
    3. Добавьте 2 мл индукционной среды NSPC, дополненной ингибитором Rock (NIM + 10 мкМ Y-27632).
    4. Вручную рассекайте каждую колонию hIPSC из одной 35-миллиметровой чашки с помощью иглы, чтобы разрезать каждую колонию точно в горизонтальном и вертикальном направлениях, чтобы создать узор шахматной доски, разделяющий каждую колонию на равные кластеры.
    5. Отсоедините колонию с помощью клеточного скребка и перенесите их на тарелку со сверхнизким креплением 35 мм.
    6. Пусть они плавают в течение ночи (ON) в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2, чтобы они могли образовывать эмбриональные тела (EB).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриоидные тела (ЭБ) определяются как плавающие сфероидные кластеры или агрегаты hIPSC.
    7. Переложите ЭБ в поли-L-орнитин/ламинин (PO/лам) покрытые 35 мм тарелки в 2 мл NIM + 10 мкМ Y-27632.
    8. Ежедневное обновление индукционной среды NSPC (NIM без Y-27632) до образования нейронных розеток занимает примерно от 12 до 14 дней. Проверьте под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа нейронные розетки могут быть расширены, дифференцированы и обработаны для анализа иммуноокрашивания или диссоциированы для получения изолированных нервных стволовых и прогениторных клеток (НСПК).
  2. Расширение нейронной розетки и ранняя дифференциация
    1. Вырежьте нейронные розетки в виде сетки с помощью иглы и вытесните кластеры с помощью клеточного скребка.
    2. Переложите розетки в 4-луночную пластину, содержащую стеклянную крышку с PO/лам-покрытием (4-5 розеток/лунку) в 0,5 мл среды технического обслуживания NSPC (NMM).
    3. Инкубируют пластину в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
    4. Обновляйте NMM через день до 20 дня.
    5. С 20-го дня культивирование нейронных розеток в 0,5 мл цитокина истощает НММ, чтобы обеспечить дифференцировку. Обновляйте среду каждые 2-3 дня.
    6. На 30-й и 40-й день (10 или 20 дней дифференциации) зафиксируют розетки с 0,5 мл 4% ПФА, 20 мин, РТ.
  3. Анализ биогенеза и функций ПК на изолированных НСПК
    1. Диссоциация NSPC
      1. Вырежьте нейронные розетки с шага 1.1.8 в сетчатый узор с помощью иглы и вытесните кластеры с помощью клеточного скребка. Переложите клетки в покрытые PO/лам 35 мм чашки в 2 мл НММ и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      2. Обновляйте НММ через день до слияния (примерно 5-7 дней).
      3. После соскабливания больших, прозрачных клеток, окружающих нейронные розетки, соберите их вручную и перенесите на свежие 35-миллиметровые чашки с покрытием PO / лам, чтобы обогатить NPPC и истощить ненейронные типы клеток.
      4. После одного или двух ручных проходов (при необходимости повторите этап 1.3.1.3) необходимо удалить все загрязняющие типы клеток, удалить среду и промыть PBS.
      5. Добавьте 300 мкл 0,05% трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C до тех пор, пока большинство клеток не отсоединятся.
      6. Добавьте 2 мл среды, содержащей 10% FBS (DMEM + 10% FBS), чтобы инактивировать трипсин. Соберите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл. Аккуратно пипеткой суспензию клетки вверх и вниз три раза, чтобы разбить клеточные сгустки.
      7. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
      8. Осторожно аспирируйте супернатант и повторно суспендируйте клетки в NMN.
      9. Высевают диссоциированные НСПК в виде одиночных клеток (1 х 105 клеток/см2) в НММ на посуду, покрытую PO/ламом, и инкубируют их в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      10. Расширяйте НСПК в НММ, меняя среду через день.
        ПРИМЕЧАНИЕ: НСПК высеиваются с высокой плотностью, чтобы избежать дифференциации.
    2. Анализ биогенеза ПК
      1. Семена диссоциируют НСПК при 100 000 клеток/см2 и инкубируют их в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в NMM в течение 2 дней.
      2. Аспирировать среду и голодать НСПК в среде, обедненной цитокинами (среде голодания NSPC, дополнительная таблица 1) в течение 48 ч.
      3. Исправьте НСПК с 4% PFA в течение 20 мин при RT.
      4. Дважды промыть PBS в течение 5 мин при RT перед иммуноокрашиванием.
    3. Анализ функции ПК: сигнальный путь SHH
      1. Семена диссоциированных НСПК при 100 000 клеток/см2 на 8-луночных камерных слайдах с покрытием PO/лам (300 мкл) или T25 (5 мл) и инкубируют в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в NMM в течение 2 дней.
      2. Голодать НСПК в голодной среде NSPC (300 мкл на скважину с 8-луночным камерным затвором и 5 мл в колбе T25) в течение 48 ч.
      3. Чтобы индуцировать путь SHH, инкубируют НСПК с голодующей средой, дополненной рекомбинантным SHH (100 нг/мл) или SAG (500 нМ); (150 мкл на скважину 8-луночного камерного затвора и 2 мл в колбе Т25) в течение 24 ч.
      4. Зафиксируйте НСПК, культивируемые на 8-луночных камерных слайдах в 250 мкл 4% PFA на скважину в течение 20 мин при РТ, и дважды промывайте их 250 мкл PBS в течение 5 мин при РТ перед иммуноокрашивающим анализом.
      5. Удалите среду и вымойте НСПК, культивированные в посуде T25, PBS.
      6. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C до тех пор, пока клетки не отсоединятся.
      7. Добавьте 2 мл среды, содержащей 10% FBS (DMEM + 10% FBS), чтобы инактивировать трипсин и собрать клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
      8. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и тщательно аспирируют супернатант для получения гранул NSPC, которые могут быть криоконсервированы при -80 °C перед экстракцией РНК и анализом ОТ-ПЦР.

2. Генерация органоидов дорсального переднего мозга

  1. Одноклеточная культура hIPSC
    1. Начнем с культур hIPSC, в которых обитают большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и которые были пройдены почти один раз. Убедитесь, что клетки не более чем на 80% сливаются.
    2. Промыть колонии 2 мл PBS.
    3. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток (GCDR) и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C.
    4. Аспирировать GCDR и добавить 2 мл среды mTeRS1, дополненной 5 мкМ Y-27632.
    5. Пипетку клеток осторожно вверх и вниз 10 раз, чтобы диссоциировать все колонии на отдельные клетки.
    6. Переложите клетки на посуду, покрытую витронектином, и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните, по меньшей мере, 1 прохождение hIPSC с использованием GCDR до эксперимента дифференцировки для адаптации hIPSC к условиям одноклеточной культуры.
  2. На 0-й день позвольте hIPSC сформировать эмбриональные тела в среде EB, содержащей низкую концентрацию FGF2 и высокую концентрацию ингибитора горных пород, необходимую для выживания hIPSC. Для этого выполните следующие действия.
    1. Промыть колонии 2 мл PBS.
    2. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток (GCDR) и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C.
    3. Аспирировать GCDR и добавить 1 мл среды EB с добавлением 50 мкМ Y-27632; Используйте пипетку 1 мл, чтобы аккуратно отсоединить клетки и перенести их в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. Промыть еще раз 2 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632, перенести оставшиеся клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Немедленно добавьте 3 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632, в коническую трубку и осторожно гомогенизируйте раствор с помощью пипетки 5 мл.
    5. Центрифугируют диссоциированные клетки при 100 х г в течение 5 мин.
    6. Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют клетки в 6 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632.
    7. Центрифугировать ячейки при 100 х г в течение 5 мин.
    8. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 1 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632. Используйте пипетку объемом 1 мл, чтобы аккуратно диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию.
    9. Сразу после повторного использования клеток разбавьте и посчитайте их.
    10. Разбавить надлежащий объем клеточной суспензии (содержащей 900 000 клеток) в 30 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632 и 4 нг/мл bFGF и осторожно перемешать раствор.
    11. Пластина 9 000 ячеек/лунка в сверхнизкую пластину 96U (300 мкл/лунка). Чтобы избежать нарушения образования ЭБ, инкубируйте пластину в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до 3-го дня без изменения среды.
  3. Нейронная индукция (двойное ингибирование SMAD)
    1. На 3-й день убедитесь, что ЭБ измеряют 300-400 мкм и показывают регулярные границы. Если оба критерия достигнуты, замените половину среды (150 мкл) индукционной средой-1, содержащей двойные ингибиторы SMAD, что приведет к осветлению контура ЭБ с 6-го по 7-й день, что указывает на нейроэктодермальную дифференцировку (дополнительная таблица 2).
    2. На 4-й день замените 3/4 среды (225 мкл) на индукционную среду-1.
    3. На 6-й и 8-й день: Обновите половину индукционной среды-1 (150 мкл).
  4. Встраивание органоидов в матрицу базальной мембраны (День 10)
    1. На 10-й день встраивают ЭБ в матрицу базальной мембраны с уменьшенным фактором роста (BMM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе всегда используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать отверстие кончиков пипетки, чтобы избежать повреждения органоидов путем повторного пипетирования.
    2. Сначала переносят около 15-17 органоидов в конические трубки. Дайте EB осесть и удалите среду. Добавьте 50 мкл индукционной среды-2 и переложите их в микроцентрифужную трубку, содержащую 100 мкл BMM.
    3. Нанесите матрично-ЭБ-смесь на центр колодца пластины со сверхнизким креплением и отделите ЭБ, чтобы предотвратить их плавление.
    4. Дайте BMM затвердеть в инкубаторе при 37 °C в течение 45 мин.
    5. Добавьте 3 мл индукционной среды-2 в каждую лунку и поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эта процедура выполнена как можно быстрее, так как BMM затвердевает при комнатной температуре.
  5. Стационарная культура органоидов, встроенных в матрицу базальной мембраны
    1. День 12, 14: Освежите индукционную среду-2.
    2. День 16: Освежите индукционную среду-2 и проверьте под микроскопом расширение нейроэпителиальных петель.
  6. Диссоциация и культивирование матрицы базальной мембраны на орбитальном шейкере
    1. На 17-й день диссоциируют органоиды от БММ путем пипетки вверх и вниз 10 раз пипеткой 5 мл и переносят их в дифференцирующую среду-1 (без витамина А). Инкубируйте на орбитальном шейкере со скоростью 80 оборотов в минуту в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 для улучшения усвоения питательных веществ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другой инкубатор для стационарной культуры и культивирования на орбитальном шейкере, чтобы избежать любых вибраций, наносящих ущерб росту клеток прилипшего hIPS.
    2. День 19: Обновление дифференциации среды-1.
    3. День 21: Изменение дифференцировки среды-1 на дифференцировочной среды-2 (с витамином А).
    4. С 23-го по 35-й день: Обновляйте среду с дифференцировкой-2 раза в 2-3 дня.
    5. С 35-го по 70-й день: Обновите дифференцировочную среду-2 с 1% BMM и обновляйте каждые 2-3 дня.
    6. Собирают органоиды через 28, 42 и 70 +/- 2 дня дифференцировки и фиксируют их на ночь при 4 °C, в 5 мл 4% PFA на конической трубке объемом 15 мл.
    7. Для дальнейшего анализа внутри или свободно плавающего иммунонаказания органоиды затем дважды промывают в PBS и сохраняют при 4 °C в PBS + 0,05% азида натрия.
    8. Для иммунонаказательного анализа на замороженных срезах погружают 4% фиксированных органоидов PFA в 10 мл 30% сахарозы при +4 °C ON (или до тех пор, пока органоиды не утонут). Вставьте их в замороженную матрицу встраивания и храните при температуре -80°C до криосечения.

3. In toto иммуномаркировка, очистка и получение светового листа органоидов дорсального переднего мозга

  1. Фиксация
    1. Соберите органоиды в 6-луночные пластины, удалите среду и зафиксируйте их 2 мл 4% PFA при 4 °C на ночь.
    2. Выполните три промывки в 2 мл PBS при комнатной температуре.
    3. Переведите органоиды в пробирки по 2 мл и храните при 4 °C в 2 мл PBS + 0,05% азида натрия.
  2. Пермеабилизация
    1. Инкубируют органоиды в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Triton X100 при RT в течение 1 ч. Сделайте это дважды.
    2. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Triton X100 и 20% DMSO, при 37 °C, в течение ночи.
    3. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащего 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% дезоксихолата, 0,1% NP40 и 20% DMSO, при 37 °C, в течение ночи.
    4. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Triton-X100, на RT, в течение 1 ч. Сделайте это дважды.
  3. Блокирование и иммуномаркировка
    1. Блокируют в 1 мл блокирующего раствора (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Ослиная сыворотка, 10% DMSO), при 37 °C, ON.
    2. Инкубировать с первичными антителами, разведенными в 250 мкл PBS, 0,2% Tween20, 0,1 мкг/мл гепарина, 5% DMSO и 3% Ослиной сыворотки, при 37 °C, в течение 2 дней.
    3. Промывать в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween20 и 0,1 мкг/мл гепарина, в течение 1 ч при 37 °C. Сделайте это четыре раза.
    4. Промыть в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Tween20 и 0,1 мкг/мл гепарина, на ночь при 37 °C.
    5. Инкубат с вторичными антителами, разведенными в 250 мкл PBS, содержащих 0,2% Tween 20, 0,1 мкг/мл гепарина и 3% Ослиной сыворотки, при 37 °C, в течение 2 дней.
    6. Промывайте в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween 20 и 0,1 мкг/мл гепарина, в течение 1 ч, на колесе, при RT. Сделайте это четыре раза.
    7. Промыть в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween 20 и 0,1 мкг/мл гепарина, на ночь, на колесе, на RT.
    8. Промыть в 1 мл PBS, в течение 24 ч, на RT.
    9. Хранить при +4 °С в 1 мл PBS и 0,05% азида натрия до очистки.
  4. Очистка в ТДЭ (2,2′ -тиодиэтанол)
    1. Инкубируют органоиды в 1 мл 30% TDE (3 мл TDE + 7 мл PBS), в течение 24 ч, при RT.
    2. Инкубировать в 1 мл 60% TDE (6 мл TDE + 4 мл PBS), в течение 24 ч, на RT.
    3. Инкубировать в 1 мл 80% ТДЭ (8 мл ТДЭ + 2 мл ПБС), в течение 24 ч, на РТ.
  5. Встраивание органоидов перед приобретением светового листа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте индивидуальную систему; изготовлен шприцем объемом 1 мл с наконечником, вырезанным скальпелем.
    1. Готовят 100 мл 4% низкоплавкой агарозы в 60% растворе ТДЭ и аликвоту в пробирках по 2 мл. Сохраняется при температуре +4 °C.
    2. Перед встраиванием органоидов предварительно разогрейте одну трубку, содержащую 1,5 мл 4% низкоплавкой агарозы в 60% ТДЭ, на водяной бане при 37 °C до тех пор, пока она не разжижится.
    3. Тем временем подготовьте изготовленную на заказ систему формования из шприца объемом 1 мл, кончик которого отрезается с помощью скальпеля.
    4. Вставьте в шприц 600 мкл раствора геля с помощью плунжера.
    5. Расположите образец с помощью увеличенного наконечника пипетки, отверстие которого было разрезано стерильными ножницами.
    6. Заполните шприц 400 мкл раствора геля так, чтобы образец располагался в нижней трети шприца.
    7. Дайте гелю полимеризоваться и хранить в 80% растворе TDE при 4 °C, защищенном от света, до момента получения.
    8. Для получения светового листа используйте 20-кратный объектив, погруженный в 80% раствор TDE, добавленный в камеру для отбора проб, чтобы точно отрегулировать показатель преломления метода очистки.
    9. Вставьте шприц, содержащий органоид, встроенный в агарозу, в самый большой держатель образца, предназначенный для размещения шприца объемом 1 мл, плунжер которого может быть использован для позиционирования органоида перед объективом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение легкого листа всего органоида занимает примерно от 5 до 10 минут.

4. Иммуноокрашивание и очистка свободно плавающих участков органоидов дорсального переднего мозга

  1. Фиксация, встраивание агарозы и сечение органоидов
    1. Собирают органоиды через 28, 42 и 70 +/- 2 дня дифференцировки в 6-луночную пластину и фиксируют на ночь при 4 °C в 2 мл 4% PFA.
    2. Промыть дважды в 2 мл PBS и сохранить при 4 °C в 2 мл PBS + 0,05% азида натрия.
    3. Встраиваем фиксированные органоиды в 4% низкоплавкую агарозу в пластиковую форму для встраивания (7 х 7 мм). Аккуратно извлеките блок агарозы из пластиковой формы и приклейте его к стадии вибратома.
    4. Секционирование встроенных органоидов с помощью вибратома для получения 150 мкм свободно плавающих секций, перенесенных в скважину из 24-луночной пластины, содержащей 500 мкл PBS, с помощью кисти, чтобы избежать повреждения секций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется низкоплавящая агароза, так как температура ее плавления составляет всего около 60 °C. Приготовьте 4% низкоплавкущую агарозу в растворе PBS и оставьте ее остывать чуть выше 37 °C на водяной бане перед встраиванием органоидов.
  2. Пермеабилизация, блокирование и иммуноокрашивание
    1. Инкубируют срезы в 500 мкл PBS, содержащие 0,3% Triton X100, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это три раза.
    2. Инкубируют участки в 500 мкл PBS, содержащих 0,3% Triton X100 и 5% обезжиренного молока, на RT, при перемешивании, в течение 2 ч.
    3. Инкубируют срезы в 250 мкл раствора первичных антител (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% обезжиренное молоко), при перемешивании, при +4 °C, в течение ночи.
    4. Промыть срезы в 500 мкл PBS, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это четыре раза.
    5. Инкубировать срезы в 250 мкл раствора вторичных антител (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% обезжиренное молоко), на RT, при перемешивании, в течение 2 ч.
    6. Промыть срезы в 500 мкл PBS, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это четыре раза.
    7. Хранить срезы в 500 мкл PBS при температуре +4°C до очистки.
  3. Очистка в ТДЭ (2,2′ -тиодиэтанол)
    1. Инкубируют срезы в 500 мкл 30% и 60% TDE в течение 1 ч каждый при RT, а затем в 500 мкл 80% TDE в течение ночи, на RT.
    2. Хранить очищенные срезы в 500 мкл 80% TDE до получения при температуре +4 °C.
  4. Монтаж свободно плавающих секций перед приобретением с резонансным сканированием конфокаль
    1. Установите свободно плавающую секцию в герметичной камере, позволяющую поддерживать образец в 80% растворе TDE и предназначенную для адаптации на моторизованной ступени XY конфокальных микроскопов.
    2. Поместите одну круглую крышку в систему камеры.
    3. Аккуратно перенесите очищенный иммуноокрашенный участок с помощью кисти.
    4. Заполните камеру 80% раствором TDE.
    5. Добавьте два стандартных обтекателя плюс один второй круглый чехл и силиконовое уплотнение.
    6. Навинтите на завинчивающееся кольцо камеры, чтобы идеально герметизировать систему.

5. Легкий лист и резонансное сканирование конфокального анализа

  1. Обрабатывайте световые листы и резонансные сканирующие сборы с помощью программного обеспечения, которое позволяет осуществлять 3D-визуализацию и анализ всего иммуноокрашенного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такое программное обеспечение позволяет быстро открывать огромные данные, чтобы легко делать снимки и анимацию. Это позволяет перемещать образец в разных ориентациях и генерировать 2D-виды благодаря инструменту 2D-слайсера в разных ориентациях, например, XY и YZ.
  2. Для автоматического обнаружения как центросом, так и первичных ресничек используйте точечный мастер, позволяющий количественно оценить их количество в патологических и контрольных состояниях.
  3. Для 3D-реконструкции ПК, позволяющей точно измерить их длину, используйте мастер нити накаливания, чтобы вручную зафиксировать начальную точку ПК, а программное обеспечение использует флуоресцентный сигнал для точной реконструкции ПК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2D hIPS клеточные модели для изучения первичного биогенеза и функции ресничек
Протокол, подробно описанный здесь, был адаптирован из ранее опубликованных исследований20,21,22. Этот протокол позволяет генерировать нейронные розетки, которые содержат неокортикальные предшественники и нейроны, аналогичные тем, которые наблюдаются в развивающейся неокортексе. Детальная валидация может быть выполнена с помощью обычного иммуноокрашающего анализа с использованием конкретных производителей3. Например, апикальные предшественники (AP) должны быть дважды окрашены SOX2 и PAX6, промежуточные предшественники (IP) выявляются окрашиванием TBR2 / EOMES, а ранорожденные неокортикальные нейроны выявляются окрашиванием CTIP2 (рисунок 1A-C). Такие нейронные розеткоподобные структуры моделируют межкинетическую ядерную миграцию (INM) AP, которую можно визуализировать путем иммуноокрашивания антителами, поднятыми против фосфо-виментина, который окрашивает митотические ядра и TPX2, который окрашивает митотическое веретено. Эти маркеры, таким образом, позволяют анализировать несколько характеристик АП, в том числе INM с делением клеток, которое происходит апикально вокруг центрального просвета (рисунок 1D, D'), а также режим деления, определяемый измерением угла между плоскостью деления и поверхностью апикальной артерии. Наконец, цилиогенез может быть проанализирован путем иммуноокрашивания антителами, поднятыми против PCNT, который окрашивает базальное тело PC, и ARL13B, который окрашивает аксонему. На таких розеточных структурах ПК простираются от апикального полюса AP до центрального просвета каждой желудочковой области (рисунок 1E, E'), в то время как они также выступают из нейронов CTIP2+ (рисунок 1E'').

Диссоциация этих розеточных структур позволяет получать изолированные НСПК, культивируемые на поли-L-орнитиновых/ламининовых культуральных пластинах в НММ при высокой плотности, что позволяет поддерживать стабильную и расширяемую популяцию НСПК не менее 15 проходов без накопления аномалий кариотипа21,27. Для анализа биогенеза ПК диссоциированные НСПК культивируют до слияния и голодают в течение 48 ч. Анализы иммуноокрашивания с использованием антител, поднятых против маркеров ПК, показывают, что эти НСПК содержат ПК (рисунок 2А). Объединив два взаимодополняющих инструмента с открытым исходным кодом, Ilastik, инструмент анализа изображений на основе машинного обучения, полезный для сегментации ПК28, и CiliaQ, пакет плагинов Fiji/ImageJ29, которые позволяют 3D-реконструкцию ПК из стеков 3D-конфокальных изображений, можно легко оценить несколько структурных параметров, включая количество ПК и их длину.

Функция ПК НСПК также может быть оценена путем тестирования трансдукции сигнального пути Ежа. Для оценки трансдукции сигнального пути SHH НСПЦ голодают в течение 48 ч и обрабатывают рекомбинантным SHH (rSHH) или сглаженным агонистом (SAG) в течение 24 ч. Используя антитела, поднятые против GPR161, SMO и GLI2, иммунофлуоресцентный (IF) анализ позволяет проверить трафик этих ключевых сигнальных субъектов SHH вдоль ПК, при этом GPR161 обычно выходит из ПК, в то время как GLI2 и SMO накапливаются в ПК в ответ на активацию пути SHH (рисунок 2C-D). Анализ стеков 3D-конфокальных изображений с помощью инструментов CiliaQ позволяет количественно оценить выход GPR161 из ПК, а также накопление GLI2 и SMO в ПК после активации пути SHH (рисунок 2F-G). Кроме того, полуколичественный анализ ОТ-ПЦР на мРНК, извлеченных из НСПК, обработанных rSHH- или SAG, показывает индукцию двух генов-мишеней SHH, GLI1 и PTCH1, что свидетельствует о нормальной сигнальной трансдукции SHH в НСПК, полученных из контрольных hIPSC (рисунок 2B).

В целом, 2D-клеточные модели развития дорсального переднего мозга четко воспроизводят несколько аспектов нормального развития коры головного мозга и представляют собой многообещающие инструменты для препарирования СВЯЗАННЫХ с ПК механизмов, лежащих в основе аномалий неокортикального развития, с использованием контроля по сравнению с hIPSC пациента, содержащим мутации в генах, ответственных за аномалии развития человека коры головного мозга.

3D hIPS клеточные модели для изучения первичного вовлечения ресничек во время неокортикального развития
Протокол, описанный здесь (рисунок 3A), был адаптирован из ранее опубликованных протоколов23,24,25,26,30 и успешно протестирован на пяти различных линиях управления hIPSC. Это позволяет генерировать органоиды дорсального переднего мозга, полученные из hIPSC, которые увеличиваются в размерах с течением времени, образуя большие нейроэпителиальные петли (рисунок 3B). Для контроля качества может быть выполнен иммуномаркирующий анализ либо на органоидных криосекции (криостат, 20 мкм), свободно плавающих секциях (вибратом, 150 мкм), либо in toto. На 28 ± 2 день органоиды состоят из стратифицированных нейроэпителиальных петель, совместно экспрессирующих нейронный маркер предшественника SOX2 и маркер дорсального переднего мозга PAX6, что свидетельствует об идентичности дорсального переднего мозга. На 42 ± 2 день (6 недель дифференциации) эти петли должны демонстрировать более сложную стратифицированную организацию. От апикальной до базальной поверхности этих петлевых структур может быть очерчена желудочковая зона (VZ)-подобная область с SOX2/PAX6-положительными апикальными радиальными глиальными предшественниками (aRG), а также субвентрикулярная зона (SVZ)-подобная область с TBR2-положительными промежуточными предшественниками (IP) и кортикальная пластинчатая (CP)-подобная область, содержащая CTIP2-положительные ранние неокортикальные нейроны (рисунок 3C, Апикальная молекулярная полярность aRG может быть оценена по апикальному обогащению на желудочковой поверхности ZO-1 и N-CADH (рисунок 4A, видео 1). Свойства деления прародителя aRG могут быть оценены с использованием маркеров TP2X и P-VIM для анализа INM, что обычно приводит к выравниванию митотических ядер aRG на желудочковой поверхности корковых петель (рисунок 4B, видео 2). Такая иммуномаркировка также позволяет измерить угол деления для оценки симметричного и асимметричного режима деления aRG. Положительные прародители P-Vim также могут наблюдаться в SVZ-подобной области, сохраняя уникальный базальный процесс, простирающийся на базальную поверхность, напоминающий внешнюю радиальную глию (oRG или базальная радиальная глия, рисунок 4C, видео 2). В то время как они отсутствуют с 42-го дня органоидов, положительные поздние нейроны SATB2 должны быть обнаружены с 70-го дня (10 недель дифференцировки) (рисунок 3D, F), что свидетельствует о in vivo-подобном времени дифференцировки неокортикальных нейронов.

Эксперименты по иммуномаркировке с использованием маркеров базального тела (гамма-тубулин) и аксонемы (ARL13B) позволяют визуализировать ПК на 20 мкм криосекциях (рисунок 3G,H). Чтобы воспользоваться преимуществами 3D-организации органоидов дорсального переднего мозга, можно выполнить иммуноокрашивание целиком. Легкое получение таких в тото иммуноокрашенных и очищенных органоидов позволяет обнаруживать как центросомы, так и ПК на всех типах NSPC, а также на неокортикальных нейронах (Видео 3). Кроме того, для выполнения более точных анализов биогенеза ПК может быть выполнен иммуногистохимический анализ свободно плавающих толстых срезов (150 мкм) органоидов дорсального переднего мозга. После очистки такие участки могут быть получены с помощью 40x (NA 1.3) или 63x (NA 1.4) масляного объектива инвертированного резонансного конфокального лазерного микроскопа белого света, позволяющего улучшить разрешение при сохранении 3D пространственной информации органоидов. Такой лазерный сканирующий конфокальный микроскоп позволяет быстро захватывать толстые срезы, с точным и гибким возбуждением и обнаружением без каких-либо помех (Видео 4). С помощью программного обеспечения для 3D-визуализации можно оценить несколько структурных параметров ПК, включая номер ПК, длину и ориентацию. Специальные инструменты с открытым исходным кодом, свободно доступные инструменты, такие как Ilastik28, инструмент анализа изображений на основе машинного обучения, а также пакет плагинов CiliaQ на Фиджи / ImageJ29 очень полезны для автоматической сегментации ПК, что позволяет проводить последующий качественный и количественный анализ биогенеза ПК и функции в контроле против патологических состояний.

Figure 1
Рисунок 1: Генерация и характеристика 2D нейронных розеток. Иммуногистохимическая характеристика нейронных розетковых структур с использованием антител (A) SOX2 и PAX6 для обнаружения AP, (B) TBR2 / EOMES для выявления IP и (C) CTIP2 для окрашивания ранорожденных неокортикальных нейронов. Пролиферирующие АП обнаруживаются с помощью фосфо-виментиновых и TPX2-антител и располагаются на апикальной поверхности (D,D'). ПК выявляются двойным иммуноокрашиванием антителами PCNT и ARL13B. ПК простираются от каждой точки доступа к центральному просвету каждой розетки, в то время как они также обнаруживаются на IP и раннерожденных нейронах (E, E', E''). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изолированные NFPC, полученные из 2D нейронных розеток, содержат функциональный ПК. Диссоциация 2D-нейронных розеток приводит к появлению изолированных НСПК, укрывающих ПК после голодания в течение 48 ч, как выявлено иммуноокрашиванием ARL13B и PCNT (A). НСПК содержат функциональный ПК, выявленный количественной оценкой ОТ-ПЦР двух генов-мишеней SHH GLI1 и PTCH1 после голодания в течение 48 ч и последующей активации пути путем лечения рекомбинантным SHH (rSHH) в течение 24 ч. Данные экспрессии GLI1 и PTCH1 выполняли в трех экземплярах и нормализовали данные экспрессии ACTB . Данные были проанализированы методом 2−ΔΔCt и представлены в виде относительного выражения ± SEM (тест Манна Уитни) (B). Анализ IF на голодающих НСПК с (D) или без (C) rSHH для проверки динамики двух важнейших участников сигнального пути SHH, GLI2 и GPR161, которые соответственно накапливаются или выходят из ПК после активации пути SHH. Комбинируя инструменты Ilastik и CiliaQ для анализа конфокальных изображений, интенсивность сигнала GPR161 (F) и GLI2 (G) в ПРЕДЕЛАХ ПК сравнивали в +/- rSHH обработанных NSPC. Окрашивание ARL13B использовалось для сегментации ПК, и, как и ожидалось, длина ПК не изменилась в +/- rSHH обработанных NSPC (E). Данные суммируются в виде квадратов и усов (средние значения ± SEM). p < 0,0001 (тест Манна Уитни). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Генерация и характеристика органоидов дорсального переднего мозга. (A) Схематический обзор протокола для генерации органоидов дорсального переднего мозга. (B) Репрезентативные изображения органоидов с ярким полем в дни 1, 3, 7, 24 и 42 дифференциации. Конфокальные изображения 20 мкм криосекций органоидов на 42 (C) и 70 (D) день после иммуноокрашения антителами SOX2, TBR2 и CTIP2, очерчивающими, соответственно, желудочковую зону (VZ), субвентрикулярную зону (SVZ), содержащую TBR2-положительный IP, и препластинчатую область (CP), содержащую CTIP2-положительные ранние неокортикальные нейроны. Конфокальные изображения 20 мкм криосекций органоидов на 42 (E) и 70 (F) день после иммуноокрашения антителами PAX6, CTIP2 и SATB2, показывающие появление положительных поздних нейронов SATB2 на 70-й день. Конфокальные изображения 20 мкм криосекций органоида на 42-й день после иммуноокрашения антителами ARL13B и PCNT, выявляющие ПК на апикальном полюсе радиальных глиальных предшественников (G), в то время как они также присутствуют на CTIP2 положительных нейронах (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: 3D-визуализация органоидов дорсального переднего мозга. (A) Легкий лист получения всего органоида дорсального переднего мозга (день 42), окрашенного антителами PAX6, N-CADH и CTIP2, показывающими множественные нейроэпителиальные петли с положительными радиальными глиальными предшественниками PAX6, демонстрирующими правильную апикобазальную полярность, выявленную накоплением N-кадгерина на их апикальной стороне и CTIP2 положительных ранних неокортикальных нейронов, очерчивающих препластинчатую область. (B) Получение светового листа целого органоида дорсального переднего мозга (день 42), окрашенного антителами TPX2, P-Vim и CTIP2, иллюстрирующими межкинетическую ядерную миграцию желудочковых радиальных глиальных предшественников. (C) Увеличение светового листа захвата всего дорсального органоида переднего мозга (день 42), окрашенного антителами TPX2 и P-Vim, показывающим предшественника, расширяющего уникальный базальный процесс и локализованного в субвентрикулярной зоне, напоминающего внешнего радиального глиального прародителя. (D) Получение резонансным сканером 150 мкм участка дорсального органоида переднего мозга (день 42), окрашенного антителами PCNT и ARL13B, показывающими ПК в НСПК и неокортикальных нейронах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Генерация и характеристика 2D и 3D hIPS клеточных моделей развития дорсального переднего мозга для препарирования участия ПК в патофизиологии церебральных корковых аномалий. клеткам hIPS позволяют формировать эмбриональные тела (ЭБ) в пластины культуры с низкой адгезией, а затем инкубируют в индукционную среду, содержащую двойные ингибиторы SMAD для индукции нейроэктодермальной дифференцировки. Адгезия ЭБ в посуду с покрытием PO/лам позволяет генерировать 2D нейронные розетки, в то время как свободно плавающая культура ЭБ с последующим встраиванием в БММ позволяет генерировать органоиды дорсального переднего мозга. Вывод митогенных факторов из адгезивной нейронной розетки способствует наступлению нейрогенеза, который может быть проверен анализом ИФ. Диссоциация адгезивных нейронных розеток позволяет генерировать изолированные культуры NSPC, полезные для биогенеза ПК и анализа функций. Органоиды дорсального переднего мозга собирают после 4, 6 или 10 недель дифференцировки и фиксируют для последующего иммуноразрушающего анализа либо in toto, на участках толщиной 150 мкм, либо в криосекциях 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Получение светового листа целого органоида дорсального переднего мозга (день 42), иммуноокрашенного антителами PAX6, CTIP2 и NCADH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Получение светового листа целого органоида дорсального переднего мозга (день 42), иммуноокрашенного антителами TPX2, P-VIM и CTIP2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Получение легкого листа целого органоида дорсального переднего мозга (день 42), иммуноокрашенного антителами PCNT и ARL13B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 4: Резонансное сканирование конфокального захвата 150 мкм участка дорсального органоида переднего мозга (день 42), иммуноокрашенного антителами ARL13B и PCNT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФАЙЛЫ: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить таблицы.

Дополнительная таблица 1: Рецептура среды, используемой для генерации 2D-нейронных розеток и НСПК.

Дополнительная таблица 2: Рецепт среды, используемой для генерации органоидов дорсального переднего мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ПК в настоящее время рассматриваются как ключевые органеллы, регулирующие важнейшие этапы нормального развития коры головного мозга18,19,31, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также миграцию нейронов13,14 и синаптогенез16,17 . В дополнение к анализу на животных моделях или тканях головного мозга плода человека, генерация высоко инновационных и актуальных моделей неокортикального развития на основе hIPSC, полученных от пациентов, имеет важное значение для анализа роли ПК как во время нормального, так и в патологическом развитии коры головного мозга.

Протокол моделирования на основе 2D hIPSC, подробно описанный здесь, был адаптирован из трех основных публикаций20,21,22. Нейроэпителиальная дифференцировка индуцируется двойным ингибированием SMAD с использованием ингибиторов малых молекул активин/узлов (SB-431542) и BMP (LDN-193189) путей22. Клетки организованы в розеткообразные структуры, содержащие НСПК, а также нейроны неокортикального глубокого слоя после 20 дней дифференцировки. Кроме того, эти розеткообразные структуры демонстрируют правильную апикобазальную полярность, межкинетическую ядерную миграцию апикальных прародителей, а также ПК, простирающуюся от всех НСПК и нейронов. После диссоциации этих розеточных структур получается однородная и стабильная популяция корковых прародителей21. При культивировании до слияния и голодании в течение 48 ч эти кортикальные предшественники содержат ПК, для которого морфология, число и длина могут быть легко проанализированы путем объединения пакета плагинов Ilastik28 и CiliaQ28,29 на Фиджи / ImageJ. Кроме того, используя цитокины для индуцирования сигнального пути SHH, функция ПК также может использоваться IF для проверки динамики ключевых субъектов сигнального пути вдоль ПК, таких как GLI2, SMO и GPR161. Кроме того, полуколичественные анализы ОТ-ПЦР позволяют тестировать индукцию экспрессии генов-мишеней SHH, включая GLI1 и PTCH1, в ответ на активацию пути SHH. Другие сигнальные пути, зависящие от функции ПК, также должны быть протестированы, включая пути WNT и IGF2,32,33. Чтобы сделать вывод об этом подходе к 2D-моделированию, который четко воспроизводит несколько аспектов нормального развития коры головного мозга, он представляет собой полезный и актуальный инструмент для тестирования биогенеза и функции ПК в нормальных и патологических состояниях и должен способствовать дальнейшему пониманию участия ПК во время неокортикального развития.

В дополнение к подходам к моделированию на основе 2D hIPSC, дорсальные органоиды переднего мозга предлагают беспрецедентные возможности для исследования нормального и патологического развития головного мозга in vitro, поскольку они повторяют многие особенности и характеристики раннеразвивающейся коры головного мозга человека. В настоящее время используются два основных типа протоколов: внутренние и управляемые методы. Внутренний протокол, разработанный Ланкастером и его коллегами23, опирается на внутреннюю способность IPSC к самоорганизации с минимальными внешними факторами и дает начало церебральным органоидам, содержащим зачатки различных областей мозга, предлагая уникальную возможность моделировать взаимодействия между различными областями мозга. Однако высокая изменчивость и неоднородность, присущие такой стратегии моделирования, создают значительные проблемы воспроизводимости. Управляемые протоколы дифференцировки органоидов позволяют генерировать специфические для области мозга органоиды с минимальной гетерогенностью24,25,26. Такой подход позволил успешно генерировать дорсальные органоиды переднего мозга с желудочковыми структурами, которые рекапитулируют основные процессы раннего развития коры головного мозга человека. Первая критическая проблема заключается в том, чтобы начать с высококачественных культур hIPSC, содержащих большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и которые были пройдены почти один раз в качестве монослоя для адаптации hIPC к условиям одноклеточной культуры. Действительно, для ограничения органоидной гетерогенности, одной из основных проблем в этой области, образование ЭБ с однородным размером является предпосылкой, которая подразумевает необходимость диссоциации колоний hIPSC в одноклеточную суспензию, позволяющую засеивать при определенной плотности клеток. Другим важным шагом является включение BMM ЭБ, необходимых для поддержки 3D-структуры и нейроэпителиального расширения. Мы отдали предпочтение групповому включению около пятнадцати органоидов по сравнению с индивидуальным включением, даже если оно включает в себя дополнительный этап, диссоциацию BMM. Было показано, что диссоциация BMM до встряхивания культуры уменьшает изменчивость внутри и между партиями органоидов, что приводит к более высокой воспроизводимости34. Кроме того, это позволяет избавиться от клеточных процессов, распространяющихся в БММ, которые не наносят ущерба следующим этапам дифференцировки, но затрудняют наблюдение органоидов для контроля качества на последующих этапах процедуры. Чтобы улучшить поглощение питательных веществ и кислородный обмен, мы сравнили созревание органоидов на орбитальных шейкерах и вращающихся биореакторах, что привело к аналогичным результатам. Поэтому мы выбрали вариант орбитального шейкера, так как он позволяет значительно снизить средние объемы и, следовательно, общую стоимость экспериментов. Важно отметить, что используйте другой инкубатор для стационарной и встряхивающей культуры на орбитальном шейкере, чтобы избежать любых вибраций, наносящих ущерб росту прилипшего hIPSC. Мы успешно применили этот протокол на пяти различных линиях управления hIPSC35, которые дают однородные результаты, обеспечивающие надежность этой процедуры.

Характеристика таких органоидов может быть достигнута с помощью нескольких методов. Чтобы сохранить 3D-пространственную информацию внутри органоидов, мы создали протокол, позволяющий полностью загрязнять и очищать целые органоиды с последующим получением светового листа. Появились различные методы очистки с эффективностью в зависимости от происхождения и толщины образца36,37. Здесь мы создали простой, быстрый и экономически эффективный метод очистки, который опирается на TDE (2,2'-тиодиэтанол), производное гликоля, ранее использовавшееся для очистки мозга мыши и кишечных органоидов38,39. Получение иммуноокрашенных и очищенных органоидов осуществлялось на световом листовом микроскопе с использованием 20-кратного объектива, погруженного в 80% TDE. По сравнению с другими методами получения 3D-изображений, микроскопия светового листа представляет интерес по нескольким причинам: быстрое получение, хорошее проникновение и уменьшенное фотоотбеливание. Оптимизация стадии пермеабилизации позволяет достичь эффективного и однородного проникновения антител, позволяя визуализировать базальные тела и аксонемы ПК, простирающиеся от всех типов клеток-предшественников и нейронов всего органоида. Кроме того, приобретение свободно плавающих участков толщиной 150 мкм с использованием инвертированного резонансного сканирующего конфокального микроскопа с 40-кратными (NA 1.3) или 63x (NA 1.4) масляными объективами позволяет получить дальнейшее разрешение, сохраняя при этом значительную степень пространственной 3D-информации и позволяя проводить качественный и количественный анализ биогенеза и функции ПК.

Сочетание таких 2D и 3D клеточных моделей и анализа 3D-визуализации (рисунок 5) на hIPSC, генерируемых либо путем перепрограммирования клеток пациента с цилиопатией, либо с использованием технологии CRISPR / CAS9 для специального редактирования центросомальных или цилиарных генов, должно обеспечить значительный прогресс в понимании вклада ПК в нормальное и патологическое развитие коры головного мозга. Важно отметить, что технология редактирования генома также позволяет специально спасать мутации пациентов для получения изогенных контрольных hIPSC для преодоления генетической гетерогенности, которая бросает вызов обнаружению механизмов заболевания. Кроме того, одноклеточные геномные подходы в настоящее время широко используются во всей области и представляют собой релевантные и взаимодополняющие подходы к анализу иммуноокрашения. Таким образом, несмотря на некоторые ограничения и трудности, присущие всем новым технологиям и широко рассматриваемые, такие модели на основе 2D и 3D hIPSC и методы характеристики, которые мы представили здесь, предлагают мощные и актуальные инструменты для анализа участия ПК в патологических механизмах, лежащих в основе неокортикальных аномалий развития человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального агентства исследований (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) и N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 и ANR-19-CE16-0002-01). LB поддерживается ANR в рамках программы Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) и Фондом Бетанкур Шуллер (программа MD-PhD). Институт Imagine поддерживается государственным финансированием ANR в рамках программы Investissements d'avenir (проекты ANR-10-IAHU-01, CrossLab) и в рамках второй программы Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 181 первичная ресничка индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки hIPSC нервные стволовые и предшественники развитие коры головного мозга человека нейронные розетки органоиды дорсального переднего мозга 2D и 3D модели неокортикального развития на основе hIPSC церебральные органоиды звуковой еж цельное иммуноокрашание оптическая очистка световой листовой микроскоп
2D и 3D индуцированные человеком плюрипотентные модели на основе стволовых клеток для рассечения первичного поражения ресничек во время неокортикального развития
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter