Summary
ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。
Abstract
転移は、がん関連死亡率の90%を占め、原発性腫瘍から骨、脳、肺などの二次部位への癌細胞の全身的な広がりを伴う。広範囲に研究されているが、このプロセスの機械主義的な詳細は十分に理解されていない。コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)を含む一般的なイメージングモダリティは、様々な程度の総可視化を提供しますが、それぞれが個々の腫瘍細胞のダイナミクスを検出するために必要な時間的および空間的解像度を欠いています。これに対処するために、一般的な転移部位の生体内イメージングに関する多数の技術が説明されている。これらの部位のうち、肺は生命を維持する上での繊細さと重要な役割のために、生体内画像へのアクセスに特に困難であることが証明されている。インタクトな肺の単一細胞内生体イメージングにはいくつかのアプローチが以前に記載されているが、すべて非常に侵襲性および末期の手順を伴い、可能な限り最大のイメージング期間を6〜12時間に制限する。ここで説明する、肺の高解像度イメージングのための低侵襲胸部光学窓(WHRIL)の恒久的な移植のための改良された技術である。マイクロカートグラフィーに適応したアプローチと組み合わせることで、革新的な光学窓は、複数のイメージングセッションにわたって単一細胞解像度で無傷の肺の連続的なインビタルイメージングを容易にし、数週間にわたる。イメージングデータを収集できる前例のない時間を考えると、WHRILは、転移性の進行と肺内の多数の追加の生物学的プロセスの基礎となる動的メカニズムの加速的発見を促進することができます。
Introduction
死亡の90%を占める、転移は癌関連死亡率の主な原因である1。臨床的に観察された転移(骨、肝臓、肺、脳)2の主要部位の中で、肺は、生体内顕微鏡による 生体内 イメージングに特に挑戦的であることが証明されている。これは、肺が永久的な動きの繊細な器官であるためです。肺の連続運動は、胸腔内心臓運動によってさらに複合され、正確な画像化に対する実質的な障壁を表す。したがって、高解像性生体内光学画像化のためのモダリティに対する相対的なアクセス不能のために、肺内の癌増殖は、しばしばオカルトプロセス3とみなされてきた。
臨床現場では、コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放射断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)などの画像技術により、肺4などのインタクトな重要な器官の奥深くで可視化が可能になる。しかし、これらのモダリティは、グロス臓器の優れた見解を提供するが(多くの場合、臨床症状の発症前に病理を明らかにすることさえある)、転移の初期段階を進める個々の播種腫瘍細胞を検出するには不十分な分解能である。その結果、前述のモダリティが肺に転移の兆候を提供する時点で、転移性病巣はすでに十分に確立され増殖している。腫瘍微小環境は癌進行及び転移形成5,6において極めて重要な役割を果たすため、生体内で転移性播種の最も早いステップを調査することに大きな関心がある。この関心は、原発性腫瘍が検出される前でさえ癌細胞が広まることの増加の評価によってさらに促進される7,8そしてそれらがマクロ転移に成長する前に数十年から数十年休眠状態で生き残る証拠を増加させる9.
以前は、単一細胞分解能での肺のイメージングは、必ずしも10、11、12、13のex vivoまたは外植の調製を伴い、分析を単一の時点に制限していた。これらの調製物は有用な情報を提供するが、それらは無傷の循環系に接続された器官内の腫瘍細胞のダイナミクスに関する洞察を提供しない。
イメージングにおける最近の技術の進歩により、12時間14、15、16までの期間にわたって単一細胞分解能で無傷の肺の生体内可視化が可能になった。これは、機械的換気、胸部の切除、真空支援肺固定化を含むプロトコルを使用してマウスモデルで達成された。しかし、生理学的に無傷の肺の最初の単一細胞分解能画像を提供したにもかかわらず、この技術は非常に侵襲性および末端であり、それによって、インデックス手順を超えてさらなるイメージングセッションを排除する。この制限は、従って、12時間を超える転移ステップの研究への応用を妨げる、例えば、休止状態および成長14、15、16の再開始などである。さらに、このイメージング手法を用いて観察された細胞行動のパターンは、真空による圧力差が血流の転換を引き起こす可能性があることを考えると、慎重に解釈されなければならない。
これらの制限を克服するために、肺の高解像度イメージングのための低侵襲窓(WHRIL)が最近開発され、機械的換気を必要とせずに、数日間から数週間にわたって連続画像化を促進する。この技術は、正常な肺機能の保存のための密閉胸腔を有する「透明な胸部」の作成を伴う。この手順は十分に許容され、ベースラインの活動と機能を意味のある変更なしにマウスが回復することを可能にする。それぞれのイメージングセッションで全く同じ肺領域を確実に局地化するために、マイクロカートグラフィとして知られる技術をこの窓18に適用した。この窓を通して、肺の血管床に到着し、内皮を横切り、細胞分裂を受け、微小転移に成長する細胞の画像を捕捉することが可能であった。
ここでは、WHRILの移植のための改善された外科プロトコルの詳細な説明を提示し、同時にその再現性と品質を高めながら手術を簡素化する。このプロトコルは転移の根底にある動的プロセスの調査を可能にするように設計されたが、この技術は肺生物学および病理学の多数のプロセスの調査に代わり適用されるかもしれない。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバート・アインシュタイン医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会の事前承認を含む脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制に従って行われています。
1. 窓のパッシベーション
- 光学窓枠(補足図2)を、酵素活性洗剤の1%(w/v)溶液で洗い上げ
- ガラス瓶の中に、光窓フレームを70°Cで30分間水酸化ナトリウム溶液5%(w/v)に沈めます。
- 脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。
- 新しいガラス瓶の中に、光学窓枠を55°Cで10分間クエン酸溶液7%(w/v)に沈めます。
- 再度、脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。
- ステップ 1.2 を繰り返します。その後、脱イオン水で窓枠を取り出して洗います。
2. 手術の準備
- フードまたはラミナーフローキャビネットで手術を行います。手術分野の汚染を避けるために、それぞれ準備、手術、および回復のための明確な分離された領域を確保する。
- 手術の前に、オートクレーブ内のすべての手術器具を殺菌する。後続の手順が計画されている場合は、ホットビーズ滅菌器を使用して器具を再殺菌します。この外科的処置のために、先端のみの技術が使用される。
- 加熱された外科ビーズとビーズの滅菌器に電源を入れ。
- 麻酔室で5%イオブルランでマウスを麻酔します。
- 毛髪を除去するには、左上胸部切開部位に脱毛クリームをたっぷり塗布する。20s以下の後、湿らせたティッシュペーパーを使用して髪と脱毛クリームをしっかりと拭き取ります。必要に応じて繰り返し、手術部位からすべての毛髪を取り除きます。
- 2-0 シルク縫合を使用して、22 G カテーテルの基部で結び目を結び、2 インチの長い尾を残します ( 図 1Aを参照)。
3. 肺窓手術
- 防腐石鹸を使って手を洗います。
- 新しい手術を行う前に、新しい無菌手袋を着用してください。
- 角膜乾燥やマウスの目の損傷を防ぐために、両眼に眼科軟膏を塗布してください。
- 90 μLの無菌PBSでブプレノルフィンを10 μL(0.1 mg/kg)希釈し、術前の鎮痛を確実にするために皮下注射を行います。
- シルク縫合糸で結ばれた22Gカテーテル15でマウスを挿管する。インフレ球根を使用して、電球スクイーズ時に両側の胸部上昇に基づいて挿管に成功したことを確認する。
- 2-0 シルク縫合糸をマウスのスナッと結んで挿管カテーテルを固定します( 図1Bを参照)。
- 加熱された外科用スタンドにマウスを置き、右横の褥瘡に置いて左胸郭を露出させます。
- 挿管カテーテルに人工呼吸器を接続します。
- 換気装置の制御され、安定した換気を保障し、イオブルオレアンを3%に下げる。手順の発症時および手順の期間を通して定期的に、つま先ピンチテストを行うことによって麻酔の妥当性を評価する。
- 紙テープを使用して、前肢と後肢をそれぞれ加熱された外科段階に固定する。マウスの背中の長さにテープをもう 1 枚置くと、外科分野への露出を最大限に高めます ( 図 1Cを参照)。
- 無菌性の維持のためにフードの下のすべての外科器具を開く。
- マウスの皮膚に消毒剤の寛大な適用によって外科部位を殺菌する。
- 鉗子を使用して、皮膚を持ち上げて~10mmの円形切開をし、胸骨の左に~7mm、肋骨下マージンより約7mm優れた(図1D)。
- 主要な容器を慎重に特定する。容器の分割が必要な場合は、止まり止まりを維持するために電気焼灼ペンで両端を焼灼する。
- 肋骨の上に柔らかい組織を物品化します。
- 鉗子を使用して6番目または7番目の肋骨を高めます。鈍いマイクロ解剖ハサミの単一の刃を使用して、丸みを帯びた側を肺に向かって、6番目と7番目の肋骨の間の肋間筋を慎重に突き刺して胸腔内空間に入る(図1E)。
- 欠陥時に圧縮空気キャニスターを繊細に排出し、肺を崩壊させ、胸壁から分離します。肺の肺損傷を防ぐために、短いバーストで圧縮空気を発射します。
- 切削工具(補足図1)の上に生検パンチを置き、肋間切開を通して切削工具のベースを慎重に操縦する(図1F)。
- 切削工具のベースを胸壁と平行になるように向けます。リブケージに5mmの円形の穴を開けます(図1G)。
注:露出した肺組織が損傷の兆候なしにピンクであることを確認してください。 - 5-0シルク縫合糸を使用して、穴から〜1mmの財布ひもステッチを作成し、周回して、肋骨とインターレースを行います(図1H)。
- 円形の欠陥の端がウィンドウの溝の内側に揃うようにウィンドウフレームを配置します( 図 1Iを参照)。
- 5-0シルク縫合糸をしっかりと結ぶことで、埋め込まれた窓をしっかりとロックします。
- 1 mL シリンジにシアノアクリル酸ゲル接着剤を 100 μL に荷重します。
- ~10~20sの圧縮空気を安定して流して肺を乾かす(図1J)。
- 鉗子を使用して窓枠を外側の端でつかみ、静かに持ち上げて、窓枠の下面から肺を分離させます。
- 光学窓枠の下面に沿ってシアノクリレート接着剤の薄い層を分配する(図1K)。
- 呼吸器の正の終気圧(PEEP)を増加させ、肺を膨らまします。
- 10~20sを保持し、穏やかで堅固な圧力をかけて、光窓枠を肺組織に取り付けます(図1L)。
- 残りのシアノクリレートゲル接着剤の5mmの滴を長方形のカバースリップに分配する。
- 真空ピックアップを使用して5 mmカバースリップをピックアップします。カバースリップの下面を接着剤に浸し、非常に薄い層だけが残るような長方形のカバースリップの側面に対して余分な接着剤を3回削り取ります(図1M)。
- カバースリップを慎重に配置して、光窓フレームの中央に凹部の内側に収まり、肺組織の上に角度を持たなければなりません。人工呼吸器を短くクランプして、肺を超膨張させる陽圧を発生させる。回転運動を使用して、カバースリップを肺組織に平行に向けて、肺の表面とカバースリップの下面との間に直接割り当てを作成します。穏やかな圧力を維持し、シアノアクリル酸接着剤をセット(〜25s)にします。
- 鉗子を使用して、カバースリップと真空ピックアップを分離します(図1N)。
- 5-0シルク縫合糸を使用して、再び財布ひもステッチを作成し、今度は皮膚切開部のカットエッジから周回に1mm<。ロックノットでしっかりと結ぶ前に、窓枠の外縁の下に余分な皮膚をタックします。
- カバースリップと窓枠の間に気密シールを確保するには、金属ガラスインターフェイスで少量の液体シアノアクリルを分配します( 図1Oを参照)。
- 1 mL インシュリンシリンジに無菌の針を取り付けます。針をxiphoidプロセスの下に挿入し、左肩に向かって進み、横隔膜を通って胸腔に入ります。シリンジを軽く引き戻して、胸腔から残った空気を取り除きます( 図1Pを参照)。
- マウスからテープを取り外します。
- イオフルランをオフにします。
- マウスが目覚める準備が整うまで、酸素を100%で換気を続けます。
- 慎重にマウスのスナ出の周りに2-0シルク縫合糸をカットし、マウスを抜き出します。
- マウスをクリーンケージに移し、完全に回復するまで監視します。呼吸困難の兆候が存在する場合は、マウスを安楽死させる。
- 90 μL の無菌リン酸緩衝液 (PBS) で希釈したブプレノルフィンの 10 μL (0.1 mg/kg) を皮下注射して術後鎮痛を提供します。
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Representative Results
このプロトコルで説明する外科的処置のステップを要約し、図1に示す。簡単に言えば、手術の前に、マウスは麻酔を受け、左胸郭の上の毛は取り除かれる。マウスは、胸腔の破られた時の生存を可能にするために挿管され、機械的に換気される。肋骨の上に重なっている軟部組織が切除され、小さな円形の欠陥が作成され、6番目と7番目の肋骨にまたがっています。光学窓枠は欠陥に挿入され、その底面(透明開口の外側)は肺組織に付着する。窓枠は縫合糸と接着剤の組み合わせで固定され、胸腔を再密封し、排泄後の正常な呼吸の再開を可能にする。正常に移植されると、肺は胸壁の一部として組み込まれる)光学窓に付着し、胸部内圧勾配が維持される。これにより、マウスの快適な生存が可能になり、プロトコル許容値(2週間)まで毎日のイメージングが可能になります。その後、他のウィンドウ15、 19、20について説明したように、インビタルイメージングはウィンドウを通して実行できます。
種々の細胞型、生物学的構造、または細胞機能状態の可視化のために、ここで提示される手順は、蛍光タンパク質21を発現するか、または色素22を注入するために遺伝的に操作されたマウスの広い範囲に対して行うことができる。ウィンドウの永続的な性質は、光変換23、24またはマイクロカートグラフィ17、18などの視野の再ローカライズのための技術と互換性を持たせます。マイクロカートグラフィは、対象領域を予測および再ローカライズするために、イメージングセッション間の固定受託マークの座標の計算変換を使用して、三角測量技術です。上記のように作成されたウィンドウでは、これらの受託マークは、顕微鏡下で容易に識別できる窓枠(補足図2)にエッチングされた軽い傷である。これにより、無印の組織であっても同じ視野を複数回見つけることができます。図2は、3日間にわたって再局在化した色素標識高分子量デキストラン(テトラメチルローダミン155kDデキストラン)および同じ微小血管構造の注射により、肺血管系が標識されたマウスにおけるこれらの技術の結果を示す。
このデキストランは、腫瘍細胞の細胞内膜内膜25、26、27の期間中に誘発される一過性血管開口部を評価するのに極めて有用であることが分かった。実際に、原発性乳房腫瘍において、この高分子量デキストランは、それ以外の場合は血管構造に効果的に隔離され、インタースティチウム25に漏れ出さないことが示されている。これは、28,29の受動的に血管から漏出することが示されている低分子量(例えば10kDまたは70kD)のデックストランスとは対照的である。一方、健康な肺血管構造は漏れに対してより耐性であることが観察されており、デクストランス>10kDは、エキソソーム30またはウイルス31への暴露時などの臓器への侮辱によってインタースティジウムに逃げるだけである。また、血管透過性に加えて、肺の他のパラメータ(例えば、核マーカー、ライブ/デッドインジケータ、酸化ストレスレポーター、血流速度トラッカー)を測定するために、様々な造影剤が存在します。それらをカタログ化する優れたリソースは、Uekiらら22.のプロトコルで見つけることができます。
WHRILは、肺の血流のダイナミクスを調べるのに非常に適した技術です。これはいくつかの方法で実現できます。第一に、比較的遅いフレームレート(毎秒1〜10フレーム、fps)を用いて画像化した場合、血流速度は、より大きな血管内を流れるときに標識されていない赤血球が作る影によって決定することができる。低fpsでは、これらの影は、その角度を血管に対して使用できる線を形成し、その角度を使用して、赤血球流量32(図2、黄色の線)を計算することができる。第2に、顕微鏡の高速スキャン軸に血管を合わせ、高速線スキャン33、34、35を用いてカイモグラフを取得することによって、低fps顕微鏡上で影を追跡することもできる。最後に、時間の経過とともに信号を組み込むことができる顕微鏡上で高フレームレート(>10fps)で撮像する場合(例えば、電荷結合装置(CCD)検出器を搭載した回転ディスク共焦点を備え、個々の粒子を直接16,17にトレースすることができる。このような場合、静止オブジェクトは明るい点として表示され、流れるオブジェクトは循環とともにトラックをトレースします。セルの速度は、トラックの長さを測定し、フレーム取得時間で割ることによって定量化できます。この例は、画像化の前に2μmの蛍光微小球がマウスに血管内注入された図3および補足ムービー1に示されている。
同じ視野に繰り返し、一貫して戻る能力を持つ、複数の日にわたって進化するプロセスの可視化が可能になりました。このアプリケーションのデモンストレーションとして、WHRILは、肺17、21内の乳癌細胞の転移性進行を可視化するために使用された、すなわち、肺血管系に到達する個々の腫瘍細胞の運命を時間の経過とともに追跡する。この概念は、肺マイクロ血管系のセグメントに宿泊した直後に単一の播種腫瘍細胞が視覚化される図4Aに描かれています。その後の日に同じ場所に戻ると、腫瘍細胞の運命(例えば、再循環、血管外挿など)が明らかになります。肺における転移進行の最も高次ステップの調査に応用して、腫瘍細胞の到着(図4B)、外挿(図4C)および増殖を含む動的プロセスを視覚的に記録してマクロ転移を形成することが可能であった(図4D)。
図1:肺の高解像度画像処理のための窓の移植のための手術の概要(WHRIL)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2マイクロカートグラフィにより、光学窓内の固定位置の再局在化が可能になります。 光学的に透明なカバースリップの下の肺の単一領域の多光子の生体内画像化は、マイクロカートグラフィを使用して3日間にわたってマイクロバスキュアチュアが移動することを示す。黄色の矢印は、連続した日ごとに特定された単一の容器から明確に定義可能な分岐点を示す。黄色の線は、ラベルのない赤血球が大きな血管を流れるときに作る影を強調します。血管に対するこれらの線の角度は、赤血球流量を計算するために使用することができる。赤=tdTomato標識内皮細胞および155kDaテトラメチルローダミンデキストラン標識血清、グリーン=GFP標識腫瘍細胞、青=第2高調波発生。スケールバー= 15 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:血流速度の可視化 血流速度は、直径2μmの蛍光微小球をレトロ軌道に注入し、血管を通過する通路をイメージングすることによって可視化することができる。時間の経過とともに信号を統合することができる顕微鏡(例えば、CCD検出器を搭載した回転ディスク共焦点)上で画像化すると、静止した微小球は明るい点(矢印)として現れ、流れる球は循環(括弧状の線)でトラックをトレースします。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.WHRILは、播種された腫瘍細胞の運命を直接可視化することによって、肺内の転移カスケードの各ステップを捕捉することができる。(A) 分化した腫瘍細胞(緑色)の運命を追跡することは、数日間にわたって、WHRILを介して連続イメージングで達成可能である。1日目には、腫瘍細胞が肺血管系に到着し、宿宿することが観察される。2日目と3日目には、細胞は肺血管系内に存在しなくなり、再循環または死亡した。スケールバー=15μm(B-D)肺における腫瘍細胞転移の各段階の可視化。 (B) 到着後に肺血管系に宿した血管内播種腫瘍細胞(緑色)(C)肺のパレンチマに飛び出した後の腫瘍細胞(緑色)を播種した。(D) 増殖し、微小転移に成長した腫瘍細胞。赤=tdTomato標識内皮細胞および155kDaテトラメチルローダミンデキストラン標識血清、グリーン=GFP標識腫瘍細胞、青=第2高調波発生。スケールバー= 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:2μmの微小球を循環した肺血管構造を示す図3に対応するビデオ。こちらをクリックして、このムービーをダウンロードしてください。
補足図1:5mmバイオプシーパンチを導くために使用されるtainless鋼製の切削工具の機械設計図面。このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図2:ステンレス製窓枠用の機械設計図面。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:窓ホルダーツールの機械設計図面。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肺などの遠隔転移部位では、高解像光学イメージングは、腫瘍細胞転移の精巧なダイナミクスに関する洞察を提供する。単一癌細胞の 生体内 可視化と宿主組織との相互作用を可能にすることにより、高解像インビタルイメージングは、転移の根底にあるメカニズムを理解するのに役立つ証明された。
ここで説明する、高解像多光子顕微鏡を介してマウス肺の連続画像化を可能にするように設計された光学窓の恒久的な胸部移植のための改善された外科プロトコルである。このプロトコルを使用して作成されたウィンドウは十分に許容され、胸腔を正常に再密封する能力を考えると、自発的換気に必要な胸腔内圧勾配を維持することができます(マウス肺14、15、16、36、37のイメージングのための他の記載されたウィンドウに反して、).これにより、マウスは麻酔から目覚め、独立して呼吸し、透明な胸部で数週間にわたる長期間快適に生き残ることができます。
このウィンドウを使用して、単一細胞の解像度で、到着、飛び出し、微小転移への成長を含む転移のすべてのステップを視覚化することが可能でした。
プロトコルは、いくつかの重要なステップに練習と慎重に、いくつかの技術的な熟練を必要としますが、手順は、高い成功率で実行することができます。まず、手術前に毛髪を取り除くとき、20s以下の接触後に湿らせた組織で脱毛クリームを除去することによって、マウスの皮膚を保護することが重要である。手術中は、血管の切断を避けるために細心の注意を払う必要があります。過剰な出血は、乳腺脂肪パッドの除去中に上腕または内乳腺動脈の分裂のために最も一般的に遭遇し、外科分野での視覚化をあいまいにしたり、排泄を通じて死に至る可能性がある。このプロトコルで新たに説明されているのは、リブケージを通して円形欠陥の作成を大幅に急いで簡素化する生検パンチおよび切削工具(補足図1)と、埋め込みを容易にする窓ホルダーツールの利用である。これらの進歩の実施はプロシージャの成功率を著しく改善し、前の外科技能の必要なレベルを減らす。個々の研究所は、社内または商業機械店のいずれかでこれらのツールを製造するために補足図の図面を使用することができます。「マシンショップ入札サイト」のインターネット検索は、地元の商用マシンショップを見つけるのに役立ついくつかのオンラインアプリケーションを生み出します。
最後に、粘着剤塗布前に肺組織が乾燥したままであることを確認することが重要です。失敗したカバースリップの取り付けをもたらす最も一般的な落とし穴はフレームまたはカバーガラスとの付着の前に肺表面からの水分の完全な除去を保障するために失敗である。さらに、品質の画像を確保するために、非常に薄い接着剤(<10 μm)の層を適用する必要があります。余分な接着剤は、カバーガラスの配置前に削り取る必要があります。
WHRILを通したIVIの主な制限は、達成可能な浸透の比較的限られた深さです。したがって、肺の深部で起こる病理はアクセス不能である。この制限にもかかわらず、この技術は、末梢局在性肺転移38、39、40、41に対する記述されたプロクティビティを考えると、特に腫瘍学的調査において、臨床的に関連する情報の豊富さを得ることができる。最終的には、このイメージングアプローチは、生体内イメージングのための標準的なex vivoアッセイおよび他の方法よりもかなりの利点を提供し、重要な生理学的プロセスから組織を切断する10、11、12、13、または長手分析を12時間14、15、16、37、42の最大持続時間に制限する。それぞれ。
この期間に繰り返しイメージングを行う場合、いくつかの課題を克服する必要があります。第1に、埋め込まれた窓の周りの皮膚の健康を維持することが重要であり、ために、傷ついた組織が露出していない間、周囲の皮膚は依然として炎症を起こしたり感染したりする可能性がある。抗生物質軟膏の日常的な適用は、これを防ぐのに役立ちます。第二に、時間とともに、切り取られた皮膚から滲出し、窓枠の下に混雑し、顕微鏡ステージでマウスを固定するために使用される固定板の配置を妨げる。10-15分間WHRILの上に濡れたティッシュを置くことはこの滲出物を柔らかくし、窓枠の配置を可能にする。第三に、余分な水を排出し、恒常性を維持するための身体のメカニズムの1つは、蒸気の呼気によるものである。したがって、あまりにも多くの水分摂取(主に造影剤または腫瘍細胞懸濁液の注入の結果として)は、肺表面がこの余分な水を排泄し、WHRILから肺組織が剥離する原因となる。これは、一度に最大50 μLに注入の量を制限することによって回避することができます。最後に、最善の注意を払っても、マウスが大量の水を摂取したり、マウスが過剰に働いたりするため、肺組織がWHRILから切り離されることがあります。これが起こると、WHRILからの肺組織の剥離は、通常、外縁から始まり、ゆっくりと起こる。したがって、画像処理の最初の日に、ウィンドウの全期間に位置するいくつかの視野に従うことは不可能である可能性があります。最初の数日以内に最良のイメージング結果が得られ、以前に公開された大容量高解像度のイントラバイタルイメージング21 のようなモザイク技術を採用することで、この制限の影響を最小限に抑えることができることがわかりました。
WHRILがマウスの胸壁に組み込まれている場合、イメージング中のドリフトは、窓と顕微鏡の間の取り付けがしっかりしていることを確認するために注意が払われている限り、一般的に重要な問題ではありません。それでも、顕微鏡ステージでマウスの配置直後の時間に、少しのドリフトが観察され得る。これは、マウスの身体の弛緩から、または環境室による顕微鏡部品(ステージプレート、XYステージ、対物レンズ)の熱膨張から来る可能性があります。このドリフトは、イメージング手順を開始する前に、平衡のために〜30分を割り当てることによって回避することができる。この期間は、マウスの生理学が麻酔下で安定し、すべての成分が熱平衡状態に来ることを可能にします。残余ドリフトの少ない量は、StackReg43 や HyperStackReg44などの計算アルゴリズムによって簡単に処理できます。
最後に、このプロトコルは、2つの理由から、以前の書き込みバージョンよりも改善されています。まず、視覚形式は、外科プロトコルのより良い概念化を可能にする。これは、1)肺が圧縮空気の安定した穏やかな流れを適用することによって乾燥する重要なステップのために特に有用である(ステップ3.24、図1J)、2)カバースリップは、気泡の封じ込めを防ぐ方法で窓枠の中央穴に取り付けられ(ステップ3.31)、3)少量の液体シアノアクリル酸を金属ガラスインターフェースに加えて、カバーガラスと窓枠の間に気密シールを確保します(ステップ(ステップ)3.34,図1O)。
結論として、WHRILの出現により、長期間にわたって同じ肺組織の細胞内視覚化に対する無分化性を考えると、研究者は新たに多くの未回答の質問に対処する権限を与えられている。具体的には、本明細書で概説されるプロトコルは、癌転移の進行を含む多数の病理の根底にある動的プロセスの根本的な探索を可能にする。
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Disclosures
著者らは利益相反を明らかにしていない。
Acknowledgments
この作品は、CA216248、CA013330、モンテフィオーレのルースL.キルシュシュタインT32トレーニンググラントCA200561、METAvivorアーリーキャリア賞、グルースリッパーバイオフォトニクスセンターとその統合イメージングプログラム、ジェーンA.とマイレスP.アインシュタイン医科大学の分析イメージング施設(AIF)にイメージングサポートを感謝申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
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