Summary
간 질환은 섬유증이나 간경변증을 촉진하는 많은 원인에 의해 유도됩니다. 이식은 건강을 회복하기위한 유일한 옵션입니다. 그러나 이식 가능한 장기의 희소성을 감안할 때 대안을 모색해야합니다. 우리의 연구는 동물 모델에서 간 조직에 콜라겐 비계의 이식을 제안한다.
Abstract
간 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 과도한 알콜 소비, 고지방 규정식 및 C형 간염 바이러스 감염은 섬유증, 간경변 및/또는 간세포 암종을 승진시합니다. 간 이식은 고급 질병 단계에서 환자의 수명을 개선하고 연장하기 위해 임상적으로 권장되는 절차입니다. 그러나 이식의 10%만이 장기 가용성, 외과 전 및 수술 후 수술 및 높은 비용과 직접 상관 관계가 있습니다. 세포 외 매트릭스 (ECM) 비계조직 복원을위한 대안으로 등장했다. 생체 적합성 및 접목 수용은 이러한 생체 재료의 주요 유익한 특성입니다. 간 의 크기와 정확한 기능을 복원하는 능력은 간 간 절제술 모델에서 평가되었지만, 스캐폴드 또는 멸종 된 간 질량의 부피를 대체하기 위한 일종의 지원의 사용은 평가되지 않았습니다.
부분 적인 간 절제술은 소 콘딜로부터 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 (CMS)의 이노 삽입을 가진 쥐 간에서 수행되었다. 좌간 엽 조직을 제거 (약 40%), CMS의 동등한 비율은 수술로 이식되었다. 간 기능 테스트는 외과 수술 전후에 평가되었다. 3일, 14일, 21일 후, 동물들은 안락사되었고, 거시적 및 점학적 평가를 수행했다. 3일과 14일에, 지방 조직은 21일째에 혈관 신형성 및 CMS 재흡수와 같이 거부 또는 감염의 임상적인 증거가 없는 CMS를 둘러싸고 관찰되었습니다. CMS에 인접한 세포의 사소한 염증 과정 및 이동의 히스토릭 증거가 있었다, 헤마톡시린과 eosin으로 관찰 (H&E) 및 마슨의 삼색 얼룩. CMS는 간 조직에서 잘 수행 하 고 조직 재생 및 만성 간 질환에서 복구를 공부 하기 위한 유용한 대안 이 될 수 있습니다.
Introduction
간은 항상성 및 단백질 생산1을유지하는 데 관여하는 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 불행히도, 간 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 간경변과 간세포 암종을 포함하는 간 손상의 고급 단계에서 간 이식은 임상적으로 권장되는 절차입니다. 그러나, 기증자의 희소성과 성공적인 이식의 낮은 비율로 인해 조직 공학 (TE) 및 재생 의학 (RM)에 있는 새로운 기술이2,3개발되었습니다.
TE는 염증, 섬유성 및 부종 장기 및 조직의 복원을 촉진하기 위해 줄기 세포, 비계 및 성장 인자4의 사용을포함1,5,6. 스캐폴드에 사용되는 생체 재료는 기본 ECM을 모방하여 유도 된 세포 리모델링7에대한 물리적, 화학적 및 생물학적 단서를 제공합니다. 콜라겐은 진피, 힘줄, 장 및 구심8,9로부터얻은 가장 풍부한 단백질 중 하나입니다. 더욱이, 콜라겐은 바이오프린팅 또는 전기방사(10,11)을통해 2차원 및 3차원 스캐폴드를 생성하는 바이오 폴리머로서 수득될 수 있다. 이 그룹은 간 조직의 재생을 위한 뼈 근원에서 콜라겐의 사용을 보고하는 첫번째입니다. 또 다른 연구는 소 콜라겐에서 합성 된 비계의 사용을보고, 이는 피부에서 얻은, 균질적이고 밀접하게 위치 모공을, 그들 사이의 통신없이12.
탈세포화는 네이티브 ECM을 보존하여 줄기 세포 전위13,14를가진 세포의 후속 편입을 허용한다. 그러나, 이 절차는 마우스, 쥐, 토끼, 돼지, 양, 가축 및 말3,14에서간, 심장, 신장, 소장 및 오줌 방광에 있는 실험 단계에 아직도 있습니다. 현재, 절제된 간 질량 량은 동물 간 절제술 모델 중 어느 모델에서도 대체되지 않는다. 그러나, 세포 증식 및 혈관 신생을 가능하게 하는 추가 지원 또는 네트워크(생체 재료)의 사용은 간 완구기능의 신속한 복원을 위해 필수적일 수 있었다. 따라서, 스캐폴드는 만성 간 질환에서 조직을 재생하거나 복구하는 대체 접근법으로 사용될 수 있으며, 차례로 간 이식의 기증 및 임상 합병증으로 인한 제한을 제거합니다.
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Protocol
본 연구는 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코(UNAM)와 멕시코 병원 총독(CI/314/15)의 윤리위원회(DI/115/2015)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 기관은 실험실 동물의 생산, 관리 및 사용에 대한 모든 기술 사양을 충족하며 국가 법 (NOM-062-ZOO-1999)에 의해 합법적으로 인증됩니다. 이 연구를 위해 150-250g(6-8주 된) 수컷 위스타 쥐는 UNAM 의과 대학의 실험실 동물 시설에서 수득되었다.
1. 소 대퇴골에서 콜라겐 매트릭스 비계 를 얻기
- 멕시코의 보건 및 농업 당국에 의해 인증 된 도살장에서 소 대퇴골에서 condyle을 가져옵니다.
- 정결 지방, 근육 및 연골을 외과 기기로 조심스럽게 해부합니다. 콘딜 조각을 톱 커터를 사용하여 3cm x3cm 조각으로 자르고 수건으로 지방과 혈액을 청소하십시오. 콘딜 조각을 물로 씻으시다.
- 30분 동안 애니오닉 세제(10g/L)의 1L로 조각을 끓입니다(92°C). 콘딜 조각을 두 번 세척하여 음이온 세제의 잔재를 제거하십시오.
- 필터 용지(0.5mm)를 사용하여 콘딜 조각을 3시간 동안 건조시다.
- 1.1단계(도1A)에언급된 조각으로부터 0.5cm의 삼각형(1cm x1cm x1cm)의 CMS를 준비한다.
- 일정한 동요로 10 분 동안 0.5 M HCl의 100 mL에서 조각을 탈염. HCl을 제거합니다.
참고: 수산화나트륨(10M)으로 HCl을 중화한다. - 조각조각을 증류수 100mL, 매번 15분씩 일정한 동요로 세 번 헹구는 다. 1 시간 동안 필터 용지 (0.5mm)로 CMS를 건조시다.
- 스테레오현미경(15)을 사용하여 CMS(모공 의 크기, 모공 형성 및 다공성 상호 연결)의 구조적 특성을 분석한다(도1B).
- CMS trabeculae(도 1C)의거친 표면을 분석하기 위해 스캐닝 전자현미경(16)을 사용합니다.
- CMS(도1D)의기계적 변화(가소성 및 유연성)를 평가하기 위해 해부 계측기를 사용하여 블렌딩 및 스트레칭을 한다.
- CMS를 살균 파우치에 넣고 과산화수소 플라즈마로 38분 간 살균합니다. 멸균 CMS를 원래 팩에 20-25°C의 건조 부위에 보관하여 사용까지 보관하십시오.
- 일정한 동요로 10 분 동안 0.5 M HCl의 100 mL에서 조각을 탈염. HCl을 제거합니다.
2. 수술 부위의 준비 및 동물 모델의 취급 및 준비
- 수술 부위, 작업성, 미세 수술 현미경 및 시트를 2% 클로르헨시딘 용액으로 소독합니다. 열 살균을 통해 모든 수술 기구, 수술 용 스폰지, 면봉 및 일회용 수술 커튼을 살균 (121 ° C / 30 분 / 100 kPa)
- 개쥐(n=5)를 그룹당 5마리의 쥐로 3개 그룹으로 할당합니다: 1. sham, 2. hepatectomy 및 3. hepatectomy 플러스 CMS, 그리고 일 3, 14 및 21 일에 모든 그룹을 따릅니다.
- 케타민 (35 mg/kg) 및 자일라진 (2.5 mg/kg) 뒷사지에 근육질 관리.
참고: 진정제 기간은 일반적으로 30-40분 동안 지속됩니다. - 수술용 비누와 양날 블레이드를 사용하여 복부 피부(5cm x 2cm)를 면도하고, 국소 10% 포비도요오드 용액을3라운드 17번으로사용하여 피부를 소독한다.
- 투과성 기도를 유지하기 위해 목을 과도하게 확장한 데큐비투스 등쪽 위치에 따뜻한 접시에 동물을 놓습니다(그림2).
- 호흡 패턴과 사지의 철수 반사의 손실을 통해 마취의 깊이를 평가합니다.
- 면도된 피부 주위에 일회용 수술 커튼을 놓고 메스가 있는 알부스 라인에 절개(2.5cm)를 만들어 시포이드 공정을 기준점으로 사용한다. 출혈을 방지하기 위해 복부 벽 혈관을 피하십시오.
- 복부 리트랙터를 제자리에 놓고 복강을 관찰하십시오. 해부 집게를 사용하여 왼쪽 간 엽을 추출하여 금속 판에 놓습니다(도3A).
참고 : 가짜 그룹에서, 단지 왼쪽 간 엽을 추출한 다음 복강에 간을 반환합니다. 3-0 나일론 봉합사복벽과 피부를 봉합합니다. - CMS가 없는 실험 군에서는 메스 블레이드와 멸균 메스 블레이드(#15)를 사용하여 두 컷으로 간 절제술(약 40%)을 수행합니다. 삼각형 금속 템플릿(1cm x 1cm x 1cm)을 사용하여 간절제술(도 3B)을수행합니다.
- 간 출혈을 방지하기 위해 간 가장자리에 면봉으로 수술 압축을 5 분 동안 유지하십시오.
- 수술 전에 20 분 동안 멸균 식염수 용액으로 CMS를 수분하십시오. 간 조직과 CMS 사이에 4개의 바늘 봉합사를 사용하여 간 절제술 부위에 CMS를 이식하여 생체 재료의 변위를 방지합니다. 7-0 흡수성 폴리프로필렌 봉합사(도3C)를사용하십시오.
참고: 두 번째 수술에서 봉합사를 제거하지 마십시오. 봉합사는 CMS 이식 부위를 식별하는 참조로 사용할 수 있습니다. - 간을 복강으로 되돌리고 3-0 나일론 봉합사로 복벽과 피부를 봉합합니다. 수술요오드에 젖은 스폰지로 수술 절개를 두 라운드로 청소하십시오. 동물의 활력 징후를 관찰하고 모니터링합니다.
- 케타민 (35 mg/kg) 및 자일라진 (2.5 mg/kg) 뒷사지에 근육질 관리.
3. 수술 후 치료
- 메글루민 플루신을 관리 (2.5 mg/kg) 뒷다리에 근육질. 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 진통을 관리한다.
- 마취 복구를 위해, 온도 조절 (23 °C)이있는 소음없는 지역에 실험실 동물 침구가있는 개별 폴리 카보네이트 상자에 동물을 놓습니다.
- 동물의 회복을 관찰하고 2 시간 동안 물과 음식 소비를 모니터링하십시오. 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수술 후 동물을 모니터링합니다.
4. 혈청에서 간 기능의 평가
- 수술 전 마취동물의 측면 꼬리 정맥(500 μL)과 평가일 3, 14 및 21에서 혈액 샘플(500 μL)을 수집한다.
- 실온에서 850 × g/10분에서 혈액 샘플을 원심분리합니다(23°C); 세럼을 분리하고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
- 간 기능 테스트의 패널수행: 혈청 알부민 (ALB), 알칼리 인스파타제 (ALP), 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르타테 아미노 트랜스퍼라제 (AST), 총 빌리루빈 (TB), 직접 빌리루빈 (DB)(표 1).
5. 안락사 및 조직 관리
- 전술한 프로토콜을 따라 각 평가(일 3, 14 및 21일)에 대해 동물을 마취한다.
- 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 통해 안락사.
- 복강의 장기를 관찰하고 CMS의 유무에 관계없이 샴과 실험군의 간절제술 영역의 사진을 찍을 수 있도록 메스와 함께 알부 라인에 절개(5-6cm)를 수행한다.
- 간 샘플 (2cm x 2cm; 0.40-0.45 g) 모든 연구 그룹 동물에서 하 고 후속 조직 평가를 위한 24 시간 대 한 4% 포름알데히드 용액에 배치.
6. 조직학적 분석
- 간 조직을 4% 포름알데히드로 보존하고 일련의 알코올 농도(60%, 70%, 80%, 90%, 100%)를 사용하여 조직을 탈수합니다. 자일렌 (1h)에 배치하고 파라핀16에내장 .
- 8개의 슬라이드를 준비하기 위해 마이크로토메로 파라핀 블록을 4 μm 두께섹션으로 잘라냅니다.
- H&E와 마슨의 삼색 염색16을수행합니다.
- CMS의 유무에 관계없이 간의 대표적인 영역을 선택하기 위해 가벼운 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오. 4배, 10배, 40배율로 포토마이크로그래프를 얻고 적절한소프트웨어(18)를 사용하여 이미지를 처리합니다(재료표참조).
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Representative Results
뼈 탈염은 모공의 원래 모양이나 상호 연결을 변경하지 않고 CMS의 기계적 특성에 영향을미칩니다. CMS는 임의의 형상을 가질 수 있으며, 따라서 선택된 장기 또는조직(19)의크기 및 형상으로 조절될 수 있다. 본 프로토콜에서는 삼각형 CMS(도1A-D)를사용하였다. 쥐 모델은 간에서 CMS 제노임플란트의 재생 능력을 평가하기 위해 사용되었다. 간은 경화되고 연약한 기관이더라도, 이 프로토콜에서 수행된 외과 적 절차는 CMS가 제자리에 남아 있는지 확인했습니다(그림 2 및 도 3A-C). 왼쪽 엽의 40%의 부분 적인 간 절제술은 임플란트와 토착 parenchyma의 변경을 비교할 수 있도록, 간의 나머지부분을 온전하게 유지, 평가될 기관의 일부를 가능하게 했습니다. 또한, 우리는 CMS 이식 전후간 간 기능을 평가하기 위해 혈액 샘플을 획득했습니다.
3일과 14일CMS 이식유무에 관계없이 샴그룹과 실험군 사이의 생화학적 파라미터의 기준기 농도에는 차이가 없었다. 그들은 기준 값 내에 남아(ALB: 0.43-2.41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0.01-0.43 mg/dL; DB: 0.1 mg / dL)20. 또한, 21일 동안 샴그룹과 실험군 사이에 는 알부민, ALP, ALT, AST, TB, 및 DB 수준에 차이가 없었으며, CMS가 간 기능을 방해하지 않는다는 것을나타낸다(표 1).
안락사 동안, 탐구 복강경은 간 전형적인 색상과 정확한 크기와 모양을 공개했다. 어떤 경우에 이식 부위에서 염증이나 감염이 관찰되지 않았다. 3일째에는 복강(도4A)과관련하여 장기에 변화가 없었다. 간 조직 및 CMS를 포함하는 부분에서, 혈액은 CMS에 침투한 것으로 관찰되었다, 증분 부착 성지방(도 4B). 14일째에, 지방의 양이 증가했습니다; 혈관 신형성과 CMS의 통합이 수취인 간 조직으로 통합되었지만 복강의 소장 또는 장기에 변화가없었다(도 5A). CMS 이식 부위의 내장영역(도 5C)과비교하여 전방 영역(도5B)에서오멘탈 지방이 높았다. 평가일째인 21일에, CMS가 간으로 통합하는 것이 더분명했다(그림 6A). 중년 줄기세포(21)의공급원이기 때문에 오멘탈 지방의 증가는 재생의 진행을 나타내는 지표로 사용될 수 있다. 더욱이, 21일, 간은 분해및 흡수에 대응하는 조밀한 부위를 제시하여 크기와 원래의형상(도 6B)을변화시켰다.
CMS 임플란트로 간 미세구조를 분석하기 위해, 우리는 오른쪽 간 엽(control)의 조직과 비교된 이식 부위로부터의 대표적인 조직 단편에 대한 조직학적 분석을 수행하였다. 3일, 14일, 21일에 수행된 생검은 H&E와 매슨의 삼색 얼룩을 처리하고 시행하였다. 간 parenchyma의 정상적인 구조는 21 일째에 샴 그룹에서 관찰되었다(도 7A 및 도 7E). 3일째, 조직학적 분석은 간에서 CMS의 존재가 이물질 반응을 촉진하지 않았으며, 느슨한 결합 조직의 눈에 띄는 존재가 관찰되었다는 것을보여주었다(도 7B 및 도 7F). 14일과 21일에, 느슨한 결합 조직은 간세포에 둘러싸인 CMS trabeculae와 함께, 더 풍부했다, 간세포가 CMS로 마이그레이션했다는 것을 시사(도 7C 및 도 7G; 그림 7D 및 그림 7H). 결과는 또한 혈관에 의해 관개된 간세포의 영역을 보여주었다(도 8A). 면밀한 검사 결과 CMS trabeculae에 부착한 간세포가 때때로 느슨한 결합조직(도 8B-D)에둘러싸여 있는 것으로 나타났습니다. 두 개의 이중 맹검 독립적 인 병리학자는 조직 병리학 분석을 수행했습니다. 면역히스토케와 중합효소 연쇄 반응 기반 분석은 간 재생 공정과 관련된 상이한 단백질 및 유전자를 평가하기 위해 진행 중이다.
따라서, 거시적 및 현미경 관측 및 생화학적 가치는 CMS가 간 재생을 지원하고 촉진하기위한 이상적인 생체 재료라는 우리의 제안을 뒷받침합니다. 그럼에도 불구 하 고, CMS 이식 은 그것의 흡수 시간을 결정 하 고 전체 간 조직 복원을 결정 하기 위해 21 일 이상 평가 해야 합니다. 또한 CMS의 존재에서 간 재생과 관련된 상이한 단백질 및 유전자를 평가하는 연구가 수행되어야 한다.
도 1: 뼈 표본 및 CMS. (A)뼈 표본의 삼각형 샘플이 CMS를 준비하기 위해 활용되었다. (b)전자 현미경 검사법에 의해 관찰된 바와 같이 CMS의 모공 및 상호 연결 또는 궤적 연결에 대한 상세한 보기. (C)CMS, 스테레오 현미경에서 볼 수 있듯이. (D)기계적 특성의 수정을 확인하기 위해 계측기로 CMS 조작이 수행되었다. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술을 위해 동물을 준비합니다. 동물은 절단 절제술 및 CMS 이식을 위해 준비된 면도한 복부 지역을 보여주는 decubitus 등대 위치에 있습니다. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 간 좌측 엽의 대장 절제술. (A)좌측 엽을 추출하여 금속판에 올려 간 절제술을 수행하였다. (B)왼쪽 엽의 40%의 간절제술은 CMS와 같은 삼각형 모양으로 수행되었다. (C) 간 절제술의 영역은 CMS로 대체됩니다. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 평가 3일째 평가일. (A)평가일 3일 동안 이식 부위의 매크로스코픽 관찰. CMS(점선)로 이식된 간은 색상이나 크기가 변하지 않았다. 소장(빈 별)과 나머지 복부 구조는 아무런 변화를 보이지 않았다. (B)간 (채워진 별) 및 CMS (흰 화살표)의 샘플은 오멘탈 지방 (빨간 화살표)으로 덮여. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 평가 14일차 평가일. (A)평가일 14일 동안 이식 부위의 매크로스코픽 관찰. CMS를 가진 간 조직 (채워진 별)은 색깔 또는 크기에서 변경되지 않았습니다. 소장(빈 별)과 복강의 나머지 구조와 장기는 아무런 변화를 보이지 않았다. 이식된 CMS를 가진 간 샘플:(B)전방 시야; (C)후방/내장 보기. 지역을 덮고 있는 오멘탈 지방(적색 화살표). CMS는 간 조직으로 통합되었다. 오멘탈 지방(적색 화살표)은 주로 전방 시야의 영역을 덮습니다. 점선은 CMS 이식 부위를 나타낸다. 봉합사(파란색 실). 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 평가 21일. (A)평가일 21일 이식 부위의 거시적 관찰. CMS(점선)로 이식된 받는 사람 간(채워진 별)은 색상이나 크기를 변경하지 않았다. 소장(빈 별)과 나머지 복부 구조는 아무런 변화를 보이지 않았다. (B)이식된 CMS(점선)를 가진 간 샘플은 크기와 모양의 변화를 나타낸다. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: CMS를 가진 간 및 간의 히스토로지. (A)특징적인 조직 구조를 보여주는 정상 간(SHAM). (B)CMS(파선 타원형)의 trabeculae에서 느슨한 결합 조직을 보여주는 CMS 이식3일. (C)CMS(화살표)의 trabeculae와 네이티브 간(오른쪽)과 CMS(왼쪽) 사이의 전이 영역. (D)21일째CMS(점선)와 접촉하는 원종 간. (E)마슨의 삼색 얼룩이 있는 정상적인 간. (F)간에서 이식된 CMS; 3 일째 (대시 타원형)에 느슨한 결합 조직의 침공. (G)14일째에 CMS trabeculae를 가진 토착 간, 모종 간 외부의 간세포(채워진 별)의 면적을 보여주며, 이는 토착 간세포가 CMS를 통해 이동했음을 나타낸다. (H)21일째에, 네이티브 간세포가 CMS(화살표)를 향해 이동했습니다. A 및 E: 스케일 바 = 200 μm: 4x, B-D 및 F-H: 스케일 바 = 100 μm : 10x. A-D: H&E 염색; E-H: 마슨의 삼색 얼룩. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 비계; H&E = 헤마톡슬린과 에신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 간 및 CMS의 히스토로지( A)CMS(블랙 화살표)의 궤적에 존재하는 간세포(흰색 화살표)의 풀. 간세포는 용기 (채워진 별)에 의해 관개됩니다. (B)간세포(흰색 화살표)가 이동하여 CMS(검정 화살표)의 trabeculae에 부착하였다. (C)CMS의 두 개의 trabeculae(검정화) 사이에서 간세포(dashed 원)의 그룹이 관찰된다. (D)간세포는 느슨한 결합 조직 (대시 타원형)의 존재에 CMS의 trabeculae (검은 화살표)를 부착했다. A 및 C: 스케일 바 = 100 μm : 10x. B 및 D : 스케일 바 = 20 μm : 40배. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 일 | 가짜 | 간 절제술 | 이식 CMS | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| 결핵 (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0.5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0.4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0.1±0 | 0.05±0.07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
표 1: 간 기능. 간 기능 테스트는 3, 14 및 21 일에 CMS가 없는 샴 및 실험 군을 위해 수행되었다. 약어 : CMS = 콜라겐 매트릭스 비계; ALB = 알부민; ALP = 알칼리성 인산염; ALT= 알라닌 아미노트랜스페라아제; AST = 아미노트랜스퍼라제 아스파타테; 결핵 = 총 빌리루빈; DB = 직접 빌리루빈.
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Discussion
장기 이식은 간 섬유증 또는 간경변 환자에서 치료의 주류입니다. 몇몇 환자는 이 절차에서 유익합니다, 대기자 명단에 있는 환자를 위한 치료 대안을 제공하는 것을 필요하게 하는. 조직 공학은 재생 잠재력2,4,13을가진 발판 및 세포를 사용하는 유망한 전략입니다. 간 부분의 제거는 이 혈관화된 기관의 경질 출혈 때문에 이 절차에서 중요한 단계입니다. 따라서 수술용 침대의 혈안이 이러한 합병증을 방지하기 위해 수행해야 합니다. 더욱이, 조직-생체 물질 상호 작용을 보장하기 위해 필수적인 CMS에 간 조직의 결합은 봉합사의 사용을 통해 촉진됩니다. 그러나, 그것은 간 찢 고 나중에 출혈을 일으키는 것을 피하기 위해 신중 하 게 수행 해야 합니다.
본 원에 제안된 생체 물질은 소 기원(xenogenic)이지만, 쥐에 생체 물질 반응의 데이터가 없기 때문에 선택적 간 절제술을 가능하게 합니다. 대조적으로, 2/3 간 절제술 모델은 다량의 간조직(14)을제거하여 동물의 죽음을 유발하는 것으로 나타났다. 또한, 간 절제술과 CMS의 크기를 표준화하는 데 어려움이 있었기 때문에 스테인레스 스틸 금속 템플릿을 개발했습니다. CMS의 살균은 기존 기술이 콜라겐과 생화학적 특성의 구조를 수정했기 때문에 어려웠습니다. 따라서, 열, 감마 방사선 및 에틸렌 산화물에 의한 살균은 과산화수소의 혈장이 최적의 기술이었다는 것을 결정하기 전에 살균 방법으로탐구되었다(13)
간에서 이식될 수 있는 CMS의 최대 크기를 결정하고 전신 수준에서 생물학적 반응을 평가하는 것이 필수적입니다. 또한, 더 큰 동물 종에서이 기술의 효능을 최적화하고 조사할 필요가 있다. 더욱이, CMS의 생체 흡수 정도와 간 조직의 재생정도를 평가할 수 있는 장기간(>30일)에 대한 간에서 CMS 이식의 효과를 조사하는 것이 중요하다. 또한, CMS 이식의 효과는 간 손상을 입은 동물 모델에서 검사되어야 합니다. 이러한 이식 방법은 절제된 조직의 모양과 부피의 복원을 탐구하는 전략의 문을 열어 마취, 수술 기간 및 회복 시간을4,13으로감소시킵니다.
CMS는 천연 공급원으로부터 수득되어 생체적합성 또는 생체흡수성2,3이아닌 생체 인쇄 또는 전기방사와 같은 복잡한 방법론을 사용하여 만들어진 합성 생체재료에비해 물리적 및 화학적 특성을 보존하였다. 이 CMS의 1차 성분은 세포 접착 및증식(22)을가능하게 하는 ECM의 주요 단백질인 콜라겐 타입 I이다. 추가적으로, CMS 모공의 trabeculae는 재생 프로세스의 성장 인자, 혈액 및 그밖 중재자의 세포 이동 그리고 연속한 교류를 가능하게 합니다. 수리 할 조직에 따르면,이 연구 그룹은 3D 구조를 보존, 다른 모양의 CMS를 설계 경험이있다. 예를 들어, 원통형 CMS는 돼지의 개 요도 및 담관에 이식되었고 조직 재생23,24에서유망한 결과를 산출했다.
이 CMS의 이식은 조직 재생을 자극하고 다른 병학으로 인한 간경변의 섬유발생-섬유증 균형을 복원하는 대체 치료법이 될 수 있다(예: 바이러스, 알코올, 대사 인자). 증식, 이주 및 염증 작용은 CMS에 의해 유발되는 분자 및 세포 메커니즘을 확인하기 위해 수행되어야 합니다. 결론적으로, 이 논문은 생물 물질의 제노이식을 통한 재생 공정의 검사뿐만 아니라 간 절제술에 대한 재현 가능한 절차를 설명합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다. 벤자민 레온-만실라는 미타 드 닥터라도 엔 시엔시아스 바이오메디카, 유니버시다드 나시오날 아우토노마 데 멕시코(UNAM)의 박사 과정 학생으로, DGAPA-UNAM 펠로우십을 받았다.
Acknowledgments
저자는 실험 의학 단위의 실험실 동물 시설의 직원, 기술 및 외과 지원을위한 간호사 캐롤라이나 Baños G., 마이크로 사진지원을 위한 마르코 E. Gudiño Z. 및 간 조직학 지원을 위한 에릭 아포에게 감사를 표하고자 합니다. 국가위원회는과학기술(CONACyT),교부금 수 SALUD-2016-272579 및 PAPIIT-UNAM TA200515에 대한 연구를 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
