Summary
Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.
Abstract
Principes van DNA-vouwing in de celkern en de dynamische transformaties die optreden tijdens de vervulling van fundamentele genetische functies (transcriptie, replicatie, segregatie, enz.) blijven slecht begrepen, deels als gevolg van het gebrek aan experimentele benaderingen voor hoge resolutie visualisatie van specifieke chromatine loci in structureel bewaard gebleven kernen. Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie van replicerende domeinen in monolaagcelcultuur in situ, door EdU-labeling van nieuw gesynthetiseerd DNA te combineren met daaropvolgende labeldetectie met Ag-amplificatie van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van chromatine. Dit protocol maakt de contrastrijke, zeer efficiënte pre-embedding etikettering mogelijk, compatibel met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van chromatine biedt voor monsterverwerking op kamertemperatuur. Een ander voordeel van pre-embedding labeling is de mogelijkheid om vooraf cellen te selecteren die van belang zijn voor secties. Dit is vooral belangrijk voor de analyse van heterogene celpopulaties, evenals compatibiliteit met elektronentomografiebenaderingen voor hoge-resolutie 3D-analyse van chromatine-organisatie op replicatieplaatsen, en de analyse van postreplicatieve chromatineherschikking en zusterchromatidenscheiding in de interfase.
Introduction
DNA-replicatie is een fundamenteel biologisch proces dat nodig is voor het getrouw kopiëren en overbrengen van de genetische informatie tijdens de celdeling. Bij hogere eukaryoten wordt DNA-replicatie onderworpen aan een strakke spatio-temporele regulatie, die zich manifesteert in sequentiële activering van replicatieoorsprong1. Naburige replicatieoorsprongen die synchroon worden afgevuurd, vormen clusters van repliconen2. Op het niveau van optische microscopie worden plaatsen van voortdurende DNA-replicatie gedetecteerd als replicatiehaarden van verschillende aantallen en groottes. Replicatiehaarden vertonen specifieke patronen van ruimtelijke verdeling binnen de celkern, afhankelijk van de replicatietiming van het gelabelde DNA 3,4, dat op zijn beurt nauw gecorreleerd is met zijn genactiviteit. Dankzij de goed gedefinieerde sequentie van DNA-replicatie, strikt geordend in ruimte en tijd, is replicative labeling een krachtige methode voor nauwkeurige DNA-labeling, niet alleen voor de studie van het replicatieproces op zich, maar ook om een specifieke DNA-subfractie te onderscheiden met gedefinieerde transcriptieactiviteit en verdichtingsniveau. Visualisatie van replicerend chromatine wordt meestal uitgevoerd door de detectie van belangrijke eiwitcomponenten van DNA-replicatiemachines (hetzij door immunostaining of door expressie van fluorescerende eiwittags 5,6) of door de integratie van gemodificeerde DNA-syntheseprecursoren 7,8,9,10 . Hiervan maken alleen methoden op basis van de opname van gemodificeerde nucleotiden in nieuw gerepliceerd DNA het mogelijk om conformationele veranderingen in chromatine tijdens replicatie vast te leggen en het gedrag van replicerende domeinen te traceren nadat hun replicatie is voltooid.
Bij hogere eukaryoten voegt DNA-verpakking in chromatine een ander niveau van complexiteit toe aan de regulatie van genetische basisfuncties (transcriptie, replicatie, reparatie, enz.). Chromatinevouwing beïnvloedt de toegankelijkheid van DNA tot regulerende transfactoren en DNA-conformatieveranderingen (dubbele helixafwikkeling) die nodig zijn voor de sjabloonsynthese. Daarom wordt algemeen aanvaard dat DNA-afhankelijke synthetische processen in de celkern een structurele overgang van chromatine vereisen van zijn gecondenseerde, repressieve toestand naar een meer toegankelijke, open conformatie. Cytologisch worden deze twee chromatinetoestanden gedefinieerd als heterochromatine en euchromatine. Er is echter nog steeds geen consensus over de wijze van DNA-vouwing in de kern. De hypothesen variëren van een "polymeersmelt" model11, waarbij nucleosomale vezel zich gedraagt als een willekeurig polymeer waarvoor de pakkingsdichtheid wordt geregeld door fasescheidingsmechanismen, tot hiërarchische vouwmodellen die sequentiële vorming van chromatinevezelachtige structuren van toenemende diktepostuleren 12,13. Hiërarchische vouwmodellen kregen onlangs steun van moleculaire benaderingen op basis van de analyse van in situ DNA-DNA-contacten (chromosoomconformatievangst, 3C), wat het bestaan van de hiërarchie van chromatine structurele domeinen14 aantoont. Het is belangrijk op te merken dat replicatie-eenheden zeer goed correleren met deze chromatinedomeinen15. De belangrijkste kritiek op deze modellen is gebaseerd op mogelijke kunstmatige chromatineaggregatie veroorzaakt door monstervoorbereidingsprocedures, zoals permeabilisatie van celmembranen en verwijdering van niet-chromatinecomponenten, om het chromatinecontrast voor ultrastructurele studies te verbeteren en tegelijkertijd de toegankelijkheid van chromatine voor verschillende probes (bijv. Antilichamen) te verbeteren. Recente technische vooruitgang in selectieve DNA-kleuring voor elektronenmicroscopie door DNA-bindende fluorofoor-gemedieerde foto-oxidatie van diaminobenzidine (ChromEMT6) heeft de eliminatie van dit obstakel mogelijk gemaakt. Dezelfde overwegingen gelden echter voor elektronenmicroscopievisualisatie van het repliceren van DNA17,18. Hier beschrijven we een techniek die het mogelijk maakt om tegelijkertijd ultrastructurele mapping met hoge resolutie nieuw gesynthetiseerd DNA en totaal chromatine in intacte aldehyde-gekruiste cellen mogelijk te maken. De techniek combineert detectie van EdU-gelabeld DNA door Click-chemie met gebiotinyleerde probes en streptavidin-Nanogold en ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is geoptimaliseerd voor adherente cellen en is getest op HeLa, HT1080 en CHO cellijnen.
1. Celletikettering en fixatie
- Plaatcellen op zuur gereinigde coverslips in een petrischaaltje van 3 cm. Laat de cellen in de media die worden aanbevolen voor de cellijn die wordt gebruikt, groeien tot 70% confluentie.
- Voeg EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) toe van 10 mM voorraad tot 10 μM eindconcentratie en plaats de cellen gedurende 10 minuten of langer in de incubator (afhankelijk van het experimentdoel). Voor kortere pulsen (tot 2 min), bereid een petrischaal met voorverwarmde verse kweekmedia aangevuld met 10 μM EdU, en breng coverslips erin over, in plaats van EdU direct aan de cellen toe te voegen.
OPMERKING: Alle volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur als dit niet anders is aangegeven. - Fixeer de gelabelde cellen met 2,5% glutaaraldehyde, vers gemaakt door 25% bouillon te verdunnen in 100 mM cacodylaatbuffer, gedurende 1 uur.
OPMERKING: De volgende EdU-detectiestappen zijn gevoelig voor fixatietiming. Langere fixatietijden kunnen de EdU-etikettering nadelig beïnvloeden, waardoor de signaal-ruisverhouding lager is. - Verwijder glutaaraldehyde door de monsters daarna te wassen met PBS aangevuld met 5 mM MgCl2 (PBS*). Was drie keer met een incubatietijd van 10 minuten voor elke wasbeurt.
- Plasmameabiliseren met 1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T daarna). Was tweemaal met een incubatietijd van 5 minuten voor elke wasbeurt.
- Was het monster uitgebreid met PBS*. Voer vijf wijzigingen uit en incubeer gedurende 5 minuten in elke wijziging.
- Blus de restvrije aldehydegroepen met 20 mM glycine in PBS*, tweemaal gedurende elk 10 minuten.
- Blokkeer de monsters in 1% BSA in PBS* gedurende 30 minuten.
2. Klikreactie
OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerd protocol19.
- Bereid onmiddellijk voor gebruik een klikreactiemengsel voor EdU-detectie: meng in een microcentrifugebuis 430 μL van 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL van 100 mM CuSO4, 1,2 μL biotine-azide (10 mM in DMSO) en 50 μL van 0,5 M ascorbinezuur. Voor kwaliteitscontrole van de replicatieve etikettering en Click-procedure op het niveau van fluorescerende microscopie kan biotine-azide worden vervangen door AlexaFluor 488-azide.
OPMERKING: De volgorde van toevoeging van componenten in de bovenstaande reactie is belangrijk. - Voer een klikreactie uit in een vochtige kamer om de verdamping en concentratieverschuivingen in de reactiecocktail te minimaliseren. Bereid de vochtige kamer voor door een nat vel filtreerpapier op de bodem van de petrischaal te leggen en deze te bedekken met een paraffinefilm. Plaats de coverslips op het oppervlak van de film met de cellen naar boven gericht en leg 50-100 μL van de reactiecocktail op de coverslip. De reactie duurt 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Stop de reactie door het monster te wassen in 0,1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T), vijf keer gedurende elk 5 minuten.
- Blok 1% BSA in PBS*T gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Bereid streptavidin-Nanogold oplossing met PBS*T met 1% BSA. Incubeer het monster met streptavidin, geconjugeerd met 1,4 nm Nanogold-deeltjes (Nanoprobes) in 1% BSA + PBS*T gedurende de nacht bij +4 °C in de nieuw bereide vochtige kamer.
- Stop de reactie en was het monster in PBS*T, vijf keer gedurende elk 10 minuten.
- Stabiliseer het biotine streptavidin complex door postfixing in 1% glutaaraldehyde in PBS* gedurende 30 min.
- Verwijder glutaaraldehyde door intensief te wassen met gedeïoniseerd water en was het monster in PBS*, vijfmaal gedurende elk 20 minuten.
- Blus vrije aldehydegroepen met vers bereide 1 mg/ml NaBH4 in water, twee keer gedurende elk 10 minuten. Tijdens de incubatie worden bubbels van H2 gevormd die de dekenslips kunnen optillen. Duw ze voorzichtig naar beneden met het pincet.
- Was vijf keer met gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten.
OPMERKING: Voor kwaliteitscontrole bij de etiketteringsstap is het raadzaam om controle-etikettering uit te voeren met fluorescerend gelabelde streptavidin (figuur 2). Dit zou een schatting geven van de labelintensiteit en het achtergrondniveau voordat wordt overgeschakeld naar vervelende en artefact-gevoelige vervolgstappen.
3. Ag-amplificatie
OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd ten opzichte van Gilerovitch et al., 1995 (zie 20,21).
- Resuspend 50 g acaciapoeder in 100 ml gedeïoniseerd water. Los gedurende 3 dagen op, ontgas en filtreer door vier lagen kaasdoek. Bewaren bevroren in 5 ml aliquots in buizen van 50 ml. Ontdooi direct voor gebruik.
- Voeg 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) toe aan 5 ml ontdooide aliquot acaciapoederoplossing om 7 ml van 0,28 M MES (pH = 6,1) in acaciapoederoplossing te maken. Meng door de buis gedurende 30 minuten langzaam te wiegen. Wikkel de tube in met folie ter bescherming tegen licht.
- Gelijktijdig met stap 3.2., waszeilen met wasbuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sucrose), drie keer gedurende 10 minuten elk.
- Bereid de verse oplossing van N-propylgallaat (NPG). Los in een buis van 15 ml 10 mg NPG op in 250 μl 96% ethanol en pas aan tot 5 ml met gedeïoniseerd water.
- Doe 36 mg zilverlactaat in een met folie omwikkelde tube van 15 ml.
- Na stap 3.2. is voltooid, voeg 1,5 ml NPG-oplossing toe aan acaciapoedermengsel en rock nog eens 3 minuten.
OPMERKING: Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een donkere kamer. Gebruik niet-actinisch safelight (geel of rood). - Breng het monster in evenwicht met de wasbuffer en ga naar de donkere kamer. Voeg tegelijkertijd 5 ml gedeïoniseerd water toe aan zilverlactaat en los op door krachtig schudden gedurende 1-2 minuten.
- Voeg 1,5 ml zilverlactaatoplossing toe aan acaciapoedermengsel, laat langzaam 1 minuut schommelen. Vermijd bubbelvorming, omdat zuurstof in het mengsel de reactie zal vertragen.
- Giet de oplossing uit de schaal met coverslips en giet 3 ml zilverlactaat-acaciapoedermengsel op de cellen. Rock het gerecht meerdere keren en incubeer gedurende 2-5 minuten. De incubatietijd is afhankelijk van de acaciapoederbatch en de temperatuur. Dit moet experimenteel worden gedefinieerd.
OPMERKING: Een langere incubatietijd kan resulteren in niet-specifieke zilverbinding. - Om de reactie te stoppen, giet u het reactiemengsel af en wast u het gerecht uitgebreid met drie tot vijf verversing van gedeïoniseerd water, gevolgd door nog drie veranderingen gedurende elk 5 minuten.
- Controleer de kleuring onder de brightfield microscoop. Goede vlekken moeten licht tot donkerbruin zijn met een zeer zwakke gelige achtergrond.
OPMERKING: Als de kleuring zich niet ontwikkelt, is het mogelijk om onmiddellijk te herhalen met de reeds gemaakte mix (de mix is ongeveer 15 minuten actief als deze in het donker wordt bewaard). De vlekken kunnen zich in dit geval echter te snel ontwikkelen.
4. Goud toning
OPMERKING: Om zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door OsO4-oxidatie in de daaropvolgende procedures, wordt bij deze stap een impregnatie met goud gebruikt (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Spoel coverslips af met gedeïoniseerd water.
- Om zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door OsO4-oxidatie , incubeer de monsters in 0,05% tetrachloorzuur gedurende 2 minuten in het donker.
- Was grondig met gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.
OPMERKING: In dit stadium wordt extra contrast toegevoegd aan het DNA-bevattende materiaal. De kleur van het monster moet veranderen van bruin naar zwart.
5. ChromEM
OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van Ou et al., 201716.
- Incubeer de coverslips en verzadig de monsters in 10 μM DRAQ5 in PBS gedurende 10 minuten in het donker.
- Bereid 0,2% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) oplossing in 50 mM Tris of PBS:
los DAB op in 90% van het uiteindelijke volume door krachtig te roeren in het donker en pas vervolgens de pH aan op 7,0-7,4 met NaOH. Stel het volume in op 100% en filter door een filter van 0,22 μM, bewaar gewikkeld in folie. - Voeg DAB-oplossing toe aan cellen (2 ml per petrischaaltje van 3 cm) en incubeer gedurende 1 minuut.
- Verplaats de dekselslip in de petrischaal met glazen bodem en plaats deze op het podium van een omgekeerde microscoop. Bestraal het monster (verschillende gezichtsvelden) op een omgekeerde microscoop met metaalhalogenide lichtbron en Cy5 filterset (640 nm, 1 W/cm2 bij het brandpuntsvlak) door plan Apo λ 40х (NA = 0,95) lens gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Een indicatie van succesvolle DAB-fotoconversie is volledige DRAQ5-fotobleaching en donkere DAB-neerslagvorming in bestraalde kernen. Dit laatste is echter niet altijd duidelijk over een intens EdU-zilver-goudsignaal (vooral wanneer uitgebreide EdU-pulsen worden gebruikt). - Was drie keer met gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten.
6. Uitdroging en inbedding van epoxyhars
- Bereid in een microcentrifugebuis gedeeltelijk gereduceerde osmiumtetraoxideoplossing door 2% waterige oplossing van K4Fe(CN)6 te mengen met een gelijke hoeveelheid van 2% waterige oplossing van OsO4, om 1% eindconcentratie van beide componenten te verkrijgen. Incubeer coverslips in gereduceerd OsO4 gedurende 1 uur en was drie keer in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten elk.
OPMERKING: In dit stadium reageert de gereduceerde osmiumverbinding met DAB-afzettingen en verhoogt het contrast van DNA.
LET OP: Osmium is giftig, werkt onder een zuurkast en verwerkt afval volgens de lokale veiligheidsvoorschriften. - Droog de monsters uit in een reeks gegradeerde ethanoloplossingen in toenemende percentages: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Gebruik voor infiltratie en inbedding de harsformule met de componentvolumetrische verhouding als volgt: epoxyharsmonomeer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Deze formule is mengbaar met ethanol.
- Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (3 delen 100% EtOH:1 deel epoxyhars) gedurende 30 min.
- Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (1 deel 100% EtOH:1 deel epoxyhars) gedurende 2 uur.
- Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (1 deel 100% EtOH:3 delen epoxyhars) 's nachts.
- Vervang ethanol-harsmengsel door vers bereide pure hars. Incubeer in pure harsmix gedurende 8 uur. Open de schaal om resten ethanol te laten verdampen.
- Breng coverslips over in een nieuwe schaal met pure hars en incubeer gedurende 2 uur bij 37-42 °C.
- Vul een siliconen mal met vers bereide hars. Plaats de coverslips met de cellen naar beneden gericht op de juiste siliconen mal gevuld met epoxyhars. Laat de hars 24 uur uitharden bij 37 °C en daarna minstens 2 dagen bij 60 °C.
LET OP: Componenten van epoxyharsmengsel zijn potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen en werk onder de zuurkast.
- Verwijder de harsplaat uit de mal, reinig het oppervlak van de coverslip met het scalpel of scheermesje. Om de coverslip te verwijderen, laat u de coverslip in vloeibare stikstof vallen en brengt u de plaat vervolgens over in het kokende water. Herhaal indien nodig.
- Lokaliseer het bestraalde gebied onder een stereomicroscoop en knip het uit de plaat met een ijzerzaag of een ander geschikt instrument. Verwarm de plaat zo nodig voor op 70 °C op een hete plaat.
- Bevestig de uitsparing in een ultramicrotome monsterhouder voor het laatste bijsnijden van blokken. Bereid met het scheermes het piramidevormige monster voor. Monteer de houder met piramide op de ultramicrotoom en installeer het mes.
- Snijd het blok bij zodat de bestraalde cellen met het EdU-label worden meegeleverd. Bereid een halfdunne sectie (250 nm dikte) voor die geschikt is voor elektronentomografie.
OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden aangepast aan de experimentele vereisten.
- Snijd het blok bij zodat de bestraalde cellen met het EdU-label worden meegeleverd. Bereid een halfdunne sectie (250 nm dikte) voor die geschikt is voor elektronentomografie.
- Maak het gedeelte los van de rand van het mes en plaats ze op de roosters met één sleuf. Voor elektronentomografie worden 250 nm-secties op 1 mm enkelsluimerroosters geplukt en na het drogen kunnen deze secties van beide zijden koolstofcoating krijgen. Er is geen extra contrastering nodig.
OPMERKING: Aangezien de secties al Au-Ag-deeltjes met een hoog contrast bevatten, is het niet nodig om fiduciale gouddeeltjes aan het oppervlak van de sectie toe te voegen. - Onderzoek de rasters in een transmissie-elektronenmicroscoop bij lage vergroting (ongeveer 600x) om de cellen met de juiste replicatiepatronen te lokaliseren.
OPMERKING: Dit protocol genereert een labeldichtheid die hoog genoeg is voor eenvoudige detectie van replicatiehaarden, zelfs bij lage vergroting. Het is raadzaam om eerst een kaart van de sectie te maken voor latere navigatie en hoekprojecties voor tomografie. Schakel over naar een hogere vergroting en maak afbeeldingen met een hoge resolutie.
7. Elektronentomografie
- Plaats het rooster in de transmissie-elektronenmicroscoop met een high-tilt houder. Laad het monster in de elektronenmicroscoop en lokaliseer het interessegebied.
- Lijn de microscoop uit in EFTEM-modus in bijna parallelle verlichtingsmodus. Stem het energiefilter af met een energieselectie van 20 eV die op een nulverliespiek is geplaatst.
- Bestraal het tomografische acquisitiegebied vooraf met een dosissnelheid van 40 e/Å2/s gedurende ten minste 1,5-2 min, wat overeenkomt met de totale dosis van ten minste 3000 e/Å2.
- Pas de eucentrische hoogte aan met automatische taak in SerialEM. Controleer de autofocustaak om er zeker van te zijn dat deze correct werkt bij nul kantelhoek en -0,8 mkm doelonscherpte.
- Kantel de monsterhouder naar -60° met de Walk-Up taak.
- Stel de tomografie-acquisitie in van -60 tot +60° met stap 2,0°. De belichting moet afhankelijk van de kantelhoek worden ingesteld om de gemiddelde intensiteit op de camera te behouden. Beperk de beeldverschuiving in het geval dat het een energieverschuiving veroorzaakt en dus een verkeerde uitlijning van de spleet veroorzaakt. De tomografiegegevens moeten worden opgeslagen als .mrc-bestand.
- Importeer het .mrc-bestand in IMOD-software voor tomografiereconstructie. Verwijder de uitschieter pixelwaarden als gevolg van röntgenstralen.
- Lijn de kantelreeks uit. Voer de eerste kruiscorrelatie uit en markeer vervolgens handmatig 10-12 gouddeeltjes als fiducials. Volg het fiduciale model en inspecteer of elke fiducial correct wordt gevolgd door de kantelserie. Maak voorbeeldtomogrammen (segmenten) en markeer handmatig de dunne sectieranden om te voorkomen dat de gereconstrueerde dichtheid in het volume kan kantelen. De gemiddelde restfout voor fijne uitlijning was minder dan 1,2 pix.
- Reconstrueer het tomogram met een gefilterd backprojectiealgoritme en snijd vervolgens de uitvoer bij zodat deze in het uiteindelijke volume past.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replicatiehaarden in celkernen van zoogdieren vertonen verschillende distributiepatronen binnen de kern, afhankelijk van de progressie in de S-fase. Deze patronen correleren met transcriptionele activiteit van de loci die wordt gerepliceerd. Aangezien de hier gepresenteerde methode gebruik maakt van een vrij sterkefixatieprocedure, is het vrij eenvoudig om replicatieve pulsetikettering te gebruiken voor specifieke detectie van chromatine loci in verschillende transcriptionele toestanden, zelfs onder omstandigheden die de beste structurele conservering van chromatine bieden, verkregen door chemische fixatie bij kamertemperatuur.
Stappen voor kwaliteitscontrole zijn bedoeld om een succesvolle afronding van de belangrijkste procedures in dit protocol te garanderen. In eerste instantie moet succesvolle EdU-etikettering worden bevestigd door Click-reaction met fluorescerend gelabeld azide, wat typische replicatiepatronen aantoont als heterogene celpopulatie wordt gebruikt (figuur 2). De tweede belangrijke stap is streptavidin-etikettering, die sterk kan worden beïnvloed door glutaaraldehydefixatie. Gebruik voor de evaluatie van streptavidinbindingsefficiëntie AlexaFluor-488-geconjugeerde streptavidin onder dezelfde omstandigheden als streptavidin-Nanogold (figuur 3). Op dit punt wordt enige achtergrond verwacht, voornamelijk als gevolg van glutaraldehyde-autofluorescentie en onvolledige streptavidin-wash-out. Als de signaal-ruisverhouding onaanvaardbaar is, probeer dan het aantal en de duur van de wasstappen te verhogen bij stap 2.6. U kunt ook glutaaraldehyde doven met NaBH4 (stappen 2.9-2.10) toevoegen na stap 1.5.
De zilververbeteringsprocedure levert vaak inconsistente resultaten op en vereist optimalisatie. Ten eerste varieert de reactiesnelheid dramatisch, afhankelijk van de acaciapoederoplossingspartij. De viscositeit van de oplossing is omgekeerd evenredig met de tijd van de ontwikkeling van de zilverkleuring. Het is een goed idee om meerdere aliquots van dezelfde batch te hebben en deze op de controlemonsters te testen om de optimale reactietiming te bepalen. Omdat de temperatuur van de reagentia en de omgeving ook een aanzienlijke invloed heeft op de reactiesnelheid, probeer de reactie bij exact dezelfde temperatuur uit te voeren. Als u meer dan drie monsters tegelijkertijd verwerkt, is het handig om de reactie met intervallen van 30 seconden te starten om voldoende tijd te hebben voor wasstappen.
Een goed resultaat van de zilververbeteringsprocedure is de donkerbruine kleuring van sommige (niet alle) kernen met zeer zwakke gelige cytoplasmatische kleuring (figuur 4). Dit betekent dat de gemiddelde grootte van zilverdeeltjes ongeveer 20 nm is, wat geschikt is voor eenvoudige labeldetectie in een breed vergrotingsbereik van TEM over de chromatinetellers. Voor tomografie-experimenten moet de grootte van de deeltjes worden teruggebracht tot ongeveer 10 nm door de reactietijd te verkorten. De kleur moet in dit geval lichtbruin of roodachtig zijn. De kleur van zilverkleuring moet worden gecontroleerd voordat goudtontinaak wordt gegeven.
DAB-fotoconversie en osmificatie wordt uitgevoerd na goudtoning om zilveren schelpen te beschermen tegen ontbinding. Bij onvoldoende goudimpregnatie raken zilveren nanodeeltjes geërodeerd en krijgen ze een onregelmatige vorm, maar blijven ze nog steeds zichtbaar onder TEM. De kwaliteit van DAB-fotoconversie wordt eerst bewaakt door DRAQ5-bleken (in fluorescentiemodus), vervolgens in een brightfield-modus, wanneer de celkernen in een bestraald veld donkerbruin worden (figuur 5). Dab-kleuringsintensiteit mag niet erg hoog zijn, zodat Ag-Au-kleuring goed gedetecteerd blijft om de selectie van de cellen met de vereiste replicatietiming voor sectie mogelijk te maken.
Ultradunne of halfdunne secties vereisen geen extra beitsing en kunnen direct onder TEM worden bekeken. De juiste etikettering resulteert meestal in goed gedefinieerde clusters van Ag-nanodeeltjes die replicatieplaatsen afbakenen (figuur 6), terwijl achtergrondetikettering beperkt is tot enkele nanodeeltjes per vierkante micrometer. Halfdunne secties zijn klaar voor tomografie en vereisen geen toevoeging van gouden nanodeeltjes aan het sectieoppervlak, omdat Ag-nanodeeltjes die in een sectie aanwezig zijn, kunnen worden gebruikt als fiduciële tekens (figuur 7). In deze figuur wordt het effect van verlengde labelingtijd getoond: individuele replicatiehaarden fuseren tot vezelachtige structuren, waardoor chromatinedomeinen van hogere orde worden afgebakend.
Figuur 1. Het methode overzicht. Cellen gekweekt op coverslips worden gelabeld met EdU, gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde, gepermeabiliseerd en Click-reactie wordt uitgevoerd met gebiotinyleerd azide. Als alternatief worden fluorescerend gelabelde aziden gebruikt bij microscopische observatie van licht. Locaties van biotine-opname zijn gelabeld met Nanogold-streptavidin (of fluorescerend gelabeld streptavidin als controle), zilver verbeterd en na goudtonning onderworpen aan DRAQ5-gemedieerde DAB-fotoconversie en osmificatie. De monsters zijn ingebed in epoxyhars, gesneden, onderzocht in TEM en onderworpen aan elektronentomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Replicatiepatronen in zoogdiercellen onthuld door EdU-labeling en Click-reaction (groen). S-fase progressie van vroege naar late S-fase (van links naar rechts) manifesteert zich door een ordelijke verandering in replicatiepatronen: A,B - vroege S-fase, C - midden S-fase, D,E - late S-fase. DNA is gekleurd met DAPI (rood). Schaalbalk = 10 um. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Replicatiepatronen in zoogdiercellen onthuld door EdU-etikettering en tweestaps Click-biotine en streptavidin-AlexaFluor 488-kleuring na glutaaraldehydefixatie. Controlemonster gelabeld met streptavidin-AlexaFluor 488 geeft optimale etiketteringsefficiëntie en S / N-verhouding weer na glutaaraldehydefixatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatief beeld van cellen na zilververbeteringsprocedure (stap 3). Verschillende replicatieve patronen (vroege S-fase, pijlen; midden S-fase, pijlpunt; late, dubbele pijlen) zijn gemakkelijk zichtbaar in een brightfield light microscopiemodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Een typisch resultaat van DRAQ5-gemedieerde DAB-fotoconversie. (A) DRAQ5-kleuring (onderbroken cirkel geeft bestraald gebied aan). Let op sterke DRAQ5-bleeking in de cirkel. (B) Hetzelfde gebied gezien in brightfield lichtmicroscoop. Let op sterkere DAB-neerslag in de kernen in bestraald gebied. Inzet: pijlen geven vroege S-fase kernen aan waar replicatiepatronen gelabeld met Ag-Au nog steeds gemakkelijk detecteerbaar zijn op de achtergrond van DRAQ5-foto-oxidazed DAB-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Replicatie foci in zoogdiercelkernen onthuld door EdU-etikettering en tweestaps Click-biotine en streptavidin-Nanogold-kleuring na glutaaraldehydefixatie. Dunne 90 nm-secties van een S-fasecel met clusters van Ag-Au-nanodeeltjes bij replicatiehaarden (A, rode cirkels). Het achtergrondniveau kan worden gewaardeerd in een niet-S-fase cel (B). Pijlpunten geven chromatinevezels van verschillende toonladders aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. 0°-tilt projectie van 250 nm doorsnede. (A) en virtuele tomografische sectie. (B) van een celkern gelabeld met EdU gedurende 2 uur. Zie individuele replicatiehaarden versmolten tot vezelachtige structuren (pijlpunten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen. Ten eerste elimineert het gebruik van Click-chemie voor het labelen van gerepliceerd DNA de noodzaak van DNA-denaturatievoorwaarde voor BrdU-detectie met antilichamen, waardoor chromatine ultrastructuur beter behouden blijft.
Ten tweede minimaliseert het gebruik van biotine als secundair ligand dat wordt gegenereerd na glutaaraldehydefixatie en het correct blussen van ongebonden aldehydegroepen de chemische modificatie van het doelwit, waardoor de etiketteringsefficiëntie wordt verbeterd en de achtergrond als gevolg van endogene biotine wordt verminderd. Biotine-streptavidin voegt ook veelzijdigheid toe omdat het gebruik van fluorescerend gelabelde streptavidin eenvoudige kwaliteitscontrole biedt in het zeer vroege stadium van de procedure. Het protocol kan verder worden vereenvoudigd door de introductie van FluoroNanogold-gelabelde streptavidin, maar in onze handen gaven deze reagentia een iets hogere achtergrond in vergelijking met Nanogold-streptavidin, misschien vanwege de grotere omvang van de sondes.
Ten derde zorgt een combinatie van kleine sondes, streptavidin-Nanogold is de grootste component van ongeveer 5 nm, voor een zeer goede penetratie in zelfs glutaaraldehyde-gekruiste cellen. Dit maakt de techniek geschikt voor het vooraf inbedden van labeling van optimaal ultrastructureel geconserveerde cellen en gemakkelijk compatibel met verschillende 3D-elektronenmicroscopietechnieken, waaronder seriële sectiereconstructie, arraytomografie, elektronentomografie, seriële blokgezichtsbeeldvorming en FIB-SEM.
Zilververbetering is de meest kritieke stap en vereist nauwkeurige controle van reagensdiffusie en wasstappen, die gemakkelijker uit te voeren is met hechtende cellen. Aan de andere kant, aangezien sterke crosslinking met glutaaraldehyde ook de zilververbetering kan beïnvloeden, moeten de fixatieomstandigheden worden verfijnd om het behoud van de chromatinestructuur en de efficiëntie van zilververbetering in evenwicht te brengen. Om deze reden zijn cryofixatie-/cryosubstitutietechnieken, die uitgebreide en slecht gecontroleerde postfixatie vereisen, hoewel ze een nog betere structuurconservering mogelijk maken, mogelijk niet volledig compatibel met de voorgestelde etiketteringsstrategie23. De techniek kan verder worden verbeterd door Au-amplification te gebruiken in plaats van zilververbetering24. Deze wijziging maakt het mogelijk om de gouden toningstap over te slaan, maar in onze handen geeft het een aanzienlijk hogere achtergrond.
Ten slotte maakt pre-embedding labeling voorselectie van doelcellen voor ChromEM en sectioning mogelijk op basis van het replicatiepatroon dat detecteerbaar is onder brightfield of fluorescerende microscoop. Bovendien kan de methode eenvoudig worden uitgebreid naar CLEM, inclusief verschillende superresolutietechnieken. Dit opent nieuwe horizonten in studies van chromatine hogere orde structuur en dynamica in verschillende fysiologische toestanden. De benadering die we hier hebben beschreven, kan worden gebruikt voor studies van chromatine-organisatie op replicatielocaties, voor analyse van postreplicatieve herschikking van chromatine, inclusief hoge-resolutie beeldvorming van chromatide segregatie in interfase, en voor replicerende labeling van grote chromosomale domeinen en studies van hogere orde chromatinevouwing van specifieke fracties van het genoom (euchromatine of heterochromatine, gelabeld op basis van replicatietiming). Dit soort beeldvormingstechnieken zijn ook belangrijk als referentiepunt voor de gegevens die door alternatieve benaderingen worden gegenereerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door RSF (subsidie #17-15-01290) en RFBR (subsidie #19-015-00273). De auteurs bedanken lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) en Nikon Center of Excellence in correlative imaging aan het Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology voor toegang tot beeldvormingsinstrumenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
