Summary
يصف هذا التقرير طرق توليد نموذج لصرع الفص الصدغي بناء على الإشعال الكهربائي للفئران المعدلة وراثيا VGAT-Cre. قد تكون فئران VGAT-Cre المشابهة مفيدة في تحديد أسباب الصرع وفحص العلاجات الجديدة.
Abstract
تم اكتشاف أن إشعال كهربائي لفئران VGAT-Cre أدى إلى نوبات تلقائية وإلكتروغرافية. ركزت ورقة بحثية حديثة على كيفية استخدام فئران VGAT-Cre الفريدة في تطوير نوبات متكررة عفوية (SRS) بعد إشعال النار وآلية محتملة - إدخال Cre في جين VGAT - عطلت تعبيرها وقللت من نغمة GABAergic. توسع الدراسة الحالية هذه الملاحظات لتشمل مجموعة أكبر من الفئران ، مع التركيز على القضايا الرئيسية مثل المدة التي يستمر فيها SRS بعد إشعال النار وتأثير جنس الحيوان وعمره. يصف هذا التقرير البروتوكولات الخاصة بالخطوات الرئيسية التالية: صنع سماعات رأس مزودة بأقطاب عمق الحصين للتحفيز الكهربائي ولقراءة مخطط كهربية الدماغ. عملية جراحية لتثبيت سماعة الرأس بشكل آمن على جمجمة الماوس حتى لا تسقط ؛ والتفاصيل الرئيسية لبروتوكول إشعال النار الكهربائي مثل مدة النبضة وتردد القطار ومدة القطار وكمية التيار المحقون. بروتوكول إشعال النار قوي من حيث أنه يؤدي بشكل موثوق إلى الصرع في معظم الفئران VGAT-Cre ، مما يوفر نموذجا جديدا لاختبار الأدوية الجديدة المضادة للصرع.
Introduction
الصرع هو اضطراب عصبي كبير مع أعباء اقتصادية وبشرية كبيرة. تقدر NINDS أن هناك 3 ملايين أمريكي يعانون من الصرع. يعاني ما يقرب من 0.6 مليون من هؤلاء المرضى من صرع الفص الصدغي (TLE)1. لسوء الحظ ، فشل العلاج الطبي ل TLE في ثلث المرضى بسبب عدم الفعالية أو تطور مقاومة الأدوية أو عدم تحمل الآثار الجانبية2. من الواضح أن هناك حاجة كبيرة لتطوير علاجات جديدة ل TLE، وهو استنتاج تشاركه لجنة العلوم الأساسية لجمعية الصرع الأمريكية، ومجموعة عمل الرابطة الدولية لمكافحة الصرع لاكتشاف أدوية الصرع قبل السريرية، والمجلس الاستشاري الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية3،4.
تستخدم النماذج الحيوانية الحالية لصرع الفص الصدغي إما الاختلاجات الكيميائية (على سبيل المثال ، kainate ، pilocarpine) أو التحفيز الكهربائي لفترات طويلة للحث على حالة صرع طويلة الأمد5،6،7. تموت العديد من الحيوانات أثناء العملية (10٪ -30٪ في الفئران ، حتى 90٪ في الفئران8). الحيوانات التي تنجو وتطور الصرع تظهر موتا عصبيا واسع النطاق في جميع أنحاء الدماغ 9,10. يؤدي هذا الموت إلى سلسلة من الاستجابات ، بدءا من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية والخلايا الوحيدة المتسللة. تشمل الاستجابات العصبية إعادة تنظيم الدوائر (على سبيل المثال ، تنبت الألياف الطحلبية) ، ولادة خلايا عصبية جديدة تفشل في الاندماج بشكل صحيح في الدوائر (على سبيل المثال ، الخلايا الحبيبية خارج الرحم) ، والتغيرات الجوهرية التي تؤدي إلى فرط الاستثارة (على سبيل المثال ، تنظيم قنوات Na +). نموذج الصرع دون موت عصبي كبير سيسهل البحث عن أدوية جديدة مضادة للصرع.
أثناء اختبار فرضية GABA للصرع ، تم اكتشاف أن علاج الفئران VGAT-Cre ببروتوكول إشعال كهربائي خفيف أدى إلى نوبات تلقائية وكهربائية11. بشكل عام ، لا يؤدي إشعال القوارض الكهربائية إلى نوبات عفوية تحدد الصرع ، على الرغم من أنه يمكن ، في حالات الإفراط في إشعال11. تعبر فئران VGAT-Cre عن Cre recombinase تحت سيطرة جين ناقل GABA الحويصلي (VGAT) ، والذي يتم التعبير عنه على وجه التحديد في الخلايا العصبية المثبطة GABAergic. وقد وجد أن إدخال Cre عطل التعبير عن VGAT عند مستويات mRNA والبروتين ، مما يضعف انتقال GABAergic المشبكي في الحصين. وخلص إلى أن الفئران VGAT-Cre المشتعلة يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الآليات المشاركة في تكوين الصرع ولفحص العلاجات الجديدة11. ويقدم هذا التقرير بالتفصيل الأساليب المستخدمة في وضع النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبع استخدام الحيوانات إرشادات REACH12 وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة فيرجينيا.
1. صنع سماعات الرأس بقطبين كهربائيين ثنائي القطب (الشكل 1)
الشكل 1: الخطوات الرئيسية في تصنيع سماعة EEG. (أ) ظهور الأقطاب الكهربائية في الخطوات المختلفة في البروتوكول (الأرقام في خطوة المطابقة اليسرى). (ب) صورة للمنتج النهائي مثبتة في حامل منزلي الصنع يلائم الإطار المجسم. لاحظ أن الحامل ينتهي بمجموعة دبوس طوق تتناسب مع قاعدة سماعة الرأس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قطع 3.5 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ المطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين.
- قم بتجريد حوالي 1 مم من طبقة العزل من السلك من كلا الطرفين. لا تقم بتجريد الكثير من الأسلاك.
- ضع دبوسين على حامل الملزمة بحيث يكون الجزء السفلي من الدبوس الذي يحتوي على شق أطول متجها لأسفل.
- ضع التدفق على الأطراف المجردة من السلك وعلى قمم المسامير.
- قم بقصدير الجزء المجرد من السلك بلحام كاف لتغطيته.
- أضف الحد الأدنى من اللحام إلى الجزء العلوي من الدبوس دون أن يفيض على الجانبين.
- ضع أحد طرفي الطرف المجرد من السلك في الدبوس بعمق يسمح به أثناء ذوبان اللحام.
ملاحظة: يوجد ثقب جانبي حيث يمكن أن يخرج السلك - لا تدع السلك يخرج من الدبوس. يجب أن يبقى كل السلك المجرد داخل الدبوس. - كرر الخطوات 1.6-1.7 للدبوس الثاني ، الآن مع الأطراف الأخرى المجردة من السلك.
- اترك المسامير لمدة 30 ثانية لضبطها ، وقم بإزالتها من حامل الملزمة ، ثم اسحبها للتأكد من أن الاتصال بين السلك والدبابيس قوي ويثبت.
- شطف المسامير في الماء البارد ، ثم تجف.
- تحقق من التوصيل بين الدبوس 1 والسن 2 باستخدام مقياس الأومتر.
- اجمع المسامير الموجودة في نهايات السلك معا ؛ امسكها بالتوازي والإغلاق. المشبك مرقئ إلى وسط السلك. ثم ، قم بتدوير مرقئ ، بحيث يلتوي السلك حول نفسه ضيق إلى حد ما. إزالة مرقئ.
- ثبت ملقط على السلك الملتوي 2 مم أسفل المسامير وثني السلك بزاوية 90 درجة.
- ادفع نفس السلك مرة أخرى 90 درجة للخلف فوق الملقط مما يؤدي إلى انحناء آخر 1 مم من الأول.
- قطع السلك الملتوي بزاوية 45 درجة أسفل الانحناء عند 3.5 مم بمقص حاد صغير.
- قم بإعداد اثنين من هذه الأقطاب الكهربائية ثنائية القطب (الملتوية ذات الدبوس المزدوج) لكل سماعة رأس (اختياري ، والثاني احتياطي في حالة حدوث مشاكل كهربائية مع الأول).
- قم بإعداد قطب مرجعي واحد عن طريق قطع سلك به دبابيس ملحومة من كلا الطرفين إلى قسمين (الخطوات 1.1-1.17 ، الشكل 1 أ).
- قطع السلك في 7 ملم.
- ثني النهاية 1 مم أسفل الحافة.
- بعد ذلك ، قم بتغطية طرف السلك المثني 1 مم بالملقط وقم بتدوير السلك بإحكام حول الملقط لإنشاء حلقة صغيرة (قطرها 1 مم).
- ثني الملف عموديا على الجزء المستقيم من السلك لجعل طرف السلك يشير إلى الخارج مرة أخرى.
- قم بتجميع القطبين ثنائي القطب والقطب المرجعي الفردي في قاعدة التمثال ذات الستة سنون بطريقة تكون فيها الأقطاب ثنائية القطب جنبا إلى جنب مع مسافة 6 مم بينهما ، وأن يتم وضع القطب المرجعي في الفتحة الخارجية الوسطى (الشكل 1 ب).
ملاحظة: هناك طريقة بديلة تتمثل في زرع الأقطاب الكهربائية ، وتثبيتها في مكانها ، ثم إدخال دبابيسها في القاعدة.
2. زرع القطب التجسيمي
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية ومجموعة القطب الكهربائي ذات الستة سنون عن طريق التعقيم قبل الجراحة. يجب الحفاظ على مجال جراحي معقم أثناء الجراحة ، ويجب استخدام قفازات جراحية معقمة. يوصى باستخدام الستائر المعقمة (على سبيل المثال ، Press n 'Seal) لتغطية الحيوان باستثناء منطقة الجراحة.
- استخدم فئران VGAT-Cre البالغة من العمر 8 أسابيع (المتطابقة مع العمر ، ذكورا وإناثا) لإجراء العمليات الجراحية بعد 4 أسابيع من الفطام. سجل وزن الحيوان قبل الجراحة للسماح بقياس فقدان الوزن بعد الجراحة.
- استخدم مبخر إيزوفلوران معتمد أو نظام تخدير منخفض التدفق مزود بمضخة حقنة دقيقة ومبخر رقمي متكامل ووسادة حرارية مرتدة.
ملاحظة: أنظمة التدفق المنخفض قادرة على تقديم التخدير بمعدلات تدفق منخفضة تتناسب مع حجم الحيوان إما في غرفة الحث أو من خلال مخروط الأنف على الإطار التجسيمي (70 مل / دقيقة ، تركيز الأيزوفلوران في الهواء هو 4٪ للحث و 2٪ للجراحة). إن استخدام تخدير أقل لا يفيد الحيوان أثناء العمليات الجراحية فحسب ، بل يقلل أيضا من خطر تعرض موظفي المختبر للأيزوفلوران. - ضع الحيوان المخدر على ضمادة ساخنة دافئة إلى 37 درجة مئوية لإبقائه دافئا أثناء الجراحة. في حالة استخدام نظام درجة حرارة يتم التحكم فيه بالتغذية المرتدة ، أدخل مسبار درجة الحرارة المشحم قليلا في مستقيم الحيوان لمراقبة درجة الحرارة أثناء الجراحة.
- قم بتركيب الحيوان على الإطار التجسيمي عن طريق وضع قضبان الأذن برفق في الأذنين والأسنان العلوية الأمامية في شريط القاطعة. ضع مخروط الأنف على الأنف لتوصيل التخدير المناسب. تأكد من أن الرأس مستوي ومتمركز ولا يمكن تحريكه عند فحصه قليلا.
- حقن تحت الجلد 0.5 مل من النورموسول للترطيب.
- تطبيق مواد التشحيم العينية لمنع جفاف القرنية.
- مراقبة عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس الانسحاب بعد معسر إصبع القدم الخلفي ، ثم تقليل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ -2.0٪ أثناء الجراحة.
- إزالة الشعر في وحول المنطقة الجراحية عن طريق نتف أو استخدام كليبرز (الحلاقة) أو كريم مزيل الشعر ، وتطهير الجلد مع ثلاث دورات من التطبيق بالتناوب من اليود والإيثانول ، والانتهاء من اليود. يوصى بإزالة الشعر بعيدا عن موقع الجراحة فقط إذا كانت هناك وسائل للحفاظ على التخدير في ذلك الموقع. إذا لزم الأمر ، استخدم أدوات وضع أطراف قطنية مغموسة بالكحول لإزالة الشعر من المنطقة المحيطة بالرأس مباشرة. حقن 0.05 مل من بوبيفاكايين مسكن محلي (0.25 ٪) تحت الجلد.
- قم بعمل شق على الجمجمة باستخدام مشرط ، ثم قطع جزء من الجلد بمقص جراحي حاد ، وفضح الجمجمة. دفع الجلد جانبا ، باستخدام قطعة قطن ، وتنظيف الجمجمة من جميع العضلات والأنسجة الكامنة التي تعيق الرؤية.
ملاحظة: لوقف النزيف العرضي ، اضغط على موقع النزيف بقطعة قطن معقمة حتى تتوقف. - نظف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين باستخدام مسحات قطنية معقمة لجعل خيوط الجمجمة وكل من البريجما واللامدا مرئية.
- جفف الجمجمة جيدا ، ثم ضع قطرة واحدة من لاصق الأسنان ذاتي النقش باستخدام قضيبها. قم بتنظيفه في الجمجمة ، وانتظر 60 ثانية ، وعالجه بضوء الأشعة فوق البنفسجية للأسنان لمدة 40 ثانية. يشير السطح اللامع إلى أن المادة اللاصقة قد تم ربطها بشكل فعال مع الجمجمة.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للتثبيت الآمن لسماعة الرأس. - استخدم مثقاب 0.031 بوصة (0.79 مم) لحفر فتحتين من النتوءات بشكل ثنائي لزرع أقطاب عمق الحصين (حوالي 5000 دورة في الدقيقة). احفر ثقبا إضافيا للقطب المرجعي فوق المخيخ خلف لامدا.
ملاحظة: عند الحفر ، احرص على خفض الحفر ببطء وتجنب الحفر في الدماغ. - إحداثيات الأقطاب الكهربائية هي كما يلي (من bregma بالملليمتر): أقطاب الحصين عند عمق 3 مم خلفي و 3 مم جانبي وعمق 3 مم. والقطب المرجعي المخيخي عند 6 مم خلفي ، 0 مم جانبي ، وعمق 0 مم (تحت الجافية).
- لزيادة الدقة ، استخدم مثقابا مثبتا بشكل مجسم ، وقم بصفر محور X / Y للمناور التجسيمي عند لمس bregma - هذه هي النقطة المرجعية للإحداثيات.
- قم بتجميع سماعة رأس عن طريق إدخال جميع الأقطاب الكهربائية في القاعدة ذات الستة سنون ، مع التأكد من دفع المسامير بالكامل إلى القاعدة. قم بتركيب القاعدة في حامل القطب على إطار مجسم (الشكل 1 ب).
- قم بمحاذاة الأقطاب الكهربائية فوق فتحات الأزيز المقابلة. زرع أقطاب كهربائية من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ ثنائية القطب الملتوية بشكل مجسم في الحصين الأيمن والأيسر والقطب المرجعي في المخيخ عن طريق خفض سماعة الرأس ببطء وتوجيه الأقطاب الكهربائية إلى ثقوب الأزيز.
- عندما يكون قطب الحصين الملتوي فوق الفتحة مباشرة ، قم بتصفير المحور Z وانخفض ببطء إلى -3.0 مم.
- قم بتغطية سطح الجمجمة والأقطاب الكهربائية بأسمنت الأسنان واملأ الفراغ بين سطح الجمجمة وأسفل القاعدة. ستكون حواف الجلد مجاورة لأسمنت الأسنان بحيث لا تبقى الأنسجة الكامنة مكشوفة. انتظر حتى يجف الأسمنت ويتصلب. ثم افصل حامل القطب الكهربائي عن الذراع التجسيمي وقم بإزالة الحامل من قاعدة التمثال.
- حقن 0.1 مل من كيتوبروفين (1 ملغ / مل ، SC) للتسكين وجرعة ثانية من 0.5 مل من النورموسول (SC) للترطيب وإزالة الحيوان من الإطار المجسم.
- ضع وسادة متساوية الحرارة مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية داخل قفص فارغ مغطى بمنشفة ورقية. بمجرد أن يستيقظ تماما ، ضع الحيوان في قفص نظيف مع الفراش والطعام اللين ، وأعده إلى بيت الحيوان. يتم إيواء الحيوانات منفردة من هذه النقطة فصاعدا لمنع مضغ سماعات الرأس الخاصة ببعضها البعض. لا يتم استخدام قواديس شريط الأسلاك لتجنب تعطل سماعات الرأس ، وبدلا من ذلك ، يتم ربط زجاجات المياه بالجانب السفلي من قمم القفص ، ويوجد تشاو في الفراش.
- إطعام الحيوان بعض الطعام اللين لمدة 72 ساعة بعد الجراحة ، ومراقبة فقدان الوزن ودرجة حالة الجسم. يمكن إعطاء الحيوانات المجففة 0.5 مل من النورموسول تحت الجلد إذا كانت مجففة (فقدان الوزن ، زيادة تورم الجلد ، العيون الغائرة). يمكن إعطاء كيتوبروفين تحت الجلد مرة واحدة يوميا لمدة 2 أيام أخرى بعد الجراحة (اتبع نظام التسكين وفقا لإرشادات IACUC المحلية). اسمح للحيوانات بالتعافي تماما في أقفاصها لمدة 4-7 أيام قبل نقلها إلى نظام تسجيل EEG.
3. بروتوكول إشعال كهربائي
- قم بتوصيل الفئران بنظام تسجيل EEG باستخدام كابل مرن يناسب المقابس الموجودة على رأس الماوس والمبدل (انظر قائمة جدول المواد ). اسمح للحيوانات بالتأقلم لمدة يوم واحد قبل متابعة بروتوكول التحفيز الكهربائي أدناه. مراقبة صحتهم العامة وتأقلمهم على أساس يومي ، وإزالتهم من النظام عندما تكون هناك علامات للمرض و / أو الضيق و / أو فقدان وزن الجسم المستمر الذي يتجاوز 25٪
- قم بتوصيل كلا الخيوط من القطب المنجذب بإخراج محفز تيار ثابت.
ملاحظة: من المفيد جدا أن يكون لديك لوحة دائرة تقوم بتبديل هذه الأقطاب الكهربائية بعيدا عن مسجل EEG وإلى المحفز. - اضبط المحفز لتوصيل نبضات 1 مللي ثانية عند 50 هرتز لمدة قطار 2 ثانية.
- اضبط خرج المحفز على 20 ميكروأمبير (μA) وقمبتوصيل النبضة 1.
- راقب مخطط كهربية الدماغ بحثا عن خاصية ما بعد التفريغ للطفرات عالية التردد التي تدوم أكثر من نبض التحفيز الكهربائي.
- إذا لم يلاحظ أي تفريغ ، فقم بزيادة كمية التيار المحقون بزيادات قدرها 20 μA حتى يتم تشغيل التفريغ اللاحق. مقدار التيار المطلوب هو عتبة ما بعد التفريغ (ADT).
- ADTs النموذجية هي 20-50 μA. إذا لم يلاحظ أي تفريغ حتى بعد زيادته إلى 200 μA ، فيجب استكشاف أخطاء التوصيلات الكهربائية وأسلاك سماعات الرأس ذات مقياس الحساسية العالية وإصلاحها. إذا كانت المشكلة في القطب المحفز ، فحاول التحفيز باستخدام أقطاب العمق الأخرى.
- يتم إشعال الحيوانات عن طريق تحفيز إما 2x أو 6x يوميا باستخدام تيار يبلغ 1.5x قيمة ADT لهذا الماوس.
- مراقبة الاستجابة السلوكية للتحفيز ، والتي ترتفع من تغيير الحالة إلى نوبات الصرع التوتري الرمعي الثنائية مع السقوط. سجل باستخدام نظام فئة راسين المعدل11. لتجنب نوبات منشط قاتلة ، يجب إيقاف الإشعال مؤقتا إذا أدت المحفزات المتتالية إلى تصاعد شدة وطول النوبات حتى درجة راسين المعدلة 6 (الجري والقفز)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحيوانات
تم تطوير النموذج في الأصل باستخدام فئران VGAT-Cre (Slc32a1tm2 (cre) Lowl / J) 13 على خلفية مختلطة. ومع ذلك ، فقد تم تطبيقه أيضا على سلالة VGAT-Cre الملائمة مع C57BL / 6J. لم يلاحظ أي فرق في الصرع الذي يتطور بين السلالات. تعبر كلتا السلالتين عن Cre recombinase تحت سيطرة مروج ناقل GABA الحويصلي. تم إنشاء هذه الفئران عن طريق الطرق في شريط IRES-Cre بعد كودون التوقف في جين Vgat . تتكاثر هذه الفئران بشكل طبيعي ، لذلك يتم الحفاظ عليها كزيجوت متماثل. لمنع الانجراف الجيني للمستعمرة ، قم بشراء المربين واستخدم فقط فئران الجيل F1 لإجراء التجارب. تم إيواء جميع الفئران في حظيرة معتمدة من AAALAC. تم منح الفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء ، ودورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، وبيئة غنية. بالنسبة لتسجيل تخطيط كهربية الدماغ (EEG) ، تم إيواء الفئران بشكل فردي في أقفاص بلاستيكية شفافة (محلية الصنع) ، مما يسمح بمراقبة الفيديو المتزامنة. استخدم كل من الفئران الذكور والإناث لإجراء التجارب. لم يلاحظ أي فرق من حيث معدل إشعال النار أو تواتر النوبات بين الجنسين. استخدمت غالبية هذه الدراسات فئران عمرها 8 أسابيع في وقت جراحة سماعة الرأس. ومع ذلك ، يمكن للمرء أيضا استخدام الفئران التي يتراوح عمرها بين 4-20 أسبوعا. في 4 أسابيع ، تكون جمجمة الفأر ~ 90٪ من حجمها النهائي14 ، لذا فإن لصق سماعة الرأس له تأثير ضئيل على النمو. الوقت بين الجراحة وبدء بروتوكول إشعال النار ليس حرجا ، على الرغم من أن الفئران تحتاج إلى مراقبة بعناية أثناء التعافي من الجراحة لمدة 72 ساعة.
تأجيج المعلمات
تم تطوير بروتوكول التحفيز الكهربائي من قبل لوثمان وزملائه في العمل وتم وصفه بالتفصيل في ورقتهمالبحثية 15 لعام 1989. باختصار ، يتم توصيل قطب الحصين بمحفز تيار ثابت ، ويتم توصيل نبضة موجة مربعة ثنائية الطور 1 مللي ثانية عند 50 هرتز على مدار 2 ثانية. تم اختبار المعلمات المختلفة لبروتوكول إشعال16. استخدم شدة تيار تبلغ 1.5 ضعف الحد الأدنى من التيار المطلوب لإحداث نوبة كهربية لهذا الفأر (عتبة ما بعد التفريغ ، ADT). يتم تحفيز الفئران كهربائيا مرتين في اليوم كل يوم (2x ، منتصف الصباح وبعد الظهر الباكر). يوضح الشكل 2 أ نظرة عامة على بروتوكول إشعال النار وخصائص الاستيلاء الرئيسية. ومع ذلك ، فإن بروتوكول الإشعال السريع فعال أيضا ، حيث يتم تحفيز الفئران ست مرات في اليوم يتم تسليمها كل يوم (6x ، ساعة واحدة بين التحفيز). ومن المثير للاهتمام ، أن معدلات إشعال النار متشابهة بين بروتوكولات 2x و 6x من حيث عدد المحفزات المطلوبة لتحقيق حالة إشعال (الشكل 2B: 2x ، 15 ± 1 ، n = 46 ؛ 6x ، 13 ± 1 ، n = 12 ، يعني ± SEM ، P = 0.3). تعتبر الفئران مشتعلة تماما عندما يثير ما مجموعه خمسة محفزات نوبات تشنجية رمعية مع فقدان السيطرة على الوضع ، وهي درجة سلوكية تبلغ 5 على مقياس راسين المعدل17. يمكن إجراء إشعال ما بعد هذا المستوى ، ما يسمى بالإفراط في إشعال النار ، ولكنه يحمل خطر حدوث نوبة منشط قاتلة أو SUDEP18. معدل الوفيات في بروتوكول VGAT-Cre هذا هو ~ 13٪ (15 من أصل 119 فئران) ؛ وهذا يشمل الفئران من أي من الجنسين التي ماتت بعد نوبات مستثارة أو عفوية (8 ذكور ، 7 إناث).
خصائص الضبط
تم إيقاف نظام التسجيل المستخدم في هذه الدراسات. يتم توفير موردين بديلين لإعدادات تسجيل EEG المستخدمة في وحدة مراقبة الصرع القوارض بجامعة فيرجينيا في جدول المواد. يوضح الشكل 2 أ نظرة عامة على بروتوكول إشعال النار وخصائص الاستيلاء الرئيسية.
الشكل 2: خواص النوبة لفئران VGAT-Cre المشتعلة. أ: رسم تخطيطي للمسار الزمني للتجربة. ب: توزيع عدد المحفزات الكهربية اللازمة للوصول إلى الحالة الكاملة الاشتعال. تتحقق حالة الإشعال عندما تثير المحفزات خمس نوبات حركية ثنائية منشطة. ج: توزيع الكمون على أول نوبة تلقائية بعد آخر تحفيز كهربائي. د: توزيع ترددات النوبات المرصودة، ويحسب على أنه إجمالي عدد النوبات مقسوما على عدد الأيام المسجلة. (ه) توزيع مدة صرع الفئران كما هو محدد من خلال النوبات التلقائية التي تحدث مع فاصل زمني بين النوبات أقل من 5 أيام. تستخدم جميع الرسوم البيانية مخططات الكمان حيث يظهر الوسيط بخط داكن ويظهرالربعان 25و 75 بخطوط ضوئية. يظهر عدد الحيوانات في كل قطعة أرض على المحور السيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
عادة ما تصل فئران VGAT-Cre إلى معيار الحالة المشعلة بعد 15 تحفيزا (بروتوكولات 2x و 6x مجمعة ، متوسط ± SD من 7.4 تحفيز ، الشكل 2B). كما يتضح من مخطط الكمان للبيانات ، تتطلب العديد من الحيوانات تحفيزا أقل (10) والعديد منها يتطلب المزيد (18). لم يكن من الممكن العثور على عامل يحدد الفرق ، باستثناء الجنس أو العمر أو قيمة ADT أو موضع القطب. في غضون أسابيع قليلة من إشعال النار ، تصاب معظم الفئران بنوبات عفوية متعددة (90٪) ، والتي تحدد الصرع. الكمون للنوبات المتكررة التلقائية (SRS) هو 10.7 ± 6.3 أيام (الشكل 2C). يصاب جزء صغير من الفئران ب SRS قبل الوصول إلى حالة الإشعال. كما لوحظ سابقا11 ، الفئران VGAT-Cre ليست صرع تلقائيا وتتطلب التحفيز الكهربائي لتطوير الصرع. بمجرد أن تبدأ النوبات ، تحدث بتردد 1.3 ± 0.6 نوبة في اليوم (الشكل 2 د). جميع النوبات الكهربية مصحوبة بنوبات حركية منشطة. كانت الدراسات الأولية قصيرة الأجل (تم قياس تكرار النوبات التلقائية 1-2 أسابيع) ، ولكن عندما تم تمديد فترة التسجيل ، تم اكتشاف أن تكرار النوبات يتضاءل بمرور الوقت. باستخدام قطع تعسفي لمدة 5 أيام متتالية دون نوبة ، تحدث نوبات موثوقة لمدة 23 ± 11 يوما. مجتمعة ، يحدد هذا الفترة التي تكون فيها فئران VGAT-Cre مفيدة لحملات فحص المخدرات. يظهر تحليل الطاقة باستخدام SD وحجم التأثير بنسبة 50٪ أن 16 فأرا لكل مجموعة مطلوبة للتأثيرات ذات الدلالة الإحصائية على التحفيز على إشعال النار وتكرار النوبات ومدة الصرع.
من سمات نموذج VGAT-Cre الذي يميزه عن نماذج الصرع بعد الحالة عدم وجود موت عصبي. تم فحص ذلك باستخدام طريقتين مقبولتين (الشكل 3): الأولى ، عن طريق حساب النوى في طبقة CA1 الملطخة بجسم مضاد ل NeuN. والثاني ، عن طريق قياس كمية تلطيخ Fluoro-Jade C في الحقول الفرعية الحصين المعرضة لموت الخلايا الناجم عن الاختلاج الكيميائي (المسنن ، CA1 ، والقشرة المخية الداخلية).
الشكل 3: موت الخلايا العصبية كما تم فحصه إما عن طريق تلطيخ مضاد للنيوين أو تلطيخ فلورو جايد سي. أ: مخطط الخلايا العصبية المضادة ل NeuN في مختلف المجالات الفرعية للحصين والقشرة المخية الداخلية. الاختصارات هي كما يلي: DGC ، طبقة الخلايا الحبيبية المسننة ؛ يشير هيلوس إلى هيلوس المسنن ، CA1 ، طبقة الذرة الأمونيس الهرمية الأولى. و EC ، القشرة المخية الداخلية. L2 ، الطبقة 2 ؛ و L3 ، الطبقة 3. تم تلطيخ شريحتين أفقيتين من الدماغ تقابلان -4 مم أسفل البريغما من كل (السيطرة على الفئران الساذجة ، ن = 7 ؛ الصرع VGAT-Cre ، ن = 13 ؛ انظر Straub et al. لمزيد من التفاصيل11). تم تطبيع البيانات إلى متوسط عدد الخلايا العصبية المحددة في الفئران الساذجة VGAT-Cre في الحقل الفرعي المعني. صور تلطيخ Fluoro-Jade C من فأر VGAT-Cre مصاب بالصرع (B) ومن فأر ما بعد الحالة (C) (نموذج Li / pilocarpine ، انظر Dey et al. للحصول على التفاصيل والتحليل10). تم تقديم تحليل تلطيخ Fluoro-Jade C لفئران VGAT-Cre في Straub et al.11). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا التقرير بروتوكولا يؤدي فيه إشعال الفئران كهربائيا إلى الصرع. نظرا لأن القطب المنبه يوضع في الحصين ، فهذا صرع حوفي بؤري يصمم صرع الفص الصدغي (TLE) في المرضى. تتمثل الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول في استخدام فئران VGAT-Cre ، والتي بسبب إدخال شريط IRES-Cre recombinase في جين Vgat ، تظهر تيارات GABA المثبطةالضعيفة 11. C57BL / 6 لا تتطور الصرع بعد إشعال هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه من الممكن أن سلالات أخرى من الفئران سوف.
تم تطوير البروتوكول باستخدام وضع أقطاب العمق المحفزة في الحصين. زودت الإحداثيات الهدف بإسقاطات المسار المثقوبة من القشرة المخية الداخلية عند دخولها الحقل الفرعي CA1. لم يتم تحديد المجال الكهربائي الناجم عن التحفيز الكهربائي ، وبالتالي ، فإن الموقع الدقيق للأقطاب الكهربائية ليس حرجا. في الواقع ، يمكن إشعال القوارض كهربائيا في أي مكان في الدائرة الحوفية ، على سبيل المثال ، اللوزة وقشرة الكمثري19. فيما يلي خطوات حاسمة في البروتوكول: واحد ، لحام مناسب لسماعات EEG لضمان مقاومة منخفضة للتيار المحفز. اثنان ، باستخدام مادة لاصقة للأسنان قيد الاستخدام في عيادات الأسنان لربط الجمجمة وتوفير سطح للتصاق الأسمنت السني ؛ وثالثا ، استخدام مضخم تيار ثابت لتوصيل النبضات الكهربائية الموصوفة.
عادة ما يقتصر استكشاف الأخطاء وإصلاحها على فحص التوصيلات الكهربائية ، والتي تشمل التوصيلات في سماعة الرأس ، وسماعة الرأس بالكابل ، والكابل بمبدل التيار ، ومبدل التيار بجهاز التسجيل. يعد استخدام مقياس الأومتر ذو الحساسية العالية أمرا بالغ الأهمية.
تشمل القيود المفروضة على هذه التقنية متطلبات الخبرة والمعدات المناسبة لإجراء العمليات الجراحية وتسجيل مخطط كهربية الدماغ.
ميزة النموذج على النماذج الحيوانية الحالية من TLE هو أن هناك الحد الأدنى من موت الخلايا العصبية11. نماذج TLE الأخرى هي نماذج الصرع بعد الحالة ، والتي تؤدي إلى موت الخلايا العصبية واسعة النطاق10. يؤدي هذا الموت إلى تنشيط واسع النطاق للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية والتسلل عن طريق الخلايا الوحيدة المتداولة. مجتمعة ، يصبح من الصعب التمييز بين الآليات التي تسبب الصرع والآليات الناجمة عن حالة الصرع لفترات طويلة. من المتوقع أن تكون فئران VGAT-Cre الموقد مفيدة لتطوير علاجات جديدة مضادة للنوبات ومضادة للصرع. يقدم هذا التقرير المقاييس الرئيسية وتحليل القوة التي يمكن أن توجه جهود تطوير الأدوية المستقبلية باستخدام هذه الفئران.
ميزة أخرى لنموذج VGAT-Cre المشتعل هي النسبة العالية من الحيوانات التي تصاب بالصرع (90٪) وانتظام النوبات التلقائية. عيوب النموذج هي تكرار نوبات منخفض نسبيا (1.5 / يوم) وأن تكرار النوبات ينخفض بعد 3 أسابيع ، وفي بعض الحالات يبدو أن النوبات تتوقف. وتبذل الجهود حاليا لمعالجة هذه القضايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون جون ويليامسون على المناقشات المفيدة حول هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NINDS NS112549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
