Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.
Abstract
עקרונות קיפול DNA בגרעין התא והשינויים הדינמיים שלו המתרחשים במהלך מילוי פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, הפרדה וכו ') נשארים מובנים היטב, בין היתר בשל היעדר גישות ניסיוניות להדמיה ברזולוציה גבוהה של לוצי כרומטין ספציפי בגרעינים שהשתמרו מבנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של תחומים משוכפלים בתרבית תאים מונולאיים במקום, על ידי שילוב תיוג EdU של DNA מסונתז חדש עם זיהוי תווית עוקב עם Ag-הגברה של חלקיקי ננוגולד וכרום הכתמת כרומטין. פרוטוקול זה מאפשר תיוג טרום הטמעה בעל ניגודיות גבוהה ויעילות גבוהה, התואם לקיבעון גלוטרדהיד מסורתי המספק את השימור המבני הטוב ביותר של כרומטין לעיבוד מדגם בטמפרטורת החדר. יתרון נוסף של תיוג טרום הטבעה הוא האפשרות לבחור מראש תאים מעניינים עבור חלוקה. זה חשוב במיוחד לניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגניים, כמו גם תאימות עם גישות טומוגרפיה אלקטרונים לניתוח תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של ארגון כרומטין באתרי שכפול, וניתוח של ארגון כרומטין לאחר שכפול, וניתוח של ארגון מחדש של כרומטין לאחר שכפול והפרדה כרומטית אחות באינטרפאזה.
Introduction
שכפול DNA הוא תהליך ביולוגי בסיסי הנדרש להעתקה והעברה נאמנה של המידע הגנטי במהלך חלוקת התאים. באוקריוטים גבוהים יותר, שכפול DNA כפוף לרגולציה מרחבית-זמנית הדוקה, המתבטאת בהפעלה רציפה של מקורותהשכפול 1. מקורות שכפול שכנים ירי באופן סינכרוני טופס אשכולות של replicons2. ברמה של מיקרוסקופיה אופטית, אתרים של שכפול DNA מתמשך מזוהים כמו מוקדי שכפול של מספר וגודל שונים. מוקדי שכפול מציגים דפוסים ספציפיים של התפלגות מרחבית בתוך גרעין התא בהתאם לתזמון השכפול של ה- DNAהמסומן בתווית 3,4, אשר, בתורו, מתואם היטב עם פעילות הגנים שלו. הודות לרצף מוגדר היטב של שכפול DNA, מסודר בקפדנות בחלל ובזמן, תיוג שכפול היא שיטה רבת עוצמה של תיוג DNA מדויק לא רק לחקר תהליך השכפול כשלעצמו, אלא גם להפלות תת-שבר DNA ספציפי עם פעילות שעתוק מוגדרת ורמת דחיסה. הדמיה של שכפול כרומטין מבוצעת בדרך כלל באמצעות זיהוי רכיבי חלבון עיקריים של מכונות שכפול DNA (או על ידי חיסון או על ידי ביטוי של תגי חלבון פלואורסצנטיים 5,6) או על ידי שילוב של מבשרי סינתזת DNA שונה 7,8,9,10 . מתוכם, רק שיטות המבוססות על שילוב של נוקלאוטידים שהשתנו בדנ"א ששוכפל לאחרונה מאפשרות לכידת שינויים קונפורמציה בכרומטין במהלך השכפול, ומעקב אחר אופן הפעולה של תחומים משוכפלים לאחר השלמת השכפול שלהם.
באאוקריוטים גבוהים יותר, אריזות DNA לכרומטין מוסיפות רמה נוספת של מורכבות לוויסות פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, פיצוי וכו '). קיפול הכרומטין משפיע על נגישות הדנ"א לטרנס-גורמים רגולטוריים ושינויים קונפורמיים בדנ"א (התרופפות סליל כפול) הנדרשים לסינתזת התבנית. לכן, מקובל כי תהליכים סינתטיים תלויי DNA בגרעין התא דורשים מעבר מבני של כרומטין ממצבו המרוכז והדכאני לקונפורמציה נגישה ופתוחה יותר. מבחינה ציטולוגית, שני מצבים כרומטין אלה מוגדרים כהטרוכרומטין ואאוכרומטין. עם זאת, עדיין אין קונצנזוס לגבי אופן קיפול ה- DNA בגרעין. ההשערות נעות בין "פולימר נמס" מודל11, שבו סיבים נוקלאוזומיים מתנהגים כפולימר אקראי שעבורו צפיפות האריזה נשלטת על ידי מנגנוני הפרדת פאזה, למודלים מתקפלים היררכיים המניחים היווצרות רציפה של מבנים דמויי סיבי כרומטין של עובי הולך וגדל12,13. מודלים קיפול היררכיים זכו לאחרונה לתמיכה בגישות מולקולריות המבוססות על ניתוח מגעי DNA-DNA-DNA (לכידת קונפורמציה כרומוזומית, 3C), הממחישים את קיומה של ההיררכיה של תחומים מבניים כרומטין14. חשוב לציין כי יחידות שכפול לתאם היטב לתחומים כרומטין אלה15. הביקורת העיקרית על מודלים אלה מבוססת על צבירת כרומטין מלאכותית פוטנציאלית הנגרמת על ידי הליכי הכנת מדגם, כגון permeabilization של קרום התא והסרת רכיבים שאינם כרומטין, על מנת לשפר את ניגודיות הכרומטין למחקרים אולטרה מובנים תוך שיפור נגישות הכרומטין לבדיקות שונות (למשל, נוגדנים). ההתקדמות הטכנית האחרונה בהכתמת DNA סלקטיבית למיקרוסקופיה אלקטרונית על ידי חמצון צילום בתיווך פלואורופור מחייב DNA של דיאמינובנזידין (ChromEMT6) אפשרה את חיסול המכשול הזה. עם זאת, אותם שיקולים נכונים להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים של שכפול DNA 17,18. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת מיפוי אולטרה-מבני ברזולוציה גבוהה בו זמנית של דנ"א מסונתז חדש וכרום מוחלט בתאים שלמים המחוברים לאלדהיד. הטכניקה משלבת זיהוי של DNA שכותרתו EdU על ידי קליק-כימיה עם בדיקות biotinylated וסטרפטאבידין-Nanogold, ו ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול מותאם לתאים דבקים ונבדק בשורות התאים HeLa, HT1080 ו- CHO.
1. תיוג וקיבעון תאים
- תאי צלחת על כיסויים ניקוי חומצה בצלחת פטרי 3 ס"מ. הגדל את התאים במדיה המומלצים עבור קו התא המשמש למפגש של 70%.
- הוסף EdU (5-אתניל-2'-deoxyuridine) ממלאי 10 mM לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ומניחים את התאים באינקובטור למשך 10 דקות או יותר (בהתאם למטרת הניסוי). לפולסים קצרים יותר (עד 2 דקות), הכינו צלחת פטרי עם מדיה תרבותית טרייה שחוממה מראש בתוספת 10 מיקרומטר EdU, והעבירו בה כיסויים, במקום להוסיף EdU לתאים ישירות.
הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר אם לא צוין אחרת. - תקן את התאים המסומנים עם 2.5% glutaraldehyde, טרי עשה על ידי דילול 25% מלאי במאגר 100 mM cacodylate, במשך 1 שעה.
הערה: שלבי הזיהוי הבאים של EdU רגישים לתזמון הקיבעון. זמני קיבוע ארוכים יותר עלולים להשפיע לרעה על תיוג EdU ולגרום ליחס אות לרעש נמוך יותר. - הסר glutaraldehyde על ידי שטיפת הדגימות עם PBS בתוספת 5 מ"מ MgCl2 (PBS* לאחר מכן). לשטוף שלוש פעמים עם דגירה של 10 דקות לכל שטיפה.
- חלחלו קרומי פלזמה עם 1% טריטון X-100 ב-PBS* (PBS*T לאחר מכן). לשטוף פעמיים עם דגירה של 5 דקות לכל שטיפה.
- יש לשטוף את הדגימה בהרחבה באמצעות PBS*. בצע חמישה שינויים ודגר במשך 5 דקות בכל שינוי.
- להרוות את קבוצות אלדהיד ללא שיורית עם 20 מ"מ גליצין ב PBS *, פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
- חסום את הדגימות ב- 1% BSA ב- PBS * למשך 30 דקות.
2. תגובת קליקים
הערה: הליך זה משתנה מפרוטוקול19 שפורסם בעבר.
- מיד לפני השימוש, להכין תערובת תגובה קליק לזיהוי EdU: בצינור microcentrifuge, לערבב 430 μL של 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL של 100 mM CuSO4, 1.2 μL של ביוטין-אזיד (10 מ"מ ב- DMSO), ו 50 μL של 0.5 M חומצה אסקורבית. עבור בקרת איכות של תיוג replicative והליך קליק ברמה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ביוטין-אזיד יכול להיות מוחלף על ידי AlexaFluor 488-azide.
הערה: סדר הוספת הרכיבים בתגובה לעיל חשוב. - בצע קליק-תגובה בתא לח כדי למזער את שינויי האידוי והריכוז בקוקטייל התגובה. מכינים את התא הלח על ידי הנחת גיליון רטוב של נייר סינון בתחתית צלחת פטרי ומכסה אותו בסרט פרפין. מניחים את כיסויי הכיסוי על פני השטח של הסרט עם התאים פונים כלפי מעלה ושכבה 50-100 μL של קוקטייל התגובה על כיסוי. התגובה אורכת 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הפסיקו את התגובה על ידי שטיפת הדגימה ב-0.1% טריטון X-100 ב-PBS* (PBS*T), חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- לחסום ב 1% BSA ב PBS * T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכן פתרון סטרפטאבידין-ננוגולד עם PBS*T המכיל 1% BSA. לדגור על המדגם עם streptavidin, מצומד עם 1.4 ננומטר חלקיקי Nanogold (גשושי ננו) ב 1% BSA + PBS * T לילה ב +4 °C (4 °F) בתא הלח שהוכן לאחרונה.
- הפסיקו את התגובה ושטפו את הדגימה ב-PBS*T, חמש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
- לייצב את קומפלקס הביוטין סטרפטאבידין על ידי פוסט-פיקסינג ב-1% גלוטרלדהיד ב-PBS* למשך 30 דקות.
- הסר glutaraldehyde על ידי כביסה אינטנסיבית עם מים deionized ולשטוף את המדגם ב PBS *, חמש פעמים במשך 20 דקות כל אחד.
- להרוות קבוצות אלדהיד חינם עם מוכן טרי 1 מ"ג / מ"ל NaBH4 במים, פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. במהלך הדגירה, בועות של H2 נוצרים אשר יכול להרים את כיסויים. בזהירות לדחוף אותם למטה עם פינצטה.
- לשטוף עם מים deionized חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
הערה: לבקרת איכות בשלב התוויות, מומלץ לבצע תיוג בקרה עם סטרפטאבידין המסומן בפלואורסצנטיות (איור 2). זה יספק הערכה של עוצמת תיוג ורמת הרקע לפני המעבר לשלבים מייגעים ונוטים לחפץ לאחר מכן.
3. הגברה אג
הערה: הליך זה שונה מ Gilerovitch ואח ', 1995 (ראה 20,21).
- Resuspend 50 גרם של אבקת שיטה ב 100 מ"ל של מים deionized. ממיסים במשך 3 ימים, דגה, ומסננים דרך ארבע שכבות של מטלית גבינה. יש לאחסן קפואים ב-5 מ"ל בצינורות של 50 מ"ל. הפשירו מיד לפני השימוש.
- הוסף 2 מ"ל של 1 M MES (pH = 6.1) ל 5 מ"ל של aliquot מופשר של פתרון אבקת שיטה כדי להפוך 7 מ"ל של 0.28 M MES (pH = 6.1) בתמיסת אבקת שיטה. מערבבים על ידי נדנדה איטית של הצינור במשך 30 דקות. לעטוף את הצינור עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.
- במקביל לשלב 3.2, כיסויי כביסה עם חיץ כביסה (50 מ"מ MES, pH = 5.8, 200 מ"מ סוכרוז), שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
- הכן את הפתרון הטרי של N-propyl gallate (NPG). בצינור 15 מ"ל, להמיס 10 מ"ג של NPG ב 250 μL של 96% אתנול, ולהתאים ל 5 מ"ל עם מים deionized.
- שים 36 מ"ג של לקטט כסף בצינור 15 מ"ל עטוף בנייר כסף.
- אחרי שלב 3.2. הושלם, להוסיף 1.5 מ"ל של פתרון NPG לתערובת אבקת שיטה וסלע עוד 3 דקות.
הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בחדר חושך. יש להשתמש באור בטוח שאינו אקטיני (צהוב או אדום). - שיווי משקל את הדגימה עם חוצץ כביסה ולהמשיך לחדר החשוך. בו זמנית, מוסיפים 5 מ"ל של מים deionized כדי לקטט כסף להתמוסס על ידי רועד נמרץ במשך 1-2 דקות.
- מוסיפים 1.5 מ"ל של תמיסת לקטט כסף לתערובת אבקת שיטה, רוק לאט במשך 1 דקה. הימנע היווצרות בועות, כמו חמצן בתערובת יאט את התגובה.
- מסננים את התמיסה מהצלחת עם כיסויים ויוצקים 3 מ"ל של תערובת אבקת לקטט-שיטה כסופה על התאים. מנענעים את המנה מספר פעמים ודוללים במשך 2-5 דקות. זמן הדגירה תלוי באצווה אבקת שיטה ובטמפרטורה. זה צריך להיות מוגדר באופן ניסיוני.
הערה: זמן דגירה ארוך יותר עלול לגרום לכריכת כסף לא ספציפית. - כדי לעצור את התגובה, לנקז את תערובת התגובה לשטוף את המנה בהרחבה עם שלושה עד חמישה שינויים של מים deionized, ואחריו שלושה שינויים נוספים במשך 5 דקות כל אחד.
- תבדוק את הכתמים מתחת למיקרוסקופ של ברייטפילד. כתמים טובים צריכים להיות בהירים עד כהים עם רקע צהבהב קלוש מאוד.
הערה: אם הכתמים אינם מתפתחים, ניתן לחזור מיד עם התערובת שכבר נוצרה (התערובת פעילה כ -15 דקות אם נשמר בחושך). עם זאת, הכתמים במקרה זה עלולים להתפתח מהר מדי.
4. גוון זהב
הערה: על מנת להגן על חלקיקי כסף מפני פירוק על ידי חמצון OsO4 בהליכים הבאים, ספיגה עם זהב משמש בשלב זה (Sawada, Esaki, Esaki, 1994)22.
- יש לשטוף את המכסים במים שעברו דה-יוניזציה.
- על מנת להגן על חלקיקי כסף מפני פירוק על ידי חמצון OsO4 , לדגור על הדגימות 0.05% חומצה טטרכלורואורית במשך 2 דקות בחושך.
- לשטוף ביסודיות עם מים deionized במשך 10 דקות.
הערה: בשלב זה מתווספת ניגודיות נוספת לדנ"א המכיל חומר. צבע המדגם צריך להשתנות מחום לשחור.
5. כרום
הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Ou et al., 201716.
- לדגור על כיסויים להרוות את הדגימות ב 10 μM DRAQ5 ב PBS במשך 10 דקות בחושך.
- הכן 0.2% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) פתרון ב 50 mM Tris או PBS:
המיסו את ה-DAB ב-90% מהנפח הסופי על-ידי ערבוב נמרץ בחושך, ולאחר מכן התאימו את רמת החומציות ל-7.0-7.4 עם NaOH. כוונן את עוצמת הקול ל- 100% וסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, יש לאחסן עטוף בנייר כסף. - מוסיפים פתרון DAB לתאים (2 מ"ל לצלחת פטרי בגודל 3 ס"מ) ודוללים במשך דקה אחת.
- מעבירים את כיסוי הכיסוי לתוך צלחת הפטרי התחתונה של הזכוכית ומניחים אותה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. הקרין את המדגם (מספר שדות ראייה) על מיקרוסקופ הפוך עם מקור אור מתכת-הליד וערכת מסנן Cy5 (640 ננומטר, 1 W / cm2 במישור מוקד) באמצעות תוכנית Apo λ 40х (NA = 0.95) עדשה למשך 10 דקות.
הערה: אינדיקציה של צילום DAB מוצלח הוא צילום מלא DRAQ5 צילום היווצרות משקעים DAB כהה גרעינים מוקרן. עם זאת, האחרון לא תמיד ניכר על אות EdU-כסף-זהב אינטנסיבי (במיוחד כאשר פולסים EdU מורחבים מנוצלים). - לשטוף עם מים deionized שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
6. התייבשות והטבעת שרף אפוקסי
- בצינור microcentrifuge, להכין פתרון טטראוקסיד אוסמיום מופחת חלקית על ידי ערבוב 2% פתרון מימי של K4Fe(CN)6 עם כמות שווה של 2% פתרון מימית של OsO4, כדי לקבל 1% ריכוז סופי של שני הרכיבים. דגירה מכסה את הליפס ב OsOמופחת 4 במשך 1 שעות ולשטוף במים deionized שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
הערה: בשלב זה תרכובת האוסמיום מופחת מגיב עם תצהירי DAB ומגביר את הניגודיות של DNA.
זהירות: אוסמיום רעיל, לעבוד תחת מכסה המנוע אדים ולטפל בפסולת על פי תקנות בטיחות מקומיות. - מייבשים את הדגימות בסדרה של פתרונות אתנול מדורגים באחוזים הולכים וגדלים: 50% EtOH - 3 x 10 דקות; 70% EtOH - 3 x 10 דקות, 80% EtOH - 3 x 10 דקות, 96% EtOH - 3 x 10 דקות, 100% EtOH - 3 x 10 דקות.
- לחדירה והטבעה השתמש בנוסחת השרף עם יחס נפח הרכיב כדלקמן: מונומר שרף אפוקסי:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). נוסחה זו היא שונה עם אתנול.
- דגור על כיסוי בתערובת אתנול-שרף (3 חלקים 100% EtOH:1 חלק שרף אפוקסי) במשך 30 דקות.
- דגור על כיסוי בתערובת אתנול-שרף (1 חלק 100% EtOH:1 חלק שרף אפוקסי) במשך 2 שעות.
- דרגו את כיסוי הכיסוי בתערובת האתנול-שרף (1 חלק 100% EtOH:3 חלקים שרף אפוקסי) לילה.
- החליפו תערובת אתנול-שרף בשרף טהור טרי. יש לדגור בתערובת שרף טהורה למשך 8 שעות. פתח את המנה כדי לתת שרידים של אתנול להתאדות.
- מעבירים כיסויים למנה חדשה עם שרף טהור ודגרה במשך 2 שעות בטמפרטורה של 37-42 מעלות צלזיוס.
- ממלאים תבנית סיליקון בשרף טרי. מניחים את כיסוי עם התאים הפונים כלפי מטה על תבנית סיליקון מתאימה מלאה שרף אפוקסי. לרפא את השרף עבור 24 שעות ב 37 °C (50 °F), ולאחר מכן ב 60 °C (60 °F) לפחות 2 ימים.
זהירות: רכיבים של תערובת שרף אפוקסי הם חומרים מסרטנים פוטנציאליים. תלבש כפפות ותעבוד מתחת למכסה המנוע של האדים.
- הסר את לוח השרף מהתבנית, לנקות את פני השטח של כיסוי עם אזמל או סכין גילוח. כדי להסיר את כיסוי, טיפה כיסוי לתוך חנקן נוזלי ולאחר מכן להעביר את הלוח לתוך המים הרותחים. יש לחזור על הפעולה במידת הצורך.
- אתר את האזור המוקרן תחת סטריאומיקרוסקופ וחתוך אותו מהלוח עם מסור או כל מכשיר מתאים אחר. מחממים מראש את הלוח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה, במידת הצורך.
- הדקו את החתך למחזיק מדגם אולטרה-מיקרוטומי לחיתוך בלוק סופי. בעזרת התער, הכינו את הדגימה בצורת פירמידה. הר את המחזיק עם פירמידה על ultramicrotome ולהתקין את הסכין.
- חתוך את הבלוק כך שהתאים המוקרנים הנושאים תווית EdU ייכללו. הכן קטע דק למחצה (עובי 250 ננומטר) המתאים לטומוגרפיה אלקטרונית.
הערה: ניתן להתאים את עובי המקטע כך שיתאים לדרישות הניסוי.
- חתוך את הבלוק כך שהתאים המוקרנים הנושאים תווית EdU ייכללו. הכן קטע דק למחצה (עובי 250 ננומטר) המתאים לטומוגרפיה אלקטרונית.
- נתק חלק מקצה הסכין והנח אותם על רשתות החריץ הבודד. עבור טומוגרפיה אלקטרונית, 250 ננומטר קטעים נבחרים על רשתות 1 מ"מ חריץ יחיד ולאחר ייבוש קטעים אלה יכולים להיות מצופים פחמן משני הצדדים. אין צורך בניגוד נוסף.
הערה: מכיוון שהמקטעים כבר מכילים חלקיקי Au-Ag בעלי ניגודיות גבוהה, אין צורך להוסיף חלקיקי זהב פידוקאליים לפני השטח של המקטע. - בדוק את הרשתות במיקרוסקופ אלקטרוני שידור בהגדלה נמוכה (כ -600x) כדי לאתר את התאים עם דפוסי שכפול מתאימים.
הערה: פרוטוקול זה יוצר צפיפות תוויות גבוהה מספיק לזיהוי קל של מוקדי שכפול אפילו בהגדלה נמוכה. מומלץ תחילה ליצור מפה של המקטע לניווט הבא ואיסוף הקרנות זוויתיות לטומוגרפיה. עבור להגדלה גבוהה יותר וצלם תמונות ברזולוציה גבוהה.
7. טומוגרפיה אלקטרונית
- הכנס את הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים של השידור עם מחזיק הטיה גבוהה. טען את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים ואתר את אזור העניין.
- יישר את המיקרוסקופ במצב EFTEM במצב תאורה כמעט מקבילי. כוונן את מסנן האנרגיה עם חריץ בחירת אנרגיה 20 eV ממוקם בשיא אפס הפסד.
- לפני הקרנת אזור רכישת טומוגרפיה בקצב מינון של 40 e/ Å2/s לפחות 1.5-2 דקות, אשר תואם את המינון הכולל לפחות של 3000 e / Å2.
- התאם גובה אוצנטרי עם פעילות אוטומטית ב- SerialEM. בדוק את משימת המיקוד האוטומטי כדי לוודא שהיא פועלת כראוי בזווית הטיה אפסית ובערך defocus היעד של -0.8 מ'ק"מ.
- הטה את מחזיק הדגימה ל- -60° באמצעות המשימה Walk-Up.
- הגדר את רכישת הטומוגרפיה מ- -60 עד +60° עם שלב 2.0°. יש להגדיר את החשיפה בהתאם לזווית ההטיה כדי לשמור על העוצמה הממוצעת במצלמה. הגבל את הסטת התמונה במקרה שהיא גורמת לשינוי אנרגיה ובכך חותכת אי-התאמה. יש לשמור את נתוני הטומוגרפיה כקובץ .mrc
- יבא את קובץ ה- .mrc לתוכנת IMOD לשחזור טומוגרפיה. הסר את ערכי הפיקסלים החריגים ביותר עקב צילומי רנטגן.
- ישר את סדרת ההטיה. בצע מתאם צולב ראשוני, ולאחר מכן סמן באופן ידני 10-12 חלקיקי זהב כנאמנות. עקוב אחר המודל הפיקטיבי ובדוק כי כל fiducial הוא במעקב נכון דרך סדרת הטיה. צור טומוגרמה לדוגמה (פרוסות) וסמן באופן ידני את גבולות המקטע הדק כדי למנוע הטיה אפשרית של הצפיפות המשוחזרת בתוך אמצעי האחסון. השגיאה השיורית הממוצעת עבור יישור עדין הייתה פחות מ 1.2 פיקס.
- שחזר את הטומוגרמה באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי מסונן ולאחר מכן חתוך את הפלט כך שיתאים לאזור העניין לאמצעי האחסון הסופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מוקדי שכפול בגרעין תאי היונקים מציגים דפוסי הפצה ברורים בתוך הגרעין בהתאם להתקדמות שלב ה- S. דפוסים אלה מתואמים עם פעילות שעתוק של loci להיות משוכפל. מאז השיטה המוצגת כאן משתמשת בהליך חזק למדי, זה די פשוט להשתמש תיוג דופק משכפל לגילוי ספציפי של loci כרומטין במצבים תמלול שונים, אפילו בתנאים המציעים שימור מבני הטוב ביותר של כרומטין המתקבל על ידי קיבעון כימי טמפרטורת החדר.
שלבי בקרת איכות נועדו להבטיח השלמה מוצלחת של הליכי המפתח בפרוטוקול זה. בתחילה, תיוג מוצלח של EdU צריך להיות מאושר על ידי תגובת קליק עם azide בעל תווית פלואורסצנטית, המדגימה דפוסי שכפול אופייניים אם נעשה שימוש באוכלוסיית תאים הטרוגניים (איור 2). הצעד החשוב השני הוא תיוג סטרפטאבידין, אשר יכול להיות מושפע מאוד על ידי קיבעון glutaraldehyde. להערכת היעילות המחייבת של סטרפטאווידין, השתמש בסטרפטאווידין מצומד AlexaFluor-488 באותם תנאים כמו סטרפטאבידין-ננוגולד (איור 3). בשלב זה, קצת רקע צפוי בעיקר בשל glutaraldehyde autofluoreoreence, כמו גם שטיפה streptavidin לא שלם. אם יחס האות לרעש אינו מקובל, נסה להגדיל את מספר ומשך הכביסה בשלב 2.6. לחלופין, להוסיף glutaraldehyde מרווה עם NaBH4 (שלבים 2.9-2.10) לאחר שלב 1.5.
הליך שיפור הכסף מייצר לעתים קרובות תוצאות לא עקביות ודורש אופטימיזציה. ראשית, מהירות התגובה משתנה באופן דרמטי בהתאם לאצווה פתרון אבקת שיטה. הצמיגות של הפתרון היא ביחס הפוך לזמן ההתפתחות כתמי הכסף. מומלץ לקבל כמה aliquots של אותה אצווה ולבדוק אותם על דגימות הבקרה כדי לקבוע תזמון תגובה אופטימלי. כמו הטמפרטורה של ריאגנטים והסביבה יש גם השפעה משמעותית על מהירות התגובה, לנסות לבצע את התגובה בדיוק באותה טמפרטורה. אם מעבדים יותר משלוש דגימות בו זמנית, נוח להתחיל את התגובה במרווחים של 30 שניות כדי שיהיה מספיק זמן לשטיפת צעדים.
תוצאה טובה של הליך שיפור הכסף היא הכתמים החומים הכהים של חלק מהגרעין (לא כולם) עם כתמים ציטופלסמיים צהבהבים קלושים מאוד (איור 4). משמעות הדבר היא שהגודל הממוצע של חלקיקי כסף הוא כ -20 ננומטר, אשר מתאים לזיהוי תוויות קל בטווח הגדלה רחב של TEM על פני הנגד כרומטין. עבור ניסויים טומוגרפיה, גודל החלקיקים צריך להיות מופחת על 10 ננומטר על ידי קיצור זמן התגובה. הצבע במקרה זה צריך להיות חום בהיר או אדמדם. יש לבדוק את צבע כתמי הכסף לפני גוון הזהב.
DAB פוטוקונקטורציה וההשמדה מתבצעת לאחר גוון זהב כדי להגן על קליפות כסף מפני פירוק. במקרה של הספגת זהב לא מספקת, חלקיקי כסף נשחקים ורוכשים צורה לא סדירה, אך עדיין נשארים גלויים תחת TEM. איכות הצילום של DAB מנוטרת תחילה על-ידי הלבנת DRAQ5 (במצב פלואורסצנטי), ולאחר מכן במצב ברייטפילד, כאשר גרעיני התא בשדה מוקרן הופכים לחום כהה (איור 5). עוצמת הכתמת DAB לא צריכה להיות גבוהה מאוד, כך שהכתמת Ag-Au נשארת מזוהה היטב כדי לאפשר את בחירת התאים עם תזמון השכפול הנדרש לחיתוך.
מקטעים דקים במיוחד או דקים למחצה אינם דורשים כתמים נוספים וניתן לצפות בהם ישירות תחת TEM. התיוג המתאים מוביל בדרך כלל לאשכולות מוגדרים היטב של חלקיקי Ag המגדירים אתרי שכפול (איור 6), בעוד שתיוג הרקע מוגבל למספר חלקיקים למיקרומטר מרובע. חלקים דקים למחצה מוכנים לטומוגרפיה ואינם דורשים תוספת של חלקיקי זהב למשטח המקטע, שכן חלקיקי Ag הנמצאים בסעיף יכולים לשמש כסימני פידוקאליים (איור 7). באיור זה, מוצגת ההשפעה של זמן תיוג ממושך: נתיך מוקדי שכפול בודדים למבנים דמויי סיבים, המתארים תחומים כרומטין מסדר גבוה יותר.
איור 1. מבט כולל על פעולת השירות. תאים הגדלים על כיסויים מסומנים עם EdU, קבוע עם 2.5% glutaraldehyde, חלחל, ותגובה קליק מבוצעת עם אזיד biotinylated. לחלופין, אזידים מסומנים בפלואורסצנטיות משמשים בהתבוננות מיקרוסקופית קלה. אתרים של התאגדות ביוטין מסומנים עם Nanogold-streptavidin (או בפלואורסצנטיות מסומן סטרפטאבידין כבקרה), כסף משופר, ולאחר גוון זהב נתון DRAQ5 בתיווך DAB פוטוברס והתמדה. הדגימות מוטבעות בשרף אפוקסי, מחולקות, נבדקות ב- TEM ונבדקות לטומוגרפיה אלקטרונית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. דפוסי שכפול בתאי יונקים מתגלים על ידי תיוג EdU ותגובת קליק (ירוק). התקדמות שלב S משלב S מוקדם עד מאוחר (משמאל לימין) באה לידי ביטוי בשינוי מסודר בדפוסי השכפול: A,B - שלב S מוקדם, C - אמצע שלב S, D,E - שלב S מאוחר. הדנ"א מוכתם ב-DAPI (אדום). סרגל קנה מידה = 10 אום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. דפוסי שכפול בתאי יונקים מתגלים על ידי תיוג EdU ו- Click-biotin דו-שלבי וסטרפטווידין-AlexaFluor 488 מכתימים לאחר קיבוע גלוטרלדהיד. דגימת בקרה המסומנת עם סטרפטאבידין-AlexaFluor 488 מציגה יעילות תיוג אופטימלית ויחס S/N לאחר קיבוע glutaraldehyde. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. תמונה מייצגת של תאים לאחר הליך שיפור הכסף (שלב 3). דפוסי שכפול שונים (שלב S מוקדם, חצים; אמצע שלב S, ראש חץ; חצים מאוחרים וכפולים) נראים בקלות במצב מיקרוסקופיה של אור בהיר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. תוצאה אופיינית של היפוך תמונות DAB בתיווך DRAQ5. (A) כתמי DRAQ5 (עיגול מקווקו מציין אזור מוקרן). שימו לב להלבנה חזקה של DRAQ5 בתוך העיגול. (B) אותו אזור שנראה במיקרוסקופ אור ברייטפילד. שים לב משקעים DAB חזקים יותר בגרעינים באזור מוקרן. Inset: חצים מציינים גרעינים בשלב S מוקדם שבו דפוסי שכפול המסומנים עם Ag-Au עדיין ניתן לזהות בקלות על רקע של DRAQ5-פוטו-חמצון DAB כתמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. מוקדי שכפול בגרעיני תאי יונקים שנחשפו על ידי תיוג EdU וכתמים דו-שלביים של קליק-ביוטין וסטרפטאבידין-ננוגולד לאחר קיבוע גלוטרלדהיד. מקטעים דקים של 90 ננומטר של תא שלב S המציגים אשכולות של חלקיקי Ag-Au במוקדי שכפול (A, עיגולים אדומים). ניתן להעריך את רמת הרקע בתא שאינו שלב S (B). ראשי חץ מציינים סיבי כרומטין בקנה מידה שונה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. הקרנה של 0° הטיה של מקטע 250 ננומטר. (א) ומקטע טומוגרפי וירטואלי. (B) של גרעין תא המסומן עם EdU במשך 2 שעות. ראה מוקדי שכפול בודדים התמזגו למבנים דמויי סיבים (ראשי חץ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לשיטה המתוארת כאן יש מספר יתרונות על פני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. ראשית, השימוש ב-Click-chemistry לתיוג דנ"א משוכפל מבטל את הצורך בדנטורציה של DNA תנאי מוקדם לגילוי BrdU עם נוגדנים, ובכך לשפר את המבנה האולטרה-מבנה של הכרומטין.
שנית, ניצול הביוטין כליגנד משני שנוצר לאחר קיבוע glutaraldehyde ומרווה נכונה של קבוצות אלדהיד לא מאוגדות ממזער את השינוי הכימי של המטרה, ובכך משפר את יעילות התוויות תוך הפחתת הרקע עקב ביוטין אנדוגני. ביוטין-סטרפטאבידין מוסיף גם רב-תכליתיות שכן השימוש בסטרפטאווידין המסומן בפלואורסצנטיות מספק בקרת איכות קלה בשלב מוקדם מאוד של ההליך. הפרוטוקול יכול להיות פשוט עוד יותר על ידי הצגתו של FluoroNanogold שכותרתו סטרפטאווידין, עם זאת, בידיים שלנו ריאגנטים אלה נתנו רקע קצת יותר גבוה בהשוואה Nanogold-streptavidin, אולי בשל גודל גדול יותר של הבדיקות.
שלישית, שילוב של בדיקות קטנות, streptavidin-Nanogold להיות המרכיב הגדול ביותר של כ 5 ננומטר, מספק חדירה טובה מאוד אפילו תאים מוצלבים glutaraldehyde. זה הופך את הטכניקה מתאימה לתיוג טרום הטמעה של תאים שהשתמרו באופן אולטרה-מבני בצורה אופטימלית ומתאימה בקלות לטכניקות מיקרוסקופיות שונות של אלקטרונים תלת-ממדיים, כולל שחזור מקטע טורי, טומוגרפיה של מערך, טומוגרפיה אלקטרונית, הדמיית פנים בלוק סדרתית ו- FIB-SEM.
שיפור כסף הוא הצעד הקריטי ביותר, הדורש שליטה מדויקת של דיפוזיה ריאגנט וצעדי כביסה, אשר קל יותר לבצע עם תאים דבקים. מצד שני, מאז crosslinking חזק עם glutaraldehyde יכול גם להשפיע על שיפור הכסף, תנאי הקיבעון צריך להיות מכוון היטב על מנת לאזן שימור מבנה כרומטין ויעילות שיפור הכסף. מסיבה זו, טכניקות קריו-קיבעון /קריו-החלפה, הדורשות לאחר קיבוע מורחב ונשלט בצורה גרועה, אם כי מאפשרות שימור מבנה טוב עוד יותר, עשויות שלא להתאים באופן מלא לאסטרטגיית התיוג המוצעת23. הטכניקה ניתן לשפר עוד יותר באמצעות Au-הגברה במקום שיפור כסף24. שינוי זה מאפשר לדלג על שלב גוון הזהב, עם זאת, בידיים שלנו, זה נותן רקע גבוה בהרבה.
לבסוף, תיוג טרום הטבעה מאפשר בחירה מוקדמת של תאי יעד עבור ChromEM וחתך בהתבסס על תבנית השכפול הניתנת לזיהוי תחת מיקרוסקופ brightfield או פלואורסצנטי. יתר על כן, ניתן להרחיב את השיטה בקלות ל- CLEM, כולל טכניקות שונות של רזולוציית-על. זה פותח אופקים חדשים במחקרים של מבנה ודינמיקה מסדר גבוה יותר כרומטין במצבים פיזיולוגיים שונים. הגישה שתיארנו כאן יכולה לשמש למחקרים של ארגון כרומטין באתרי שכפול, לניתוח של ארגון מחדש לאחר שכפול של כרומטין, כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה של הפרדה כרומטית באינטרפאזה, ולתיוג משכפל של תחומים כרומוזומליים גדולים ומחקרים של קיפול כרומטין מסדר גבוה יותר של שברים ספציפיים של הגנום (אאוכרומטין או הטרוכרומטין, המסומנים על בסיס תזמון השכפול). סוגים אלה של טכניקות הדמיה חשובים גם כנקודת התייחסות לנתונים הנוצרים על ידי גישות חלופיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי RSF (מענק #17-15-01290) ו- RFBR (מענק #19-015-00273). המחברים מודים לתוכנית הפיתוח של אוניברסיטת המדינה לומונוסוב מוסקבה (PNR 5.13) ולמרכז ניקון למצוינות בהדמיה קורלטיבית במכון בלוזרסקי לביולוגיה פיזיקלית-כימית על הגישה למכוני הדמיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
