Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.
Abstract
Le metastasi, che rappresentano circa il 90% della mortalità correlata al cancro, comportano la diffusione sistemica delle cellule tumorali dai tumori primari ai siti secondari come l'osso, il cervello e il polmone. Sebbene ampiamente studiati, i dettagli meccanicistici di questo processo rimangono poco compresi. Mentre le modalità di imaging comuni, tra cui la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI), offrono vari gradi di visualizzazione grossolana, ognuna manca della risoluzione temporale e spaziale necessaria per rilevare la dinamica delle singole cellule tumorali. Per risolvere questo problema, sono state descritte numerose tecniche per l'imaging intravitale di siti metastatici comuni. Di questi siti, il polmone si è dimostrato particolarmente difficile da accedere per l'imaging intravitale a causa della sua delicatezza e del suo ruolo critico nel sostenere la vita. Sebbene in precedenza siano stati descritti diversi approcci per l'imaging intravitale a singola cellula del polmone intatto, tutti comportano procedure altamente invasive e terminali, limitando la durata massima possibile dell'imaging a 6-12 ore. Qui è descritta una tecnica migliorata per l'impianto permanente di una finestra ottica toracica minimamente invasiva per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL). In combinazione con un approccio adattato alla microcartografia, l'innovativa finestra ottica facilita l'imaging intravitale seriale del polmone intatto a risoluzione a singola cellula in più sessioni di imaging e per più settimane. Data la durata senza precedenti del tempo in cui i dati di imaging possono essere raccolti, il WHRIL può facilitare la scoperta accelerata dei meccanismi dinamici alla base della progressione metastatica e di numerosi processi biologici aggiuntivi all'interno del polmone.
Introduction
Responsabile di circa il 90% dei decessi, la metasta è la principale causa di mortalità correlata al cancro1. Tra i principali siti di metastasi clinicamente osservate (ossa, fegato, polmone, cervello)2, il polmone si è dimostrato particolarmente impegnativo per l'imaging in vivo tramite microscopia intravitale. Questo perché il polmone è un organo delicato in moto perpetuo. Il movimento continuo dei polmoni, ulteriormente aggravato dal movimento cardiaco intratoracico, rappresenta una barriera sostanziale per l'imaging accurato. Pertanto, a causa della sua relativa inaccessibilità alle modalità per l'imaging ottico intravitale ad alta risoluzione, la crescita del cancro all'interno del polmone è stata spesso considerata un processo occulto3.
In ambito clinico, le tecnologie di imaging come la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI) consentono la visualizzazione in profondità all'interno di organi vitali intatti come il polmone4. Tuttavia, mentre queste modalità forniscono eccellenti viste dell'organo grossolano (spesso anche rivelando la patologia prima dell'insorgenza dei sintomi clinici), sono di risoluzione inadeguata per rilevare le singole cellule tumorali disseminate mentre avanzano attraverso le prime fasi delle metastasi. Di conseguenza, nel momento in cui le modalità di cui sopra forniscono qualsiasi indicazione di metastasi al polmone, i focolai metastatici sono già ben consolidati e proliferanti. Poiché il microambiente tumorale svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro e nella formazione di metastasi5,6,c'è un grande interesse nello studio dei primi passi della semina metastatica in vivo. Questo interesse è ulteriormente alimentato dal maggiore apprezzamento che le cellule tumorali si diffondono anche prima che il tumore primario venga rilevato7,8 e dalla crescente evidenza che sopravvivono come singole cellule e in uno stato dormiente per anni o decenni prima di crescere in macro-metastasi9.
In precedenza, l'imaging del polmone a risoluzione monocellulare ha necessariamente coinvolto preparati ex vivo o di espianto10,11,12,13,limitando le analisi a singoli punti temporali. Mentre questi preparati forniscono informazioni utili, non forniscono alcuna visione della dinamica delle cellule tumorali all'interno dell'organo collegato a un sistema circolatorio intatto.
I recenti progressi tecnologici nell'imaging hanno permesso la visualizzazione intravitale del polmone intatto a risoluzione unicellulare per periodi fino a 12 h14,15,16. Ciò è stato realizzato in un modello murino utilizzando un protocollo che prevedeva la ventilazione meccanica, la resezione della gabbia toracica e l'immobilizzazione polmonare assistita dal vuoto. Tuttavia, nonostante offra le prime immagini a risoluzione cellulare singola del polmone fisiologicamente intatto, la tecnica è altamente invasiva e terminale, precludendo così ulteriori sessioni di imaging oltre la procedura di indice. Questa limitazione, quindi, impedisce la sua applicazione allo studio di passaggi metastatici che richiedono più di 12 ore, come la dormienza e il riavvio dellacrescita 14,15,16. Inoltre, i modelli di comportamento cellulare osservati utilizzando questo approccio di imaging devono essere interpretati con cautela, dato che i differenziali di pressione indotti dal vuoto possono causare deviazioni nel flusso sanguigno.
Per superare queste limitazioni, è stata recentemente sviluppata una finestra minimamente invasiva per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL), che facilita l'imaging seriale per un periodo prolungato di giorni o settimane, senza la necessità di ventilazione meccanica17. La tecnica prevede la creazione di una 'gabbia toracica trasparente' con una cavità toracica sigillata per il mantenimento della normale funzione polmonare. La procedura è ben tollerata, consentendo al mouse di recuperare senza alterazioni significative dell'attività e della funzione di base. Per localizzare in modo affidabile esattamente la stessa regione polmonare in ogni rispettiva sessione di imaging, a questa finestra18è stata applicata una tecnica nota come microcartografia. Attraverso questa finestra, è stato possibile catturare immagini di cellule mentre arrivano al letto vascolare del polmone, attraversano l'endotelio, subiscono la divisione cellulare e crescono in micro-metastasi.
Qui, lo studio presenta una descrizione dettagliata di un protocollo chirurgico migliorato per l'impianto del WHRIL, che semplifica l'intervento chirurgico aumentando contemporaneamente la sua riproducibilità e qualità. Mentre questo protocollo è stato progettato per consentire lo studio dei processi dinamici alla base delle metastasi, la tecnica può essere applicata alternativamente alle indagini di numerosi processi di biologia e patologia polmonare.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, compresa l'approvazione preventiva da parte dell'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivazione delle finestre
- Risciacquare i telai delle finestre ottiche (Figura supplementare 2) con una soluzione all'1% (p/v) di detergente enzimaticamente attivo.
- All'interno di un barattolo di vetro, immergere gli infissi ottici in soluzione di idrossido di sodio al 5% (p/v) per 30 minuti a 70 °C.
- Rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.
- All'interno di un nuovo barattolo di vetro, immergere i telai delle finestre ottiche in soluzione di acido citrico al 7% (p/v) per 10 minuti a 55 °C.
- Ancora una volta, rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.
- Ripetere il passaggio 1.2; quindi, rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.
2. Preparazione per la chirurgia
- Condurre l'intervento chirurgico in un cappuccio o in un armadio a flusso laminare. Per evitare la contaminazione del campo operatorio, garantire aree distinte e separate rispettivamente per la preparazione, l'intervento chirurgico e il recupero.
- Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. Se sono previste procedure successive, risterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore a caldo. Per questa procedura chirurgica, viene utilizzata una tecnica di soli suggerimenti.
- Accendere lo sterilizzatore chirurgico riscaldato per perline e perline.
- Anestetizzare il mouse con il 5% di isoflurano nella camera di anestesia.
- Per rimuovere i peli, applicare generosamente la crema depilatoria sul sito di incisione toracica in alto a sinistra. Dopo non più di 20 s, asciugare saldamente i capelli e la crema depilatoria usando carta velina inumidita. Ripetere se necessario per rimuovere tutti i capelli dal sito chirurgico.
- Usando la sutura di seta 2-0, legare un nodo alla base di un catetere da 22 G, lasciando code lunghe 2 pollici (vedi Figura 1A).
3. Chirurgia della finestra polmonare
- Lavarsi le mani con sapone antisettico.
- Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare nuovi guanti sterili.
- Per prevenire l'essiccazione corneale e danni agli occhi del topo, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
- Diluire 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina in 90 μL di PBS sterile e quindi iniettare per via sottocutanea per garantire l'analgesia preoperatoria.
- Intubare il topo con il catetere 22 G legato alla sutura di seta15. Utilizzando un bulbo di gonfiaggio, confermare il successo dell'intubazione notando l'aumento bilaterale del torace alla compressione del bulbo.
- Fissare il catetere di intubazione legando la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo (vedere Figura 1B).
- Posizionare il mouse sul supporto chirurgico riscaldato e posizionarlo nel decubito laterale destro per esporre il torace sinistro.
- Collegare il ventilatore al catetere di intubazione.
- Garantire una ventilazione controllata e stabile sul ventilatore e quindi abbassare l'isofluorano al 3%. All'inizio della procedura e periodicamente per tutta la durata della procedura, valutare l'adeguatezza dell'anestesia eseguendo un test del pizzico della punta.
- Usando nastro di carta, fissare cranicamente e caudally gli arti anteriori e posteriori, rispettivamente, alla fase chirurgica riscaldata. Posizionare un altro pezzo di nastro lungo la lunghezza della schiena del mouse per massimizzare l'esposizione al campo chirurgico (vedere Figura 1C).
- Aprire tutti gli strumenti chirurgici sotto il cofano per la conservazione della sterilità.
- Sterilizzare il sito chirurgico con una generosa applicazione di antisettico sulla pelle del topo.
- Usando la pinza, sollevare la pelle e fare un'incisione circolare di ~ 10 mm, ~ 7 mm a sinistra dello sterno e ~ 7 mm superiore al margine subcostale (Figura 1D).
- Identificare attentamente eventuali navi principali. Se è necessaria la divisione dei vasi, cauterizzare ad entrambe le estremità con la penna elettrocauterizzata per mantenere l'emostasi.
- Asportare i tessuti molli sovrastanti le costole.
- Elevare la6a o la7a costola usando una pinza. Utilizzando una singola lama delle forbici smussate micro-dissezionanti, il lato arrotondato verso il polmone, perforare con cura il muscolo intercostale tra la6a e la7a costola per entrare nello spazio intratoracico (Figura 1E).
- Scaricare delicatamente il contenitore di aria compressa al difetto per far collassare il polmone e separarlo dalla parete toracica. Sparare l'aria compressa in brevi raffiche per prevenire lesioni polmonari iatrogene.
- Posizionare il punzone della biopsia sull'utensile da taglio (Figura supplementare 1) e manovrare attentamente la base dell'utensile da taglio attraverso l'incisione intercostale (Figura 1F).
- Orientare la base dell'utensile da taglio in modo che sia parallela alla parete toracica. Forare un foro circolare di 5 mm attraverso la gabbia toracica (Figura 1G).
NOTA: Assicurarsi che il tessuto polmonare esposto sia rosa, senza segni di danno. - Utilizzando la sutura di seta 5-0, creare un punto a corda di borsa ~ 1 mm dal foro, circonferenzialmente, intrecciandosi con le costole (Figura 1H).
- Posizionare il telaio della finestra in modo che i bordi del difetto circolare si allineino all'interno della scanalatura della finestra (vedere figura 1I).
- Bloccare saldamente la finestra impiantata legando saldamente la sutura di seta 5-0.
- Caricare 100 μL di adesivo gel cianoacrilato nella siringa da 1 mL.
- Asciugare il polmone applicando un flusso costante e delicato di aria compressa per ~ 10-20 s (Figura 1J).
- Utilizzando una pinza per afferrare il telaio della finestra dal suo bordo esterno, sollevare delicatamente per garantire la separazione del polmone dal sottosuolo del telaio della finestra.
- Erogare un sottile strato di adesivo cianoacrilato lungo il sottosuolo del telaio ottico della finestra (Figura 1K).
- Aumentare la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) sul ventilatore per gonfiare il polmone.
- Tenendo premuto per 10-20 s, applicare una pressione delicata ma decisa per fissare il telaio della finestra ottica sul tessuto polmonare (Figura 1L).
- Erogare una goccia di 5 mm dell'adesivo gel cianoacrilato rimanente su una slitta rettangolare.
- Raccogli il coperchio da 5 mm usando pickup a vuoto. Immergere il sottosuolo del coverslip nell'adesivo, quindi raschiare via l'adesivo in eccesso tre volte contro il lato del coverslip rettangolare, in modo tale che rimanga solo uno strato molto sottile (Figura 1M).
- Posizionare con attenzione il coperchio per adattarlo all'interno della rientranza al centro del telaio della finestra ottica e viene tenuto sopra il tessuto polmonare ad angolo. Bloccare brevemente il ventilatore per generare una pressione positiva, ipergonfiando il polmone. Utilizzando un movimento rotatorio, orientare il coverslip parallelamente al tessuto polmonare per creare un'apposizione diretta tra la superficie del polmone e il sottosuolo del coverslip. Mantenere una pressione delicata, consentendo all'adesivo cianoacrilato di fissarsi (~ 25 s).
- Utilizzare la pinza per separare il coverslip dai pickup sottovuoto (Figura 1N).
- Usando la sutura di seta 5-0, crea di nuovo un punto a corda di borsa, questa volta <1 mm circonferenzialmente dal bordo tagliente dell'incisione cutanea. Infilare la pelle in eccesso sotto il bordo esterno del telaio della finestra prima di legarlo saldamente con nodi di bloccaggio.
- Per garantire una tenuta ermetica tra il coperchio e il telaio della finestra, erogare una piccola quantità di cianoacrilato liquido all'interfaccia metallo-vetro (vedere figura 1O).
- Attaccare un ago sterile a una siringa da insulina da 1 mL. Inserire l'ago sotto il processo xifoideo, avanzando verso la spalla sinistra, entrando nella cavità toracica attraverso il diaframma. Aspirare delicatamente sulla siringa per rimuovere l'aria residua dalla cavità toracica (vedere Figura 1P).
- Rimuovere il nastro dal mouse.
- Disattivare l'isoflurano.
- Continuare la ventilazione con ossigeno al 100% fino a quando il mouse appare pronto a svegliarsi.
- Tagliare con cura la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo ed estubare il mouse.
- Trasferire il mouse in una gabbia pulita e monitorarlo fino a completo recupero. Eutanasia del topo se sono presenti segni di difficoltà respiratorie.
- Fornire analgesia postoperatoria iniettando per via sottocutanea 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina diluita in 90 μL di soluzione tamponata con fosfato sterile (PBS).
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Representative Results
Le fasi della procedura chirurgica descritte in questo protocollo sono riassunte e illustrate nella Figura 1. In breve, prima dell'intervento chirurgico, i topi vengono anestetizzati e i peli sul torace sinistro vengono rimossi. I topi sono intubati e ventilati meccanicamente per consentire la sopravvivenza in caso di violazione della cavità toracica. I tessuti molli sovrastanti le costole vengono asportati e viene creato un piccolo difetto circolare, che copre le costole6 ° e7 °. Il telaio ottico della finestra viene inserito nel difetto e il suo lato inferiore (al di fuori dell'apertura chiara) è aderente al tessuto polmonare. Il telaio della finestra viene quindi fissato con una combinazione di suture e adesivo, risigillando la cavità toracica e consentendo la ripresa della normale respirazione dopo l'estubazione. Una volta impiantato con successo, il polmone aderirà alla finestra ottica (che è incorporata come parte della parete toracica), con gradienti di pressione intratoracica preservati. Ciò consente una comoda sopravvivenza del topo, consentendo l'imaging giornaliero fino alla dose di protocollo (2 settimane). L'imaging intravitale può quindi essere eseguito attraverso la finestra, come precedentemente descritto per altre finestre15,19,20.
Per la visualizzazione di vari tipi di cellule, strutture biologiche o stati funzionali cellulari, la procedura qui presentata può essere eseguita su una vasta gamma di topi che sono stati geneticamente manipolati per esprimere proteine fluorescenti21 o iniettati con coloranti22. La natura permanente della finestra la rende compatibile con tecniche di rilocalizzazione di campi visivi come la fotoconversione23,24 o la microcartografia17,18. La microcartografia è una tecnica di triangolazione basata sull'utilizzo di trasformazioni computerizzate di coordinate di segni fiduciali fissi tra sessioni di imaging al fine di prevedere e ri-localizzare una regione di interesse. Nella finestra creata come descritto sopra, questi segni fiduciali sono leggeri graffi incisi nel telaio della finestra (Figura supplementare 2) che sono facilmente identificabili al microscopio. Ciò consente di trovare lo stesso campo visivo più volte, anche in tessuti altrimenti non contrassegnati. La Figura 2 mostra il risultato di queste tecniche in un topo in cui la vascolarizzazione polmonare è stata etichettata mediante iniezione di un destro ad alto peso molecolare marcato con colorante (tetrametilrodamina 155 kD destrano) e la stessa micro-vascolarizzazione ri-localizzata nell'arco di 3 giorni.
Questo destrano si è rivelato estremamente utile nella valutazione delle aperture vascolari transitorie che vengono indotte durante i periodi di intravaso delle cellule tumorali25,26,27. Infatti, è stato dimostrato che, nei tumori primari della mammella, questo destrano ad alto peso molecolare è altrimenti efficacemente sequestrato alla vascolarizzazione e non fuoriesce nell'interstizio25. Questo è in contrasto con dextrans di peso molecolare inferiore (come 10 kD o 70 kD), che hanno dimostrato di fuoriuscire passivamente dai vasi neoangiogenici28,29. Nel frattempo, la vascolarizzazione polmonare sana è stata osservata per essere più resistente alla perdita, con dextrans >10 kD che fuoriesce all'interstizio solo dopo l'insulto all'organo, come dopo l'esposizione agli esosomi30 o virus31. Esiste anche una varietà di agenti di contrasto per misurare altri parametri nel polmone (ad esempio, marcatori nucleari, indicatori vivi / morti, reporter di stress ossidativo, tracker della velocità del flusso sanguigno) oltre alla permeabilità vascolare. Un'eccellente risorsa che li cataloga può essere trovata nel protocollo di Ueki et al.22.
Il WHRIL è una tecnica che si presta molto bene ad indagare la dinamica del flusso sanguigno nel polmone. Questo può essere realizzato in diversi modi. In primo luogo, quando si riprendono utilizzando frame rate relativamente lenti (~ 1-10 fotogrammi al secondo, fps) le velocità del flusso sanguigno possono essere determinate dalle ombre che gli eritrociti non etichettati producono quando scorrono in vasi più grandi. A bassi fps, queste ombre formano linee il cui angolo rispetto al vaso può essere utilizzato per calcolare le portate degli eritrociti32 (Figura 2, linee gialle). In secondo luogo, le ombre possono anche essere tracciate su microscopi a basso fps allineando i vasi con l'asse di scansione veloce del microscopio e acquisendo kymographs utilizzando la scansione rapida della linea33,34,35. Infine, quando si esegue l'imaging a frame rate elevati (>10 fps) su un microscopio in grado di integrare il segnale nel tempo (ad esempio, un disco rotante confocale dotato di un rilevatore di dispositivo accoppiato alla carica (CCD), le singole particelle possono essere rintracciate direttamente16,17. In questa situazione, gli oggetti stazionari appaiono come punti luminosi e gli oggetti fluenti tracciano tracce attraverso la circolazione. Le velocità delle celle possono essere quantificate misurando la lunghezza delle tracce e dividendo per il tempo di acquisizione del telaio. Un esempio di questo è dato nella Figura 3 e Nel Film supplementare 1, dove microsfere fluorescenti da 2 μm sono state iniettate per via intravascolare nel topo prima dell'imaging.
Con la possibilità di tornare ripetutamente e costantemente allo stesso campo visivo, è ora possibile la visualizzazione di processi che si evolvono in più giorni. A dimostrazione di questa applicazione, il WHRIL è stato utilizzato per visualizzare la progressione metastatica delle cellule del cancro al seno all'interno dei polmoni17,21: cioè, per tracciare nel tempo il destino delle singole cellule tumorali che arrivano alla vascolarizzazione polmonare. Questo concetto è rappresentato nella Figura 4A,dove una singola cellula tumorale disseminata viene visualizzata poco dopo l'alloggio in un segmento di micro-vascolarizzazione polmonare. Tornare in quella stessa posizione nei giorni successivi rivela il destino della cellula tumorale (ad esempio, ricircolo, stravaso, ecc.). Applicato allo studio delle fasi culminanti della progressione metastatica nel polmone, è stato possibile cronometrare visivamente i processi dinamici, tra cui l'arrivo delle cellule tumorali(Figura 4B),lo stravaso(Figura 4C)e la proliferazione per formare macro-metastasi(Figura 4D).
Figura 1: Riepilogo dell'intervento chirurgico per l'impianto della finestra per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La microcartografia consente la rilocalizzazione di posizioni fisse all'interno della finestra ottica. L'imaging intravitale multifotonico di una singola regione del polmone sotto il coverslip otticamente trasparente mostra la microvascolarizzazione trasferita per 3 giorni consecutivi utilizzando la microcartografia. Le frecce gialle indicano un punto di diramazione chiaramente definibile da una singola nave identificata ogni giorno consecutivo. Le linee gialle evidenziano le ombre che gli eritrociti non etichettati producono quando scorrono in vasi più grandi. L'angolo di queste linee rispetto al vaso può essere utilizzato per calcolare le portate degli eritrociti. Rosso = tdTomato marcato cellule endoteliali e 155 kDa Tetrametilrhodamine destro marcato siero del sangue, Verde = cellule tumorali marcate GFP, Blu = seconda generazione armonica. Barra della scala = 15 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione della velocità del flusso sanguigno. Le velocità del flusso sanguigno possono essere visualizzate iniettando microsfere fluorescenti di 2 μm di diametro retro-orbitale e immaginando il loro passaggio attraverso i vasi sanguigni. Quando vengono visualizzate su un microscopio in grado di integrare il segnale nel tempo (ad esempio, un disco rotante confocale dotato di un rilevatore CCD), le microsfere stazionarie appaiono come punti luminosi (frecce) e le sfere che scorrono tracciano tracce attraverso la circolazione (linee tra parentesi). Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Il WHRIL può catturare ogni fase della cascata metastatica all'interno del polmone visualizzando direttamente il destino delle cellule tumorali disseminate. (A) Il monitoraggio del destino delle cellule tumorali disseminate (verde) è realizzabile con l'imaging seriale, per diversi giorni, attraverso il WHRIL. Il giorno 1, si osserva che una cellula tumorale è arrivata e alloggiata nella vascolarizzazione polmonare. Il giorno 2 e il giorno 3 la cellula non è più presente nella vascolarizzazione polmonare, essendo circolata o morta. Barra di scala = 15 μm. (B-D) Visualizzazione di ciascuno degli stadi delle metastasi delle cellule tumorali nel polmone. (B) Una cellula tumorale disseminata intravascolare (verde) depositata nella vascolarizzazione polmonare dopo l'arrivo. (C) Cellula tumorale disseminata (verde) dopo lo stravaso nel parenchima polmonare. (D) Cellule tumorali che sono proliferate e cresciute in micro-metastasi. Rosso = tdTomato marcato cellule endoteliali e 155 kDa Tetrametilrhodamine destro marcato siero del sangue, Verde = cellule tumorali marcate GFP, Blu = seconda generazione armonica. Barra della scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato supplementare 1: Video corrispondente alla Figura 3 che mostra la vascolarizzazione polmonare con microsfere circolanti da 2 μm. Clicca qui per scaricare questo film.
Figura supplementare 1: Disegni di progettazione meccanica per l'utensileda taglio in acciaio inossidabile utilizzato per guidare il punzone da biopsia da 5 mm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Disegni di progettazione meccanica per il telaio della finestra in acciaio inossidabile. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Disegni di progettazione meccanica per lo strumento porta finestra. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Nei siti di metastasi a distanza come il polmone, l'imaging ottico ad alta risoluzione fornisce informazioni sulle elaborate dinamiche delle metastasi delle cellule tumorali. Consentendo la visualizzazione in vivo di singole cellule tumorali e delle loro interazioni con il tessuto ospite, l'imaging intravitale ad alta risoluzione si è dimostrato strumentale alla comprensione dei meccanismi alla base delle metastasi.
Qui è descritto un protocollo chirurgico migliorato per l'impianto toracico permanente di una finestra ottica progettato per consentire l'imaging seriale del polmone murino tramite microscopia multifotonica ad alta risoluzione. La finestra creata utilizzando questo protocollo è ben tollerata e, data la sua capacità di risigillare con successo la cavità toracica, è in grado di mantenere i gradienti di pressione intratoracica necessari per la ventilazione spontanea (contrariamente a qualsiasi altra finestra precedentemente descritta per l'imaging del polmone murino14,15,16,36,37 ). Ciò consente al topo di risvegliarsi dall'anestesia, respirare in modo indipendente e sopravvivere comodamente con la gabbia toracica trasparente per un lungo periodo di tempo che dura più settimane.
Utilizzando questa finestra, è stato possibile visualizzare, con risoluzione a singola cellula, tutte le fasi delle metastasi, tra cui l'arrivo, lo stravaso e la crescita in micrometastasi.
Sebbene il protocollo richieda una certa competenza tecnica, con pratica e attenzione a diversi passaggi chiave, la procedura può essere eseguita con un alto tasso di successo. In primo luogo, quando si rimuovono i capelli prima dell'intervento chirurgico, è fondamentale proteggere la pelle del topo rimuovendo la crema depilatoria con un tessuto inumidito dopo non più di 20 secondi di contatto. Durante l'intervento chirurgico, è necessario prestare estrema cautela per evitare di tagliare i vasi. Il sanguinamento eccessivo, più comunemente riscontrato a causa della divisione delle arterie mammarie brachiali o interne durante la rimozione del cuscinetto di grasso mammario, può oscurare la visualizzazione in campo chirurgico o portare alla morte attraverso il dissanguamento. Recentemente descritto in questo protocollo è l'utilizzo di un punzone e di un utensile da taglio per biopsia (Figura supplementare 1), che accelera e semplifica notevolmente la creazione del difetto circolare attraverso la gabbia toracica e uno strumento porta finestra che facilita l'impianto. L'implementazione di questi progressi migliora significativamente il tasso di successo della procedura e riduce il livello richiesto di abilità chirurgiche precedenti. I singoli laboratori possono utilizzare i disegni nelle figure supplementari per produrre questi strumenti con officine meccaniche interne o commerciali. Una ricerca su Internet per "siti di offerte per officine meccaniche" produrrà diverse applicazioni online che aiuteranno a trovare officine meccaniche commerciali locali.
Infine, è fondamentale assicurarsi che il tessuto polmonare rimanga asciutto prima dell'applicazione dell'adesivo. L'insidia più comune con conseguente attacco di coverslip non riuscito è l'incapacità di garantire la completa rimozione dell'umidità dalla superficie polmonare prima dell'apposizione con il telaio o il vetro di copertura. Inoltre, per garantire immagini di qualità, dovrebbe essere applicato uno strato estremamente sottile di colla (<10 μm). La colla in eccesso deve essere raschiata via prima del posizionamento del vetro di copertura.
Il principale limite dell'IVI attraverso il WHRIL è la profondità di penetrazione relativamente limitata raggiungibile. Pertanto, la patologia che si verifica in profondità all'interno del polmone è inaccessibile. Nonostante questa limitazione, la tecnica può ancora produrre un'abbondanza di informazioni clinicamente rilevanti, specialmente nelle indagini oncologiche, data la propensione descritta per le metastasi polmonari localizzate perifericamente38,39,40,41. In definitiva, questo approccio di imaging offre un notevole vantaggio rispetto ai saggi ex vivo standard e ad altri metodi per l'imaging in vivo, che disconnettono il tessuto dai processi fisiologici vitali10,11, 12,13o limitano l'analisi longitudinale a una durata massima di 12 h14,15,16,37,42, rispettivamente.
Per l'imaging ripetuto in questo periodo di tempo, diverse sfide devono ancora essere superate. In primo luogo, è importante mantenere la salute della pelle intorno alla finestra impiantata, perché, mentre il tessuto ferito non è esposto, la pelle intorno può ancora infiammarsi o infettarsi. L'applicazione di routine di un unguento antibiotico aiuterà a prevenirlo. In secondo luogo, con il tempo, l'essudato dalla pelle tagliata può congelarsi sotto il telaio della finestra e impedire il posizionamento della piastra di fissaggio utilizzata per immobilizzare il mouse nella fase del microscopio. Posizionare un fazzoletto bagnato sopra il WHRIL per 10-15 minuti ammorbidirà questo essudato e consentirà il posizionamento del telaio della finestra. In terzo luogo, uno dei meccanismi del corpo per espellere l'acqua in eccesso e mantenere l'omeostasi è attraverso l'espirazione del vapore. Pertanto, un'assunzione eccessiva di liquidi (principalmente a seguito dell'iniezione di mezzi di contrasto o sospensioni di cellule tumorali) causerà l'espellere della superficie polmonare questa acqua in eccesso e comporterà il distacco del tessuto polmonare dal WHRIL. Questo può essere evitato limitando il volume delle iniezioni a un massimo di 50 μL alla volta. Infine, anche con la massima cura, il tessuto polmonare può occasionalmente staccarsi dal WHRIL a causa dell'ingestione da parte del topo di un grande volume d'acqua o a causa dello sforzo eccessivo del topo. Quando ciò si verifica, il distacco del tessuto polmonare dal WHRIL avviene in genere lentamente, a partire dal bordo esterno. Pertanto, potrebbe essere impossibile seguire alcuni campi visivi situati il primo giorno di imaging per l'intera durata della finestra. È stato riscontrato che i migliori risultati di imaging saranno ottenuti entro i primi giorni e che l'utilizzo di tecniche di mosaico come l'Imaging intravitale ad alta risoluzione ad alto volume precedentemente pubblicato21 può ridurre al minimo l'impatto di questa limitazione.
Dato che il WHRIL è integrato nella parete toracica del mouse, la deriva durante l'imaging non è generalmente un problema significativo, purché si presti attenzione per garantire che l'attacco tra la finestra e il microscopio sia solido. Tuttavia, una piccola quantità di deriva può essere osservata durante il tempo immediatamente successivo al posizionamento del topo nella fase del microscopio. Ciò può derivare dal rilassamento del corpo del topo o dall'espansione termica dei componenti del microscopio (piastra dello stadio, stadio XY, lente dell'obiettivo) a causa della camera ambientale. Questa deriva può essere evitata assegnando ~ 30 minuti per l'equilibrio prima di iniziare la procedura di imaging. Questo periodo di tempo consente alla fisiologia del topo di stabilizzarsi sotto anestesia e consente a tutti i componenti di raggiungere l'equilibrio termico. Qualsiasi piccola quantità di deriva residua può essere facilmente gestita da algoritmi computazionali come StackReg43 o HyperStackReg44.
Infine, questo protocollo è un miglioramento rispetto alla versione scritta precedente per due motivi. In primo luogo, il formato visivo consente una migliore concettualizzazione del protocollo chirurgico. Ciò è particolarmente utile per i passaggi cruciali in cui 1) il polmone viene asciugato applicando un flusso costante e delicato di aria compressa (passaggio 3.24, Figura 1J), 2) il coperchio è fissato al foro centrale del telaio della finestra in modo da impedire l'intrappolamento delle bolle (passaggio 3.31) una piccola quantità di cianoacrilato liquido viene aggiunta all'interfaccia metallo-vetro per garantire una tenuta ermetica tra il vetro di copertura e il telaio della finestra (gradino 3.34, Figura 1O).
In conclusione, con l'avvento del WHRIL, data la sua suscettibilità alla visualizzazione subcellulare dello stesso tessuto polmonare per un periodo prolungato, i ricercatori hanno il potere di affrontare molte domande senza risposta. In particolare, il protocollo qui delineato consente l'esplorazione fondamentale dei processi dinamici alla base di numerose patologie, tra cui la progressione delle metastasi tumorali.
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Disclosures
Gli autori non rivelano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 di Montefiore, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo Integrated Imaging Program, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Vorremmo ringraziare l'Analytical Imaging Facility (AIF) presso l'Einstein College of Medicine per il supporto di imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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