Summary
Здесь мы представляем протокол хирургической имплантации постоянно пребывающего оптического окна для грудной клетки мышей, которое позволяет проводить прижизненную визуализацию легких с высоким разрешением. Постоянство окна делает его хорошо подходящим для изучения динамических клеточных процессов в легких, особенно тех, которые медленно развиваются, таких как метастатическое прогрессирование диссеминированных опухолевых клеток.
Abstract
Метастазирование, на которое приходится ~ 90% смертности, связанной с раком, включает системное распространение раковых клеток из первичных опухолей во вторичные участки, такие как кость, мозг и легкие. Несмотря на то, что механистические детали этого процесса широко изучены, они остаются плохо изученными. В то время как общие методы визуализации, включая компьютерную томографию (КТ), позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) и магнитно-резонансную томографию (МРТ), предлагают различную степень грубой визуализации, каждому из них не хватает временного и пространственного разрешения, необходимого для обнаружения динамики отдельных опухолевых клеток. Чтобы решить эту проблему, были описаны многочисленные методы для прижизненной визуализации общих метастатических участков. Из этих участков легкие оказались особенно сложными для доступа к прижизненной визуализации из-за его деликатности и критической роли в поддержании жизни. Хотя ранее было описано несколько подходов для одноклеточной прижизненной визуализации интактного легкого, все они включают высокоинвазивные и терминальные процедуры, ограничивающие максимально возможную продолжительность визуализации до 6-12 ч. Здесь описана улучшенная методика перманентной имплантации минимально инвазивного грудного оптического окна для визуализации легких с высоким разрешением (WHRIL). В сочетании с адаптированным подходом к микрокартографии инновационное оптическое окно облегчает последовательную прижизненную визуализацию неповрежденного легкого с одноклеточным разрешением в течение нескольких сеансов визуализации и в течение нескольких недель. Учитывая беспрецедентную продолжительность времени, в течение которого данные визуализации могут быть собраны, WHRIL может способствовать ускоренному открытию динамических механизмов, лежащих в основе метастатического прогрессирования и многочисленных дополнительных биологических процессов в легких.
Introduction
Ответственные за ~ 90% смертей, метастазы являются основной причиной смертности, связанной с раком1. Среди основных участков клинически наблюдаемых метастазов (кости, печень, легкие, мозг)2,легкие оказались особенно сложными для визуализации in vivo с помощью прижизненной микроскопии. Это связано с тем, что легкое является тонким органом в вечном движении. Непрерывное движение легких, дополнительно усугубляемое внутригрудным сердечным движением, представляет собой существенный барьер для точной визуализации. Поэтому из-за его относительной недоступности для модальностей для прижизненной оптической визуализации с высоким разрешением рост рака в легких часто считается оккультным процессом3.
В клинических условиях технологии визуализации, такие как компьютерная томография (КТ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют визуализировать глубоко внутри интактных жизненно важных органов, таких как легкие4. Однако, хотя эти модальности обеспечивают превосходный вид грубого органа (часто даже выявляя патологию до появления клинических симптомов), они имеют недостаточное разрешение для обнаружения отдельных диссеминированных опухолевых клеток по мере их продвижения через ранние стадии метастазирования. Следовательно, к тому времени, когда вышеупомянутые модальности дают какие-либо признаки метастазирования в легкие, метастатические очаги уже хорошо укоренились и размножаются. Поскольку микроокружение опухоли играет ключевую роль в прогрессировании рака и образовании метастазов5,6,существует большой интерес к исследованию самых ранних этапов метастатического посева in vivo. Этот интерес дополнительно подпитывается повышенным пониманием того, что раковые клетки распространяются еще до того, как первичная опухоль обнаружена7,8, и растущими доказательствами того, что они выживают как одиночные клетки и находятся в спящем состоянии в течение многих лет или десятилетий, прежде чем перерасти в макрометастаз9.
Ранее визуализация легких при одноклеточном разрешении обязательно включала ex vivo или эксплант препараты10,11,12,13,ограничивая анализы одиночными временными точками. Хотя эти препараты предоставляют полезную информацию, они не дают никакого представления о динамике опухолевых клеток в органе, связанном с неповрежденной кровеносной системой.
Последние технологические достижения в области визуализации позволили интравитальной визуализации неповрежденного легкого с одноклеточным разрешением в течение периодов до 12 ч14,15,16. Это было достигнуто в мышиной модели с использованием протокола, который включал механическую вентиляцию, резекцию грудной клетки и вакуумную иммобилизацию легких. Однако, несмотря на то, что он предлагает первые изображения физиологически неповрежденного легкого с разрешением одной клетки, этот метод является высокоинвазивным и терминальным, что исключает дальнейшие сеансы визуализации за пределами индексной процедуры. Это ограничение, таким образом, препятствует его применению для изучения метастатических стадий, которые занимают более 12 ч, таких как покоя и реинициация роста14,15,16. Кроме того, паттерны клеточного поведения, наблюдаемые с использованием этого подхода к визуализации, должны быть осторожно интерпретированы, учитывая, что вызванные вакуумом перепады давления, вероятно, вызовут отклонения в кровотоке.
Чтобы преодолеть эти ограничения, недавно было разработано минимально инвазивное окно для визуализации легких с высоким разрешением (WHRIL), облегчающее последовательную визуализацию в течение длительного периода от нескольких дней до недель без необходимости механической вентиляции17. Методика влечет за собой создание «прозрачной грудной клетки» с герметичной грудной полостью для сохранения нормальной функции легких. Процедура хорошо переносится, что позволяет мыши восстанавливаться без значимых изменений в исходной активности и функции. Чтобы надежно локализовать одну и ту же область легких на каждом соответствующем сеансе визуализации, к этому окну18был применен метод, известный как микрокартография. Через это окно можно было захватывать изображения клеток, когда они поступают в сосудистое русло легкого, пересекают эндотелий, проходят деление клеток и превращаются в микрометастазы.
Здесь в исследовании представлено подробное описание улучшенного хирургического протокола имплантации WHRIL, который упрощает операцию, одновременно повышая ее воспроизводимость и качество. Хотя этот протокол был разработан для исследования динамических процессов, лежащих в основе метастазирования, этот метод может быть альтернативно применен к исследованиям многочисленных процессов биологии легких и патологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Комитета по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.
1. Пассивация окон
- Промыть оптические оконные рамы(Дополнительный рисунок 2)1% (мас./об.) раствором ферментативно-активного моющего средства.
- Внутрь стеклянной банки погружают оптические оконные рамы в 5% (мас./об.) раствор гидроксида натрия на 30 мин при 70 °C.
- Снимите и помойте оконные рамы деионизированной водой.
- Внутри новой стеклянной банки погрузите оптические оконные рамы в 7% (мас./об.) раствор лимонной кислоты на 10 мин при 55 °C.
- Снова снимите и вымойте оконные рамы деионизированной водой.
- Повторите шаг 1.2; затем снимите и помойте оконные рамы деионизированной водой.
2. Подготовка к операции
- Проведите операцию в капюшоне или ламинарном проточном шкафу. Чтобы избежать загрязнения операционного поля, обеспечьте отдельные, разделенные области для подготовки, операции и восстановления соответственно.
- Перед операцией стерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве. Если запланированы последующие процедуры, повторно стерилизуйте инструменты с помощью горячего стерилизатора. Для этой хирургической процедуры используется техника только подсказок.
- Питание на нагретой хирургической бусине и стерилизаторе для бисера.
- Обезболить мышь 5% изофлураном в анестезиологической камере.
- Для удаления волос обильно нанесите крем для депиляции на верхний левый участок разреза грудной клетки. Не дольше 20 с плотно вытрите волосы и крем для депиляции с помощью смоченной папиросной бумаги. Повторите по мере необходимости, чтобы удалить все волосы с места операции.
- Используя 2-0 шелковый шов, завяжите узел у основания катетера 22 G, оставив хвосты длиной 2 дюйма (см. Рисунок 1A).
3. Хирургия окна легких
- Мойте руки с помощью антисептического мыла.
- Перед каждой новой операцией надевайте новые стерильные перчатки.
- Чтобы предотвратить высыхание роговицы и повреждение глаз мыши, нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза.
- Развести 10 мкл (0,1 мг/кг) бупренорфина в 90 мкл стерильного PBS, а затем ввести подкожно для обеспечения предоперационной анальгезии.
- Интубируйте мышь шелковым шовным катетером 22 G15. Используя надувную луковицу, подтвердите успешную интубацию, отметив двусторонний подъем грудной клетки при сжатии луковицы.
- Закрепите интубационный катетер, завязав шелковый шов 2-0 вокруг морды мыши (см. Рисунок 1B).
- Поместите мышь на нагретую хирургическую стойку и поместите ее в правый боковой пролежн, чтобы обнажить левую грудную клетку.
- Подключите вентилятор к интубационному катетеру.
- Обеспечьте контролируемую, стабильную вентиляцию на вентиляторе, а затем уменьшите содержание изофторана до 3%. В начале процедуры и периодически на протяжении всей процедуры оценивайте адекватность анестезии, выполняя тест на ущемление пальца ноги.
- Используя бумажную ленту, краниально и каудально закрепляйте передние и задние конечности, соответственно, до нагретой хирургической стадии. Поместите еще один кусок ленты по длине спины мыши, чтобы максимизировать воздействие на операционное поле (см. Рисунок 1C).
- Откройте все хирургические инструменты под капотом для сохранения стерильности.
- Стерилизуйте место операции путем щедрого нанесения антисептика на кожу мыши.
- Используя щипцы, поднимите кожу и сделайте круговой разрез ~10 мм, ~7 мм слева от грудины и ~7 мм выше подреберного края(рисунок 1D).
- Тщательно определите любые крупные сосуды. Если необходимо деление сосудов, прижигают на обоих концах электрокоагуляционной ручкой для поддержания гемостаза.
- Иссечь мягкие ткани, покрывающие ребра.
- Поднимите6-е или7-е ребро с помощью щипцов. Используя одно лезвие тупых микрорассекающих ножниц, закругленной стороной по направлению к легкому, осторожно пронзите межреберную мышцу между6-м и7-м ребрами для входа во внутригрудное пространство(рисунок 1Е).
- Деликатно разряжайте канистру со сжатым воздухом при дефекте, чтобы разрушить легкое и отделить его от стенки грудной клетки. Обжигайте сжатый воздух короткими очередями, чтобы предотвратить ятрогенное повреждение легких.
- Поместите биопсийный перфоратор на режущий инструмент(Дополнительный рисунок 1)и осторожно маневрируйте основанием режущего инструмента через межреберный разрез(рисунок 1F).
- Ориентируйте основание режущего инструмента так, чтобы оно было параллельно грудной стенке. Проткните круглое отверстие диаметром 5 мм через грудную клетку(рисунок 1G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что открытая легочная ткань розовая, без признаков повреждения. - Используя шелковый шов 5-0, создайте кошелек-струнный стежок ~1 мм от отверстия, по окружности, переплетаясь с ребрами(рисунок 1H).
- Расположите рамку окна таким образом, чтобы края круглого дефекта выровнялись в канавке окна (см. рисунок 1I).
- Надежно зафиксируйте имплантированное окно, плотно завязав шелковый шов 5-0.
- Загрузите 100 мкл цианоакрилатного гелевого клея в шприц объемом 1 мл.
- Высушите легкое, применяя устойчивый мягкий поток сжатого воздуха в течение ~10-20 с(рисунок 1J).
- С помощью щипцов захватите оконную раму за ее внешний край, осторожно поднимите, чтобы обеспечить отделение легкого от нижней поверхности оконной рамы.
- Дозируйте тонкий слой цианоакрилатного клея вдоль нижней поверхности оптической оконной рамы(рисунок 1K).
- Увеличьте положительное давление в конце выдоха (PEEP) на вентиляторе, чтобы раздуть легкое.
- Удерживая в течение 10-20 с, нанесите мягкое, но твердое давление, чтобы прикрепить оптическую оконную раму к легочной ткани(рисунок 1L).
- Нанесите 5-миллиметровую каплю оставшегося цианоакрилатного гелевого клея на прямоугольную крышку.
- Подберите крышку диаметром 5 мм с помощью вакуумных звукоснимателей. Опустите нижнюю поверхность крышки в клей, а затем соскоблите лишний клей три раза о сторону прямоугольной крышки, так что останется только очень тонкий слой(рисунок 1M).
- Осторожно расположите крышку, чтобы поместиться внутри углубления в центре оптической оконной рамы и удерживается над легочной тканью под углом. Ненадолго зажмите вентилятор для создания положительного давления, гипер-раздувая легкое. Используя вращающееся движение, ориентируйте покров параллельно легочной ткани, чтобы создать прямое расположение между поверхностью легкого и нижней поверхностью покрова. Поддерживайте мягкое давление, позволяя цианоакрилатному клею схватиться (~ 25 с).
- Используйте щипцы, чтобы отделить крышку от вакуумных звукоснимателей(рисунок 1N).
- Используя 5-0 шелковый шов, снова создайте стежок из кошелька, на этот раз <1 мм по окружности от разрезанного края разреза кожи. Засуньте лишнюю кожу под внешний край оконной рамы, прежде чем плотно завязать ее фиксирующими узлами.
- Чтобы обеспечить герметичное уплотнение между крышкой и оконной рамой, дозируйте небольшое количество жидкого цианоакрилата на границе раздела металл-стекло (см. Рисунок 1O).
- Прикрепите стерильную иглу к инсулиновому шприцу объемом 1 мл. Вводят иглу ниже мечевидного отростка, продвигаясь к левому плечу, проникая в грудную полость через диафрагму. Осторожно потяните за шприц, чтобы удалить остаточный воздух из грудной полости (см. Рисунок 1P).
- Извлеките ленту из мыши.
- Выключите изофлуран.
- Продолжайте вентиляцию со 100% кислородом до тех пор, пока мышь не появится готовой к пробуждению.
- Аккуратно обрежьте шелковый шов 2-0 вокруг морды мыши и экстубируйте мышь.
- Перенесите мышь в чистую клетку и контролируйте до полного восстановления. Усыплите мышь, если присутствуют признаки затруднения дыхания.
- Обеспечить послеоперационную анальгезию путем подкожного введения 10 мкл (0,1 мг/кг) бупренорфина, разведенного в 90 мкл стерильного фосфатно-буферного раствора (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этапы хирургической процедуры, описанные в этом протоколе, обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1. Вкратце, перед операцией мышей обезболивают и удаляют волосы над левой грудной клеткой. Мышей интубируют и механически вентилируют, чтобы обеспечить выживание при нарушении грудной полости. Мягкие ткани, покрывающие ребра, иссекаются, и создается небольшой циркулярный дефект,охватывающий 6-е и7-е ребра. Оптическая оконная рама вставляется в дефект, а его нижняя сторона (снаружи прозрачного отверстия) приклеивается к легочной ткани. Затем оконная рама закрепляется комбинацией швов и клея, повторно запечатывая грудную полость и позволяя возобновить нормальное дыхание после экстубации. При успешной имплантации легкое будет прилипать к оптическому окну (которое включено как часть грудной стенки), с сохранением градиентов внутригрудного давления. Это обеспечивает комфортную выживаемость мыши, обеспечивая ежедневную визуализацию до протокольной нормы (2 недели). Прижизненная визуализация затем может быть выполнена через окно, как описано ранее для других окон15,19,20.
Для визуализации различных типов клеток, биологических структур или клеточных функциональных состояний процедура, представленная здесь, может быть выполнена на широком спектре мышей, которые либо были генетически манипулированы для экспрессии флуоресцентных белков21, либо введены красителями22. Постоянный характер окна делает его совместимым с методами релокализации полей зрения, такими как фотоконверсия23,24 или микрокартография17,18. Микрокартография - это метод триангуляции, основанный на использовании вычислительных преобразований координат фиксированных фидуциальных меток между сеансами визуализации с целью прогнозирования и повторной локализации интересующей области. В окне, созданном, как описано выше, эти фидуциальные отметины представляют собой легкие царапины, выгравированные на оконной раме(дополнительный рисунок 2),которые легко идентифицируются под микроскопом. Это позволяет находить одно и то же поле зрения несколько раз, даже в немаркированной ткани. На рисунке 2 показан результат этих методов на мыши, где сосудистая система легких была помечена инъекцией меченого красителем высокомолекулярного декстрана (тетраметилродамина 155 кД декстрана) и той же микро-сосудистой системы, повторно локализованной в течение 3 дней.
Было обнаружено, что этот декстран чрезвычайно полезен при оценке преходящих сосудистых отверстий, которые индуцируются в периоды интравазации опухолевых клеток25,26,27. Действительно, было показано, что при первичных опухолях молочной железы этот высокомолекулярный декстран в противном случае эффективно изолируется в сосудистую систему и не просачивается в интерстиций25. Это в отличие от дектранса с более низкой молекулярной массой (например, 10 кД или 70 кД), которые, как было показано, просачиваются из неоангиогенных сосудов пассивно28,29. Между тем, было замечено, что здоровые сосуды легких более устойчивы к утечке, причем декстранс >10 кД выходит в интерстиций только при оскорблении органа, например, при воздействии экзосом30 или вирусов31. Существует также множество контрастных веществ для измерения других параметров в легких (например, ядерные маркеры, живые / мертвые индикаторы, репортеры окислительного стресса, трекеры скорости кровотока) в дополнение к проницаемости сосудов. Отличный ресурс, каталогизирующий их, можно найти в протоколе Ueki et al.22.
WHRIL - это метод, который очень хорошо подходит для исследования динамики кровотока в легких. Это может быть достигнуто несколькими способами. Во-первых, при изображении с использованием относительно медленной частоты кадров (~ 1-10 кадров в секунду, fps) скорости кровотока могут быть определены по теням, которые создают немаркированные эритроциты при протекании в более крупных сосудах. При низком fps эти тени образуют линии, угол которых относительно сосуда может быть использован для расчета скорости потока эритроцитов32 (рисунок 2,желтые линии). Во-вторых, тени также можно отслеживать на микроскопах с низким fps путем выравнивания сосудов с быстрой осью сканирования микроскопа и приобретения кимографов с использованием быстрого линейного сканирования33,34,35. Наконец, при визуализации с высокой частотой кадров (>10 кадров в секунду) на микроскопе, способном интегрировать сигнал с течением времени (например, вращающийся диск конфокальный, оснащенный детектором устройства с зарядовой связью (ПЗС)), отдельные частицы могут быть прослежены непосредственно16,17. В этой ситуации неподвижные объекты выглядят как яркие точки, а струящиеся объекты прослеживают следы через циркуляцию. Скорости ячеек могут быть количественно определены путем измерения длины дорожек и деления на время получения кадра. Пример этого приведен на рисунке 3 и дополнительном фильме 1,где флуоресцентные микросферы 2 мкм были внутрисосудисто введены в мышь перед визуализацией.
Благодаря возможности многократно и последовательно возвращаться в одно и то же поле зрения, теперь возможна визуализация процессов, которые развиваются в течение нескольких дней. В качестве демонстрации этого применения WHRIL был использован для визуализации метастатического прогрессирования клеток рака молочной железы в легких17,21:то есть для отслеживания со временем судьбы отдельных опухолевых клеток, которые прибывают в сосудистую систему легких. Эта концепция изображена на рисунке 4А,где одна диссеминированная опухолевая клетка визуализируется вскоре после размещения в сегменте микро-сосудистой системы легких. Возвращение в то же место в последующие дни раскрывает судьбу опухолевой клетки (например, рециркуляция, экстравазация и т. Д.). Применительно к исследованию кульминационных этапов метастатического прогрессирования в легких можно было визуально вести хронику динамических процессов, включая приход опухолевых клеток(рисунок 4B),экстравазацию(рисунок 4C)и пролиферацию с образованием макрометастазов(рисунок 4D).
Рисунок 1:Краткое описание операции по имплантации окна для визуализации легких с высоким разрешением (WHRIL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Микрокартография позволяет релокализовать фиксированные положения в оптическом окне. Многофотонная прижизненная визуализация одной области легкого под оптически прозрачным покровом показывает микроциркуляторное русло, перемещенное в течение 3 последовательных дней с использованием микрокартографии. Желтые стрелки указывают на четко определяемую точку ответвления от одного судна, идентифицируемого каждый последующий день. Желтые линии выделяют тени, которые немаркированные эритроциты создают при протекании в более крупных сосудах. Угол этих линий относительно сосуда может быть использован для расчета скорости потока эритроцитов. Красный = tdTomato меченые эндотелиальные клетки и 155 кДа тетраметилродамин декстран меченая сыворотка крови, зеленый = GFP-меченые опухолевые клетки, синий = вторая гармоническая генерация. Шкала = 15 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Визуализация скорости кровотока. Скорость кровотока может быть визуализирована путем введения флуоресцентных микросфер диаметром 2 мкм ретро-орбитально и визуализации их прохождения через кровеносные сосуды. При изображении на микроскопе, способном интегрировать сигнал с течением времени (например, вращающийся диск-конфокаль, оснащенный ПЗС-детектором), стационарные микросферы появляются в виде ярких точек (стрелок), а протекающие сферы прослеживают следы с циркуляцией (линии в скобках). Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. WHRIL может захватывать каждый шаг метастатического каскада в легких, непосредственно визуализируя судьбу диссеминированных опухолевых клеток. (A) Отслеживание судьбы диссеминированных опухолевых клеток (зеленый) достижимо с помощью серийной визуализации в течение нескольких дней через WHRIL. На 1-й день опухолевая клетка прибыла и застряла в сосудистой системе легких. На 2-й и 3-й день клетка больше не присутствует в сосудистой системе легких, либо рециркулируя, либо умирая. Шкала бара = 15 мкм. (B-D) Визуализация каждой из стадий метастазирования опухолевых клеток в легкое. (B) Внутрисосудистая диссеминированная опухолевая клетка (зеленая), застрявшая в сосудистой системе легких после прибытия. (C) Диссеминированная опухолевая клетка (зеленая) после экстравазации в паренхиму легкого. (D) Опухолевые клетки, которые размножились и выросли в микрометастазы. Красный = tdTomato меченые эндотелиальные клетки и 155 кДа тетраметилродамин декстран меченая сыворотка крови, зеленый = GFP-меченые опухолевые клетки, синий = вторая гармоническая генерация. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный фильм 1: Видео, соответствующее рисунку 3, показывающее сосудистую систему легких с циркулирующими микросферами 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный рисунок 1: Чертежи механического проектирования дляинструмента длярезки нержавеющей стали, используемого для управления 5-миллиметровым ударом биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Чертежи механического проектирования оконной рамы из нержавеющей стали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Чертежи механического проектирования инструмента для оконодержателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В местах отдаленного метастазирования, таких как легкие, оптическая визуализация с высоким разрешением дает представление о сложной динамике метастазирования опухолевых клеток. Обеспечивая визуализацию in vivo отдельных раковых клеток и их взаимодействия с тканью хозяина, прижизненная визуализация с высоким разрешением оказалась полезной для понимания механизмов, лежащих в основе метастазирования.
Здесь описан улучшенный хирургический протокол для постоянной грудной имплантации оптического окна, предназначенного для обеспечения последовательной визуализации мышиного легкого с помощью многофотонной микроскопии высокого разрешения. Окно, созданное с помощью этого протокола, хорошо переносится и, учитывая его способность успешно запечатывать грудную полость, способно поддерживать градиенты внутригрудного давления, необходимые для спонтанной вентиляции (в отличие от любого другого ранее описанного окна для визуализации мышиного легкого14,15,16,36,37 ). Это позволяет мыши проснуться от анестезии, дышать самостоятельно и комфортно выживать с прозрачной грудной клеткой в течение длительного периода времени, охватывающего несколько недель.
Используя это окно, можно было визуализировать, с одноклеточным разрешением, все этапы метастазирования, включая прибытие, экстравазацию и рост в микрометастазы.
Хотя протокол требует некоторого технического мастерства, с практикой и тщательным вниманием к нескольким ключевым шагам, процедура может быть выполнена с высоким уровнем успеха. Во-первых, при удалении волос перед операцией крайне важно защитить кожу мыши, удалив крем для депиляции с увлажненной тканью после не более 20 с контакта. Во время операции следует соблюдать крайнюю осторожность, чтобы избежать разрезания сосудов. Чрезмерное кровотечение, чаще всего встречающееся из-за деления плечевых или внутренних молочных артерий во время удаления жировой прокладки молочной железы, может скрыть визуализацию в хирургическом поле или привести к смерти через экссангинацию. В этом протоколе недавно описано использование перфоратора и режущего инструмента для биопсии(дополнительный рисунок 1),которые значительно ускоряют и упрощают создание кругового дефекта через грудную клетку, а также инструмента для держателя окон, облегчающего имплантацию. Реализация этих достижений значительно повышает успешность процедуры и снижает требуемый уровень предшествующих хирургических навыков. Отдельные лаборатории могут использовать чертежи на дополнительных рисунках для изготовления этих инструментов либо собственными, либо коммерческими механическими мастерскими. Поиск в Интернете по запросу «сайты торгов механических магазинов» даст несколько онлайн-приложений, которые помогут найти местные коммерческие механические магазины.
Наконец, крайне важно убедиться, что легочная ткань остается сухой перед нанесением клея. Наиболее распространенной ловушкой, приводящей к неудачному креплению крышки, является неспособность обеспечить полное удаление влаги с поверхности легких до аппозиции с рамой или покровным стеклом. Кроме того, для обеспечения качества изображений следует наносить чрезвычайно тонкий слой клея (<10 мкм). Избыток клея следует соскоблить перед размещением покровного стекла.
Основным ограничением IVI через WHRIL является относительно ограниченная глубина достижимого проникновения. Поэтому патология, возникающая глубоко внутри легкого, недоступна. Несмотря на это ограничение, методика все же может давать обилие клинически значимой информации, особенно в онкологических исследованиях, учитывая описанную склонность к периферически локализованным метастазам в легкие38,39,40,41. В конечном счете, этот подход к визуализации обеспечивает значительное преимущество перед стандартными анализами ex vivo и другими методами визуализации in vivo, которые либо отключают ткань от жизненно важных физиологических процессов10,11, 12,13,либо ограничивают продольный анализ максимальной продолжительностью 12 ч14,15,16,37,42, соответственно.
Для повторной визуализации в течение этого периода времени еще предстоит преодолеть несколько проблем. Во-первых, важно поддерживать здоровье кожи вокруг имплантированного окна, поскольку, пока раненая ткань не подвергается воздействию, кожа вокруг все еще может воспалиться или заразиться. Рутинное применение антибиотической мази поможет предотвратить это. Во-вторых, со временем экссудат из разрезанной кожи может застыть под оконной рамой и препятствовать размещению фиксирующей пластины, используемой для обездвиживания мыши в стадии микроскопа. Размещение влажной ткани над WHRIL в течение 10-15 мин размягчит этот экссудат и позволит разместить оконную раму. В-третьих, одним из механизмов организма для выведения избытка воды и поддержания гомеостаза является выдох пара. Таким образом, слишком большое потребление жидкости (в основном в результате инъекции контрастных веществ или суспензий опухолевых клеток) приведет к тому, что поверхность легких выведет эту избыточную воду и приведет к отделению легочной ткани от WHRIL. Этого можно избежать, ограничив объем инъекций максимум 50 мкл за один раз. Наконец, даже при лучшем уходе легочная ткань может иногда отделяться от WHRIL из-за того, что мышь глотает большой объем воды или из-за того, что мышь перенапрягается. Когда это происходит, отслоение легочной ткани от WHRIL обычно происходит медленно, начиная с внешнего края. Таким образом, может быть невозможно следить за некоторыми полями зрения, расположенными в первый день съемки, в течение всей продолжительности окна. Было обнаружено, что наилучшие результаты визуализации будут получены в течение первых нескольких дней и что использование методов мозаики, таких как ранее опубликованная прижизненная визуализация большого объема с высоким разрешением21, может свести к минимуму влияние этого ограничения.
Учитывая, что WHRIL интегрирован в грудную стенку мыши, дрейф во время визуализации, как правило, не является существенной проблемой, если заботиться о том, чтобы крепление между окном и микроскопом было прочным. Тем не менее, некоторое небольшое количество дрейфа может наблюдаться в течение времени, непосредственно следующего за размещением мыши в стадии микроскопа. Это может происходить от расслабления тела мыши или от теплового расширения компонентов микроскопа (сценическая пластина, стадия XY, объективная линза) из-за камеры окружающей среды. Этого дрейфа можно избежать, выделив ~ 30 минут для уравновешивания перед началом процедуры визуализации. Этот период времени позволяет физиологии мыши стабилизироваться под наркозом и позволяет всем компонентам прийти к тепловому равновесию. Любое небольшое количество остаточного дрейфа может быть легко обработано вычислительными алгоритмами, такими как StackReg43 или HyperStackReg44.
Наконец, этот протокол является улучшением по сравнению с предыдущей письменной версией по двум причинам. Во-первых, визуальный формат позволяет лучше концептуализировать хирургический протокол. Это особенно полезно для критических этапов, где 1) легкое высушивается путем применения устойчивого мягкого потока сжатого воздуха (этап 3.24, рисунок 1J),2) крышка прикреплена к центральному отверстию оконной рамы таким образом, чтобы предотвратить захват пузырьков (этап 3.31), и 3) небольшое количество жидкого цианоакрилата добавляется на границе раздела металл-стекло для обеспечения герметичного уплотнения между покровным стеклом и оконной рамой (шаг 3.34, рисунок 1O).
В заключение, с появлением WHRIL, учитывая его способность к субклеточной визуализации одной и той же легочной ткани в течение длительного периода, исследователи вновь получили возможность решать многие вопросы, оставшиеся без ответа. В частности, протокол, изложенный в настоящем документе, позволяет фундаментально исследовать динамические процессы, лежащие в основе многочисленных патологий, включая прогрессирование метастазирования рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана следующими грантами: CA216248, CA013330, Учебный грант Рут Л. Киршштейн T32 Монтефиоре CA200561, премия METAvivor Early Career Award, Центр биофотоники Грусса-Липпера и его Интегрированная программа визуализации, а также Джейн А. и Майлз. Демпси. Мы хотели бы поблагодарить Центр аналитической визуализации (AIF) в Медицинском колледже Эйнштейна за поддержку визуализации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
