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Neuroscience

टेम्पोरल लोब एपिलेप्सी के लिए एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए विद्युत किंडलिंग वीजीएटी-क्रे चूहों के लिए इलेक्ट्रोड की तैयारी और आरोपण

Published: August 17, 2021 doi: 10.3791/62929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Pharmacology, University of Virginia, 2UVA Brain Institute, University of Virginia

Summary

यह रिपोर्ट ट्रांसजेनिक वीजीएटी-क्रे चूहों के विद्युत किलिंग के आधार पर टेम्पोरल लोब मिर्गी का एक मॉडल उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करती है। किंडल वीजीएटी-क्रे चूहे यह निर्धारित करने में उपयोगी हो सकते हैं कि मिर्गी का कारण क्या है और नए उपचारों की स्क्रीनिंग के लिए।

Abstract

यह पता चला कि वीजीएटी-क्रे चूहों के विद्युत किलिंग ने सहज मोटर और इलेक्ट्रोग्राफिक दौरे का नेतृत्व किया। हाल ही के एक पेपर में इस बात पर ध्यान केंद्रित किया गया था कि कैसे अद्वितीय वीजीएटी-क्रे चूहों का उपयोग सहज आवर्ती दौरे (एसआरएस) विकसित करने में किया गया था और एक संभावित तंत्र - वीजीएटी जीन में सीआरई के सम्मिलन - ने इसकी अभिव्यक्ति को बाधित किया और जीएबीएर्जिक टोन को कम कर दिया। वर्तमान अध्ययन इन अवलोकनों को चूहों के एक बड़े समूह तक बढ़ाता है, जैसे कि प्रमुख मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करते हुए किलिंग के बाद एसआरएस कितने समय तक जारी रहता है और जानवर के लिंग और उम्र का प्रभाव। यह रिपोर्ट निम्नलिखित प्रमुख चरणों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है: विद्युत उत्तेजना के लिए हिप्पोकैम्पल गहराई इलेक्ट्रोड के साथ हेडसेट बनाना और इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राम को पढ़ने के लिए; माउस की खोपड़ी पर हेडसेट को सुरक्षित रूप से चिपकाने के लिए सर्जरी ताकि यह गिर न जाए; और विद्युत किंडलिंग प्रोटोकॉल के प्रमुख विवरण जैसे पल्स की अवधि, ट्रेन की आवृत्ति, ट्रेन की अवधि और इंजेक्शन की मात्रा। किंडलिंग प्रोटोकॉल इस मायने में मजबूत है कि यह विश्वसनीय रूप से अधिकांश वीजीएटी-क्रे चूहों में मिर्गी की ओर जाता है, जो नोवेल एंटीपीलेप्टोजेनिक दवाओं के परीक्षण के लिए एक नया मॉडल प्रदान करता है।

Introduction

मिर्गी महत्वपूर्ण आर्थिक और मानव बोझ के साथ एक प्रमुख न्यूरोलॉजिकल विकार है। एनआईएनडीएस का अनुमान है कि मिर्गी के साथ 3 मिलियन अमेरिकी हैं। इनमें से लगभग 0.6 मिलियन रोगियों में टेम्पोरल लोब मिर्गी (टीईएल) 1 है। दुर्भाग्य से, टीईएल का चिकित्सा उपचार अप्रभावीता, दवा प्रतिरोध के विकास, या साइड इफेक्ट्स के प्रति असहिष्णुता के कारण एक तिहाई रोगियों में विफलरहता है। स्पष्ट रूप से, टीईएल के लिए नए उपचार विकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है, अमेरिकन एपिलेप्सी सोसाइटी बेसिक साइंस कमेटी, प्रीक्लिनिकल एपिलेप्सी ड्रग डिस्कवरी के लिए इंटरनेशनल लीग अगेंस्ट एपिलेप्सी वर्किंग ग्रुप और नेशनल एडवाइजरी न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक काउंसिल 3,4 द्वारा साझा किया गया एक निष्कर्ष।

टेम्पोरल लोब मिर्गी के वर्तमान पशु मॉडल या तो केमोकोनवल्सेंट्स (जैसे, कैनेट, पिलोकार्पिन) या लंबे समय तक चलने वाली स्थिति एपिलेप्टिकस 5,6,7 को प्रेरित करने के लिए लंबे समय तक विद्युत उत्तेजना का उपयोग करते हैं। प्रक्रिया के दौरान कई जानवर मर जाते हैं (चूहों में 10% -30%, चूहों में 90% तक8)। मिर्गी से बचने और विकसित करने वाले जानवर पूरे मस्तिष्क में व्यापक न्यूरोनल मृत्यु दिखाते हैं 9,10. यह मौत प्रतिक्रियाओं के एक कैस्केड को ट्रिगर करती है, जिसकी शुरुआत माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स और घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स के सक्रियण से होती है। न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं में सर्किट पुनर्गठन (जैसे, काई फाइबर स्प्राउटिंग), नए न्यूरॉन्स का जन्म शामिल है जो सर्किट (जैसे, अस्थानिक ग्रेन्युल कोशिकाओं) में ठीक से एकीकृत करने में विफल रहते हैं, और आंतरिक परिवर्तन जो हाइपरएक्साइटेबिलिटी (जैसे, एनए + चैनलों का अपरेगुलेशन) का कारण बनते हैं। महत्वपूर्ण न्यूरोनल मृत्यु के बिना एक मिर्गी मॉडल नई एंटीपीलेप्टिक दवाओं की खोज की सुविधा प्रदान करेगा।

मिर्गी की जीएबीए परिकल्पना का परीक्षण करते समय, यह पाया गया कि हल्के विद्युत किंडलिंग प्रोटोकॉल के साथ वीजीएटी-क्रे चूहों का इलाज करने से सहज मोटर और इलेक्ट्रोग्राफिक दौरेहुए। सामान्य तौर पर, कृन्तकों के विद्युत किलिंग से सहज दौरे नहीं पड़ते हैं जो मिर्गी को परिभाषित करते हैं, हालांकि यह ओवर-किंडलिंग11 के मामलों में हो सकता है। वीजीएटी-क्रे चूहे वेसिकुलर जीएबीए ट्रांसपोर्टर (वीजीएटी) जीन के नियंत्रण में क्रे रिकोम्बिनेस को व्यक्त करते हैं, जो विशेष रूप से जीबीएर्जिक निरोधात्मक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है। यह पाया गया कि सीआरई के सम्मिलन ने एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर पर वीजीएटी की अभिव्यक्ति को बाधित किया, इस प्रकार हिप्पोकैम्पस में जीबीएर्जिक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को बाधित किया। यह निष्कर्ष निकाला गया कि किंडेड वीजीएटी-क्रे चूहे एपिलेप्टोजेनेसिस में शामिल तंत्र का अध्ययन करने और नए चिकित्सीय11 की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकते हैं। वर्तमान रिपोर्ट मॉडल को बनाने में उपयोग की जाने वाली विधियों को विस्तार से प्रदान करती है।

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Protocol

पशु उपयोग ने अराइव12 दिशानिर्देशों का पालन किया और वर्जीनिया विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. दो द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के साथ हेडसेट बनाना (चित्रा 1)

Figure 1
चित्रा 1: ईईजी हेडसेट निर्माण में प्रमुख कदम। (ए) प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों में इलेक्ट्रोड की उपस्थिति (बाएं मिलान चरण में संख्याएं)। (बी) एक होममेड धारक में लगाए गए अंतिम उत्पाद की एक तस्वीर जो स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में फिट बैठती है। ध्यान दें, धारक एक कॉलर पिन असेंबली के साथ समाप्त होता है जो हेडसेट पेडस्टल में फिट बैठता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. स्टेनलेस पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लेपित स्टेनलेस-स्टील तार के 3.5 सेमी काटें।
  2. दोनों सिरों पर तार से लगभग 1 मिमी इन्सुलेशन कोट उतारें। तार को बहुत अधिक न छीनें।
  3. पिन के निचले हिस्से के साथ एक विज़ होल्डर पर दो पिन रखें जिसमें नीचे की ओर एक लंबा स्लिट है।
  4. तार के छीने गए सिरों पर और पिन के शीर्ष पर फ्लक्स लागू करें।
  5. तार के छीने गए हिस्से को कोट करने के लिए बस पर्याप्त सोल्डर के साथ टिन करें।
  6. किनारों पर बहने के बिना पिन के शीर्ष पर सोल्डर की न्यूनतम मात्रा जोड़ें।
  7. तार के छीने गए सिरों के एक छोर को पिन में रखें जितना कि सोल्डर पिघलने के दौरान यह अनुमति देगा।
    नोट: एक साइड छेद है जहां तार बाहर आ सकता है - तार को पिन से बाहर न आने दें। सभी छीने गए तार पिन के भीतर रहने चाहिए।
  8. दूसरे पिन के लिए चरण 1.6-1.7 दोहराएं, अब तार के अन्य छीने गए सिरों के साथ।
  9. पिन को सेट करने के लिए 30 सेकंड तक बैठने दें, उन्हें विज़ होल्डर से हटा दें, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए उन पर खींचें कि तार और पिन के बीच कनेक्शन मजबूत है और पकड़ता है।
  10. पिन को ठंडे पानी में धो लें, और फिर सुखाएं।
  11. ओममीटर का उपयोग करके पिन 1 और पिन 2 के बीच चालकता की जाँच करें।
  12. तार के सिरों पर पिन को एक साथ लाएं; उन्हें समानांतर और करीब रखें। तार के केंद्र में एक हेमोस्टैट दबाएं। फिर, हेमोस्टैट को घुमाएं, ताकि तार अपने चारों ओर काफी तंग हो जाए। हेमोस्टैट को हटा दें।
  13. पिन से 2 मिमी नीचे मुड़े हुए तार पर एक बल दबाएं और तार को 90 ° पर मोड़ें।
  14. उसी तार को फिर से बल के ऊपर 90° पीछे धकेलें, जिससे पहले से 1 मिमी का एक और मोड़ बने।
  15. मुड़े हुए तार को 3.5 मिमी पर मोड़ के नीचे 45 डिग्री कोण पर छोटी तेज कैंची से काटें।
  16. प्रत्येक हेडसेट के लिए इनमें से दो द्विध्रुवीय (डबल-पिन ट्विस्टेड) इलेक्ट्रोड तैयार करें (वैकल्पिक, पहले के साथ विद्युत समस्याओं के मामले में दूसरा बैक-अप है)।
  17. दोनों सिरों पर दो में फैले पिन के साथ एक तार काटकर एक एकल संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार करें (चरण 1.1-1.17, चित्रा 1 ए)।
  18. तार को 7 मिमी पर काटें।
  19. सिरे से 1 मिमी नीचे छोर झुकाएं।
  20. फिर, तार के मुड़े हुए 1 मिमी सिरे को बल के साथ कवर करें और एक छोटा लूप (व्यास में 1 मिमी) बनाने के लिए तार को बल के चारों ओर कसकर घुमाएं।
  21. तार के सिरे को फिर से बाहर की ओर मोड़ने के लिए तार के सीधे हिस्से के लंबवत लूप को मोड़ें।
  22. दो द्विध्रुवीय इलेक्ट्रोड और एकल संदर्भ इलेक्ट्रोड को छह-पिन पेडस्टल में इस तरह से इकट्ठा करें कि द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड उनके बीच 6 मिमी की दूरी के साथ कंधे से कंधा मिलाकर हों, और यह कि संदर्भ इलेक्ट्रोड को मध्य बाहरी छेद में रखा गया है (चित्रा 1 बी)।
    नोट: एक वैकल्पिक विधि इलेक्ट्रोड को प्रत्यारोपित करना है, उन्हें जगह पर सीमेंट करना है, और फिर उनके पिन को पेडस्टल में डालना है।

2. स्टीरियोटैक्सिक इलेक्ट्रोड आरोपण

  1. सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों और छह-पिन इलेक्ट्रोड असेंबली को निष्फल करें। सर्जरी के दौरान एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र को बनाए रखा जाना चाहिए, और बाँझ सर्जिकल दस्ताने का उपयोग किया जाना चाहिए। सर्जिकल क्षेत्र को छोड़कर जानवर को कवर करने के लिए बाँझ ड्रेप्स (जैसे, प्रेस एन'सील) की सिफारिश की जाती है।
  2. वीनिंग के 4 सप्ताह बाद सर्जरी के लिए 8 सप्ताह के वीजीएटी-क्रे चूहों (उम्र से मेल खाने वाले, पुरुष और महिला दोनों) का उपयोग करें। शल्य चिकित्सा के बाद वजन घटाने के माप की अनुमति देने के लिए सर्जरी से पहले जानवर के वजन को रिकॉर्ड करें।
  3. एक प्रमाणित आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र या एक कम-प्रवाह संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करें जो एक सटीक सिरिंज पंप, एकीकृत डिजिटल वेपोराइज़र और फीडबैक हीट पैड से लैस है।
    नोट: कम प्रवाह प्रणाली जानवर के आकार के अनुपात में कम प्रवाह दर पर एनेस्थीसिया को या तो प्रेरण कक्ष में या स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर नाक शंकु के माध्यम से वितरित करने में सक्षम हैं (70 एमएल / मिनट, हवा में आइसोफ्लुरेन एकाग्रता प्रेरण के लिए 4% और सर्जरी के लिए 2% है)। कम संज्ञाहरण का उपयोग करने से न केवल सर्जरी के दौरान जानवर को लाभ होता है, बल्कि लैब कर्मियों के आइसोफ्लुरेन के संपर्क में आने का खतरा भी कम हो जाता है।
  4. सर्जरी के दौरान इसे गर्म रखने के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पैड पर रखें। यदि प्रतिक्रिया-नियंत्रित तापमान प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं, तो सर्जरी के दौरान तापमान की निगरानी के लिए जानवर के मलाशय में हल्के स्नेहन तापमान जांच डालें।
  5. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर धीरे से कान की सलाखों में और सामने के ऊपरी दांतों को छेदक पट्टी में रखकर माउंट करें। उचित संज्ञाहरण प्रसव के लिए नाक के ऊपर नाक शंकु रखें। सुनिश्चित करें कि सिर समतल और केंद्रित है और थोड़ा जांच करने पर इसे स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है।
  6. चमड़े के नीचे हाइड्रेशन के लिए नॉर्मोसोल के 0.5 एमएल इंजेक्ट करें।
  7. कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए ओकुलर स्नेहक लागू करें।
  8. हिंडलिंब पैर की अंगुली को चुटकी लेने के बाद वापसी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें, और फिर सर्जरी के दौरान आइसोफ्लुरेन को 1.5% -2.0% तक कम करें।
  9. क्लिपर्स (शेविंग) या डिपिलेटरी क्रीम को तोड़कर या उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र में और उसके आसपास के बालों को हटा दें, और आयोडीन और इथेनॉल के वैकल्पिक अनुप्रयोग के तीन चक्रों के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें, आयोडीन के साथ समाप्त करें। सर्जिकल साइट से बालों को दूर करने की सिफारिश केवल तभी की जाती है जब उस स्थान पर संज्ञाहरण बनाए रखने के साधन हों। यदि आवश्यक हो, तो सिर के आसपास के तत्काल क्षेत्र से बालों को हटाने के लिए अल्कोहल-डिप्ड कॉटन टिप एप्लिकेटर का उपयोग करें। स्थानीय एनाल्जेसिक बुपिवैकेन (0.25%) के 0.05 एमएल को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  10. स्केलपेल का उपयोग करके खोपड़ी पर एक चीरा लगाएं, और फिर खोपड़ी को उजागर करते हुए तेज सर्जिकल कैंची से त्वचा के एक हिस्से को काट लें। त्वचा को एक तरफ धकेलते हुए, एक सूती स्वैब का उपयोग करके, खोपड़ी को सभी मांसपेशियों और अंतर्निहित ऊतकों से साफ करें जो दृश्य को बाधित करते हैं।
    नोट: आकस्मिक रक्तस्राव को रोकने के लिए, बाँझ कपास के फाहे के साथ रक्तस्राव स्थल पर दबाव डालें जब तक कि यह बंद न हो जाए।
  11. खोपड़ी के सीवन और ब्रेग्मा और लैम्ब्डा दोनों को दृश्यमान बनाने के लिए बाँझ कपास स्वैब का उपयोग करके हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ खोपड़ी को साफ करें।
  12. खोपड़ी को अच्छी तरह से सुखाएं, और फिर इसके एप्लिकेटर का उपयोग करके स्व-नक़्क़ाशी दंत चिपकने वाले की एक बूंद लागू करें। इसे खोपड़ी में ब्रश करें, 60 सेकंड प्रतीक्षा करें, और 40 सेकंड के लिए दंत यूवी प्रकाश के साथ इलाज करें। एक चमकदार सतह इंगित करती है कि चिपकने वाला खोपड़ी के साथ प्रभावी रूप से क्रॉस-लिंक्ड हो गया है।
    नोट: हेडसेट के सुरक्षित अनुलग्नक के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
  13. हिप्पोकैम्पल गहराई इलेक्ट्रोड (लगभग 5,000 आरपीएम) के आरोपण के लिए द्विपक्षीय रूप से दो छेद ड्रिल करने के लिए 0.031 "ड्रिल बिट (0.79 मिमी) का उपयोग करें। लैम्ब्डा के पीछे सेरिबैलम के ऊपर संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए एक अतिरिक्त बर्र छेद ड्रिल करें।
    ध्यान दें: ड्रिलिंग करते समय, ड्रिल को धीरे-धीरे कम करने और मस्तिष्क में ड्रिलिंग से बचने का ध्यान रखें।
  14. इलेक्ट्रोड के लिए निर्देशांक निम्नानुसार हैं (मिमी में ब्रेग्मा से): 3 मिमी पीछे, 3 मिमी पार्श्व और 3 मिमी गहराई पर हिप्पोकैम्पल इलेक्ट्रोड; और अनुमस्तिष्क संदर्भ इलेक्ट्रोड 6 मिमी पीछे, 0 मिमी पार्श्व, और 0 मिमी गहराई (सबड्यूरल) पर।
  15. सटीकता बढ़ाने के लिए, स्टीरियोटैक्सिक रूप से माउंटेड ड्रिल का उपयोग करें, ब्रेग्मा को छूते समय स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर एक्स / वाई अक्ष को शून्य करें - यह निर्देशांक के लिए संदर्भ का बिंदु है।
  16. छह-पिन पेडस्टल में सभी इलेक्ट्रोड डालकर एक हेडसेट को इकट्ठा करें, यह सुनिश्चित करें कि पिन को पेडस्टल में धकेल दिया जाए। एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 1 बी) पर इलेक्ट्रोड धारक में पेडस्टल माउंट करें।
  17. संबंधित बर्र छेद के ऊपर इलेक्ट्रोड संरेखित करें। स्टीरियोटैक्सिक रूप से प्रत्यारोपित ने दाएं और बाएं हिप्पोकैम्पस में द्विध्रुवीय स्टेनलेस-स्टील तार इलेक्ट्रोड को मोड़ दिया और हेडसेट को धीरे-धीरे कम करके और इलेक्ट्रोड को छेद में मार्गदर्शन करके सेरिबैलम में संदर्भ दिया।
  18. जब हिप्पोकैम्पल ट्विस्ट इलेक्ट्रोड छेद के ठीक ऊपर होता है, तो जेड अक्ष को शून्य करें और धीरे-धीरे -3.0 मिमी तक कम हो जाएं।
  19. खोपड़ी की सतह और इलेक्ट्रोड को दंत सीमेंट के साथ कवर करें और खोपड़ी की सतह और पेडस्टल के निचले हिस्से के बीच की जगह को भरें। त्वचा के किनारे दंत सीमेंट से सटे होंगे जैसे कि कोई अंतर्निहित ऊतक उजागर नहीं होगा। सीमेंट के सूखने और सख्त होने की प्रतीक्षा करें। फिर इलेक्ट्रोड धारक को स्टीरियोटैक्सिक बांह से अलग करें और धारक को पेडस्टल से हटा दें।
  20. एनाल्जेसिया के लिए 0.1 एमएल कीटोप्रोफेन (1 मिलीग्राम / एमएल, एससी) इंजेक्ट करें और हाइड्रेशन के लिए नॉर्मोसोल (एससी) के 0.5 एमएल की दूसरी खुराक लें और जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से हटा दें।
  21. एक पेपर तौलिया से ढके एक खाली विवेरियम पिंजरे के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए इज़ोटेर्मल पैड को रखें। एक बार जब यह पूरी तरह से जाग जाता है, तो जानवर को बिस्तर और नरम भोजन के साथ एक साफ पिंजरे में रखें, और इसे विवेरियम में वापस कर दें। जानवरों को इस बिंदु से अकेले रखा जाता है ताकि एक-दूसरे के हेडसेट को चबाने से रोका जा सके। हेडसेट के फंसने से बचने के लिए वायर बार हॉपर का उपयोग नहीं किया जाता है, और इसके बजाय, पानी की बोतलों को पिंजरे के शीर्ष के नीचे बांधा जाता है, और चाउ बिस्तर में मौजूद होता है।
  22. सर्जरी के बाद जानवर को 72 घंटे के लिए कुछ नरम भोजन खिलाएं, और वजन घटाने और शरीर की स्थिति स्कोर की निगरानी करें। निर्जलित जानवरों को निर्जलित होने पर नॉर्मोसोल के 0.5 एमएल को नॉर्मोसोल प्रशासित किया जा सकता है (वजन घटाने, त्वचा टर्गर में वृद्धि, धंसी हुई आंखें)। केटोप्रोफेन को सर्जरी के बाद 2 और दिनों के लिए रोजाना एक बार चमड़े के नीचे दिया जा सकता है (स्थानीय आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार एनाल्जेसिया आहार का पालन करें)। ईईजी रिकॉर्डिंग सिस्टम में स्थानांतरित करने से पहले जानवरों को 4-7 दिनों के लिए अपने पिंजरों में पूरी तरह से ठीक होने की अनुमति दें।

3. इलेक्ट्रिकल किंडलिंग प्रोटोकॉल

  1. चूहों को एक लचीली केबल का उपयोग करके ईईजी रिकॉर्डिंग सिस्टम में हुक-अप करें जो माउस हेड और कम्यूटेटर पर सॉकेट फिट करता है ( सामग्री सूची की तालिका देखें)। नीचे दिए गए विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले जानवरों को एक दिन के लिए अनुकूलन करने की अनुमति दें। दैनिक आधार पर उनके समग्र स्वास्थ्य और अनुकूलन की निगरानी करें, और 25% से अधिक बीमारी, संकट और / या निरंतर शरीर के वजन घटाने के संकेत होने पर उन्हें सिस्टम से हटा दें
  2. उत्तेजक इलेक्ट्रोड से एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक के आउटपुट तक दोनों लीड कनेक्ट करें।
    नोट: एक सर्किट बोर्ड होना बहुत उपयोगी है जो इन इलेक्ट्रोड को ईईजी रिकॉर्डर से दूर और उत्तेजक में बदल देता है।
  3. 2 सेकंड की ट्रेन अवधि के लिए 50 हर्ट्ज पर 1 एमएस दालें देने के लिए उत्तेजक सेट करें।
  4. उत्तेजक के आउटपुट को 20 माइक्रोए (μA) पर सेट करें और 1पल्स वितरित करें।
  5. उच्च आवृत्ति स्पाइक्स के निर्वहन के बाद ईईजी की निगरानी करें जो विद्युत उत्तेजना पल्स को पार करते हैं।
  6. यदि कोई निर्वहन नहीं देखा जाता है, तो डिस्चार्ज के बाद ट्रिगर होने तक 20 μA वृद्धि में इंजेक्ट किए गए करंट की मात्रा बढ़ाएं। आवश्यक धारा की मात्रा डिस्चार्ज के बाद की दहलीज (एडीटी) है।
  7. विशिष्ट एडीटी 20-50 μA हैं। यदि 200 μA तक बढ़ने के बाद भी कोई निर्वहन नहीं देखा जाता है, तो उच्च संवेदनशीलता ओममीटर के साथ विद्युत कनेक्शन और हेडसेट वायरिंग की समस्या निवारण की आवश्यकता होती है। यदि समस्या उत्तेजक इलेक्ट्रोड में है, तो अन्य गहराई इलेक्ट्रोड के साथ उत्तेजक करने का प्रयास करें।
  8. जानवरों को उस माउस के लिए एडीटी मान 1.5 गुना है, एक धारा का उपयोग करके प्रति दिन 2x या 6x को उत्तेजित करके दयालु किया जाता है।
  9. उत्तेजना के लिए व्यवहारिक प्रतिक्रिया की निगरानी करें, जो गिरने के साथ द्विपक्षीय टॉनिक-क्लोनिक दौरे के लिए राज्य के परिवर्तन से बढ़ता है। एक संशोधित रेसीन वर्ग प्रणाली11 का उपयोग करके स्कोर। घातक टॉनिक दौरे से बचने के लिए, किंडलिंग को रोक दिया जाना चाहिए यदि क्रमिक उत्तेजनाओं से संशोधित रेसीन स्कोर 6 (दौड़ना और कूदना) तक दौरे की गंभीरता और लंबाई बढ़ जाती है।

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Representative Results

जीवधारी
मॉडल मूल रूप से मिश्रित पृष्ठभूमि पर VGAT-Cre चूहों (Slc32a1tm2 (cre)Lowl/J)13 का उपयोग करके विकसित किया गया था। हालांकि, इसे वीजीएटी-सीआरई स्ट्रेन पर भी लागू किया गया है जो सी 57बीएल / 6 जे के साथ कॉन्जेनिक है। मिर्गी में कोई अंतर नहीं देखा गया है जो उपभेदों के बीच विकसित होता है। दोनों उपभेद वेसिकुलर जीएबीए ट्रांसपोर्टर प्रमोटर के नियंत्रण में क्रे रिकोम्बिनेस को व्यक्त करते हैं। ये चूहे वीजीएटी जीन में स्टॉप कोडन के बाद आईआरईएस-क्रे कैसेट में दस्तक देकर उत्पन्न हुए थे। ये चूहे सामान्य रूप से प्रजनन करते हैं, इसलिए उन्हें होमोजीगोट्स के रूप में बनाए रखा जाता है। कॉलोनी के आनुवंशिक बहाव को रोकने के लिए, प्रजनकों को खरीदें और प्रयोगों के लिए केवल एफ 1 पीढ़ी के चूहों का उपयोग करें। सभी चूहों को AAALAC-मान्यता प्राप्त विवेरियम में रखा गया था। चूहों को भोजन और पानी, 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र और एक समृद्ध वातावरण तक मुफ्त पहुंच दी गई थी। इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक (ईईजी) रिकॉर्डिंग के लिए, चूहों को व्यक्तिगत रूप से स्पष्ट प्लास्टिक पिंजरों (घर का बना) में रखा गया था, जिससे समवर्ती वीडियो निगरानी की अनुमति मिलती है। प्रयोगों के लिए नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग करें। लिंगों के बीच किंडलिंग दर या जब्ती आवृत्ति के संदर्भ में कोई अंतर नहीं देखा गया है। इनमें से अधिकांश अध्ययनों ने हेडसेट सर्जरी के समय 8 सप्ताह के चूहों का उपयोग किया। हालांकि, कोई चूहों का भी उपयोग कर सकता है जो 4-20 सप्ताह के बीच हैं। 4-सप्ताह में, माउस खोपड़ी अपने अंतिम आकार14 का ~ 90% है, इसलिए हेडसेट चिपकाने से विकास पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। सर्जरी और किंडलिंग प्रोटोकॉल की शुरुआत के बीच का समय महत्वपूर्ण नहीं है, हालांकि चूहों को 72 घंटे के लिए सर्जरी से उबरने के दौरान सावधानीपूर्वक देखा जाना चाहिए।

किंडलिंग पैरामीटर
विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल लोथमैन और सहकर्मियों द्वारा विकसित किया गया था और उनके 1989 के पेपर15 में विस्तार से वर्णित किया गया था। संक्षेप में, हिप्पोकैम्पल इलेक्ट्रोड एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक से जुड़ा हुआ है, और एक 1 एमएस बाइफैसिक स्क्वायर वेव पल्स को 2 एस पर 50 हर्ट्ज पर वितरित किया जाता है। किंडलिंग प्रोटोकॉल के विभिन्न मापदंडोंका परीक्षण किया गया है। एक वर्तमान तीव्रता का उपयोग करें जो उस माउस (डिस्चार्ज के बाद दहलीज, एडीटी) के लिए एक इलेक्ट्रोग्राफिक जब्ती को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक धारा की न्यूनतम मात्रा 1.5 गुना है। चूहों को हर दूसरे दिन दिन में दो बार विद्युत रूप से उत्तेजित किया जाता है (2x, मध्य-सुबह और दोपहर की शुरुआती)। चित्रा 2 ए किंडलिंग प्रोटोकॉल और प्रमुख जब्ती गुणों का अवलोकन दिखाता है। हालांकि, एक फास्ट-किंडलिंग प्रोटोकॉल भी प्रभावी है, यहां चूहों को हर दूसरे दिन दिन में छह बार उत्तेजित किया जाता है (6x, उत्तेजनाओं के बीच एक घंटे)। दिलचस्प बात यह है कि दयालु स्थिति को प्राप्त करने के लिए आवश्यक उत्तेजनाओं की संख्या के संदर्भ में किंडलिंग दर 2x और 6x प्रोटोकॉल के बीच समान हैं (चित्र 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, औसत ± SEM, P = 0.3)। चूहों को पूरी तरह से दयालु माना जाता है जब कुल पांच उत्तेजनाएं पोस्टुरल नियंत्रण के नुकसान के साथ टॉनिक-क्लोनिक दौरे पैदा करती हैं, जो एक संशोधित रेसीन स्केल17 पर 5 का व्यवहार स्कोर है। इस स्तर से परे किंडलिंग, तथाकथित ओवर-किंडलिंग, किया जा सकता है, लेकिन घातक टॉनिक दौरे या एसयूडीईपी18 का खतरा होता है। इस वीजीएटी-सीआरई प्रोटोकॉल में मृत्यु दर ~ 13% है (119 चूहों में से 15); इसमें या तो सेक्स के चूहे शामिल हैं जो या तो उत्पन्न या सहज दौरे (8 पुरुष, 7 महिला) के बाद मर गए।

जब्ती गुण
इन अध्ययनों में इस्तेमाल की जाने वाली रिकॉर्डिंग प्रणाली को बंद कर दिया गया है। वर्जीनिया कृंतक मिर्गी निगरानी इकाई विश्वविद्यालय में उपयोग में आने वाले ईईजी रिकॉर्डिंग सेट-अप के वैकल्पिक आपूर्तिकर्ताओं को सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है। चित्रा 2 ए किंडलिंग प्रोटोकॉल और प्रमुख जब्ती गुणों का अवलोकन दिखाता है।

Figure 2
चित्र 2: किंडेड वीजीएटी-क्रे चूहों के जब्ती गुण। (ए) एक प्रयोग के समय पाठ्यक्रम का योजनाबद्ध आरेख। (बी) पूरी तरह से दयालु अवस्था तक पहुंचने के लिए आवश्यक विद्युत उत्तेजनाओं की संख्या का वितरण। दयालु स्थिति तब प्राप्त होती है जब उत्तेजना पांच द्विपक्षीय टॉनिक-क्लोनिक मोटर दौरे पैदा करती है। (सी) अंतिम विद्युत उत्तेजना के बाद पहले सहज दौरे के लिए विलंबता का वितरण। (घ) प्रेक्षित जब्ती आवृत्तियों का वितरण, जिसकी गणना जब्ती की कुल संख्या के रूप में की जाती है जिसे दर्ज किए गए दिनों की संख्या से विभाजित किया जाता है। (ई) चूहों को मिर्गी के कितने समय तक रखा गया था, इसका वितरण जैसा कि 5 दिनों से कम अंतर-जब्ती अंतराल के साथ होने वाले सहज दौरे से परिभाषित किया गया है। सभी ग्राफ वायलिन भूखंडों का उपयोग करते हैं जहां माध्य को एक अंधेरी रेखा के साथ दिखाया जाता है और 25वें और 75वें चतुर्थक को प्रकाश रेखाओं के साथ दिखाया जाता है। प्रत्येक प्लॉट में जानवरों की संख्या एक्स-अक्ष पर दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीजीएटी-क्रे चूहे आम तौर पर 15 उत्तेजनाओं (पूल किए गए 2x और 6x प्रोटोकॉल, 7.4 उत्तेजनाओं के एसडी ± औसत, चित्रा 2 बी) के बाद दयालु स्थिति मानदंड तक पहुंचते हैं। जैसा कि डेटा के वायलिन प्लॉट द्वारा देखा जा सकता है, कई जानवरों को कम उत्तेजना (10) की आवश्यकता होती है और कई को अधिक (18) की आवश्यकता होती है। लिंग, आयु, एडीटी मूल्य या इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट को छोड़कर अंतर निर्धारित करने वाले कारक को ढूंढना संभव नहीं है। दयालु होने के कुछ हफ्तों के भीतर, अधिकांश चूहों में कई सहज दौरे (90%) विकसित होते हैं, जो मिर्गी को परिभाषित करता है। सहज आवर्ती दौरे (एसआरएस) की विलंबता 6.3 दिनों ± 10.7 है (चित्रा 2 सी)। चूहों का एक अंश दयालु अवस्था तक पहुंचने से पहले एसआरएस विकसित करता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाहै, वीजीएटी-क्रे चूहे अनायास मिर्गी नहीं हैं और मिर्गी विकसित करने के लिए विद्युत उत्तेजना की आवश्यकता होती है। एक बार दौरे शुरू होने के बाद, वे प्रति दिन 1.3 ± 0.6 दौरे की आवृत्ति पर होते हैं (चित्रा 2 डी)। सभी इलेक्ट्रोग्राफिक दौरे टॉनिक-क्लोनिक मोटर दौरे के साथ होते हैं। प्रारंभिक अध्ययन अल्पकालिक थे (सहज जब्ती आवृत्ति 1-2 सप्ताह मापी गई), लेकिन जब रिकॉर्डिंग अवधि बढ़ाई गई तो यह पता चला कि जब्ती आवृत्ति समय के साथ कम हो गई। दौरे के बिना लगातार 5 दिनों की मनमानी कट-ऑफ का उपयोग करके, विश्वसनीय दौरे 23 ± 11 दिनों के लिए होते हैं। एक साथ लिया गया, यह परिभाषित करता है कि वीजीएटी-क्रे चूहे दवा स्क्रीनिंग अभियानों के लिए उपयोगी हैं। इन एसडी का उपयोग करके शक्ति विश्लेषण और 50% की कमी के प्रभाव आकार से पता चलता है कि प्रति समूह 16 चूहों को उत्तेजना, जब्ती आवृत्ति और मिर्गी की अवधि पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण प्रभावों के लिए आवश्यक है।

वीजीएटी-क्रे मॉडल की एक विशेषता जो इसे पोस्ट-स्टेटस एपिलेप्टिकस मॉडल से अलग करती है, न्यूरोनल मृत्यु की अनुपस्थिति है। यह दो स्वीकृत तरीकों (चित्रा 3) का उपयोग करके परख किया गया था: एक, एंटी-न्यून एंटीबॉडी से सना सीए 1 परत में नाभिक की गणना करके; और दूसरा, हिप्पोकैम्पल उपक्षेत्रों में फ्लोरो-जेड सी धुंधला होने की मात्रा को मापकर जो केमोकोनवल्सेंट-प्रेरित कोशिका मृत्यु (डेंटेट, सीए 1, और एंटोरिनल कॉर्टेक्स) के लिए कमजोर हैं।

Figure 3
चित्र 3: न्यूरोनल मृत्यु जैसा कि एंटी-न्यून धुंधलापन या फ्लोरो-जेड सी धुंधलापन द्वारा जांचा जाता है। (ए) हिप्पोकैम्पस और एंटोरिनल कॉर्टेक्स के विभिन्न उप-क्षेत्रों में एंटी-न्यून-पॉजिटिव न्यूरॉन्स का प्लॉट। संक्षेप निम्नानुसार हैं: डीजीसी, डेंटेट ग्रेन्युल सेल परत; हिलस डेंटेट हिलस, सीए 1, कॉर्नस एम्मोनिस पिरामिड परत I को संदर्भित करता है; और ईसी, एंटोरिनल कॉर्टेक्स; एल 2, परत 2; और एल 3, परत 3। ब्रेग्मा के नीचे -4 मिमी के अनुरूप दो क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस प्रत्येक जानवर से दागदार थे (भोले चूहों को नियंत्रित करें, एन = 7; मिर्गी वीजीएटी-क्रे, एन = 13; विवरण11 के लिए स्ट्राब एट अल देखें)। डेटा को संबंधित उपक्षेत्र में भोले वीजीएटी-क्रे चूहों में निर्धारित औसत न्यूरोनल गणना के लिए सामान्यीकृत किया गया था। एक मिर्गी वीजीएटी-क्रे माउस (बी) और पोस्ट-स्टेटस चूहे (सी) (ली / पिलोकार्पिन मॉडल, विवरण और विश्लेषणके लिए डे एट अल देखें) से फ्लोरो-जेड सी धुंधला होने की छवियां। वीजीएटी-क्रे चूहों के फ्लोरो-जेड सी धुंधला होने का विश्लेषण स्ट्राब एट अल.11 में प्रस्तुत किया गया था)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह रिपोर्ट एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जहां चूहों के विद्युत किलिंग से मिर्गी होती है। चूंकि उत्तेजक इलेक्ट्रोड हिप्पोकैम्पस में रखा जाता है, इसलिए यह एक फोकल लिम्बिक मिर्गी है जो रोगियों में टेम्पोरल लोब मिर्गी (टीईएल) को मॉडल करता है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम वीजीएटी-क्रे चूहों का उपयोग करना है, जो वीजीएटी जीन में आईआरईएस-क्रे रिकोम्बिनेस कैसेट के सम्मिलन के कारण, बिगड़ा हुआ निरोधात्मक जीएबीए धाराओंको दर्शाता है। C57BL/6 इस प्रोटोकॉल के साथ किंडलिंग के बाद मिर्गी विकसित नहीं करते हैं, हालांकि यह संभव है कि चूहों के अन्य उपभेद होंगे।

प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस में उत्तेजक गहराई इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट का उपयोग करके विकसित किया गया था। निर्देशांक ने लक्ष्य को एंटोरिनल कॉर्टेक्स से परफोरेंट पथ अनुमानों के साथ प्रदान किया क्योंकि वे सीए 1 उपक्षेत्र में प्रवेश करते हैं। विद्युत उत्तेजना से प्रेरित विद्युत क्षेत्र को परिभाषित नहीं किया गया है, इसलिए, इलेक्ट्रोड का सटीक स्थान महत्वपूर्ण नहीं है। वास्तव में, कृन्तकों को लिम्बिक सर्किट में कहीं भी विद्युत रूप से किंड किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एमिग्डाला और पिरिफॉर्म कॉर्टेक्स19। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम हैं: एक, उत्तेजक प्रवाह के लिए कम प्रतिरोध सुनिश्चित करने के लिए ईईजी हेडसेट की उचित सोल्डरिंग; दो, एक दंत चिपकने वाला का उपयोग करना जो खोपड़ी को बांधने और दंत सीमेंट के आसंजन के लिए एक सतह प्रदान करने के लिए दंत क्लीनिकों में उपयोग किया जाता है; और तीसरा, वर्णित विद्युत दालों को वितरित करने के लिए एक निरंतर वर्तमान एम्पलीफायर का उपयोग।

परेशानी-शूटिंग आमतौर पर विद्युत कनेक्शन की जांच करने तक सीमित होती है, जिसमें हेडसेट में कनेक्शन, केबल को हेडसेट, कम्यूटेटर को केबल और रिकॉर्डिंग डिवाइस के लिए कम्यूटेटर शामिल होते हैं। उच्च संवेदनशीलता के साथ ओममीटर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

तकनीक की सीमाओं में सर्जरी करने और ईईजी रिकॉर्ड करने के लिए उचित विशेषज्ञता और उपकरणों की आवश्यकता शामिल है।

टीईएल के मौजूदा पशु मॉडल पर मॉडल का एक लाभ यह है कि न्यूरॉन्स11 की न्यूनतम मृत्यु होती है। अन्य टीएलई मॉडल पोस्ट-स्टेटस एपिलेप्टिकस मॉडल हैं, जो व्यापक न्यूरोनल मृत्यु10 को ट्रिगर करते हैं। यह मृत्यु माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स के व्यापक सक्रियण और मोनोसाइट्स को प्रसारित करके घुसपैठ की ओर ले जाती है। एक साथ लिया गया, लंबे समय तक स्टेटस एपिलेप्टिकस द्वारा ट्रिगर तंत्र से मिर्गी का कारण बनने वाले तंत्र को अलग करना मुश्किल हो जाता है। यह अनुमान लगाया गया है कि किंडेड वीजीएटी-क्रे चूहे नए उपचार विकसित करने के लिए उपयोगी होंगे जो एंटी-जब्ती और एंटी-मिर्गी दोनों हैं। यह रिपोर्ट प्रमुख मैट्रिक्स और शक्ति विश्लेषण प्रदान करती है जो इन चूहों का उपयोग करके भविष्य के दवा विकास प्रयासों का मार्गदर्शन कर सकती है।

वीजीएटी-क्रे मॉडल का एक और लाभ उन जानवरों का उच्च प्रतिशत है जो मिर्गी (90%) और सहज दौरे की नियमितता विकसित करते हैं। मॉडल के नुकसान अपेक्षाकृत कम जब्ती आवृत्ति (1.5 / दिन) हैं और यह जब्ती आवृत्ति 3 सप्ताह के बाद कम हो जाती है, और कुछ मामलों में दौरे बंद हो जाते हैं। इन मुद्दों के समाधान के प्रयास किए जा रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी चर्चा के लिए जॉन विलियमसन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच / एनआईएनडीएस अनुदान एनएस 112549 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) AD Instruments AM3500-115-60 Alternate EEG amplifier
363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE P1 Technologies 363SLEEVPIN0NL For electrode holder
Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM P1 Technologies 363363XXXXCM004 mouse-to-commutator cable
CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED Sony QC-SP316
Commutator SL6C/SB (single brush) P1 Technologies 8BSL6CSBC0MT formerly Plastics One, Inc.
Current amplifier A-M Systems Model 2100
Dental cement Stoelting 51459
Drill bits, #75, OD  0.310" LOC 130 PT Kyocera 105-0210.310
E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED P1 Technologies 8IE3630XXXXE pins for connector
iBond Self Etch glue Kulzer CE0197
MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE P1 Technologies 8K000229801F EEG headset connector
Ohmeter Simpson 260 High sensitivity
PowerLab 16/35 and LabChart Pro AD Instruments PL3516/P Alternate EEG software
SomnoSuite Kent Scientific Corp. SS-01 anesthesia unit & RightTemp monitoring
Stereotactic drill and micromotor kit Foredom Electric Co. K.1070
Stereotactic frame David Kopf Instruments Model 940
Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' A-M Systems 791400
VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background The Jackson Laboratory 000664

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 174
टेम्पोरल लोब एपिलेप्सी के लिए एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए विद्युत किंडलिंग वीजीएटी-क्रे चूहों के लिए इलेक्ट्रोड की तैयारी और आरोपण
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Straub, J., Vitko, I., Gaykema, R.… More

Straub, J., Vitko, I., Gaykema, R. P., Perez-Reyes, E. Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy. J. Vis. Exp. (174), e62929, doi:10.3791/62929 (2021).

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