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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

फेफड़ों के लिए कैंसर मेटास्टेसिस की जांच के लिए एक स्थायी खिड़की

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62761
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4,5, 1,2,4
1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम मुरीन छाती के लिए स्थायी रूप से अंतर्निहित ऑप्टिकल विंडो के शल्य प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो फेफड़ों के उच्च-संकल्प, इंट्राविटल इमेजिंग को सक्षम बनाता है। खिड़की का स्थायित्व यह फेफड़ों में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है, विशेष रूप से उन है कि धीरे से विकसित कर रहे हैं, जैसे प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक प्रगति के रूप में ।

Abstract

मेटास्टेसिस, कैंसर से संबंधित मृत्यु दर के ~ 90% के लिए लेखांकन, प्राथमिक ट्यूमर से हड्डी, मस्तिष्क और फेफड़ों जैसे माध्यमिक साइटों के लिए कैंसर की कोशिकाओं का प्रणालीगत प्रसार शामिल है। हालांकि बड़े पैमाने पर अध्ययन किया, इस प्रक्रिया के यंत्रवादी विवरण खराब समझ में रहते हैं । जबकि गणना टोमोग्राफी (सीटी), पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) सहित आम इमेजिंग तौर-तरीके, सकल दृश्य की अलग-अलग डिग्री प्रदान करते हैं, प्रत्येक में व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशीलता का पता लगाने के लिए आवश्यक लौकिक और स्थानिक संकल्प का अभाव है। इसका समाधान करने के लिए, आम मेटास्टैटिक साइटों के इंट्राविटल इमेजिंग के लिए कई तकनीकों का वर्णन किया गया है। इन साइटों में से, फेफड़ों ने जीवन को बनाए रखने में अपनी विनम्रता और महत्वपूर्ण भूमिका के कारण इंट्राविटल इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित किया है। यद्यपि कई दृष्टिकोणों को पहले बरकरार फेफड़ों के एकल-सेल इंट्राविटल इमेजिंग के लिए वर्णित किया गया है, सभी में अत्यधिक आक्रामक और टर्मिनल प्रक्रियाएं शामिल हैं, अधिकतम संभव इमेजिंग अवधि को 6-12 घंटे तक सीमित करते हैं। यहां वर्णित फेफड़े (WHRIL) के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव वक्ष ऑप्टिकल विंडो के स्थायी प्रत्यारोपण के लिए एक बेहतर तकनीक है। माइक्रोकार्टोग्राफी के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण के साथ संयुक्त, अभिनव ऑप्टिकल विंडो कई इमेजिंग सत्रों में एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर बरकरार फेफड़ों के सीरियल इंट्राविटल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है और कई हफ्तों तक फैली हुई है। समय की अभूतपूर्व अवधि को देखते हुए, जिस पर इमेजिंग डेटा इकट्ठा किया जा सकता है, WHRIL गतिशील मेटास्टैटिक प्रगति और फेफड़ों के भीतर कई अतिरिक्त जीवविज्ञान प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र की त्वरित खोज की सुविधा प्रदान कर सकते हैं ।

Introduction

मौतों के ~ 90% के लिए जिम्मेदार, मेटास्टेस कैंसर से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण है1. चिकित्सकीय मनाया मेटास्टेसिस (हड्डी, जिगर, फेफड़े, मस्तिष्क)2के प्रमुख स्थलों में, फेफड़ों इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से वीवो इमेजिंग में के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है । इसका कारण यह है कि फेफड़े शाश्वत गति में एक नाजुक अंग है। फेफड़ों की निरंतर गति, इंट्राथोरेसिक कार्डियक मोशन से आगे बढ़ जाती है, सटीक इमेजिंग के लिए एक पर्याप्त बाधा का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए, उच्च-संकल्प इंट्राविटल ऑप्टिकल इमेजिंग के तौर-तरीकों के सापेक्ष पहुंच के कारण, फेफड़ों के भीतर कैंसर की वृद्धि को अक्सर मनोगत प्रक्रिया 3 मानाजाताहै।

नैदानिक सेटिंग में, गणना टोमोग्राफी (सीटी), पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जैसी इमेजिंग प्रौद्योगिकियां फेफड़ों4जैसे अक्षुण्ण महत्वपूर्ण अंगों के भीतर गहरे दृश्य को सक्षम करती हैं। हालांकि, जबकि इन तौर तरीकों सकल अंग के उत्कृष्ट विचारों के लिए प्रदान (अक्सर भी नैदानिक लक्षणों की शुरुआत से पहले विकृति खुलासा), वे अपर्याप्त संकल्प के लिए व्यक्तिगत प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के रूप में वे मेटास्टेसिस के प्रारंभिक दौर के माध्यम से अग्रिम कर रहे हैं । नतीजतन, जब तक उपरोक्त तौर-तरीके फेफड़ों को मेटास्टेसिस का कोई संकेत प्रदान करते हैं, मेटास्टैटिक फोसी पहले से ही अच्छी तरह से स्थापित और प्रसार कर रहे हैं। चूंकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिसगठन 5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है , इसलिए वीवोमें मेटास्टैटिक सीडिंग के शुरुआती चरणों की जांच करने में बहुत रुचि है। यह रुचि इस बात से और अधिक बढ़ जाती है कि कैंसर कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर का पता लगाने से पहले ही7,8 और बढ़ते साक्ष्यों का प्रसार करती हैं कि वे एक कोशिकाओं के रूप में और दशकों तक एक निष्क्रिय अवस्था में मैक्रो-मेटास्टेसिस9में वृद्धि से पहले जीवित रहते हैं ।

इससे पहले, एकल-कोशिका संकल्प पर फेफड़ों की इमेजिंग में आवश्यकरूप से पूर्व वीवो या एक्सप्लांट तैयारी10, 11,12,13शामिल हैं, जो विश्लेषण को एकल समय बिंदुओं तक सीमित करते हैं। हालांकि ये तैयारी उपयोगी जानकारी प्रदान करती है, वे एक अक्षुण्ण संचार प्रणाली से जुड़े अंग के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशीलता में कोई अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं।

इमेजिंग में हाल ही में तकनीकी प्रगति ने12 घंटे14, 15,16तक की अवधि में एकल कोशिका संकल्प पर अक्षुण्ण फेफड़ों के इंट्राविटल दृश्य को सक्षम किया है। यह एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक मुरीन मॉडल में पूरा किया गया था जिसमें यांत्रिक वेंटिलेशन, रिबकेज का रीसेक्शन, और वैक्यूम-असिस्टेड फेफड़े स्थिरीकरण शामिल थे। हालांकि, शारीरिक रूप से बरकरार फेफड़ों की पहली एकल सेल-रिज़ॉल्यूशन छवियों की पेशकश करने के बावजूद, तकनीक अत्यधिक आक्रामक और टर्मिनल है, जिससे इंडेक्स प्रक्रिया से परे आगे इमेजिंग सत्र ों को पहले से ही शामिल किया जा सकता है। इसलिए, यह सीमा मेटास्टैटिक कदमों के अध्ययन में अपने आवेदन को रोकती है जो 12 घंटे से अधिक समय लेती है, जैसे निद्रा और विकास की पुनः दीक्षा14,15,16। इसके अलावा, इस इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके देखे गए सेलुलर व्यवहार के पैटर्न की सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए, यह देखते हुए कि वैक्यूम-प्रेरित दबाव अंतर रक्त प्रवाह में विचलन का कारण बनने की संभावना है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, फेफड़ों के उच्च संकल्प इमेजिंग (WHRIL) के लिए एक न्यूनतम आक्रामक खिड़की हाल ही में विकसित किया गया था, यांत्रिक वेंटिलेशन17की आवश्यकता के बिना, दिनों से सप्ताह की एक विस्तारित अवधि में धारावाहिक इमेजिंग की सुविधा । इस तकनीक में सामान्य फेफड़ों के कार्य के संरक्षण के लिए एक सीलबंद छाती गुहा के साथ 'पारदर्शी रिबकेज' के निर्माण पर जोर दिया गया है। प्रक्रिया अच्छी तरह से सहन की जाती है, जिससे माउस को बेसलाइन गतिविधि और कार्य में सार्थक परिवर्तन के बिना ठीक होने की अनुमति दी जाती है। प्रत्येक संबंधित इमेजिंग सत्र में बिल्कुल एक ही फेफड़ों के क्षेत्र को मज़बूती से स्थानीयकृत करने के लिए, माइक्रोकार्टोग्राफी के रूप में जाना जाने वाला एक तकनीक इस विंडो18पर लागू किया गया था। इस खिड़की के माध्यम से, कोशिकाओं की छवियों को कैप्चर करना संभव था क्योंकि वे फेफड़ों के संवहनी बिस्तर पर पहुंचते हैं, एंडोथेलियम को पार करते हैं, सेल डिवीजन से गुजरते हैं, और माइक्रो-मेटास्टेस में बढ़ते हैं।

यहां, अध्ययन WHRIL के प्रत्यारोपण के लिए एक बेहतर शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करता है, जो सर्जरी को सरल बनाता है, जबकि साथ ही इसकी प्रजनन क्षमता और गुणवत्ता में वृद्धि करता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल को मेटास्टेसिस में अंतर्निहित गतिशील प्रक्रियाओं की जांच को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, तकनीक को वैकल्पिक रूप से फेफड़ों के जीव विज्ञान और विकृति की कई प्रक्रियाओं की जांच के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को कशेरुकी पशुओं के उपयोग के लिए दिशा-निर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया है, जिसमें अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा पूर्व अनुमोदन शामिल है ।

1. खिड़कियों का पासिवेशन

  1. ऑप्टिकल विंडो फ्रेम(पूरक चित्रा 2)को एंजाइमेटिक रूप से सक्रिय डिटर्जेंट के 1% (w/v) समाधान के साथ कुल्ला।
  2. एक ग्लास जार के अंदर, 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5% (w/v) सोडियम हाइड्रोक्साइड समाधान में ऑप्टिकल खिड़की के फ्रेम को जलमग्न करें।
  3. खिड़की के फ्रेम को डिओनाइज्ड पानी से निकालें और धोएं।
  4. एक नए ग्लास जार के अंदर, ऑप्टिकल खिड़की के फ्रेम को 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7% (w/v) साइट्रिक एसिड समाधान में जलमग्न करें।
  5. फिर, खिड़की के फ्रेम को डिओनाइज्ड पानी से हटाएं और धोएं।
  6. दोहराएं चरण 1.2; फिर, खिड़की के फ्रेम को डिओनाइज्ड पानी से हटाएं और धोएं।

2. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. सर्जरी को हुड या लैमिनार फ्लो कैबिनेट में संचालित करें। ऑपरेटिव क्षेत्र के प्रदूषण से बचने के लिए, क्रमशः तैयारी, सर्जरी और वसूली के लिए अलग, अलग क्षेत्रों को सुनिश्चित करें।
  2. सर्जरी के अग्रिम में, एक ऑटोक्लेव में सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। यदि बाद की प्रक्रियाओं की योजना बनाई जाती है, तो गर्म मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके उपकरणों को फिर से स्टरलाइज करें। इस सर्जिकल प्रक्रिया के लिए, एक टिप्स-केवल तकनीक का उपयोग किया जाता है।
  3. गर्म सर्जिकल मनका और मनका स्टरलाइजर पर शक्ति।
  4. एनेस्थीसिया कक्ष में 5% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  5. बालों को हटाने के लिए, उदारता से ऊपरी-बाएं छाती चीरा साइट पर डेपिलेटरी क्रीम लागू करें। 20 s से अधिक समय के बाद, नम ऊतक पेपर का उपयोग करके बालों और डिपिलेटरी क्रीम को मजबूती से मिटा दें। सर्जिकल साइट से सभी बालों को हटाने के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएं।
  6. 2-0 रेशम सीवन का उपयोग करना, एक 22 जी कैथेटर के आधार पर एक गांठ टाई, 2 इंच लंबी पूंछ छोड़ (चित्रा 1Aदेखें) ।

3. फेफड़ों की खिड़की की सर्जरी

  1. एंटीसेप्टिक साबुन का उपयोग करके हाथ धोएं।
  2. प्रत्येक नई सर्जरी से पहले, डॉन नए बाँझ दस्ताने।
  3. कॉर्नियल सुखाने और माउस की आंखों को नुकसान से रोकने के लिए, दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
  4. 90 माइक्रोन पीबीएस के 90 माइक्रोन में बुप्रेनोर्फिन के 10 माइक्रोन (0.1 मिलीग्राम/किलोग्राम) को पतला करें, और फिर प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिया सुनिश्चित करने के लिए चमड़े के इंजेक्शन करें।
  5. रेशम सीवन बंधे 22 जी कैथेटर15के साथ माउस को रखना । एक मुद्रास्फीति बल्ब का उपयोग करना, बल्ब निचोड़ पर द्विपक्षीय छाती वृद्धि टिप्पण द्वारा सफल intubation की पुष्टि करें ।
  6. माउस के थूथन के चारों ओर 2-0 रेशम सीवन बांधने से स्टुबेशन कैथेटर को सुरक्षित करें (चित्रा 1Bदेखें)।
  7. माउस को गर्म सर्जिकल स्टैंड पर रखें और बाएं छाती को बेनकाब करने के लिए इसे दाएं पार्श्व डेकुबिटस में रखें।
  8. वेंटिलेटर को इंस्टीबेशन कैथेटर से कनेक्ट करें।
  9. वेंटिलेटर पर नियंत्रित, स्थिर वेंटिलेशन सुनिश्चित करें और फिर आइसोफलूरेन को 3% तक कम करें। प्रक्रिया की शुरुआत में और समय-समय पर प्रक्रिया की अवधि के दौरान, एक टोप चुटकी परीक्षण प्रदर्शन करके संज्ञाहरण की पर्याप्तता का आकलन करें।
  10. कागज टेप का उपयोग करना, कपाल और कौड़ी द्वारा गर्म सर्जिकल चरण में क्रमशः सामने और पिछले अंगों को सुरक्षित करें। सर्जिकल क्षेत्र के संपर्क को अधिकतम करने के लिए माउस की पीठ की लंबाई के साथ टेप का एक और टुकड़ा रखें (चित्रा 1Cदेखें)।
  11. बंध्यता के संरक्षण के लिए हुड के नीचे सभी सर्जिकल उपकरणों को खोलें।
  12. माउस की त्वचा के लिए एंटीसेप्टिक के उदार अनुप्रयोग द्वारा शल्य चिकित्सा साइट को निष्फल करें।
  13. संदंश का उपयोग करके, त्वचा को उठाएं और ~ 10 मिमी गोलाकार चीरा, ~7 मिमी उरोस्थि के बाईं ओर और ~7 मिमी सबकॉस्टल मार्जिन(चित्रा 1D)से बेहतर बनाएं।
  14. किसी भी बड़े जहाजों की सावधानीपूर्वक पहचान करें। यदि जहाजों का विभाजन आवश्यक है, तो हेमोसेसिस को बनाए रखने के लिए इलेक्ट्रोक्यूटेरी पेन के साथ दोनों सिरों पर काटराइज करें।
  15. नरम ऊतक पसलियों को ओवरलीटिंग करें।
  16. संदंश का उपयोग कर6 या 7 पसलीतरक्की। कुंद माइक्रो-विच्छेदन कैंची के एक ब्लेड का उपयोग करना, फेफड़ों की ओर गोल पक्ष, ध्यान से इंट्राथोरेसिक स्पेस(चित्रा 1E)में प्रवेश करने के लिए6 और7 पसलियों के बीच इंटरकोस्टल मांसपेशी को छेदना।
  17. नाजुक निर्वहन संकुचित हवा कनस्तर दोष पर फेफड़ों के पतन और छाती की दीवार से अलग करने के लिए । इट्रोजेनिक फेफड़ों की चोट को रोकने के लिए कम फटने में संकुचित हवा को आग लगाएं।
  18. कटिंग टूल(सप्लीमेंट्री फिगर 1)पर बायोप्सी पंच रखें और इंटरकोस्टल चीरा(चित्रा 1F)के माध्यम से काटने वाले उपकरण के आधार को सावधानीपूर्वक पैंतरेबाज़ी करें।
  19. काटने वाले उपकरण के आधार को इस तरह उन्मुख करें कि यह छाती की दीवार के समानांतर हो। रिब पिंजरे(चित्रा 1G)के माध्यम से एक 5 मिमी परिपत्र छेद पंच ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उजागर फेफड़ों के ऊतकों गुलाबी है, नुकसान के लक्षण के बिना ।
  20. 5-0 रेशम सीवन का उपयोग करके, छेद से ~ 1 मिमी पर्स-स्ट्रिंग सिलाई बनाएं, परिधि, पसलियों के साथ इंटरलैक्सिंग(चित्रा 1H)।
  21. खिड़की के फ्रेम को ऐसी स्थिति दें कि गोलाकार दोष के किनारे खिड़की के नाली के भीतर संरेखित हों (चित्रा 1Iदेखें)।
  22. सुरक्षित रूप से 5-0 रेशम सीवन को कसकर बांधने से प्रत्यारोपित खिड़की को लॉक करें।
  23. 1 मिली सिरिंज में साइनोएक्रिलेट जेल चिपकने के 100 माइक्रोन लोड करें।
  24. ~ 10-20 एस(चित्रा 1J)के लिए संकुचित हवा की एक स्थिर कोमल धारा लागू करके फेफड़ों को सुखाएं।
  25. अपने बाहर के किनारे से खिड़की के फ्रेम को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करना, खिड़की के फ्रेम के अंडरसतू से फेफड़ों के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे उठाएं।
  26. ऑप्टिकल विंडो फ्रेम(चित्रा 1K)के अंडरसतू के साथ साइनोक्रिलेट चिपकने की एक पतली परत को वितरित करते हैं।
  27. फेफड़ों को फुलाने के लिए वेंटिलेटर पर सकारात्मक अंत-समाप्ति दबाव (PEEP) बढ़ाएं।
  28. 10-20 एस के लिए होल्डिंग, फेफड़ों के ऊतकों(चित्रा 1L)पर ऑप्टिकल खिड़की फ्रेम संलग्न करने के लिए कोमल लेकिन दृढ़ दबाव लागू होते हैं ।
  29. एक आयताकार कवरलिप पर शेष साइनोएक्रिलेट जेल चिपकने की 5 मिमी बूंद वितरित करें।
  30. वैक्यूम पिकप का उपयोग करके 5 मिमी कवरलिप उठाएं। कवरस्लिप के अंडरसतू को चिपकने वाले में डुबोएं, और फिर आयताकार कवरलिप के पक्ष के खिलाफ तीन बार अतिरिक्त चिपकने वाले को कुरेदें, जैसे कि केवल एक बहुत पतली परत(चित्रा 1M)बनी हुई है।
  31. ऑप्टिकल विंडो फ्रेम के केंद्र में अवकाश के अंदर फिट होने के लिए कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक रखें और कोण पर फेफड़ों के ऊतकों के ऊपर आयोजित किया जाता है। फेफड़ों को हाइपर-फुलाने, सकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए वेंटिलेटर को संक्षेप में दबाना। घूर्णन गति का उपयोग करके, फेफड़ों की सतह और कवरस्लिप के अंडरसर्फेस के बीच प्रत्यक्ष अपोजिशन बनाने के लिए फेफड़ों के ऊतकों के समानांतर कवरस्लिप को उन्मुख करें। कोमल दबाव बनाए रखें, साइनोएक्रेलेट चिपकने वाले को सेट करने की अनुमति देता है (~ 25 एस)।
  32. वैक्यूम पिकप(चित्रा 1N)से कवरस्लिप को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  33. 5-0 रेशम सीवन का उपयोग करके, फिर से पर्स-स्ट्रिंग सिलाई बनाएं, इस बार त्वचा चीरा के कट-एज से <1 मिमी परिवर्तन। खिड़की के फ्रेम के बाहरी रिम के नीचे किसी भी अतिरिक्त त्वचा को लॉकिंग नॉट के साथ कसकर बांधने से पहले टक करें।
  34. कवरस्लिप और खिड़की के फ्रेम के बीच एक एयर-टाइट सील सुनिश्चित करने के लिए, धातु-ग्लास इंटरफेस पर तरल साइनोएक्रेलेट की एक छोटी राशि को वितरित करें (चित्रा 1Oदेखें)।
  35. एक 1 मिलीएल इंसुलिन सिरिंज के लिए एक बाँझ सुई संलग्न करें। xiphoid प्रक्रिया के नीचे सुई डालें, बाएं कंधे की ओर आगे बढ़, डायाफ्राम के माध्यम से छाती गुहा में प्रवेश । छाती गुहा से किसी भी अवशिष्ट हवा को हटाने के लिए सिरिंज पर धीरे से वापस आकर्षित (चित्रा 1Pदेखें) ।
  36. माउस से टेप निकालें।
  37. आइसोफ्लुरेन बंद करें।
  38. माउस जगाने के लिए तैयार दिखाई देता है जब तक 100% ऑक्सीजन के साथ वेंटिलेशन जारी रखें।
  39. ध्यान से माउस के थूथन के चारों ओर 2-0 रेशम सीवन में कटौती और माउस extubate।
  40. माउस को एक साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें और पूरी तरह से बरामद होने तक निगरानी करें। यदि सांस लेने में कठिनाई के लक्षण मौजूद हैं तो माउस को इच्छामृत्यु दें।
  41. बाँझ फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के 90 माइक्रोन में पतला बुप्रेनोरफिन के 10 माइक्रोन (0.1 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्शन द्वारा पश्चात एनाल्जेसिया प्रदान करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है और चित्र 1में दर्शाया गया है । संक्षेप में, सर्जरी से पहले, चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और बाएं छाती पर बाल हटा दिए जाते हैं। चूहों को वक्ष गुहा के उल्लंघन पर जीवित रहने में सक्षम बनाने के लिए इंडुबैटेड और यांत्रिक रूप से हवादार किया जाता है। पसलियों को ओवरलिंग करने वाले मुलायम ऊतक को उत्पादित किया जाता है, और एक छोटा गोलाकार दोष बनाया जाता है, जो 6 और7 पसलियों में फैला हुआ है। ऑप्टिकल खिड़की फ्रेम दोष में डाला जाता है और इसके नीचे की ओर (स्पष्ट एपर्चर के बाहर) फेफड़ों के ऊतकों का पालन किया जाता है। खिड़की के फ्रेम तो टांके और चिपकने वाला के संयोजन के साथ सुरक्षित है, वक्ष गुहा resealing और एक्सटयूबेशन के बाद सामांय श्वास की बहाली की अनुमति । जब सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया जाता है, तो फेफड़े ऑप्टिकल खिड़की (जो छाती की दीवार के हिस्से के रूप में शामिल किया जाता है) का पालन करेंगे, इंट्राथोरेसिक दबाव ढाल संरक्षित के साथ। यह माउस के आरामदायक अस्तित्व की अनुमति देता है, जिससे दैनिक इमेजिंग को प्रोटोकॉल भत्ते (2 सप्ताह) तक सक्षम किया जा सके। इंट्राविटल इमेजिंग को खिड़की के माध्यम से किया जा सकता है, जैसा कि पहले अन्य खिड़कियों15,19,20के लिए वर्णित था।

विभिन्न सेल प्रकारों, जैविक संरचनाओं, या सेलुलर कार्यात्मक राज्यों के दृश्य के लिए, यहां प्रस्तुत प्रक्रिया चूहों की एक विस्तृत श्रृंखला पर की जा सकती है जिन्हें या तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन21 व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया है या रंगोंकेसाथ इंजेक्शन दिया गया है। खिड़की की स्थायी प्रकृति इसे देखने के क्षेत्रों के पुनर्लोकीकरण की तकनीकों के अनुरूप बनाती है जैसे फोटोकन्वर्जन23,24 या माइक्रोकार्टोग्राफी17,18. माइक्रोकार्टोग्राफी एक त्रिभुज तकनीक है जो ब्याज के क्षेत्र की भविष्यवाणी करने और फिर से स्थानीयकरण करने के लिए इमेजिंग सत्रों के बीच निश्चित प्रत्ययी चिह्नों के निर्देशांक के गणना परिवर्तनों का उपयोग करने पर आधारित है। ऊपर वर्णित खिड़की में, ये प्रत्यूषक चिह्न खिड़की के फ्रेम(पूरक चित्रा 2)में हल्के खरोंच होते हैं जो माइक्रोस्कोप के नीचे आसानी से पहचाने जाते हैं। यह देखने के एक ही क्षेत्र को कई बार खोजने के लिए संभव बनाता है, यहां तक कि अन्यथा अचिह्नित ऊतक में भी। चित्रा 2 एक माउस में इन तकनीकों के परिणाम को दर्शाता है जहां फेफड़ों के वाक्यूलेचर को डाई-लेबल वाले उच्च आणविक वजन डेक्सट्रान (टेट्रामेथाइलरोडमाइन 155 केडी डेक्सट्रान) के इंजेक्शन द्वारा लेबल किया गया है और वही माइक्रो-वैक्यूलेचर 3 दिनों में फिर से स्थानीयकृत है।

यह डेक्सट्रान25 , 26 , 27 , 27 , 27 , 27 , 27,27ट्यूमर सेल इंट्रावेशन की अवधि के दौरान प्रेरित क्षणिक संवहनी उद्घाटनों के मूल्यांकन में अत्यंत उपयोगी पाया गया था । वास्तव में, यह दिखाया गया है कि, प्राथमिक स्तन ट्यूमर में, यह उच्च आणविक वजन डेक्सट्रान अन्यथा प्रभावी रूप से वैक्यूलेचर के लिए तनहा है और इंटरस्टिटियम25में रिसाव नहीं करता है। यह कम आणविक वजन (जैसे 10 केडी या 70 केडी) के डेक्सट्रांस के विपरीत है, जिसे28, 29निष्क्रिय रूप से नियोंगियोजेनिक जहाजों से रिसाव करने के लिए दिखाया गया है। इस बीच, स्वस्थ फेफड़ों के वाक्यूलेचर को रिसाव के लिए अधिक प्रतिरोधी देखा गया है, डेक्सट्रांस >10 केडी केवल अंग के अपमान पर इंटरस्टिटियम से बचने के लिए, जैसे एक्सोसोम्स30 या वायरस31के संपर्क में। संवहनी पारगम्यता के अलावा फेफड़ों (जैसे, परमाणु मार्कर, लाइव/डेड इंडिकेटर, ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस रिपोर्टर्स, ब्लड फ्लो वेग ट्रैकर्स) में अन्य मापदंडों को मापने के लिए कई तरह के कंट्रास्ट एजेंट भी मौजूद हैं । उन्हें सूचीबद्ध करने वाला एक उत्कृष्ट संसाधन प्रोटोकॉल में Ueki etal. 22द्वारा पाया जा सकता है।

WHRIL एक तकनीक है कि फेफड़ों में रक्त प्रवाह की गतिशीलता की जांच करने के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है। इसे कई तरह से पूरा किया जा सकता है। सबसे पहले, जब अपेक्षाकृत धीमी फ्रेम दरों (~ 1-10 फ्रेम प्रति सेकंड, एफपीएस) रक्त प्रवाह वेग का उपयोग करके कल्पना की जाती है तो बड़े जहाजों में बहने पर अवेलेबल एरिथ्रोसाइट्स छाया द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। कम एफपीएस पर, ये छाया उन रेखाओं का रूप लेते हैं जिनका कोण पोत के सापेक्ष एरिथ्रोसाइट प्रवाह दरों32 (चित्रा 2,पीली रेखाओं) की गणना करने के लिए किया जा सकता है। दूसरा , छाया को कम एफपीएस माइक्रोस्कोप पर भी ट्रैक किया जा सकता है , जहाजों को माइक्रोस्कोप की तेज स्कैन धुरी के साथ संरेखित करके और रैपिड लाइन स्कैनिंग33 , 34,35का उपयोग करके कामोग्राफ प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, जब समय के साथ सिग्नल को एकीकृत करने में सक्षम माइक्रोस्कोप पर उच्च फ्रेम दरों (>10 एफपीएस) पर इमेजिंग (उदाहरण के लिए, चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) डिटेक्टर से लैस एक कताई डिस्क कॉन्फोकल), व्यक्तिगत कणों को सीधे16,17का पता लगाया जा सकता है। इस स्थिति में, स्थिर वस्तुएं उज्ज्वल बिंदुओं के रूप में दिखाई देती हैं, और बहने वाली वस्तुएं परिसंचरण के साथ पटरियों का पता लगाती हैं। पटरियों की लंबाई को मापने और फ्रेम अधिग्रहण समय से विभाजित करके सेल की गति को निर्धारित किया जा सकता है। इसका एक उदाहरण चित्रा 3 और पूरक मूवी 1में दिया गया है, जहां इमेजिंग से पहले माउस में 2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर को इंट्रावैस्कुलर रूप से इंजेक्ट किया गया है।

बार-बार और लगातार एक ही क्षेत्र में लौटने की क्षमता के साथ, कई दिनों में विकसित होने वाली प्रक्रियाओं का दृश्य अब संभव है। इस आवेदन के प्रदर्शन के रूप में, WHRIL का उपयोग फेफड़ों के भीतर स्तन कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक प्रगति की कल्पना करने के लिए किया गया था17,21: यानी,फेफड़ों के वासकुलेचर पर पहुंचने वाली व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के भाग्य को समय के साथ ट्रैक करने के लिए। इस अवधारणा को चित्र 4 एमें चित्रित किया गया है, जहां फेफड़ों के माइक्रो-वेक्यूलेचर के एक खंड में आवास के तुरंत बाद एक प्रसारित ट्यूमर सेल की कल्पना की जाती है। बाद के दिनों में उसी स्थान पर लौटने से ट्यूमर सेल के भाग्य (जैसे, रिसर्चर, एक्स्ट्राटिवेशन आदि) का पता चलता है। फेफड़ों में मेटास्टैटिक प्रगति के समापन चरणों की जांच के लिए लागू, यह नेत्रहीन क्रॉनिकल गतिशील प्रक्रियाओं के लिए संभव था, जिसमें ट्यूमर सेल आगमन(चित्रा 4B),अतिव्यवस्था(चित्रा 4 सी)और मैक्रो-मेटास्टेसिस(चित्रा 4D)बनाने के लिए प्रसार शामिल है।

Figure 1
चित्रा 1:फेफड़ों के उच्च संकल्प इमेजिंग (WHRIL) के लिए खिड़की के प्रत्यारोपण के लिए सर्जरी का सारांश । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:माइक्रोकार्टोग्राफी ऑप्टिकल विंडो के भीतर निश्चित पदों के पुनर्लोकीकरण को सक्षम बनाती है। ऑप्टिकली पारदर्शी कवरस्लिप के तहत फेफड़ों के एक ही क्षेत्र की मल्टीफोटोन इंट्राविटल इमेजिंग माइक्रोकार्टोग्राफी का उपयोग करके लगातार 3 दिनों में माइक्रोवसकुलेचर को स्थानांतरित करती है। पीले तीर लगातार प्रत्येक दिन पहचाने गए एक ही पोत से स्पष्ट रूप से परिभाषित शाखा बिंदु का संकेत देते हैं। पीली रेखाएं उन छायाओं को उजागर करती हैं जो बड़े जहाजों में बहने पर अवेलेबल एरिथ्रोसाइट्स बनाते हैं। पोत के सापेक्ष इन पंक्तियों के कोण का उपयोग एरिथ्रोसाइट प्रवाह दरों की गणना करने के लिए किया जा सकता है। लाल = tdTomato लेबल एंडोथेलियल कोशिकाओं और 155 केडीए Tetramethylrhodamine डेक्सट्रान लेबल रक्त सीरम, ग्रीन = GFP लेबल ट्यूमर कोशिकाओं, ब्लू = दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी। स्केल बार = 15 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:रक्त प्रवाह दर का दृश्य। रक्त प्रवाह दरों को 2 माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर रेट्रो-ऑर्बिटली इंजेक्शन और रक्त वाहिकाओं के माध्यम से उनके मार्ग इमेजिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। जब समय के साथ सिग्नल को एकीकृत करने में सक्षम माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया जाता है (उदाहरण के लिए, सीसीडी डिटेक्टर से लैस एक कताई डिस्क कॉन्फोकल), स्थिर माइक्रोस्फीयर उज्ज्वल डॉट्स (तीर) के रूप में दिखाई देते हैं, और बहने वाले क्षेत्र परिसंचरण (कोष्ठक लाइनों) के माध्यम से पटरियों का पता लगाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4। WHRIL सीधे प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं के भाग्य की कल्पना करके फेफड़ों के भीतर मेटास्टैटिक झरना के प्रत्येक कदम पर कब्जा कर सकते हैं । (क)प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं (ग्रीन) के भाग्य को ट्रैक करना कई दिनों में, WHRIL के माध्यम से धारावाहिक इमेजिंग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। 1 दिन, एक ट्यूमर सेल के लिए आ गया है और फेफड़ों के वास्कुलेचर में दर्ज मनाया जाता है । दिन 2 और दिन 3 पर सेल अब फेफड़ों के वाक्यूलेचर में मौजूद नहीं है, या तो पुनः परिचालित किया गया है या मर गया है। स्केल बार = 15 माइक्रोन.(बी-डी) फेफड़ों में ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस के चरणों में से प्रत्येक का दृश्य। (ख)आने के बाद फेफड़ों के वास्कुलर में दर्ज इंट्रावैस्कुलर प्रसारित ट्यूमर सेल (हरा) । (ग)फेफड़ों के परेंचिमा में बहिष्कर होने के बाद ट्यूमर सेल (हरा) का प्रसार किया । (घ)ट्यूमर कोशिकाएं जो माइक्रो-मेटास्टेस में पैदा हुई हैं और उगाई गई हैं। लाल = tdTomato लेबल एंडोथेलियल कोशिकाओं और 155 केडीए Tetramethylrhodamine डेक्सट्रान लेबल रक्त सीरम, ग्रीन = GFP लेबल ट्यूमर कोशिकाओं, ब्लू = दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 1: चित्रा 3 के अनुरूप वीडियो 2 माइक्रोस्फीयर परिसंचारी के साथ फेफड़ों के वाक्यूलेचर दिखा रहा है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: 5 मिमी बायोप्सी पंच का मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसटैनलेस-स्टील कटिंग टूल के लिए मैकेनिकल डिज़ाइन चित्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: स्टेनलेस स्टील खिड़की फ्रेम के लिए यांत्रिक डिजाइन चित्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 3: खिड़की धारक उपकरण के लिए यांत्रिक डिजाइन चित्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

फेफड़ों जैसे दूर के मेटास्टेसिस की साइटों पर, उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल इमेजिंग ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस की विस्तृत गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। एकल कैंसर कोशिकाओं के वीवो विज़ुअलाइज़ेशन और मेजबान ऊतक के साथ उनकी बातचीत में सक्षम करके, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्राविटल इमेजिंग ने मेटास्टेसिस अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण साबित किया है।

यहां वर्णित एक ऑप्टिकल उच्च संकल्प मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मुरीन फेफड़ों के धारावाहिक इमेजिंग सक्षम करने के लिए डिज़ाइन की गई खिड़की के स्थायी छाती प्रत्यारोपण के लिए एक बेहतर शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके बनाई गई खिड़की अच्छी तरह से सहन की जाती है और, वक्ष गुहा को सफलतापूर्वक फिर से सील करने की क्षमता को देखते हुए, सहज वेंटिलेशन के लिए आवश्यक इंट्राथोरेसिक दबाव ढाल को बनाए रखने में सक्षम है (मुरीनफेफड़े14,15, 16,36,37की इमेजिंग के लिए किसी अन्य पहले वर्णित खिड़की के विपरीत ). यह माउस को संज्ञाहरण से जगाने, स्वतंत्र रूप से सांस लेने और आराम से कई हफ्तों में फैले समय की विस्तारित अवधि के लिए पारदर्शी रिबकेज के साथ जीवित रहने की अनुमति देता है।

इस विंडो का उपयोग करके, एकल-कोशिका संकल्प के साथ, मेटास्टेसिस के सभी चरणों की कल्पना करना संभव था, जिसमें आगमन, अपव्यय और माइक्रोमेटास्टेस में वृद्धि शामिल है।

हालांकि प्रोटोकॉल के लिए कुछ तकनीकी प्रवीणता की आवश्यकता होती है, अभ्यास और कई महत्वपूर्ण चरणों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने के साथ, प्रक्रिया को उच्च सफलता दर के साथ किया जा सकता है। सबसे पहले, सर्जरी से पहले बालों को हटाते समय, 20 एस से अधिक संपर्क के बाद एक गीले ऊतक के साथ डिपिलेटरी क्रीम को हटाकर माउस की त्वचा की रक्षा करना महत्वपूर्ण है। सर्जरी के दौरान, जहाजों को काटने से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी का भुगतान किया जाना चाहिए। अत्यधिक रक्तस्राव, सबसे अधिक स्तन वसा पैड को हटाने के दौरान या तो ब्रैचियल या आंतरिक स्तन धमनियों के विभाजन के कारण सामना करना पड़ा, सर्जिकल क्षेत्र में दृश्य अस्पष्ट या एक्साइनिंग के माध्यम से मौत का कारण बन सकता है। इस प्रोटोकॉल में नए वर्णित एक बायोप्सी पंच और काटने के उपकरण(पूरक चित्रा 1)का उपयोग है, जो रिब पिंजरे के माध्यम से परिपत्र दोष के निर्माण को काफी जल्दी और सरल बनाता है, और एक खिड़की धारक उपकरण प्रत्यारोपण को आसान बनाता है। इन अग्रिमों के कार्यान्वयन से प्रक्रिया की सफलता दर में काफी सुधार होता है और पूर्व शल्य चिकित्सा कौशल के अपेक्षित स्तर को कम कर देता है। व्यक्तिगत प्रयोगशालाएं इन-हाउस या वाणिज्यिक मशीन दुकानों के साथ इन उपकरणों का निर्माण करने के लिए पूरक आंकड़ों में चित्र का उपयोग कर सकती हैं। "मशीन शॉप बिडिंग साइट्स" के लिए एक इंटरनेट खोज कई ऑनलाइन अनुप्रयोगों है कि स्थानीय वाणिज्यिक मशीन की दुकानों को खोजने में सहायता करेगा निकलेगा ।

अंत में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि चिपकने वाले आवेदन से पहले फेफड़ों के ऊतक सूखे रहते हैं। असफल कवरस्लिप लगाव में जिसके परिणामस्वरूप सबसे आम नुकसान फ्रेम या कवर ग्लास के साथ अपोजिशन से पहले फेफड़ों की सतह से नमी को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने में विफलता है। इसके अलावा, गुणवत्ता छवियों को सुनिश्चित करने के लिए, गोंद की एक बेहद पतली परत (<10 माइक्रोन) लागू किया जाना चाहिए। कवर ग्लास के प्लेसमेंट से पहले अतिरिक्त गोंद को स्क्रैप किया जाना चाहिए।

WHRIL के माध्यम से IVI की मुख्य सीमा प्रवेश की अपेक्षाकृत सीमित गहराई प्राप्त की है। इसलिए, फेफड़ों के भीतर गहरी होने वाली विकृति दुर्गम है। इस सीमा के बावजूद, तकनीक अभी भी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जानकारी की एक बहुतायत पैदा कर सकती है, विशेष रूप से ऑन्कोलॉजिक जांच में, परिधि स्थानीय रूप से स्थानीय फेफड़ों के मेटास्टेस38,39,40, 41के लिए वर्णित प्रवृत्ति को देखतेहुए। अंततः, यह इमेजिंग दृष्टिकोण वीवो इमेजिंग में मानक पूर्व वीवो परख और अन्य तरीकों पर काफी लाभ प्रदान करता है, जो या तो महत्वपूर्णशारीरिक प्रक्रियाओं10, 11,12,13से ऊतक को डिस्कनेक्ट करता है या 12 घंटे14,15, 16,37,42, 42,की अधिकतम अवधि तक लंबित विश्लेषण को सीमित करता है क्रमशः।

इस समय अवधि में दोहराया इमेजिंग के लिए, कई चुनौतियों को अभी भी दूर किया जाना चाहिए । सबसे पहले, प्रत्यारोपित खिड़की के आसपास त्वचा के स्वास्थ्य को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि, जबकि घायल ऊतक उजागर नहीं होता है, चारों ओर त्वचा अभी भी सूजन या संक्रमित हो सकती है। एंटीबायोटिक मरहम का नियमित अनुप्रयोग इसे रोकने में मदद करेगा। दूसरा, समय के साथ, कट त्वचा से निकलना खिड़की के फ्रेम के नीचे कॉन्गल हो सकता है और माइक्रोस्कोप चरण में माउस को स्थिर करने के लिए उपयोग की जाने वाली फिक्स्चर प्लेट के प्लेसमेंट को रोक सकता है। 10-15 मिनट के लिए WHRIL पर एक गीला ऊतक रखने से यह बहिर्ष् नरम हो जाएगा और खिड़की के फ्रेम के प्लेसमेंट की अनुमति देगा। तीसरा, अतिरिक्त पानी को उत्सर्जित करने और होरोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए शरीर के तंत्र में से एक वाष्प के साँस छोड़ने के माध्यम से है। इस प्रकार, बहुत अधिक तरल पदार्थ का सेवन (ज्यादातर विपरीत एजेंटों या ट्यूमर सेल निलंबन के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप) फेफड़ों की सतह को इस अतिरिक्त पानी को उगलना होगा और इसके परिणामस्वरूप फेफड़ों के ऊतकों को WHRIL से अलग कर दिया जाएगा। इससे एक बार में इंजेक्शन की मात्रा अधिकतम 50 माइक्रोन तक सीमित करके टाला जा सकता है। अंत में, यहां तक कि सबसे अच्छी देखभाल के साथ, फेफड़ों के ऊतक कभी-कभी WHRIL से अलग हो सकते हैं क्योंकि माउस बड़ी मात्रा में पानी निगलना या माउस के कारण ही हो सकता है। जब ऐसा होता है, WHRIL से फेफड़ों के ऊतकों की टुकड़ी आम तौर पर धीरे-धीरे होता है, बाहर के किनारे पर शुरू. इस प्रकार, खिड़की की पूरी अवधि के लिए इमेजिंग के पहले दिन स्थित दृश्य के कुछ क्षेत्रों का पालन करना असंभव हो सकता है। यह पाया गया कि सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम पहले कुछ दिनों के भीतर प्राप्त किया जाएगा और यह कि पहले प्रकाशित लार्ज-वॉल्यूम हाई-रेजोल्यूशन इंट्राविटल इमेजिंग21 जैसी मोज़ेकिंग तकनीकों को नियोजित करने से इस सीमा के प्रभाव को कम किया जा सकता है।

यह देखते हुए कि WHRIL माउस की छाती की दीवार में एकीकृत है, इमेजिंग के दौरान बहाव आम तौर पर एक महत्वपूर्ण मुद्दा नहीं है, जब तक देखभाल सुनिश्चित करने के लिए भुगतान किया जाता है कि खिड़की और माइक्रोस्कोप के बीच लगाव फर्म है । फिर भी, माइक्रोस्कोप चरण में माउस के प्लेसमेंट के तुरंत बाद के समय के दौरान बहाव की कुछ छोटी मात्रा देखी जा सकती है। यह पर्यावरण कक्ष के कारण माउस के शरीर की छूट या माइक्रोस्कोप घटकों (स्टेज प्लेट, XY चरण, उद्देश्य लेंस) के थर्मल विस्तार से आ सकता है। इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले संतुलन के लिए ~ 30 मिनट आवंटित करके इस बहाव से बचा जा सकता है। समय की यह अवधि माउस के शरीर विज्ञान को संज्ञाहरण के तहत स्थिर करने की अनुमति देती है और सभी घटकों को थर्मल संतुलन में आने की अनुमति देती है। अवशिष्ट बहाव की किसी भी छोटी मात्रा को आसानी से कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम जैसे स्टैकरेज43 या हाइपरस्टैक्रेग44द्वारा संभाला जा सकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल दो कारणों से पूर्व लिखित संस्करण पर सुधार है। सबसे पहले, दृश्य प्रारूप सर्जिकल प्रोटोकॉल की बेहतर अवधारणा की अनुमति देता है। यह महत्वपूर्ण चरणों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जहां 1) संकुचित हवा की एक स्थिर कोमल धारा (चरण 3.24, लागू करके फेफड़े सूख जाते हैं चित्रा 1J),2) कवरस्लिप खिड़की के फ्रेम के केंद्रीय बोर से एक तरह से जुड़ा हुआ है जो बुलबुले (चरण 3.31) को फंसाने से रोकता है, और 3) कवरग्लास और खिड़की फ्रेम (चरण) के बीच एक हवा-तंग सील सुनिश्चित करने के लिए धातु-ग्लास इंटरफेस पर तरल साइनोएक्रीलेट की एक छोटी मात्रा जोड़ी जाती है 3.34, चित्रा 1O)।

अंत में, WHRIL के आगमन के साथ, एक विस्तारित अवधि में एक ही फेफड़ों के ऊतकों के उपकोशिकीय दृश्य के लिए अपनी amenability को देखते हुए, जांचकर्ताओं को कई अनुत्तरित सवालों को संबोधित करने के लिए नए अधिकार प्राप्त कर रहे हैं । विशेष रूप से, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल कैंसर मेटास्टेसिस की प्रगति सहित कई विकृतियों में अंतर्निहित गतिशील प्रक्रियाओं की मौलिक खोज को सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव का खुलासा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: CA216248, CA013330, मोंटेफिनोर के रूथ एल किर्श्स्टीन टी 32 प्रशिक्षण अनुदान CA200561, METAvivor अर्ली करियर अवार्ड, ग्रुस-लिपर बायोफोटॉनिक सेंटर और इसके एकीकृत इमेजिंग प्रोग्राम, और जेन ए और मायल्स पी डेम्पसे। हम इमेजिंग सपोर्ट के लिए आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में एनालिटिकल इमेजिंग फैसिलिटी (एआईएफ) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc N/A  concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres Invitrogen F8827
5 mm coverslip Electron Microscopy Sciences 72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
5% Isoflurane Henry Schein, Inc 29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle Ethicon, Inc. 774B
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich 251275
8 mm stainless steel window frame N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie Ethicon, Inc. LA55G
5 mm disposable biopsy punch Integra  33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors Roboz RS-5980
Brass window tool holder N/A N/A Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine Hospira 0409-2012-32
Cautery pen Braintree Scientific GEM 5917
Chlorhexidine gluconate  Becton, Dickinson and Company 260100 ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister Falcon DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive Henkel Adhesives LOC1363589
Fiber-optic illuminator O.C. White Company FL3000
Bead sterilizer CellPoint Scientific GER 5287-120V Germinator 500
Graefe forceps Roboz RS-5135
Infrared heat lamp Braintree Scientific HL-1
Insulin syringes Becton Dickinson 329424
Isoflurane vaporizer SurgiVet VCT302
Jacobson needle holder with lock Kalson Surgical T1-140
Long cotton tip applicators Medline Industries MDS202055
Nair Church & Dwight Co., Inc. 40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin Johnson & Johnson 501373005 Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
Paper tape Fisher Scientific S68702
Murine ventilator Kent Scientific PS-02 PhysioSuite
Rectangular Cover Glass Corning 2980-225
Rodent intubation stand Braintree Scientific RIS 100
Small animal lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083
Stainless steel cutting tool N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic Hi-Tech Pharmacal Co. 50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming Kent Scientific SURGI-M02 Heated surgical platform
Tracheal catheter Exelint International 26746 22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc. 528-112

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 173
फेफड़ों के लिए कैंसर मेटास्टेसिस की जांच के लिए एक स्थायी खिड़की
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Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J. Vis. Exp. (173), e62761, doi:10.3791/62761 (2021).

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