Summary
Dit rapport beschrijft de methoden om een model van temporale kwab epilepsie te genereren op basis van de elektrische aanmaakhoutjes van transgene VGAT-Cre muizen. Ontstoken VGAT-Cre-muizen kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de oorzaak van epilepsie en voor het screenen van nieuwe therapieën.
Abstract
Er werd ontdekt dat elektrische aanmaakhoutjes van VGAT-Cre-muizen leidden tot de spontane motorische en elektrografische aanvallen. Een recent artikel richtte zich op hoe unieke VGAT-Cre-muizen werden gebruikt bij het ontwikkelen van spontane terugkerende aanvallen (SRS) na aanmaakhout en een waarschijnlijk mechanisme - het inbrengen van Cre in het VGAT-gen - verstoorde de expressie ervan en verminderde de GABAerge toon. De huidige studie breidt deze observaties uit naar een groter cohort muizen, met de nadruk op belangrijke kwesties zoals hoe lang de SRS doorgaat na aanmaakhout en het effect van het geslacht en de leeftijd van het dier. Dit rapport beschrijft de protocollen voor de volgende belangrijke stappen: het maken van headsets met hippocampale diepte-elektroden voor elektrische stimulatie en voor het lezen van het elektro-encefalogram; operatie om de headset stevig op de schedel van de muis te bevestigen, zodat deze er niet af valt; en belangrijke details van het elektrische aanmaakblokprotocol, zoals de duur van de puls, de frequentie van de trein, de duur van de trein en de hoeveelheid geïnjecteerde stroom. Het aanmaakhoutprotocol is robuust omdat het betrouwbaar leidt tot epilepsie bij de meeste VGAT-Cre-muizen, wat een nieuw model biedt om te testen op nieuwe anti-epileptogene geneesmiddelen.
Introduction
Epilepsie is een belangrijke neurologische aandoening met aanzienlijke economische en menselijke lasten. NINDS schat dat er 3 miljoen Amerikanen met epilepsie zijn. Ongeveer 0,6 miljoen van deze patiënten hebben temporale kwab epilepsie (TLE)1. Helaas faalt de medische behandeling van TLE bij een derde van de patiënten vanwege ineffectiviteit, ontwikkeling van geneesmiddelresistentie of intolerantie voor bijwerkingen2. Het is duidelijk dat er een aanzienlijke behoefte is aan het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor TLE, een conclusie die wordt gedeeld door de American Epilepsy Society Basic Science Committee, de International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery en de National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Huidige diermodellen van temporale kwab epilepsie gebruiken chemoconvulsiva (bijv. kaïnaat, pilocarpine) of langdurige elektrische stimulatie om een langdurige status epilepticus 5,6,7 te induceren. Veel dieren sterven tijdens de procedure (10% -30% bij ratten, tot 90% bij muizen8). Dieren die overleven en epilepsie ontwikkelen, vertonen uitgebreide neuronale dood in de hersenen 9,10. Deze dood veroorzaakt een cascade van reacties, te beginnen met de activering van microglia, astrocyten en infiltrerende monocyten. Neuronale reacties omvatten circuitreorganisatie (bijv. Mossy fiber sprouting), geboorte van nieuwe neuronen die niet goed integreren in circuits (bijv. Ectopische korrelcellen) en intrinsieke veranderingen die leiden tot hyperexcitabiliteit (bijv. Upregulatie van Na + -kanalen). Een epilepsiemodel zonder significante neuronale dood zal de zoektocht naar nieuwe anti-epileptica vergemakkelijken.
Tijdens het testen van de GABA-hypothese van epilepsie, werd ontdekt dat de behandeling van VGAT-Cre-muizen met een mild elektrisch aanmaakblokprotocol leidde tot de spontane motorische en elektrografische aanvallen11. Over het algemeen leidt het elektrische aanmaakhout van knaagdieren niet tot spontane aanvallen die epilepsie definiëren, hoewel het dat wel kan, in gevallen van over-aanmaakhout11. VGAT-Cre muizen brengen Cre recombinase tot expressie onder controle van het vesiculaire GABA transporter (VGAT) gen, dat specifiek tot expressie komt in GABAerge remmende neuronen. Het bleek dat het inbrengen van Cre de expressie van VGAT op mRNA- en eiwitniveaus verstoorde, waardoor GABAerge synaptische transmissie in de hippocampus werd aangetast. Er werd geconcludeerd dat ontstoken VGAT-Cre-muizen nuttig zouden kunnen zijn om de mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij epileptogenese en voor het screenen van nieuwe therapieën11. Dit rapport bevat de methoden die zijn gebruikt om het model in detail te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren volgde de ARRIVE12-richtlijnen en werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Headsets maken met twee bipolaire elektroden (figuur 1)
Figuur 1: Belangrijkste stappen in de fabricage van EEG-headsets. (A) Verschijning van de elektroden bij de verschillende stappen in het protocol (nummers in de linker matchstap). (B) Een foto van het eindproduct gemonteerd in een zelfgemaakte houder die past op het stereotaxische frame. Let op, de houder eindigt met een kraagspeld die in het voetstuk van de headset past. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Snijd 3,5 cm roestvrij polytetrafluorethyleen-gecoat roestvrij staaldraad.
- Verwijder ongeveer 1 mm van de isolatielaag van de draad aan beide uiteinden. Laat niet te veel van de draad strippen.
- Plaats twee pinnen op een visehouder met het onderste deel van de pin met een langere spleet naar beneden gericht.
- Breng flux aan op de gestripte uiteinden van de draad en op de bovenkanten van de pennen.
- Tin het gestripte deel van de draad met net genoeg soldeer om het te coaten.
- Voeg een minimale hoeveelheid soldeer toe aan de bovenkant van de pin zonder over te lopen op de zijkanten.
- Plaats het ene uiteinde van de gestripte uiteinden van de draad zo diep als mogelijk is in de pen terwijl het soldeer wordt gesmolten.
OPMERKING: Er is een zijgat waar de draad uit kan komen - laat de draad niet uit de pin komen. Alle gestripte draad moet binnen de pin blijven. - Herhaal stap 1.6-1.7 voor de tweede pin, nu met de andere gestripte uiteinden van de draad.
- Laat de pinnen 30 s zitten om uit te zetten, verwijder ze uit de visehouder en trek er vervolgens aan om ervoor te zorgen dat de verbinding tussen de draad en de pinnen sterk is en vasthoudt.
- Spoel de pinnen af in koud water en droog ze vervolgens.
- Controleer de geleiding tussen pin 1 en pin 2 met behulp van een ohmmeter.
- Breng de pinnen aan de uiteinden van de draad bij elkaar; Houd ze parallel en dicht. Klem een hemostat in het midden van de draad. Draai vervolgens de hemostat, zodat de draad vrij strak om zich heen draait. Verwijder de hemostat.
- Klem een tang op de gedraaide draad 2 mm onder de pennen en buig de draad op 90°.
- Duw dezelfde draad nogmaals 90° terug over de tang en maak een andere bocht op 1 mm van de eerste.
- Knip de gedraaide draad in een hoek van 45° onder de bocht op 3,5 mm met een kleine scherpe schaar.
- Bereid twee van deze bipolaire (dubbelpins gedraaide) elektroden voor elke headset voor (optioneel, tweede is back-up in geval van elektrische problemen met de eerste).
- Bereid één enkele referentie-elektrode voor door een draad met aan beide uiteinden gesoldeerde pennen in tweeën te snijden (stappen 1.1-1.17, figuur 1A).
- Knip de draad door op 7 mm.
- Buig het uiteinde 1 mm onder de punt.
- Bedek vervolgens de gebogen punt van 1 mm van de draad met een tang en draai de draad strak rond de tang om een kleine lus (1 mm in diameter) te creëren.
- Buig de lus loodrecht op het rechte deel van de draad om de draadpunt weer naar buiten te laten wijzen.
- Monteer de twee bipolaire elektroden en de enkele referentie-elektrode in het zespolige voetstuk op een zodanige manier dat de bipolaire elektroden naast elkaar staan met een afstand van 6 mm ertussen en dat de referentie-elektrode in het middelste buitenste gat wordt geplaatst (figuur 1B).
OPMERKING: Een alternatieve methode is om de elektroden te implanteren, ze op hun plaats te cementeren en vervolgens hun pinnen in het voetstuk te steken.
2. Stereotaxische elektrode-implantatie
- Steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen en de zes-pins elektrodeassemblage door autoclaveren vóór de operatie. Een steriel chirurgisch veld moet tijdens de operatie worden onderhouden en steriele chirurgische handschoenen moeten worden gebruikt. Steriele gordijnen (bijv. Press n' Seal) worden aanbevolen om het dier te bedekken, behalve voor het operatiegebied.
- Gebruik 8 weken oude VGAT-Cre-muizen (leeftijdsgematcht, zowel mannelijk als vrouwelijk) voor operaties 4 weken na het spenen. Noteer het gewicht van het dier vóór de operatie om de meting van postoperatief gewichtsverlies mogelijk te maken.
- Gebruik een gecertificeerde isofluraan vaporizer of een low-flow anesthesiesysteem uitgerust met een precisie spuitpomp, geïntegreerde digitale vaporizer en feedback warmtepad.
OPMERKING: Low-flow systemen zijn in staat om anesthesie te leveren bij lage stroomsnelheden in verhouding tot de grootte van het dier in een inductiekamer of via een neuskegel op het stereotaxische frame (70 ml / min, isofluraanconcentratie in lucht is 4% voor inductie en 2% voor chirurgie). Het gebruik van minder anesthesie komt niet alleen het dier ten goede tijdens operaties, maar vermindert ook het risico op blootstelling van laboratoriumpersoneel aan isofluraan. - Plaats het verdoofde dier op een verwarmd kussen dat is opgewarmd tot 37 °C om het warm te houden tijdens de operatie. Als u een feedbackgestuurd temperatuursysteem gebruikt, plaatst u de licht gesmeerde temperatuursonde in het rectum van het dier voor temperatuurbewaking tijdens de operatie.
- Monteer het dier op het stereotaxische frame door voorzichtig oorbalken in de oren te plaatsen en de voorste boventanden in de snijtandbalk. Plaats de neuskegel over de neus voor een goede anesthesietoediening. Zorg ervoor dat het hoofd waterpas en gecentreerd is en niet kan worden bewogen wanneer het enigszins wordt gesondeerd.
- Injecteer subcutaan 0,5 ml normosol voor hydratatie.
- Breng oculair glijmiddel aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Controleer op de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de ontwenningsreflex na het knijpen van een achterste teen en verlaag vervolgens isofluraan tot 1,5% -2,0% tijdens de operatie.
- Verwijder haar op en rond het operatiegebied door te plukken of tondeuses (scheren) of ontharingscrème te gebruiken en desinfecteer de huid met drie cycli van afwisselende toepassing van jodium en ethanol, eindigend met jodium. Het verwijderen van haar weg van de operatieplaats wordt alleen aanbevolen als er middelen zijn om de anesthesie op die locatie te behouden. Gebruik indien nodig met alcohol gedoopte wattenstaafjes om haar uit de directe omgeving van het hoofd te verwijderen. Injecteer 0,05 ml van het lokale analgetische bupivacaïne (0,25%) subcutaan.
- Maak een incisie in de schedel met behulp van een scalpel en knip vervolgens een deel van de huid uit met een scherpe chirurgische schaar, waardoor de schedel wordt blootgesteld. Duw de huid opzij, gebruik een wattenstaafje en reinig de schedel van alle spieren en onderliggende weefsels die het zicht belemmeren.
OPMERKING: Om onbedoelde bloedingen te stoppen, oefent u druk uit op de bloedingsplaats met een steriel wattenstaafje totdat het stopt. - Reinig de schedel met waterstofperoxide met steriele wattenstaafjes om de schedelhechtingen en zowel bregma als lambda zichtbaar te maken.
- Droog de schedel grondig en breng vervolgens een druppel zelfetsende tandlijm aan met behulp van de applicator. Borstel het in de schedel, wacht 60 s en hardt uit met een tandheelkundig UV-licht gedurende 40 s. Een glanzend oppervlak geeft aan dat de lijm effectief is verknoopt met de schedel.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor een veilige bevestiging van de headset. - Gebruik een boor van 0,031" (0,79 mm) om twee braamgaten bilateraal te boren voor implantatie van hippocampusdiepte-elektroden (ongeveer 5.000 tpm). Boor een extra braamgat voor de referentie-elektrode boven het cerebellum achter de lambda.
OPMERKING: Zorg er bij het boren voor dat u de boor langzaam laat zakken en vermijd boren in de hersenen. - De coördinaten voor de elektroden zijn als volgt (van bregma in mm): hippocampuselektroden op 3 mm achterste, 3 mm laterale en 3 mm diepte; en cerebellaire referentie-elektrode op 6 mm posterieur, 0 mm lateraal en 0 mm diepte (subduraal).
- Om de nauwkeurigheid te vergroten, gebruikt u een stereotaxisch gemonteerde boor, nul de stereotaxische manipulator X / Y-as bij het aanraken van bregma - dit is het referentiepunt voor de coördinaten.
- Monteer een headset door alle elektroden in het zespolige voetstuk te plaatsen en ervoor te zorgen dat de pinnen helemaal in het voetstuk worden geduwd. Monteer het voetstuk in de elektrodehouder op een stereotaxisch frame (figuur 1B).
- Lijn elektroden uit boven de bijbehorende braamgaten. Stereotaxisch implanteren gedraaide bipolaire roestvrijstalen draadelektroden in de rechter en linker hippocampus en referentie-elektrode in het cerebellum door de headset langzaam te laten zakken en de elektroden in de braamgaten te leiden.
- Wanneer de hippocampale draaielektrode zich vlak boven het gat bevindt, zet de Z-as op nul en laat langzaam zakken tot -3,0 mm.
- Bedek het schedeloppervlak en de elektroden met tandcement en vul de ruimte tussen het schedeloppervlak en de onderkant van het voetstuk op. De huidranden zullen grenzen aan het tandcement, zodat er geen onderliggend weefsel bloot blijft. Wacht tot het cement droog en uitgehard is. Maak vervolgens de elektrodehouder los van de stereotaxische arm en verwijder de houder van het voetstuk.
- Injecteer 0,1 ml ketoprofen (1 mg / ml, SC) voor analgesie en een tweede dosis van 0,5 ml normosol (SC) voor hydratatie en verwijder het dier uit het stereotaxische frame.
- Plaats een tot 37 °C voorverwarmde isothermische pad in een lege vivariumkooi bedekt met keukenpapier. Zodra het volledig wakker is, plaatst u het dier in een schone kooi met beddengoed en zacht voedsel en brengt u het terug naar het vivarium. Dieren worden vanaf dit punt afzonderlijk gehuisvest om te voorkomen dat ze op elkaars headsets kauwen. Draadstaaftrechters worden niet gebruikt om te voorkomen dat headsets vast komen te zitten, en in plaats daarvan worden waterflessen aan de onderkant van de kooitoppen gebonden en is chow aanwezig in het beddengoed.
- Voer het dier wat zacht voedsel gedurende 72 uur na de operatie en controleer op gewichtsverlies en lichaamsconditiescore. Gedehydrateerde dieren kunnen subcutaan 0,5 ml normosol toegediend krijgen als ze uitgedroogd zijn (gewichtsverlies, verhoogde huidturgor, ingevallen ogen). Ketoprofen kan eenmaal daags subcutaan worden toegediend gedurende nog eens 2 dagen na de operatie (volg het analgesieregime volgens de lokale IACUC-richtlijnen). Laat dieren 4-7 dagen volledig herstellen in hun kooien voordat ze worden overgebracht naar het EEG-registratiesysteem.
3. Elektrisch aanmaakblokprotocol
- Sluit de muizen aan op het EEG-opnamesysteem met behulp van een flexibele kabel die past op de aansluitingen op de muiskop en commutator (zie de lijst met materialen). Laat de dieren een dag acclimatiseren voordat u doorgaat met het onderstaande elektrische stimulatieprotocol. Controleer hun algehele gezondheid en acclimatisatie op een dagelijkse basis en verwijder ze uit het systeem wanneer er tekenen zijn van ziekte, angst en / of continu gewichtsverlies van meer dan 25%
- Verbind beide draden van de stimulerende elektrode met de uitgang van een constante stroomstimulator.
OPMERKING: Het is erg handig om een printplaat te hebben die deze elektroden wegschakelt van de EEG-recorder en naar de stimulator. - Stel de stimulator in om pulsen van 1 ms op 50 Hz te leveren voor een treinduur van 2 s.
- Stel de uitgang van de stimulator in op 20 microampère (μA) en geef de 1epuls.
- Controleer het EEG op een karakteristieke na-ontlading van hoogfrequente pieken die langer meegaan dan de elektrische stimulatiepuls.
- Als er geen ontlading wordt waargenomen, verhoog dan de hoeveelheid geïnjecteerde stroom in stappen van 20 μA totdat een na-ontlading wordt geactiveerd. De benodigde hoeveelheid stroom is de After-Discharge Threshold (ADT).
- Typische ADT's zijn 20-50 μA. Als er geen ontlading wordt waargenomen, zelfs na een toename tot 200 μA, is het oplossen van problemen met elektrische verbindingen en headsetbedrading met een ohmmeter met hoge gevoeligheid vereist. Als het probleem zich in de stimulerende elektrode bevindt, probeer dan te stimuleren met de andere diepte-elektroden.
- Dieren worden aangestoken door 2x of 6x per dag te stimuleren met een stroom die 1,5x de ADT-waarde voor die muis is.
- Controleer de gedragsrespons op de stimulatie, die stijgt van de verandering van toestand naar bilaterale tonisch-clonische aanvallen met vallen. Score met behulp van een aangepast Racine-klassensysteem11. Om opgewekte fatale tonische aanvallen te voorkomen, moet aanmaakhout worden gepauzeerd als opeenvolgende stimuli leiden tot escalerende ernst en lengte van aanvallen tot gemodificeerde Racine-score 6 (rennen en springen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieren
Het model is oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van VGAT-Cre muizen (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 op een gemengde achtergrond. Het is echter ook toegepast op de VGAT-Cre-stam die congeen is met C57BL / 6J. Er is geen verschil waargenomen bij epilepsie die zich ontwikkelt tussen de stammen. Beide stammen drukken Cre-recombinase uit onder controle van de vesiculaire GABA-transporterpromotor. Deze muizen werden gegenereerd door in een IRES-Cre-cassette te kloppen na het stopcodon in het Vgat-gen . Deze muizen broeden normaal, dus ze worden onderhouden als homozygoten. Om genetische drift van de kolonie te voorkomen, koopt u fokkers en gebruikt u alleen F1-generatie muizen voor experimenten. Alle muizen werden ondergebracht in een AAALAC-geaccrediteerd vivarium. Muizen kregen gratis toegang tot voedsel en water, 12 uur licht/donker cycli en een verrijkte omgeving. Voor elektro-encefalografische (EEG) opname werden muizen individueel gehuisvest in doorzichtige plastic kooien (zelfgemaakt), waardoor gelijktijdige videobewaking mogelijk was. Gebruik zowel mannelijke als vrouwelijke muizen voor experimenten. Er is geen verschil waargenomen in termen van aanmaakhoutsnelheid of aanvalsfrequentie tussen de geslachten. De meerderheid van deze studies gebruikte muizen van 8 weken oud op het moment van headsetchirurgie. Men kan echter ook muizen gebruiken die tussen de 4-20 weken oud zijn. Na 4 weken is de schedel van de muis ~ 90% van zijn uiteindelijke maat14, dus het aanbrengen van een headset heeft een minimaal effect op de groei. De tijd tussen de operatie en het begin van het aanmaakblokprotocol is niet kritisch, hoewel muizen tijdens het herstel van de operatie gedurende 72 uur zorgvuldig moeten worden geobserveerd.
Aanmaakhoutparameters
Het elektrische stimulatieprotocol werd ontwikkeld door Lothman en collega's en in detail beschreven in hun paper15 uit 1989. Kortom, de hippocampuselektrode is verbonden met een constante stroomstimulator en een bifasische blokgolfpuls van 1 ms wordt geleverd bij 50 Hz over 2 s. Verschillende parameters van het aanmaakhoutprotocol zijn getest16. Gebruik een stroomintensiteit die 1,5x de minimale hoeveelheid stroom is die nodig is om een elektrografische aanval voor die muis te veroorzaken (After-Discharge Threshold, ADT). Muizen worden twee keer per dag om de dag elektrisch gestimuleerd (2x, halverwege de ochtend en begin van de middag). Figuur 2A toont een overzicht van het aanmaakhoutprotocol en de belangrijkste inbeslagname-eigenschappen. Een fast-kindling protocol is echter ook effectief, hierin worden muizen zes keer per dag gestimuleerd om de dag (6x, een uur tussen de stimulaties). Interessant is dat aanmaakhoutsnelheden vergelijkbaar zijn tussen 2x en 6x protocollen in termen van het aantal stimulaties dat nodig is om de aanmaaktoestand te bereiken (Figuur 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, gemiddelde ± SEM, P = 0,3). De muizen worden als volledig ontstoken beschouwd wanneer in totaal vijf stimulaties tonisch-clonische aanvallen oproepen met verlies van houdingscontrole, wat een gedragsscore van 5 is op een gemodificeerde Racine-schaal17. Aanmaakhout boven dit niveau, zogenaamde over-aanmaakhout, kan worden uitgevoerd, maar brengt het risico met zich mee van een fatale tonische aanval of SUDEP18. De mortaliteit in dit VGAT-Cre protocol is ~13% (15 van de 119 muizen); Dit omvat muizen van beide geslachten die stierven na opgeroepen of spontane aanvallen (8 mannelijk, 7 vrouwelijk).
Epileptische eigenschappen
Het registratiesysteem dat in deze onderzoeken werd gebruikt, is stopgezet. Alternatieve leveranciers van EEG-opname-opstellingen die in gebruik zijn bij de University of Virginia Rodent Epilepsy Monitoring Unit worden vermeld in de Tabel met materialen. Figuur 2A toont een overzicht van het aanmaakhoutprotocol en de belangrijkste inbeslagname-eigenschappen.
Figuur 2: Epileptische eigenschappen van ontstoken VGAT-Cre muizen. (A) Schematisch diagram van het tijdsverloop van een experiment. (B) De verdeling van het aantal elektrische stimulaties dat nodig is om de volledig ontstoken toestand te bereiken. De ontstoken toestand wordt bereikt wanneer stimulaties vijf bilaterale tonisch-clonische motorische aanvallen oproepen. (C) De verdeling van de latentie ten opzichte van de eerste spontane aanval na de laatste elektrische stimulatie. D) De verdeling van de waargenomen aanvalsfrequenties, die wordt berekend als het totale aantal inbeslagnames gedeeld door het aantal geregistreerde dagen. (E) De verdeling van hoe lang muizen epileptisch waren, zoals gedefinieerd door spontane aanvallen die optraden met een inter-epileptisch interval van minder dan 5 dagen. Alle grafieken gebruiken vioolplots waarbij de mediaan wordt weergegeven met een donkere lijn en 25een 75e kwartielenworden weergegeven met lichte lijnen. Het aantal dieren in elk waarnemingspunt wordt weergegeven op de X-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
VGAT-Cre-muizen bereiken meestal het ontstoken toestandscriterium na 15 stimulaties (gepoolde 2x- en 6x-protocollen, gemiddelde ± SD van 7,4 stimulaties, figuur 2B). Zoals te zien is aan de vioolplot van de gegevens, hebben veel dieren minder stimulaties nodig (10) en velen hebben meer nodig (18). Het is niet mogelijk geweest om een factor te vinden die het verschil bepaalt, exclusief geslacht, leeftijd, ADT-waarde of elektrodeplaatsing. Binnen een paar weken nadat ze zijn aangestoken, ontwikkelen de meeste muizen meerdere spontane aanvallen (90%), wat epilepsie definieert. De latentie voor spontane terugkerende aanvallen (SRS) is 10,7 ± 6,3 dagen (figuur 2C). Een fractie van de muizen ontwikkelt SRS voordat ze de ontstoken toestand bereiken. Zoals eerder opgemerkt11, VGAT-Cre muizen zijn niet spontaan epileptisch en hebben elektrische stimulatie nodig om epilepsie te ontwikkelen. Zodra de aanvallen beginnen, treden ze op met een frequentie van 1,3 ± 0,6 aanvallen per dag (figuur 2D). Alle elektrografische aanvallen gaan gepaard met tonisch-clonische motorische aanvallen. De eerste studies waren van korte duur (spontane aanvalsfrequentie gemeten 1-2 weken), maar toen de opnameperiode werd verlengd, werd ontdekt dat de frequentie van aanvallen met de tijd afnam. Met behulp van een willekeurige cut-off van 5 opeenvolgende dagen zonder een aanval, treden betrouwbare aanvallen op gedurende 23 ± 11 dagen. Alles bij elkaar definieert dit de periode waarin ontstoken VGAT-Cre-muizen nuttig zijn voor screeningscampagnes voor geneesmiddelen. Vermogensanalyse met behulp van deze SD en een effectgrootte van 50% reductie toont aan dat 16 muizen per groep nodig zijn voor statistisch significante effecten op stimulaties om te ontsteken, aanvalsfrequentie en epilepsieduur.
Een kenmerk van het ontstoken VGAT-Cre-model dat het onderscheidt van post-status epilepticus-modellen is de afwezigheid van neuronale dood. Dit werd getest met behulp van twee geaccepteerde methoden (figuur 3): één, door kernen te tellen in de CA1-laag gekleurd met anti-NeuN-antilichaam; en twee, door de hoeveelheid fluor-jade C-kleuring te meten in hippocampale subvelden die kwetsbaar zijn voor chemoconvulsieve geïnduceerde celdood (dentate, CA1 en entorhinale cortex).
Figuur 3: Neuronale dood zoals getest door anti-NeuN-kleuring of Fluor-Jade C-kleuring . (A) Plot van anti-NeuN-positieve neuronen in verschillende deelvelden van de hippocampus en entorhinale cortex. Afkortingen zijn als volgt: DGC, dentate granule cell layer; hilus verwijst naar de dentate hilus, CA1, cornus ammonis piramidale laag I; en EC, entorhinale cortex; L2, laag 2; en L3, laag 3. Twee horizontale hersenschijfjes overeenkomend met -4 mm onder bregma werden van elk dier gekleurd (Controlenaïeve muizen, n = 7; epileptische VGAT-Cre, n = 13; zie Straub et al. voor details11). De gegevens werden genormaliseerd tot gemiddelde neuronale tellingen bepaald in naïeve VGAT-Cre-muizen in het respectieve subveld. Afbeeldingen van Fluoro-Jade C-kleuring van een epileptische VGAT-Cre-muis (B) en van een post-status rat (C) (Li / pilocarpine-model, zie Dey et al. voor details en analyse10). Analyse van de Fluoro-Jade C-kleuring van VGAT-Cre-muizen werd gepresenteerd in Straub et al.11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport beschrijft een protocol waarbij elektrisch aanmaakhout van muizen leidt tot epilepsie. Omdat de stimulerende elektrode in de hippocampus wordt geplaatst, is dit een focale limbische epilepsie die temporale kwab epilepsie (TLE) bij patiënten modelleert. Een cruciale stap in dit protocol is het gebruik van VGAT-Cre-muizen, die als gevolg van het inbrengen van een IRES-Cre-recombinasecassette in het Vgat-gen verminderde remmende GABA-stromen vertonen11. C57BL/6 ontwikkelen geen epilepsie na aanmaakhout met dit protocol, hoewel het mogelijk is dat andere muizenstammen dat wel zullen doen.
Het protocol is ontwikkeld met behulp van plaatsing van de stimulerende diepte-elektroden in de hippocampus. De coördinaten voorzagen het doelwit van de perforante padprojecties van de entorhinale cortex als ze het CA1-subveld binnengaan. Het elektrische veld geïnduceerd door elektrische stimulatie is niet gedefinieerd, daarom is de precieze locatie van de elektroden niet kritisch. In feite kunnen knaagdieren overal in het limbische circuit elektrisch worden ontstoken, bijvoorbeeld amygdala en piriforme cortex19. De volgende zijn kritieke stappen in het protocol: één, goed solderen van de EEG-headsets om een lage weerstand tegen de stimulerende stroom te garanderen; twee, met behulp van een tandheelkundige lijm die in tandheelkundige klinieken wordt gebruikt om aan de schedel te binden en een oppervlak te bieden voor hechting van het tandcement; en drie, het gebruik van een constante stroomversterker om de beschreven elektrische pulsen te leveren.
Het oplossen van problemen is meestal beperkt tot het controleren van elektrische verbindingen, waaronder de aansluitingen in de headset, de headset naar de kabel, de kabel naar de commutator en de commutator naar het opnameapparaat. Het gebruik van een ohmmeter met hoge gevoeligheid is van cruciaal belang.
Beperkingen aan de techniek omvatten de vereiste van de juiste expertise en apparatuur om de operaties uit te voeren en het EEG vast te leggen.
Een voordeel van het model ten opzichte van bestaande diermodellen van TLE is dat er minimale sterfte is van neuronen11. De andere TLE-modellen zijn post-status epilepticus-modellen, die uitgebreide neuronale dood veroorzaken10. Deze dood leidt tot uitgebreide activering van microglia, astrocyten en infiltratie door circulerende monocyten. Alles bij elkaar wordt het moeilijk om mechanismen die epilepsie veroorzaken te onderscheiden van mechanismen die worden veroorzaakt door langdurige status epilepticus. Er wordt verwacht dat ontstoken VGAT-Cre-muizen nuttig zullen zijn voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën die zowel anti-epileptisch als anti-epileptisch zijn. Dit rapport biedt belangrijke statistieken en vermogensanalyses die toekomstige inspanningen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen met behulp van deze muizen kunnen begeleiden.
Een ander voordeel van het ontstoken VGAT-Cre-model is het hoge percentage dieren dat epilepsie ontwikkelt (90%) en de regelmaat van de spontane aanvallen. Nadelen van het model zijn een relatief lage aanvalsfrequentie (1,5/dag) en die aanvalsfrequentie neemt na 3 weken af, en in sommige gevallen lijken aanvallen te stoppen. Er worden inspanningen geleverd om deze problemen aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken John Williamson voor de nuttige discussies over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door NIH/NINDS subsidie NS112549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
