Summary
Denne rapporten beskriver metodene for å generere en modell av temporallappsepilepsi basert på elektrisk kindling av transgene VGAT-Cre-mus. Tente VGAT-Cre-mus kan være nyttige for å bestemme hva som forårsaker epilepsi og for screening av nye terapier.
Abstract
Det ble oppdaget at elektrisk tenning av VGAT-Cre-mus førte til spontanmotoriske og elektrografiske anfall. Et nylig papir fokuserte på hvordan unike VGAT-Cre-mus ble brukt til å utvikle spontane tilbakevendende anfall (SRS) etter tenning og en sannsynlig mekanisme - innsetting av Cre i VGAT-genet - forstyrret uttrykket og reduserte GABAerg tone. Den nåværende studien utvider disse observasjonene til en større kohorte av mus, med fokus på viktige spørsmål som hvor lenge SRS fortsetter etter tenning og effekten av dyrets kjønn og alder. Denne rapporten beskriver protokollene for følgende nøkkeltrinn: lage hodetelefoner med hippocampus dybdeelektroder for elektrisk stimulering og for å lese elektroensfalogrammet; kirurgi for å feste hodesettet sikkert på musens skalle slik at det ikke faller av; og viktige detaljer i den elektriske tenningsprotokollen, for eksempel pulsens varighet, togfrekvens, varighet av toget og mengde strøm injisert. Kindling-protokollen er robust ved at den pålitelig fører til epilepsi hos de fleste VGAT-Cre-mus, og gir en ny modell for å teste for nye antiepileptogene legemidler.
Introduction
Epilepsi er en alvorlig nevrologisk lidelse med betydelige økonomiske og menneskelige byrder. NINDS anslår at det er 3 millioner amerikanere med epilepsi. Omtrent 0,6 millioner av disse pasientene har temporallappsepilepsi (TLE)1. Dessverre svikter medisinsk behandling av TLE hos en tredjedel av pasientene på grunn av ineffektivitet, utvikling av legemiddelresistens eller intoleranse mot bivirkninger2. Det er klart at det er et betydelig behov for å utvikle nye terapier for TLE, en konklusjon som deles av American Epilepsy Society Basic Science Committee, International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery og National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Nåværende dyremodeller av temporallappsepilepsi bruker enten kjemokonvulsiva midler (f.eks. kainate, pilokarpin) eller langvarig elektrisk stimulering for å indusere en langvarig status epilepticus 5,6,7. Mange dyr dør under prosedyren (10% -30% hos rotter, opptil 90% hos mus8). Dyr som overlever og utvikler epilepsi viser omfattende nevrondød i hele hjernen 9,10. Denne døden utløser en kaskade av responser, som begynner med aktivering av mikroglia, astrocytter og infiltrerende monocytter. Neuronale responser inkluderer kretsomorganisering (f.eks. Mossy fiberspiring), fødsel av nye nevroner som ikke klarer å integrere riktig i kretser (f.eks. Ektopiske granulatceller) og inneboende endringer som fører til hyperexcitability (f.eks. Oppregulering av Na + kanaler). En epilepsimodell uten signifikant nevrondød vil lette søket etter nye antiepileptika.
Under testing av GABA-hypotesen om epilepsi ble det oppdaget at behandling av VGAT-Cre-mus med en mild elektrisk tenningsprotokoll førte til spontanmotoriske og elektrografiske anfall11. Generelt fører elektrisk tenning av gnagere ikke til spontane anfall som definerer epilepsi, selv om det kan, i tilfeller av overtenning11. VGAT-Cre-mus uttrykker Cre rekombinase under kontroll av det vesikulære GABA-transportørgenet (VGAT), som er spesifikt uttrykt i GABAerge hemmende nevroner. Det ble funnet at innsetting av Cre forstyrret ekspresjonen av VGAT på mRNA- og proteinnivåene, og dermed svekket GABAerg synaptisk overføring i hippocampus. Det ble konkludert med at tente VGAT-Cre-mus kunne være nyttige for å studere mekanismene involvert i epileptogenese og for screening av nye terapier11. Denne rapporten gir metodene som brukes til å generere modellen i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrebruk fulgte ARRIVE12 retningslinjer og ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Lage hodetelefoner med to bipolare elektroder (figur 1)
Figur 1: Viktige trinn i fabrikasjon av EEG-hodesett. (A) Utseendet til elektrodene på de forskjellige trinnene i protokollen (tall i venstre kamptrinn). (B) Et bilde av sluttproduktet montert i en hjemmelaget holder som passer til den stereotaktiske rammen. Merk at holderen ender med en kragestiftenhet som passer inn i hodesettets sokkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Klipp 3,5 cm rustfritt polytetrafluoretylenbelagt rustfritt ståltråd.
- Fjern ca. 1 mm av isolasjonsbelegget av ledningen i begge ender. Ikke ha for mye av ledningen strippet.
- Sett to pinner på en viserholder med den nederste delen av tappen som har en lengre spalt vendt nedover.
- Påfør flux på de strippede endene av ledningen og på toppen av pinnene.
- Tinn den strippede delen av ledningen med akkurat nok loddetinn til å belegge den.
- Legg til en minimal mengde loddetinn på toppen av tappen uten å renne over på sidene.
- Plasser den ene enden av de strippede endene av ledningen i tappen så dypt som det tillater mens loddet smelter.
NOTAT: Det er et sidehull der ledningen kan komme ut - ikke la ledningen komme ut av pinnen. All den strippede ledningen må holde seg innenfor pinnen. - Gjenta trinn 1,6-1,7 for den andre pinnen, nå med de andre strippede endene av ledningen.
- La pinnene sitte i 30 s for å stivne, fjern dem fra viserholderen, og trekk deretter i dem for å sikre at forbindelsen mellom ledningen og pinnene er sterk og holder.
- Skyll pinnene i kaldt vann, og tørk deretter.
- Kontroller konduktans mellom pinne 1 og pinne 2 ved hjelp av et ohmmeter.
- Ta pinnene i enden av ledningen sammen; Hold dem parallelle og nære. Klem en hemostat til midten av ledningen. Deretter roterer hemostaten, slik at ledningen vrir seg ganske stramt. Fjern hemostaten.
- Klem en tang på den vridde ledningen 2 mm under pinnene og bøy ledningen 90°.
- Skyv den samme ledningen igjen 90° tilbake over tangen, og lag en annen bøy 1 mm fra den første.
- Klipp den vridde ledningen i en 45° vinkel under bøyningen ved 3,5 mm med en liten skarp saks.
- Forbered to av disse bipolare (dobbeltpinners vridde) elektrodene for hvert hodesett (valgfritt, andre er sikkerhetskopiering i tilfelle elektriske problemer med det første).
- Forbered en enkelt referanseelektrode ved å kutte en ledning med pinner loddet i begge ender i to (trinn 1.1-1.17, figur 1A).
- Klipp ledningen ved 7 mm.
- Bøy enden 1 mm under spissen.
- Dekk deretter den bøyde 1 mm spissen av ledningen med tang og roter ledningen stramt rundt tangen for å lage en liten sløyfe (1 mm i diameter).
- Bøy løkken vinkelrett på den rette delen av ledningen for å få trådspissen til å peke utover igjen.
- Monter de to bipolare elektrodene og den enkle referanseelektroden i den sekspinners sokkelen slik at de bipolare elektrodene er side om side med 6 mm avstand mellom dem, og at referanseelektroden er plassert i det midtre ytre hullet (figur 1B).
MERK: En alternativ metode er å implantere elektrodene, sementere dem på plass og deretter sette pinnene inn i sokkelen.
2. Stereotaktisk elektrodeimplantasjon
- Steriliser alle kirurgiske verktøy og den seks-pinners elektrodeenheten ved autoklavering før operasjonen. Et sterilt kirurgisk felt må opprettholdes under operasjonen, og sterile kirurgiske hansker må brukes. Sterile gardiner (f.eks. Press n' Seal) anbefales for å dekke dyret bortsett fra operasjonsområdet.
- Bruk 8 uker gamle VGAT-Cre mus (aldersmatchet, både mann og kvinne) for operasjoner 4 uker etter avvenning. Registrer dyrets vekt før kirurgi for å tillate måling av postkirurgisk vekttap.
- Bruk en sertifisert isofluran fordamper eller et lavstrømningsanestesisystem utstyrt med en presisjonssprøytepumpe, integrert digital fordamper og tilbakemeldingsvarmepute.
MERK: Lavstrømningssystemer er i stand til å levere anestesi ved lave strømningshastigheter proporsjonalt med dyrets størrelse inn i enten et induksjonskammer eller gjennom en nesekjegle på den stereotaksiske rammen (70 ml / min, isofluran konsentrasjon i luft er 4% for induksjon og 2% for kirurgi). Bruk av mindre anestesi gagner ikke bare dyret under operasjoner, men reduserer også risikoen for laboratoriepersonells eksponering for isofluran. - Plasser det bedøvede dyret på en oppvarmet pute oppvarmet til 37 °C for å holde den varm under operasjonen. Hvis du bruker et tilbakemeldingskontrollert temperatursystem, sett den lett smurte temperatursonden inn i endetarmen til dyret for temperaturovervåking under operasjonen.
- Monter dyret på den stereotaktiske rammen ved forsiktig å plassere ørestenger i ørene og de fremre øvre tennene i snittstangen. Plasser nesekeglen over nesen for riktig anestesilevering. Forsikre deg om at hodet er jevnt og sentrert og ikke kan flyttes når det er litt undersøkt.
- Injiser subkutant 0,5 ml normosol for hydrering.
- Påfør okulært smøremiddel for å forhindre hornhindetørke.
- Overvåk dybden av anestesi ved fravær av tilbaketrekningsrefleksen etter å ha klemt en bakbentå, og reduser deretter isofluran til 1,5% -2,0% under operasjonen.
- Fjern håret på og rundt operasjonsområdet ved å plukke eller bruke klippere (barbering) eller hårfjerningskrem, og desinfiser huden med tre sykluser med vekslende påføring av jod og etanol, og avslutt med jod. Fjerning av hår vekk fra operasjonsstedet anbefales bare hvis det er midler for å opprettholde anestesi på det stedet. Om nødvendig, bruk alkoholdyppede bomullsspissapplikatorer for å fjerne hår fra nærområdet rundt hodet. Injiser 0,05 ml av det lokale analgetiske bupivakain (0,25 %) subkutant.
- Lag et snitt på skallen ved hjelp av en skalpell, og kutt deretter ut en del av huden med skarp kirurgisk saks, og utsett skallen. Skyv huden til side, bruk en bomullspinne, rengjør skallen fra alle muskler og underliggende vev som hindrer utsikten.
MERK: For å stoppe utilsiktet blødning, trykk på blødningsstedet med en steril bomullspinne til den stopper. - Rengjør skallen med hydrogenperoksid ved hjelp av sterile bomullspinner for å gjøre hodeskallen suturer og både bregma og lambda synlige.
- Tørk skallen grundig, og påfør deretter en dråpe selvetsende tannlim ved hjelp av applikatoren. Pensle den inn i skallen, vent 60 s, og herd med et dental UV-lys i 40 s. En blank overflate indikerer at limet har blitt effektivt tverrbundet med skallen.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for sikker tilkobling av hodesettet. - Bruk en 0,031" borkrone (0,79 mm) til å bore to borhull bilateralt for implantasjon av hippocampus dybdeelektroder (ca. 5000 rpm). Bor ett ekstra burrhull for referanseelektroden over lillehjernen bak lambdaen.
MERK: Når du borer, pass på å senke boret sakte og unngå å bore inn i hjernen. - Koordinatene for elektrodene er som følger (fra bregma i mm): hippocampuselektroder ved 3 mm bakre, 3 mm laterale og 3 mm dybde; og cerebellar referanseelektrode ved 6 mm bakre, 0 mm lateral og 0 mm dybde (subdural).
- For å øke nøyaktigheten, bruk en stereotaktisk montert drill, null den stereotaksiske manipulatoren X / Y-aksen når du berører bregma - dette er referansepunktet for koordinatene.
- Sett sammen et hodesett ved å sette inn alle elektrodene i den sekspinners sokkelen, og sørg for at pinnene skyves helt inn i sokkelen. Monter sokkelen i elektrodeholderen på en stereotaktisk ramme (figur 1B).
- Juster elektroder over de tilsvarende burrhullene. Stereotaktisk implantat vridde bipolare rustfritt ståltrådelektroder i høyre og venstre hippocampus og referanseelektrode inn i lillehjernen ved sakte å senke hodesettet og lede elektrodene inn i burrhullene.
- Når hippocampus-vridningselektroden er rett over hullet, null Z-aksen og senk sakte til -3,0 mm.
- Dekk skalleoverflaten og elektrodene med tannsement og fyll ut mellomrommet mellom skalleoverflaten og bunnen av sokkelen. Hudkantene vil ligge inntil tannsementen slik at ikke noe underliggende vev forblir eksponert. Vent til sementen tørker og herdes. Løsne deretter elektrodeholderen fra den stereotaksiske armen og fjern holderen fra sokkelen.
- Injiser 0,1 ml ketoprofen (1 mg / ml, SC) for analgesi og en andre dose på 0,5 ml normosol (SC) for hydrering og fjern dyret fra den stereotaksiske rammen.
- Plasser en isotermisk pute forvarmet til 37 °C inne i et tomt vivariumbur dekket med et papirhåndkle. Når den er helt våken, legg dyret i et rent bur med sengetøy og myk mat, og returner det til vivariumet. Dyr er plassert enkeltvis fra dette punktet for å forhindre å tygge på hverandres hodetelefoner. Trådstangbeholdere brukes ikke for å unngå at headset setter seg fast, og i stedet er vannflasker bundet til undersiden av burtoppene, og chow er til stede i sengetøyet.
- Gi dyret litt myk mat i 72 timer etter operasjonen, og overvåke for vekttap og kroppstilstandsscore. Dehydrerte dyr kan administreres 0,5 ml normosol subkutant hvis dehydrert (vekttap, økt hudturgor, nedsunkne øyne). Ketoprofen kan gis subkutant én gang daglig i ytterligere 2 dager etter operasjonen (følg analgesiregimet i henhold til lokale IACUC-retningslinjer). La dyrene komme seg helt i burene sine i 4-7 dager før de overføres til EEG-registreringssystemet.
3. Elektrisk tenningsprotokoll
- Koble musene til EEG-opptakssystemet ved hjelp av en fleksibel kabel som passer til stikkontaktene på musehodet og kommutatoren (se materiallisten ). La dyrene akklimatisere seg i en dag før du fortsetter med den elektriske stimuleringsprotokollen nedenfor. Overvåk deres generelle helse og akklimatisering på daglig basis, og fjern dem fra systemet når det er tegn på sykdom, nød og / eller kontinuerlig vekttap på over 25%
- Koble begge ledningene fra den stimulerende elektroden til utgangen av en konstant strømstimulator.
MERK: Det er veldig nyttig å ha et kretskort som bytter disse elektrodene bort fra EEG-opptakeren og til stimulatoren. - Still inn stimulatoren til å levere 1 ms pulser ved 50 Hz for en togvarighet på 2 s.
- Sett utgangen av stimulatoren på 20 mikroampere (μA) og lever 1st puls.
- Overvåk EEG for en karakteristisk etterutladning av høyfrekvente pigger som overgår den elektriske stimuleringspulsen.
- Hvis ingen utslipp observeres, øk deretter mengden strøm injisert i trinn på 20 μA til en etterutladning utløses. Mengden strøm som kreves, er terskelen etter utladning (ADT).
- Typiske ADTer er 20-50 μA. Hvis det ikke observeres utslipp selv etter økning til 200 μA, er det nødvendig med feilsøking av elektriske tilkoblinger og hodesettledninger med høy følsomhet ohmmeter. Hvis problemet er i den stimulerende elektroden, kan du prøve å stimulere med de andre dybdeelektrodene.
- Dyr tennes ved å stimulere enten 2x eller 6x per dag ved hjelp av en strøm som er 1,5x ADT-verdien for den musen.
- Overvåk atferdsresponsen på stimuleringen, som stiger fra statsendring til bilaterale tonisk-kloniske anfall med fallende. Skår ved hjelp av et modifisert Racine-klassesystem11. For å unngå fremkalte dødelige toniske anfall, bør tenningen settes på pause hvis påfølgende stimuli fører til økende alvorlighetsgrad og varighet av anfall opp til modifisert Racine score 6 (løping og hopping)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr
Modellen ble opprinnelig utviklet ved hjelp av VGAT-Cre-mus (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 på blandet bakgrunn. Det har imidlertid også blitt brukt på VGAT-Cre-stammen som er sammenfallende med C57BL/6J. Det er ikke observert noen forskjell i epilepsi som utvikler seg mellom stammene. Begge stammene uttrykker Cre rekombinase under kontroll av vesikulær GABA-transportørpromotor. Disse musene ble generert ved å banke inn en IRES-Cre-kassett etter stoppkodonet i Vgat-genet . Disse musene avler normalt, så de opprettholdes som homozygoter. For å forhindre genetisk drift av kolonien, kjøp oppdrettere og bruk bare F1-generasjons mus til eksperimenter. Alle musene ble plassert i et AAALAC-akkreditert vivarium. Mus fikk fri tilgang til mat og vann, 12 timers lyse / mørke sykluser og et beriket miljø. For elektroencefalografisk (EEG) opptak ble mus individuelt plassert i klare plastbur (hjemmelaget), noe som muliggjorde samtidig videoovervåking. Bruk både hann- og hunnmus til eksperimenter. Det er ikke observert noen forskjell i tenningsfrekvens eller anfallsfrekvens mellom kjønnene. De fleste av disse studiene brukte 8 uker gamle mus på tidspunktet for hodesettoperasjonen. Men man kan også bruke mus som er mellom 4-20 uker gamle. Etter 4 uker er museskallen ~ 90% av sin endelige størrelse14, så å feste et hodesett har minimal effekt på veksten. Tiden mellom operasjon og oppstart av kindlingprotokollen er ikke kritisk, selv om mus må observeres nøye under gjenoppretting fra kirurgi i 72 timer.
Kindling parametere
Den elektriske stimuleringsprotokollen ble utviklet av Lothman og medarbeidere og beskrevet i detalj i deres 1989-papir15. Kort fortalt er hippocampuselektroden koblet til en konstant strømstimulator, og en 1 ms bifasisk kvadratbølgepuls leveres ved 50 Hz over 2 s. Ulike parametere i tenningsprotokollen er testet16. Bruk en strømintensitet som er 1,5 ganger den minimale mengden strøm som kreves for å utløse et elektrografisk anfall for den musen (After-Discharge Threshold, ADT). Mus stimuleres elektrisk to ganger om dagen annenhver dag (2x, midt på morgenen og tidlig ettermiddag). Figur 2A viser en oversikt over tenningsprotokoll og sentrale beslagsegenskaper. Imidlertid er en hurtigopptenningsprotokoll også effektiv, her stimuleres mus seks ganger om dagen levert annenhver dag (6x, en time mellom stimuleringer). Interessant nok er tenningshastighetene like mellom 2x og 6x protokoller når det gjelder antall stimuleringer som kreves for å oppnå den tente tilstanden (figur 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, gjennomsnitt ± SEM, P = 0,3). Musene regnes som fullt tent når totalt fem stimuleringer fremkaller tonisk-kloniske anfall med tap av postural kontroll, som er en atferdsscore på 5 på en modifisert Racine-skala17. Kindling utover dette nivået, såkalt over-kindling, kan utføres, men medfører risiko for et dødelig tonisk anfall eller SUDEP18. Dødelighet i denne VGAT-Cre-protokollen er ~ 13% (15 av 119 mus); Dette inkluderer mus av begge kjønn som døde etter enten fremkalte eller spontane anfall (8 menn, 7 kvinner).
Beslag egenskaper
Registreringssystemet som ble brukt i disse studiene er avviklet. Alternative leverandører av EEG-opptaksoppsett som er i bruk ved University of Virginia Rodent Epilepsy Monitoring Unit er gitt i materialfortegnelsen. Figur 2A viser en oversikt over tenningsprotokoll og sentrale beslagsegenskaper.
Figur 2: Beslagsegenskaper hos tente VGAT-Cre-mus . (A) Skjematisk diagram over tidsforløpet til et eksperiment. (B) Fordelingen av antall elektriske stimuleringer som kreves for å nå den fullt opplyste tilstanden. Den tente tilstanden oppnås når stimuleringer fremkaller fem bilaterale tonisk-kloniske motoriske anfall. (C) Fordelingen av latens til første spontane anfall etter siste elektriske stimulering. (D) Fordelingen av observerte anfallsfrekvenser, som beregnes som totalt antall beslag delt på antall registrerte dager. (E) Fordelingen av hvor lenge mus var epileptiske som definert ved spontane anfall som forekom med et intervall under 5 dager. Alle grafene bruker fiolinplott der medianen vises med en mørk linje og 25. og 75. kvartil vises med lyse linjer. Antall dyr i hver tomt vises på X-aksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
VGAT-Cre-mus når typisk det tente tilstandskriteriet etter 15 stimuleringer (samlede 2x- og 6x-protokoller, gjennomsnittlig ± SD på 7,4 stimuleringer, figur 2B). Som det fremgår av fiolinplottet av dataene, krever mange dyr færre stimuleringer (10) og mange krever mer (18). Det har ikke vært mulig å finne en faktor som bestemmer forskjellen, unntatt kjønn, alder, ADT-verdi eller elektrodeplassering. Innen noen få uker etter å ha blitt tent, utvikler de fleste mus flere spontane anfall (90%), som definerer epilepsi. Latensen til spontane tilbakevendende anfall (SRS) er 10,7 ± 6,3 dager (figur 2C). En brøkdel av musene utvikler SRS før de når den tente tilstanden. Som nevnt tidligere11, er VGAT-Cre-mus ikke spontant epileptiske og krever elektrisk stimulering for å utvikle epilepsi. Når anfallene begynner, forekommer de med en frekvens på 1,3 ± 0,6 anfall per dag (figur 2D). Alle elektrografiske anfall ledsages av tonisk-kloniske motoranfall. De initiale studiene var kortvarige (spontan anfallsfrekvens målt 1-2 uker), men da registreringsperioden ble forlenget ble det oppdaget at anfallsfrekvensen avtok med tiden. Ved å bruke en vilkårlig avskjæring på 5 påfølgende dager uten anfall, oppstår pålitelige anfall i 23 ± 11 dager. Til sammen definerer dette perioden tente VGAT-Cre-mus er nyttige for narkotikascreeningkampanjer. Effektanalyse ved hjelp av disse SD og en effektstørrelse på 50% reduksjon viser at 16 mus per gruppe er nødvendig for statistisk signifikante effekter på stimulering til tenning, anfallsfrekvens og epilepsivarighet.
Et trekk ved den tente VGAT-Cre-modellen som skiller den fra post-status epilepticus-modeller, er fraværet av nevrondød. Dette ble analysert ved hjelp av to aksepterte metoder (figur 3): en, ved å telle kjerner i CA1-laget farget med anti-NeuN-antistoff; og to, ved å måle mengden Fluoro-Jade C-farging i hippocampus-underfelt som er sårbare for kjemokonvulsiv-indusert celledød (dentat, CA1 og entorhinal cortex).
Figur 3: Nevrondød som analysert ved enten anti-NeuN-farging eller Fluoro-Jade C-farging . (A) Plott av anti-NeuN-positive nevroner i ulike underfelt av hippocampus og entorhinal cortex. Forkortelser er som følger: DGC, dentate granulat cellelag; hilus refererer til dentate hilus, CA1, cornus ammonis pyramidelag I; og EC, entorhinal cortex; L2, lag 2; og L3, lag 3. To horisontale hjerneskiver tilsvarende -4 mm under bregma ble farget fra hvert dyr (kontrollnaive mus, n = 7; epileptisk VGAT-Cre, n = 13; se Straub et al. for detaljer11). Data ble normalisert til gjennomsnittlig antall nevroner bestemt i naive VGAT-Cre-mus i det respektive underfeltet. Bilder av Fluoro-Jade C-farging fra en epileptisk VGAT-Cre-mus (B) og fra en post-status rotte (C) (Li / pilokarpinmodell, se Dey et al. for detaljer og analyse10). Analyse av Fluoro-Jade C-farging av VGAT-Cre-mus ble presentert i Straub et al.11). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten beskriver en protokoll der elektrisk tenning av mus fører til epilepsi. Siden den stimulerende elektroden er plassert i hippocampus, er dette en fokal limbisk epilepsi som modellerer temporal lobe epilepsi (TLE) hos pasienter. Et kritisk trinn i denne protokollen er å bruke VGAT-Cre-mus, som på grunn av innsetting av en IRES-Cre rekombinase-kassett i Vgat-genet , viser svekkede hemmende GABA-strømmer11. C57BL/6 utvikler ikke epilepsi etter tenning med denne protokollen, selv om det er mulig at andre musestammer vil.
Protokollen ble utviklet ved hjelp av plassering av de stimulerende dybdeelektrodene i hippocampus. Koordinatene ga målet de perforante baneprojeksjonene fra entorhinal cortex når de kommer inn i CA1-underfeltet. Det elektriske feltet indusert av elektrisk stimulering er ikke definert, derfor er den nøyaktige plasseringen av elektrodene ikke kritisk. Faktisk kan gnagere tennes elektrisk hvor som helst i den limbiske kretsen, for eksempel amygdala og piriform cortex19. Følgende er kritiske trinn i protokollen: en, riktig lodding av EEG-headsettene for å sikre lav motstand mot stimulerende strøm; to, ved hjelp av et tannlim som er i bruk i tannklinikker for å binde seg til skallen og gi en overflate for vedheft av dental sement; og tre, bruk av en konstant strømforsterker for å levere de beskrevne elektriske pulser.
Feilsøking er vanligvis begrenset til å kontrollere elektriske tilkoblinger, som inkluderer tilkoblingene i hodesettet, hodesettet til kabelen, kabelen til kommutatoren og kommutatoren til opptaksenheten. Å bruke et ohmmeter med høy følsomhet er kritisk.
Begrensninger i teknikken inkluderer kravet om passende kompetanse og utstyr for å utføre operasjonene og registrere EEG.
En fordel med modellen over eksisterende dyremodeller av TLE er at det er minimal død av nevroner11. De andre TLE-modellene er post-status epilepticus-modeller, som utløser omfattende nevrondød10. Denne døden fører til omfattende aktivering av mikroglia, astrocytter og infiltrasjon av sirkulerende monocytter. Samlet blir det vanskelig å skille mekanismer som forårsaker epilepsi fra mekanismer utløst av forlenget status epilepticus. Det forventes at tente VGAT-Cre-mus vil være nyttige for å utvikle nye terapier som er både anti-anfall og anti-epileptiske. Denne rapporten gir nøkkeltall og kraftanalyse som kan lede fremtidig legemiddelutviklingsarbeid ved hjelp av disse musene.
En annen fordel med den tente VGAT-Cre-modellen er den høye andelen dyr som utvikler epilepsi (90%) og regelmessigheten av spontane anfall. Ulempene med modellen er en relativt lav anfallsfrekvens (1,5/dag) og at anfallsfrekvensen avtar etter 3 uker, og i noen tilfeller ser anfallene ut til å stoppe. Det arbeides med å ta tak i disse problemene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker John Williamson for nyttige diskusjoner om denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av NIH/NINDS stipend NS112549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
