Summary
Leversykdommer er indusert av mange årsaker som fremmer fibrose eller skrumplever. Transplantasjon er det eneste alternativet for å gjenopprette helse. Men gitt knappheten på transplanterbare organer, må alternativer utforskes. Vår forskning foreslår implantasjon av kollagen stillaser i levervev fra en dyremodell.
Abstract
Leversykdommer er den ledende dødsårsaken over hele verden. Overdreven alkoholforbruk, et fettrikt kosthold og hepatitt C-virusinfeksjon fremmer fibrose, skrumplever og/eller hepatocellulært karsinom. Levertransplantasjon er den klinisk anbefalte prosedyren for å forbedre og forlenge levetiden til pasienter i avanserte sykdomsstadier. Imidlertid er bare 10% av transplantasjonene vellykkede, med organtilgjengelighet, presurgiske og postsurgiske prosedyrer, og forhøyede kostnader direkte korrelert med det resultatet. Ekstracellulære matriser (ECM) stillaser har dukket opp som et alternativ for vevsrestaurering. Biokompatibilitet og graft aksept er de viktigste fordelaktige egenskapene til disse biomaterialer. Selv om kapasiteten til å gjenopprette størrelsen og riktig funksjon av leveren har blitt evaluert i leveren hepatectomy modeller, bruk av stillaser eller en slags støtte for å erstatte volumet av ekstirpated levermasse er ikke vurdert.
Delvis hepatektomi ble utført i en rottelever med xenoimplantasjon av et kollagenmatrise stillas (CMS) fra en bovin kondyle. Venstre leverlobervev ble fjernet (ca. 40%), og en lik andel cms ble kirurgisk implantert. Leverfunksjonstester ble evaluert før og etter den kirurgiske prosedyren. Etter dag 3, 14 og 21 ble dyrene euthanized, og makroskopiske og histologiske evalueringer ble utført. På dag 3 og 14 ble fettvev observert rundt CMS, uten klinisk bevis på avvisning eller infeksjon, som det var kar neoformasjon og CMS-reabsorpsjon på dag 21. Det var histologiske bevis på en ubetydelig betennelsesprosess og migrasjon av tilstøtende celler til CMS, observert med hematoksylin og eosin (H&E) og Massons trichrome farging. CMS ble vist å fungere godt i levervev og kan være et nyttig alternativ for å studere vevregenerering og reparasjon i kroniske leversykdommer.
Introduction
Leveren er et av de viktigste organene som er involvert i å opprettholde homeostase og proteinproduksjon1. Dessverre er leversykdom den ledende dødsårsaken over hele verden. I avanserte stadier av leverskade, som inkluderer skrumplever og hepatocellulært karsinom, er levertransplantasjon den klinisk anbefalte prosedyren. På grunn av mangel på donorer og den lave frekvensen av vellykkede transplantasjoner, er det imidlertid utviklet nye teknikker innen vevsteknikk (TE) og regenerativ medisin (RM)2,3.
TE innebærer bruk av stamceller, stillaser og vekstfaktorer4 for å fremme gjenoppretting av betente, fibrotiske og edematøse organer og vev1,5,6. Biomaterialene som brukes i stillaser etterligner den innfødte ECM, og gir de fysiske, kjemiske og biologiske signalene for guidet cellulær ombygging7. Kollagen er et av de mest tallrike proteinene hentet fra dermis, sene, tarm og perikardium8,9. Videre kan kollagen oppnås som biopolymer for å produsere to- og tredimensjonale stillaser gjennom bioprinting eller elektrospinning10,11. Denne gruppen er den første som rapporterer bruk av kollagen fra en benkilde for regenerering av levervev. En annen studie rapporterer bruk av stillaser syntetisert fra bovint kollagen, som ble hentet fra huden, med homogene og nærtliggende porer, uten kommunikasjon mellom dem12.
Decellularisering bevarer den opprinnelige ECM, slik at etterfølgende inkorporering av celler med stamcellepotensial13,14. Denne prosedyren er imidlertid fortsatt i eksperimentell fase i leveren, hjertet, nyren, tynntarmen og urinblæren fra mus, rotter, kaniner, griser, sauer, storfe og hester3,14. For tiden er det resekterte levermassevolumet ikke erstattet i noen av dyrets hepatektomimodeller. Imidlertid kan bruk av ytterligere støtte eller nettverk (biomaterialer) som muliggjør celleproliferasjon og angiogenese være avgjørende for rask restaurering av leverparenchymale funksjoner. Dermed kan stillaser brukes som alternative tilnærminger for å regenerere eller reparere vev i kroniske leversykdommer, i sin tur eliminere begrensninger på grunn av donasjon og kliniske komplikasjoner ved levertransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende forskningen ble godkjent av etikkkomiteen ved School of Medicine (DI/115/2015) ved Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og etikkkomiteen for Hospital General de Mexico (CI/314/15). Institusjonen oppfyller alle tekniske spesifikasjoner for produksjon, pleie og bruk av forsøksdyr og er juridisk sertifisert av nasjonal lovgivning (NOM-062-ZOO-1999). Mannlige Wistar-rotter som veide 150-250 g (6-8 uker gamle) ble hentet fra Laboratory Animal Facility ved School of Medicine, UNAM, for denne studien.
1. Oppnå kollagen matrise stillaser fra bovin femur
- Få condyle fra bovin femur fra et slakteri sertifisert av helse- og landbruksmyndigheter i Mexico.
- Disseker forsiktig kondynefett, muskel og brusk med et kirurgisk instrument. Klipp kondylefragmentene i 3 cm x3 cm fragmenter ved hjelp av en sagkutter og rengjør fettet og blodet med et håndkle. Vask condyle fragmenter med vann.
- Kok (92 °C) fragmentene med 1 L anionisk vaskemiddel (10 g/l) i 30 min. Vask kondylefragmentene to ganger for å fjerne rester av det anioniske vaskemiddelet.
- Tørk kondylefragmentene i 3 timer med filterpapir (0,5 mm).
- Forbered en trekantet (1 cm x 1 cm x1 cm) CMS med tykkelse 0,5 cm fra fragmentene som er nevnt i trinn 1.1 (Figur 1A).
- Demineraliser fragmentene i 100 ml 0,5 M HCl i 10 minutter med konstant agitasjon. Fjern listen over kompatibel maskinvare
MERK: Nøytraliser HCl med natriumhydroksid (10 M). - Skyll fragmentene tre ganger med 100 ml destillert vann, 15 min hver gang, med konstant agitasjon. Tørk CMS med filterpapir (0,5 mm) i 1 time.
- Bruk et stereomikroskop15 til å analysere CMS's strukturelle egenskaper (størrelse på porer, poredannelse og porøs sammenkobling) (Figur 1B).
- Bruk et skanneelektronmikroskop16 til å analysere den grove overflaten på CMS-trabeculaen (figur 1C).
- Bruk disseksjonsinstrumentet til blanding og strekking for å evaluere cms mekaniske endringer (plastisitet og fleksibilitet) (figur 1D).
- Pakk CMS inn i steriliseringsposen og steriliser den med hydrogenperoksidplasma i 38 min. Oppbevar det sterile CMS-et i originalpakningen på et tørt område ved 20-25 °C til bruk.
- Demineraliser fragmentene i 100 ml 0,5 M HCl i 10 minutter med konstant agitasjon. Fjern listen over kompatibel maskinvare
2. Forberedelse av det kirurgiske området og håndtering og forberedelse av dyremodellen
- Desinfiser det kirurgiske området, arbeidsbordet, mikrokirurgimikroskopet og setet med 2% klorhexidinoppløsning. Steriliser alle kirurgiske instrumenter, kirurgisk svamp, vattpinner og engangs kirurgisk gardin gjennom varmesterilisering (121 °C /30 min/100 kPa)
- Tilordne rotter (n = 5) i tre grupper på fem rotter per gruppe: 1. sham, 2. hepatectomy og 3. hepatectomy pluss CMS, og følg alle gruppene på dag 3, 14 og 21 dager.
- Administrer ketamin (35 mg/kg) og xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bakre lem.
MERK: Beroligende periode varer vanligvis i 30-40 min. - Barber bukhuden (5 cm x 2 cm) med kirurgisk såpe og et dobbeltkantet blad, og desinfiser huden ved hjelp av aktuell 10% povidon-jodoppløsning i tre runder17.
- Plasser dyret på en varm tallerken i decubitus dorsal posisjon, med nakken hypereksponert for å opprettholde en gjennomtrengelig luftvei (Figur 2).
- Evaluer dybden av anestesi gjennom luftveiene og tap av abstinensrefleksen i lemmer.
- Plasser en engangs kirurgisk gardin rundt den barberte huden og gjør et snitt (2,5 cm) på den albous linjen med en skalpell, ved hjelp av xiphoid-prosessen som referansepunkt. Unngå blodkaret i bukveggen for å forhindre blødning.
- Sett abdominal retractor på plass og observere bukhulen. Bruk disseksjons tang, trekk ut venstre leverlobe og legg den på metallplaten (Figur 3A).
MERK: I sham-gruppen trekker du bare ut venstre leverlober og returnerer deretter leveren til bukhulen. Suturer bukveggen og huden med en 3-0 nylon sutur. - I de eksperimentelle gruppene med og uten CMS, bruk et skalpellblad og sterilt skalpellblad (#15) for å utføre hepatektomi (ca. 40%) med to kutt. Bruk en trekantet metallisk mal (1 cm x 1 cm x 1 cm) til å utføre hepatektomien (figur 3B).
- For å forhindre blødning i leveren, opprettholde kirurgisk kompresjon med en vattpinne på kanten av leveren i 5 min.
- Hydrater CMS i steril saltløsning i 20 minutter før den kirurgiske prosedyren. Implanter CMS på hepatektomistedet med fire masker suturer mellom levervevet og CMS for å forhindre forskyvning av biomaterialet. Bruk 7-0 ikke-absorberbare polypropylen suturer (Figur 3C).
MERK: Ikke fjern suturene i en ny operasjon; suturer kan brukes som referanse for å identifisere stedet for CMS-implantasjon. - Returner leveren til bukhulen og suturer bukveggen og huden med en 3-0 nylon sutur. Rengjør det kirurgiske snittet med en kirurgisk jod-gjennomvåt svamp i to runder. Observer og overvåk dyrenes vitale tegn.
- Administrer ketamin (35 mg/kg) og xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bakre lem.
3. Postoperativ omsorg
- Administrer megluminflunixin (2,5 mg/kg) intramuskulært i bakre lem. Administrer smertestillende midler som godkjent av institusjonsutvalget for dyrepleie og bruk.
- For anestesigjenvinning, plasser dyrene i individuelle polykarbonatbokser med laboratoriedyr sengetøy i et støyfritt område med temperaturkontroll (23 °C).
- Vær oppmerksom på utvinning av dyrene og overvåk vann- og matforbruket i 2 timer. Overvåk dyr postoperativt som godkjent av institusjonsutvalget for dyrepleie og bruk.
4. Evaluering av leverfunksjon i serum
- Samle blodprøver (500 μL) fra laterale hale årer av bedøvede dyr før kirurgisk prosedyre (baseline verdier) og ved evaluering dager 3, 14 og 21.
- Sentrifuger blodprøvene ved 850 × g/10 min ved romtemperatur (23 °C); separere serumet og oppbevar det ved -80 °C til bruk.
- Utfør et panel av leverfunksjonstester: serumalbumin (ALB), alkalisk fosfatase (ALP), alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), total bilirubin (TB) og direkte bilirubin (DB) (tabell 1).
5. Eutanasi og vevshåndtering
- Bedøv dyrene for hver evaluering (dag 3, 14 og 21) ved å følge protokollen beskrevet ovenfor.
- Euthanize via metoder godkjennes av institusjonell dyrepleie- og brukskomité.
- Utfør et snitt (5-6 cm) på den albous linjen med en skalpell for å observere organene i bukhulen og ta bilder av hepatektomiområdet av sham og eksperimentelle grupper, med og uten CMS.
- Ta leverprøver (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) fra alle studiegruppedyrene og plasser dem i en 4% formaldehydløsning i 24 timer for etterfølgende histologisk evaluering.
6. Histologisk analyse
- Bevar levervevet i 4% formaldehyd og dehydrer vevet ved hjelp av en rekke alkoholkonsentrasjoner (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); plasser dem i xylen (1t) og innebygd dem i paraffin16.
- Klipp parafinblokkene med en mikrotom i 4 μm tykke seksjoner for fremstilling av åtte lysbilder.
- Utfør H&E og Massons trichrome farging16.
- Vær oppmerksom på de fargede seksjonene under et lysmikroskop for å velge de representative områdene i leveren, med og uten CMS. Skaff fotomikrografer ved 4x, 10x og 40x forstørrelse og behandle bildene ved hjelp av passende programvare18 (se Materialfortegnelsen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bendemineralisering påvirker cms mekaniske egenskaper uten å endre den opprinnelige formen eller sammenkoblingen av porene. CMS kan ha hvilken som helst form, og kan derfor justeres til størrelsen og formen på det valgte organet eller vevet19. I den nåværende protokollen brukte vi et trekantet CMS (Figur 1A-D). En rottemodell ble brukt til å evaluere den regenerative kapasiteten til CMS xenoimplant i leveren. Selv om leveren er et sprø og mykt organ, sørget den kirurgiske prosedyren som ble utført i denne protokollen for at CMS forble på plass (Figur 2 og Figur 3A-C). Den delvise hepatektomien på 40% av venstre lobe gjorde det mulig å vurdere en del av orgelet, og holdt resten av leveren intakt, slik at endringene i implantatet og det innfødte parenchyma kunne sammenlignes. I tillegg fikk vi blodprøver for å evaluere leverfunksjonen før og etter CMS-implantasjon.
Det var ingen forskjeller i baseline konsentrasjoner av de biokjemiske parametrene mellom sham-gruppen og den eksperimentelle gruppen med og uten CMS-implantasjon ved 3 og 14 dager; de forble innenfor referanseverdiene (ALB: 0,43-2,41 g/dl; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0,01-0,43 mg/dl; DB: 0,1 mg/dl)20. I tillegg var det ingen forskjeller i albumin-, ALP-, ALT-, AST-, TB- og DB-nivåene mellom sham-gruppen og de eksperimentelle gruppene etter 21 dager, noe som indikerer at CMS ikke forstyrrer leverfunksjonen (Tabell 1).
Under eutanasi avslørte utforskende laparotomi den typiske fargen og riktig størrelse og form på leveren. Ingen betennelse eller infeksjon ble observert på implantasjonsstedet i noen av tilfellene. På dag 3 var det ingen endringer i orgelet i forhold til bukhulen (Figur 4A). I en del som inneholdt levervev og CMS, ble det observert at blod hadde infiltrert CMS, med begynnende tilslutning omentalt fett (figur 4B). På dag 14 økte mengden fett; det var blodkar neoformasjon og integrering av CMS i mottaker levervev, men ingen endringer i tynntarmen eller organer i bukhulen (Figur 5A). Omentalt fett var høyere i den fremre sonen (figur 5B) sammenlignet med den viscerale sonen (figur 5C) på CMS-implantasjonsstedet. På evalueringsdag 21 var CMS-inkorporering i leveren tydeligere (Figur 6A). Økningen i omentalt fett kan brukes som en indikator på fremdriften av regenerering, da det er en kilde til mesenchymale stamceller21. Videre, på 21 dager, presenterte leveren tette områder som korresponderte med nedbrytning og absorpsjon, og endret størrelse og original form (Figur 6B).
For å analysere leverens mikrostruktur med CMS-implantatet utførte vi histologisk analyse av et representativt fragment av vev fra implantasjonsstedet, som ble sammenlignet med vev fra høyre leverlobe (kontroll). Biopsier utført på dag 3, 14 og 21 ble behandlet og utsatt for H&E og Massons trichrome farging. Den normale strukturen av leverparenchyma ble observert i skamgruppen på dag 21 (Figur 7A og Figur 7E). På dag 3 viste den histologiske analysen at tilstedeværelsen av CMS i leveren ikke fremmet en fremmedlegemereaksjon, og den iøynefallende tilstedeværelsen av slapp bindevev ble observert (Figur 7B og figur 7F). På dag 14 og 21 var det slappe bindevevet mer rikelig, med CMS-trabeculae omgitt av hepatocytter, noe som tyder på at hepatocytter hadde migrert til CMS (Figur 7C og Figur 7G; Figur 7D og figur 7H). Resultatene viste også områder av hepatocytter som ble vannet av et fartøy (Figur 8A). En nær inspeksjon avslørte at hepatocyttene som hadde holdt seg til CMS-trabeculae noen ganger var omgitt av slapp bindevev (Figur 8B-D). To dobbeltblinde uavhengige patologer utførte den histopatologiske analysen. Immunhiistokjemi og polymerasekjedereaksjonsbaserte analyser er i gang for å evaluere de forskjellige proteinene og genene knyttet til leverregenereringsprosessen.
Dermed støtter de makroskopiske og mikroskopiske observasjonene og de biokjemiske verdiene vårt forslag om at CMS er et ideelt biomateriale for å støtte og fremme leverregenerering. Likevel må CMS-implantasjon evalueres i mer enn 21 dager for å bestemme absorpsjonstiden og fullstendig levervevsrestaurering. I tillegg bør studier som evaluerer de forskjellige proteinene og genene relatert til leverregenerering i nærvær av CMS utføres.
Figur 1: Benprøve og CMS. (A) En trekantet prøve av beinprøven ble brukt til å forberede CMS. (B) En detaljert visning av porene og sammenkoblingen eller trabekulær tilkobling av CMS, som observert ved elektronmikroskopi. (C) CMS, som vist under et stereomikroskop. (D) CMS-manipulering med et instrument ble utført for å verifisere modifikasjonen av mekaniske egenskaper. Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forbereder dyret til kirurgi. Dyret er i decubitus dorsal posisjon, som viser det barberte bukområdet, forberedt på hepatektomi og CMS-implantasjon. Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hepatektomi i venstre lobe i leveren. (A) Venstre lobe ble ekstrahert og plassert på metallplaten for å utføre hepatektomien. (B) Hepatektomi på 40% av venstre lobe ble utført i trekantet form, som CMS. (C) Området av hepatektomi er erstattet av CMS. Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evalueringsdag 3. (A) Makroskopisk observasjon av implantasjonsstedet på evalueringsdag 3. Leveren implantert med (fylt stjerne) CMS (prikket linje) endret seg ikke i farge eller størrelse. Tynntarmen (tom stjerne) og resten av bukstrukturene viste ingen endringer. (B) Prøve av leveren (fylt stjerne) og CMS (hvit pil) dekket med omental fett (rød pil). Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Evalueringsdag 14. (A) Makroskopisk observasjon av implantasjonsstedet på evalueringsdagen 14. Levervevet (fylt stjerne) med CMS endret seg ikke i farge eller størrelse. Tynntarmen (tom stjerne) og resten av strukturene og organene i bukhulen viste ingen endringer. Prøve av leveren med implantert CMS: (B) fremre visning; (C) bakre/visceral visning. Omental fett (rød pil) som dekker området. CMS ble integrert i levervevet. Omentalfett (rød pil) dekker hovedsakelig området i den fremre visningen. Den stiplede linjen indikerer stedet for CMS-implantasjon; suturer (blå tråd). Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Evalueringsdag 21. (A) Makroskopisk observasjon av implantasjonsstedet på evalueringsdagen 21. Mottakerleveren (fylt stjerne) implantert med CMS (prikket linje) endret ikke farge eller størrelse. Tynntarmen (tom stjerne) og resten av bukstrukturene viste ingen endringer. (B) Prøve av leveren med implantert CMS (prikket linje) som viser endringer i størrelse og form. Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Leverens histologi og leveren med CMS. (A) Normal lever (SHAM) som viser den karakteristiske vevsarkitekturen. (B) Dag 3 av CMS implantasjon som viser lax bindevev i trabeculae av CMS (stiplede ovaler). (C) Overgangssone mellom den opprinnelige leveren (høyre side) og CMS (venstre side), med trabeculae av CMS (pil). (D) Innfødt lever i kontakt med CMS (stiplede linjer) på dag 21. (E) Normal lever med Massons trichrome flekk. (F) CMS implantert i leveren; invasjon av lax bindevev på dag 3 (stiplet oval). (G) På dag 14, innfødt lever med CMS trabeculae, viser et område av hepatocytter (fylt stjerne) utenfor den innfødte leveren, noe som indikerer at de innfødte hepatocytter hadde migrert gjennom CMS. (H) På dag 21 har de innfødte hepatocyttene migrert mot CMS (pilen). A og E: Skalastenger = 200 μm: 4x, B-D og F-H: Skalastenger = 100 μm: 10x. A-D: H&E flekker; E-H: Massons trichrome farging. Forkortelser: CMS = kollagen matrise stillas; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Histologi i leveren og CMS. (A) Pool av hepatocytter (hvit pil) tilstede i trabeculae av CMS (svart pil). Hepatocyttene er vannet av et fartøy (fylt stjerne). (B) Hepatocytter (hvit pil) har migrert og festet seg til trabeculae av CMS (svart pil). (C) En gruppe hepatocytter (stiplet sirkel) observeres mellom to trabekulære (svarte piler) av CMS. (D) Hepatocytter har festet seg til trabeculae (svarte piler) av CMS i nærvær av lax bindevev (stiplet oval). A og C: Skalastenger = 100 μm: 10x. B og D: Skalastenger = 20 μm: 40x. Forkortelse: CMS = kollagenmatrise stillas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Dager | UEKTE | Hepatektomi | Implantasjon CMS | |
| ALB (g/dl) | 3 | 1.4±0 | 1.25±0.07 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0,5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| ALT (IE/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| AST (IE/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| TB (mg/dl) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0,3±0 |
| 14 | 0,5±0 | 0,2±0 | 0,15±0 | |
| 21 | 0,3±0 | 0,4±0 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dl) | 3 | 0,1±0 | 0.05±0.07 | 0,1±0 |
| 14 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 | |
| 21 | 0,1±0 | 0,1±0 | 0,1±0 |
Tabell 1: Leverfunksjon. Leverfunksjonstester ble utført for sham og eksperimentelle grupper med og uten CMS på 3, 14 og 21 dager. Forkortelser: CMS = kollagen matrise stillas; ALB = Albumin; ALP = Alkalisk fosfatase; ALT= Alanin aminotransferase; AST = Aspartate aminotransferase; TB = Total bilirubin; DB = Direkte bilirubin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organtransplantasjon er bærebjelken i behandlingen hos pasienter med leverfibrose eller skrumplever. Noen få pasienter drar nytte av denne prosedyren, noe som gjør det nødvendig å gi terapeutiske alternativer for pasienter på ventelisten. Vevsteknikk er en lovende strategi som bruker stillaser og celler med regenerativt potensial2,4,13. Fjerning av en del av leveren er et kritisk skritt i denne prosedyren på grunn av den rikelige blødningen av dette vaskulære organet. Derfor må hemostase av den kirurgiske sengen utføres for å forhindre denne komplikasjonen. Videre forenkles bindingen av levervevet til CMS, som er avgjørende for å sikre vev-biomaterialeinteraksjon, ved bruk av suturer. Det må imidlertid gjøres nøye for å unngå å rive leveren og forårsake senere blødning.
Selv om biomaterialet som foreslås her, er av bovin opprinnelse (xenogen), er det ingen data om biomaterialereaksjon hos rotter, noe som gjør selektiv hepatektomi mulig. Derimot har 2/3 hepatektomimodellen vist seg å forårsake dyrenes død på grunn av fjerning av en stor mengde levervev14. Videre utviklet vi en metallisk mal i rustfritt stål fordi vi hadde problemer med å standardisere størrelsen i hepatektomi og CMS. Sterilisering av CMS var utfordrende fordi de eksisterende teknikkene endret strukturen av kollagen og dets biokjemiske egenskaper. Derfor ble sterilisering av varme, gammastråling og etylenoksid utforsket som steriliseringsmetoder før de bestemte at plasma av hydrogenperoksid var den optimale teknikken13.
Det er viktig å bestemme maksimal størrelse på CMS som kan implanteres i leveren og evaluere den biologiske responsen på et systemisk nivå. Videre er det nødvendig å optimalisere og undersøke effekten av denne teknikken i en større dyreart. Videre er det viktig å undersøke effekten av CMS-implantasjonen i leveren i en lengre periode (>30 dager), noe som vil tillate vurdering av omfanget av biosorpsjonen av CMS og regenerering av levervevet. Videre må effekten av CMS-implantasjonen undersøkes i dyremodeller med leverskade. Denne implantasjonsmetoden har åpnet døren for strategier som utforsker restaurering av formen og volumet av resected vev, og dermed redusere anestesi, kirurgisk varighet og gjenopprettingstid4,13.
CMS ble hentet fra en naturlig kilde og bevarte sine fysiske og kjemiske egenskaper sammenlignet med syntetiske biomaterialer laget ved hjelp av komplekse metoder, for eksempel bioprinting eller elektrospinning, som ikke er biokompatible eller bioabsorberbare2,3. Hovedkomponenten i dette CMS er kollagen type I, som er hovedproteinet til ECM som muliggjør celleadhesjon og spredning22. I tillegg muliggjør trabeculae av CMS-porene cellemigrasjon og kontinuerlig strøm av vekstfaktorer, blod og andre mediatorer i regenereringsprosessen. Ifølge vevet som skal repareres, har denne forskningsgruppen erfaring med å designe CMS i forskjellige former, og bevare sin 3D-struktur. For eksempel ble sylindrisk CMS implantert i hundeurethra og gallekanal hos griser og ga lovende resultater i vevregenerering23,24.
Implantasjonen av dette CMS kan være en alternativ behandling for å stimulere vevregenerering og gjenopprette fibrogenese-fibrolysebalansen i levercirrhose på grunn av forskjellige etiologier (f.eks. virus, alkohol, metabolske faktorer). Proliferation, migrasjon og betennelsesanalyser må utføres for å identifisere de molekylære og cellulære mekanismene utløst av CMS. Til slutt beskriver dette dokumentet en reproduserbar prosedyre for hepatektomi samt undersøkelse av regenereringsprosessen gjennom xenoimplantasjon av biomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser. Benjamín León-Mancilla er doktorgradsstudent fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og han fikk DGAPA-UNAM-stipend.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke personellet til Laboratory Animal Facility of the Experimental Medicine Unit, Nurse Carolina Baños G. for teknisk og kirurgisk støtte, Marco E. Gudiño Z. for støtte i mikrofotografer, og Erick Apo for støtte i lever histologi. Nasjonalrådet støttet denne forskningen for vitenskap og teknologi (CONACyT), tilskuddsnummer SALUD-2016-272579 og PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
