Summary
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا فعالا وقابلا للتكرار لعزل السكان المناعيين للجهاز التنفسي الفئراني. كما نقدم طريقة لتحديد جميع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توجد في رئتي الفئران السليمة ، باستخدام لوحة قياس التدفق الخلوي القائمة على 9 ألوان.
Abstract
الجهاز التنفسي على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية ويتطلب نظام مناعي منظم بدقة لتوفير الحماية مع قمع ردود الفعل غير المرغوب فيها على المستضدات البيئية. تستضيف الرئتين عدة مجموعات من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توفر المراقبة المناعية ولكنها تتوسط أيضا في الاستجابات المناعية الوقائية. هذه الخلايا ، التي تحافظ على توازن الجهاز المناعي الرئوي الصحي ، تشارك أيضا في العديد من الحالات المرضية مثل الربو والالتهابات وأمراض المناعة الذاتية والسرطان. يوفر التعبير الانتقائي للبروتينات السطحية وداخل الخلايا خصائص مناعية فريدة للخلايا المناعية في الرئة. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي له دور أساسي في تحديد مجموعات الخلايا هذه خلال الحالة الثابتة والظروف المرضية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يصف طريقة متسقة وقابلة للتكرار لتحديد الخلايا المناعية الموجودة في رئتي الفئران السليمة في ظل ظروف الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في مجموعات الخلايا هذه في نماذج الأمراض المختلفة للمساعدة في تحديد التغيرات الخاصة بالمرض في المشهد المناعي للرئة.
Introduction
يحتوي الجهاز التنفسي الفئراني على نظام مناعي فريد مسؤول عن مكافحة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن المناعي. يتكون الجهاز المناعي الرئوي من مجموعات خلوية ذات تباين كبير في نمطها الظاهري ووظيفتها وأصلها وموقعها. توجد البلاعم السنخية المقيمة (AMs) ، التي نشأت بشكل رئيسي من الخلايا الوحيدة الجنينية ، في التجويف السنخي1 ، في حين أن البلاعم الخلالية المشتقة من نخاع العظام (IMs) موجودة في حمة الرئة 2. ويمكن كذلك تصنيف الرسائل الفورية تصنيفا فرعيا من خلال التعبير عن CD206. تملأ CD206+ IMs المنطقة المحيطة بالشعب الهوائية وحول الأوعية الدموية ، بينما تقع CD206- IMs في الخلالي السنخي 3. تم اقتراح بعض التصنيفات الفرعية للرسائل الفورية مؤخرا3،4،5،6. على الرغم من أن IMs أقل دراسة من AMs ، إلا أن الأدلة الحديثة تدعم دورها الحاسم في تنظيم الجهاز المناعي للرئة 7. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن CD206 أيضا في AMs8 المنشطة بدلا من ذلك.
الخلايا المتغصنة الرئوية (DCs) هي مجموعة أخرى غير متجانسة من الخلايا المناعية الرئوية فيما يتعلق بخصائصها الوظيفية وموقعها وأصلها. تم وصف أربع فئات فرعية من DCs في الرئة: DCs التقليدية CD103 + (المعروفة أيضا باسم cDC1) ، CD11b + DCs التقليدية (المعروفة أيضا باسم cDC2) ، DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) ، و DCs9,10,11,12,13. يمكن تعريف الفئات الفرعية الثلاث الأولى على أنها مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) II + CD11c + 9،10،14،15. تعبر DCs البلازما عن MHC II وهي إيجابية بشكل متوسط ل CD11c ولكنها تعبر عن مستويات عالية من B220 و PDCA-19,13,16. في رئتي الفئران الساذجتين ، توجد CD103 DCs و CD11b DCs في الممر الخلالي للمجرى الهوائي ، في حين توجد DCs البلازما في الخلالي السنخي 17.
توجد مجموعتان رئيسيتان من الخلايا الوحيدة في الرئة أثناء الحالة المستقرة: الخلايا الوحيدة الكلاسيكية والخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية. الخلايا الوحيدة الكلاسيكية هي Ly6C + وهي حاسمة للاستجابة الالتهابية الأولية. في المقابل ، فإن الخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية هي Ly6C - وقد تم النظر إليها على نطاق واسع على أنها خلايا مضادة للالتهابات 3،16،18. في الآونة الأخيرة ، تم وصف مجموعة إضافية من الخلايا الوحيدة CD64 + CD16.2 + ، والتي تنشأ من الخلايا الوحيدة Ly6C وتؤدي إلى CD206 + IMs3.
تظهر الحمضات بشكل رئيسي في الرئتين أثناء عدوى الديدان الطفيلية أو حالات الحساسية. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من الحمضات في الحمة الرئوية خلال الحالة المستقرة ، والمعروفة باسم الحمضات المقيمة. على النقيض من الحمضات المقيمة ، توجد الحمضات الالتهابية في الخلالي الرئوي وغسل القصبات السنخية (BAL). في نماذج الفئران من عث غبار المنزل (HDM) ، يتم تجنيد الحمضات الالتهابية في الرئة بعد التحفيز بوساطة المستضد. وقد اقترح أن الحمضات المقيمة قد يكون لها دور تنظيمي في الحساسية عن طريق تثبيط حساسية T helper 2 (Th2) ل HDM19.
على النقيض من بقية الخلايا النخاعية الرئوية ، تعبر العدلات عن Ly6G ولكن ليس CD68 وتتميز بتوقيع النمط الظاهري المناعي CD68-Ly6G + 16,20,21. أظهرت دراسات التصور أنه خلال الحالة المستقرة، تحتفظ الرئة بمجموعة من العدلات في المقصورة داخل الأوعية الدموية وتستضيف عددا كبيرا من العدلات خارج الأوعية الدموية22. على غرار الحمضات ، لا توجد العدلات في BAL في حالة ثابتة. ومع ذلك ، فإن العديد من أشكال التحفيز المناعي ، مثل تحدي LPS أو الربو أو الالتهاب الرئوي ، تدفع العدلات إلى التجويف السنخي ، مما يؤدي إلى وجودها في BAL21،22،23.
يمثل عدد كبير من خلايا CD45+ في الرئة القاتل الطبيعي (NK) والخلايا التائية والخلايا البائية وهي سلبية لمعظم علامات النخاع الشوكي24. في رئتي الفئران الساذجة ، يمكن تحديد هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا بناء على تعبير CD11b و MHC II18. حوالي 25٪ من خلايا CD45+ الرئوية هي خلايا بائية ، في حين أن النسبة المئوية لخلايا NK أعلى في الرئة من الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية الأخرى24،25،26. بين الخلايا التائية الرئوية ، جزء كبير هو CD4-CD8- ويلعب دورا مهما في التهابات الجهاز التنفسي26.
نظرا لأن الرئة تستضيف جهازا مناعيا معقدا وفريدا للغاية ، فقد تم تطوير العديد من استراتيجيات البوابة لتحديد الخلايا المناعية الرئوية والإبلاغ عنها16،18،20،27. توفر استراتيجية البوابات الموضحة هنا طريقة شاملة وقابلة للتكرار لتحديد ما يصل إلى 12 مجموعة مناعية نخاعية رئوية وغير نخاعية مختلفة باستخدام 9 علامات. تم استخدام علامات إضافية للتحقق من صحة النتائج. علاوة على ذلك ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد تعليق أحادي الخلية يقلل من موت الخلايا ويسمح بتحديد المظهر الأكثر اكتمالا لحجرة الخلايا المناعية في الرئة. تجدر الإشارة إلى أن تحديد الخلايا غير المناعية في الرئة ، مثل الخلايا الظهارية (CD45-CD326 + CD31-) ، والخلايا البطانية (CD45-CD326-CD31 +) ، والخلايا الليفية يتطلب نهجا مختلفا28,29. ولا يشمل البروتوكول والطريقة الموصوفة هنا تحديد هوية هؤلاء السكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات والتجارب الموصوفة في هذا البروتوكول بموجب مبادئ توجيهية وفقا للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لمركز بيت إسرائيل ديكونيس الطبي. تم استخدام الفئران C57BL / 6 من أي من الجنسين التي يتراوح عمرها بين ستة وعشرة أسابيع لتطوير هذا البروتوكول.
1. الاستئصال الجراحي وإعداد الأنسجة
- القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن 1 مل من ثلاثي برومو الإيثانول داخل الصفاق (أعدت وفقا للبروتوكول القياسي ؛ جدول المواد).
ملاحظة: يجب تجنب اختناق CO2 في دراسات الرئة لأنه قد يسبب إصابة الرئة ويغير ميزات وخصائص خلايا المناعة الرئوية. يجب أيضا تجنب خلع عنق الرحم لأنه قد يسبب إصابة ميكانيكية للرئة. - انقل الماوس إلى منطقة نظيفة ومخصصة للعملية الجراحية.
- قم بتثبيت الجانب الظهري للماوس لأسفل باستخدام إبر أو شريط لاصق على الأطراف الأربعة. استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم جلد المنطقة البطنية.
- إجراء شق في الجلد ، من الرقبة إلى البطن. إزالة الجلد بعناية من منطقة الصدر.
- قم بإزالة القص والأضلاع بعناية.
- اغسل الرئتين عن طريق حقن 10 مل من PBS البارد مباشرة في البطين الأيمن ، باستخدام إبرة 18-21 جم ، حتى تصبح الرئتين بيضاء تماما.
- قم بإزالة الغدة الصعترية والقلب بعناية دون لمس الرئتين.
- افصل الرئتين بلطف عن الأنسجة المحيطة بها وانقلها إلى أنبوب به مخزن مؤقت BSA بارد (الجدول 1).
ملاحظة: يجب بذل جهد لإزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل مواصلة إعداد تعليق الخلية الواحدة ، لأن هذا يمكن أن ينحاز إلى القراءات.
2. إعداد تعليق خلية واحدة
- انقل الرئتين إلى طبق بتري فارغ وفرمهما بمشرطين ناعمين. انقل جميع قطع الرئة المفرومة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. استخدم 5 مل من المخزن المؤقت للهضم لغسل الصفيحة وإضافتها إلى أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الرئة المفرومة (الجدول 1).
ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للهضم مباشرة قبل الاستخدام. استخدم 5 ملغم/مل من الكولاجيناز28. الجمع بين 1 أو 5 ملغ من الكولاجيناز مع المخزن المؤقت BSA أو PBS الخالي من البروتين لم يحسن النتائج (الشكل التكميلي S1). - قم بتأمين غطاء الأنبوب وهضم الرئة لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد.
- بعد الهضم ، استخدم إبرة 18 جم لخلط وإذابة قطع الرئة. ضع مصفاة مرشح 70 ميكرومتر في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
ملاحظة: قد يؤدي استخدام مرشح ميكرون أصغر إلى فقدان مجموعات نخاعية كبيرة. - انقل خليط الرئة المهضوم ببطء مباشرة على المصفاة. استخدم الجانب المطاطي من مكبس حقنة سعة 10 مل لتحطيم قطع الرئة المتبقية على الفلتر. اغسل المواد المعالجة على الفلتر باستخدام المخزن المؤقت BSA.
- جهاز الطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية عند 350 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص بعناية من supernatant وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK. تخلط جيدا باستخدام ماصة 1 مل ، وتحضن لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد لإيقاف التفاعل وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.تخلص بعناية من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات في Staining Buffer لحساب الخلايا باستخدام مقياس مفاصل.
- أعد تعليق الخلايا بتركيز 5 × 106 خلية/مل واستخدمها لتلطيخ السطح (انظر القسم 3).
ملاحظة: لهذا الغرض ، قم بطلاء الخلايا في صفيحة مستديرة القاع من 96 بئرا متبوعة بتلطيخ الأجسام المضادة وغسلها. إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي اللوحتي متوفرا، فاستخدم أنابيب التدفق بدلا من اللوحات. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على 15-20 × 106 خلية لكل رئة من فأرة C57BL / 6 عمرها 6-10 أسابيع متوسطة الحجم.
3. تلطيخ الأجسام المضادة السطحية
- انقل 1 × 106 خلية في 200 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة 96 بئرا. الطرد المركزي للصفيحة عند 350 × غرام لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول كتلة Fc عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المضادة 16/32 (1:100) في مخزن التلطيخ العازل (الجدول 1).
- أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول حجب FC المعد مسبقا (جدول المواد) واحتضنها لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
- أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ وقم بالطرد المركزي للصفيحة عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة السطحية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة السطحية (1:100; الجدول 2) في تلطيخ المخزن المؤقت.
ملاحظة: (ط) يمكن استخدام الأجسام المضادة المضادة 16/32 لمنع FC مع الأجسام المضادة السطحية في نفس الخليط. (ii) إذا تم استخدام صبغة قابلة للإصلاح ، فأضفها إلى كوكتيل الأجسام المضادة السطحية بتخفيف 1: 1000. - أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المعدة مسبقا واحتضنها لمدة 30-40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. اغسل الخلايا باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ مرتين.
ملاحظة: إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من مخزن التلطيخ المؤقت وانتقل مباشرة إلى الحصول على البيانات الموجودة على مقياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، قد يتم إصلاح الخلايا وتخزينها عند 4 درجات مئوية لاقتنائها لاحقا. نوصي باستخدام الخلايا لقياس التدفق الخلوي في غضون 24 ساعة.
4. تثبيت الخلايا وتلطيخ داخل الخلايا
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتثبيت/التخلل (Fix/Perm Buffer) عن طريق خلط ثلاثة أجزاء من تركيز التثبيت/التخلل وجزء واحد من مخفف التثبيت/التخلل في مجموعة المخزن المؤقت لعامل التلطيخ FoxP3/Transcription Factor (الجدول 1).
- أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت Fix/Perm المعد مسبقا لكل بئر من صفيحة البئر المكونة من 96 بئرا، حيث تم طلاء الخلايا كما هو موضح في القسم 3، واحتضنها لمدة 20-25 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- قم بتخفيف المخزن المؤقت للنفاذية 10x على أنه 1: 10 في الماء النقي منزوع الأيونات لإعداد مخزن مؤقت للنفاذية 1x.
- اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للنفاذية 1x. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا عن طريق تخفيف الأجسام المضادة داخل الخلايا (1:100) في 1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية.
- أعد تعليق الخلايا باستخدام 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المعدة مسبقا لكل خلية من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للتخلل ومرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
ملاحظة: في حالة عدم توفر مقياس التدفق الخلوي مع قارئ اللوحات، قم بنقل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي. - الحصول على ما لا يقل عن 1.5 × 106 خلية لكل عينة على مقياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: بالنسبة للألوان المفردة وعينات التحكم غير الملطخة ، سيكون 0.5-1 × 106 خلية لكل عينة كافيا. يوصى بعيار الأجسام المضادة الفردية المستخدمة لتحقيق التلطيخ الأمثل وتقليل التكاليف. تم تحسين البروتوكول الحالي باستخدام Fix / Perm Buffer الذي تم إعداده باستخدام مجموعة المخزن المؤقت للتلطيخ FoxP3. نظرا لأن CD68 عبارة عن سيتوبلازم وليس علامة نووية ، فقد تكون حلول النفاذية الأخرى مثل التركيز المنخفض للبارافورمالديهايد أو مجموعات cytofix / cytoperm من مختلف البائعين كافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استراتيجية البوابات
الخطوة الأولى من استراتيجيتنا للبوابات هي استبعاد الحطام والمزدوجات (الشكل 1A). يعد الاستبعاد الدقيق للثنائيات أمرا بالغ الأهمية لتجنب المجموعات الإيجابية الكاذبة (الشكل التكميلي S2). بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا المناعية باستخدام CD45 + ، وهي علامة على الخلايا المكونة للدم (الشكل 1B). يمكن إضافة البقعة الحية الميتة لاستبعاد الخلايا الميتة. ومع ذلك ، يؤدي هذا البروتوكول إلى وفاة <5٪ من خلايا CD45 + (الشكل 1C) ، في حين يتم تحديد المزيد من خلايا CD45 على أنها ميتة (الشكل التكميلي S3).
لتحديد الخلايا الوحيدة والعدلات، على عكس الدراسات السابقة التي استخدمت أجساما مضادة محددة لكل من هذه المجموعات السكانية16,18، نفضل استخدام جسم مضاد مضاد GR-1 يحدد كلا من خلايا Ly6C + و Ly6G +. يسمح استخدام الجسم المضاد المضاد GR-1 مع anti-CD68 بفصل الخلايا المناعية الرئوية إلى ثلاث مجموعات: CD68-GR-1+ و CD68 + (التي يمكن تحديدها بشكل أكبر على أنها GR-1 + أو GR-1-) و CD68-GR-1-/int (الشكل 1D). CD68 هو علامة يتم اكتشافها في الغالب داخل الخلايا. تم فحص سطح CD68 ولكن لم يكن من الممكن اكتشافه دون تثبيت/نفاذية (الشكل التكميلي S4).
تم تحديد الخلايا متعددة الأشكال النووية (العدلات) على أنها CD45 + CD68-GR-1 + CD11b + (الشكل 1E). تم التحقق من هذه النتائج باستخدام GR1 جنبا إلى جنب مع جسم مضاد محدد ل Ly6G (الشكل 2) ، وهي علامة فريدة للعدلات النووية متعددة الأشكال 16،18،27. ضمن مجموعة CD45 + CD68-GR-1-/int ، ما يقرب من 10-20٪ هم MHCII و CD11blow ويمثلون خلايا NK (الشكل 1F). تم استخدام NK1.1 ، وهي علامة فريدة لخلايا NK ، لتأكيد ذلك (الشكل 3)25,30. يتكون CD45 + CD68-GR1-/intCD11b - من خلايا MHCII - T وخلايا MHCII + B (الشكل 1F). تم استخدام اثنين من الأجسام المضادة الإضافية للتحقق من الخلايا التائية والخلايا البائية-CD3 و B220 ، على التوالي (الشكل 3).
في الفئران السليمة في ظل ظروف الحالة المستقرة ، فإن غالبية خلايا CD45 + المكتشفة في BAL هي AMs ، السكان الرئيسيون في الشعب الهوائية. وبالتالي ، تم إجراء BAL لتقييم العلامات التي تميز AMs20,31. هذه الخلايا هي CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c + ولكن ، على عكس الخلايا النخاعية الأخرى ، لا تعبر عن مستويات عالية من CD11b (الشكل 4). نفس المزيج من العلامات المناعية يحدد أيضا AMs في المتجانسات من الرئتين الكلية (الشكل 1G ، H). بالإضافة إلى AMs ، في بوابة CD45 + CD68 + Sigle-F + (الشكل 1G) ، هناك مجموعة خلايا متميزة إيجابية ل CD11b ولكن ليس ل CD11c. هذا CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11b + CD11c - تمثل مجموعة الكريات البيض الحمضات (الشكل 1G) 19,32.
في البوابة التي تحتوي على خلايا CD45 + CD68 + SiglecF (الشكل 1G) ، هناك مجموعة CD11c + MHC + تمثل DCs الرئوية (الشكل 1I). يحدد العديد من الباحثين DCs الرئوية على أنها CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. تم تقييم تعبير CD24 لتأكيد هوية هؤلاء السكان (الشكل 5A). غالبية DCs الرئوية هي إما CD103 + CD11b - أو CD103-CD11b + (الشكل 1J). تمثل CD103 + CD11b - DCs DCs التقليدية CD103 + ويتم تحديدها على أنها CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103 + CD11b-. في المقابل، تنقسم DCs CD103-CD11b+ إلى DCs تقليدية و MoDCs استنادا إلى تعبير CD64 (الشكل 1K). لذلك ، يتم تعريف CD11b + DCs التقليدية على أنها CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 - في حين يتم تعريف MoDCs على أنها CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 + . وعلى النقيض من DCs التقليدية ، فإن MoDCs منخفضة الإيجابية لعلامة DC CD24 وموجبة لعلامات عموم البلاعم ، بما في ذلك F4/80 و CD64 و MERTK (الشكل 5A) 9،10،11،13،33،34.
توجد IMs والخلايا الوحيدة الكلاسيكية وغير الكلاسيكية في بوابة CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + (الشكل 1L) ويتم تمييزها بناء على تعبير CD64 و GR-1 (الشكل 1M). CD64 ، علامة عموم البلاعم ، يتم التعبير عنها بشكل رئيسي من خلال IMs و AMs ، بالإضافة إلى مجموعة فرعية من DCs. تعرف الخلايا الوحيدة الكلاسيكية أيضا باسم Ly6C + monocytes و monocytes غير الكلاسيكية باسم Ly6C- monocytes. كل من الخلايا الوحيدة والرسائل الفورية سلبية ل Ly6G. ومع ذلك ، فإن الخلايا الوحيدة الكلاسيكية تعبر عن Ly6C وبالتالي فهي إيجابية ل GR-1. في المقابل ، كل من البلاعم الخلالية والخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية سلبية ل GR-1 و Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية هي CD11cint ، في حين أن الخلايا الوحيدة الكلاسيكية هي CD11c-. على الرغم من أن هذا الاختلاف في تعبير CD11c غير مهم بشكل عام للتمييز بين نوعين من الخلايا الوحيدة عند خط الأساس ، إلا أنه قد يكون حاسما للحالات المرضية عندما تتراكم الخلايا الوحيدة الكلاسيكية. بناء على ما سبق ، يتم تعريف البلاعم الخلالية على أنها CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64 + ، والخلايا الوحيدة الكلاسيكية على أنها CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64 - ، والخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية على أنها CD45 + CD68 + CD11c - / intCD11b + GR-1-CD64- . كل من AMs و IMs إيجابية لجميع علامات البلاعم ، بما في ذلك CD68 و CD64 و F4/80 و MERTK proto-oncogene. ومع ذلك ، على عكس IMs ، فإن AMs هي CX3CR1-، على النقيض من IMs ، والتي يمكن تفسيرها من خلال الاختلاف في أصل النوعين من البلاعم الرئوية4,37,38,39 (الشكل 5B).
الشكل 1: استراتيجية بوابة الخلايا المناعية الموجودة في رئة الفئران. بعد الاستبعاد الدقيق للحطام ، والمزدوجات ، والخلايا الميتة ، والخلايا غير المناعية (CD45-) (A-C) ، تم فصل خلايا CD45 + إلى 3 مجموعات رئيسية بناء على التعبير عن CD68 و GR-1 (D). تنتمي العدلات إلى مجموعة CD68-GR-1+ (E) بينما تتكون مجموعة CD68-GR-1-/int من خلايا NK والخلايا البائية والخلايا التائية (F). يمكن تقسيم خلايا CD68+ إلى خلايا Siglec F+ (G) ، وهي AMs والحمضات (H) ، وخلايا Siglec F (G) ، والتي تتكون من الخلايا الوحيدة و IMs و DCs (I-M). الاختصارات: SSC-A = منطقة الذروة للضوء المتناثر جانبيا. FSC-A = منطقة الذروة للضوء المتناثر إلى الأمام ؛ SSC-H = ذروة ارتفاع الضوء الجانبي المتناثر ؛ L / D = تلطيخ حي / ميت ؛ MHC = مجمع التوافق النسيجي الرئيسي ؛ SF = Siglec F; GR-1 = علامة تمايز النخاع المرتبطة ب GPI (Ly-6G) ؛ NK = القاتل الطبيعي; IMs = البلاعم الخلالية; DCs = الخلايا المتغصنة; AMs = البلاعم السنخية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يتم التعبير عن Ly6G في الرئة فقط بواسطة خلايا CD45 + CD68-GR-1 + CD11b + التي تم تحديدها على أنها عدلات نووية متعددة الأشكال.
الشكل 3: التحقق من تحديد خلايا NK والخلايا التائية والخلايا البائية من خلال استراتيجية البوابة. تم استخدام علامات خاصة ب NK 1.1 و CD3 و B220 للتحقق من تحديد خلايا NK والخلايا التائية والخلايا البائية ، على التوالي. تجدر الإشارة إلى أن خلايا NKT ، إذا كانت موجودة ، قد تقع في مجموعة خلايا CD3 + داخل بوابة خلية NK ، ويجب توخي الحذر لتجنب تلوث NK بخلايا NKT. الاختصارات: NK = القاتل الطبيعي. MHC = مجمع التوافق النسيجي الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: غالبية الخلايا المناعية التي تم الحصول عليها عن طريق غسل القصبات السنخية في الفئران الساذجة هي البلاعم السنخية. الاختصارات: AMs = البلاعم السنخية; DCs = الخلايا المتغصنة; IM = البلاعم الخلالية; SSC-A = منطقة ذروة الضوء الجانبي المتناثر ؛ FSC-A = منطقة الذروة للضوء المتناثر إلى الأمام ؛ SSC-H = ذروة ارتفاع الضوء الجانبي المتناثر ؛ SF = Siglec F; GR-1 = علامة تمايز النخاع المرتبطة ب GPI (Ly-6G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة بين التعبير عن علامات مختلفة في الخلايا المناعية. (أ) مقارنة بين تعبير CD24 و CD64 و MERTK و F4/80 و CD103 في DCs الرئوية. (B) مقارنة بين CD68 و CD64 و MERTK و F4/80 و CD11c و Siglec F (SF) و CD11b و CX3CR1 في البلاعم الرئوية والخلايا الوحيدة. الاختصارات: DCs = الخلايا المتغصنة. MoDCs = DCs المشتقة من الخلايا الأحادية ؛ AMs = البلاعم السنخية; IMs = البلاعم الخلالية; SF = Siglec F; MERTK = النخاع الشوكي الظهاري التناسلي التيروزين كيناز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| BSA المخزن المؤقت | PBS + 0.5٪ الألبومين مصل البقر | ||
| المخزن المؤقت للهضم | المخزن المؤقت BSA المحفوظ مسبقا (37 درجة مئوية) + 5 ملغم / مل كولاجيناز من النوع 1 + 0.2 ملغ / مل DNase I | ||
| عازل تلطيخ | PBS + 2.5٪ FBS | ||
| إصلاح / بيرم المخزن المؤقت | ثلاثة أجزاء من التثبيت / مخفف النفاذية و 1 جزء من التثبيت / النفاذية المخفف لمجموعة المخزن المؤقت لعامل النسخ Foxp3 / Transcription Factor Staining | ||
| المخزن المؤقت للنفاذية | 10x العازلة نفاذية من Foxp3 / عامل النسخ تلطيخ مجموعة العازلة المخففة 10 مرات في المياه النقية منزوعة الأيونات | ||
الجدول 1: المخازن المؤقته.
| المستضد | استنساخ | الفلوروكروم | التخفيف | السطح/داخل الخلايا |
| CD45 | 30-F11 | إيه بي سي/سي 7 | 1:100 | سطح |
| جر-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | سطح |
| CD68 | FA-11 | بير سي بي سي5.5 | 1:100 | داخل الخلايا |
| CD11b | م1/70 | PECy7 | 1:100 | سطح |
| سيجليك إف | S17007L | فيت | 1:100 | سطح |
| CD11c | N418 | BV650 أو BV510 | 1:100 | سطح |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE / الإبهار 594 | 1:100 | سطح |
| MHC-II | م5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | سطح |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | سطح |
| الحية / الميتة القابلة للإصلاح بعيدا قراءة مجموعة وصمة عار الخلية الميتة | فارريد (APC) أو أكوا (BV510) | 1:1000 | سطح | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | سطح |
| ب٢٢٠ | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | سطح |
| NK1.1 | PK136 | فيت | 1:100 | سطح |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | سطح |
| ميرتك | 2B10C42 | PE | 1:100 | سطح |
| F4/80 | بي إم 8 | BV605 | 1:100 | سطح |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | سطح |
| إف سي بلوك (CD16/32) | 93 | 1:100 | سطح |
الجدول 2: استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
الشكل التكميلي S1: يتم تحقيق أفضل تفكك خلوي بواسطة 5 ملغ / مل من الكولاجيناز 1 في PBS المحموم مسبقا + 0.5٪ BSA. في جميع الظروف المختلفة ، تم تضمين 0.2 ملغ من الحمض النووي I أيضا. الاختصارات: BSA = ألبومين مصل البقر. FSC-A = منطقة الذروة للضوء المتناثر إلى الأمام ؛ L / D = تلطيخ حي / ميت ؛ SF = Siglec F. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: قد يؤدي إدراج الثنائيات إلى مجموعات إيجابية كاذبة. اختصار: FP = إيجابية كاذبة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: يحتوي المزيد من CD45- أكثر من CD45+ على ميزات تتفق مع الخلايا الميتة.
الشكل التكميلي S4: تلطيخ السطح ل CD68 ليس كافيا للتمييز بشكل صحيح بين مجموعات الخلايا المناعية الفردية في الرئة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يكون تحديد الخلايا المناعية الرئوية أمرا صعبا بسبب أنواع الخلايا المناعية المتعددة الموجودة في الرئة وخصائصها المناعية الفريدة مقارنة بنظيراتها المقيمة في الأنسجة الأخرى. في العديد من الحالات المرضية ، تظهر الخلايا ذات السمات الظاهرية المميزة في الرئتين. على سبيل المثال ، تؤدي إصابة الرئة الناجمة عن البليوميسين إلى تجنيد البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية المنتشرة في الفضاء السنخي ، حيث يمكن أن تبقى لمدة تصل إلى عام واحد وحتى تستمر بعد التليف الناجم عن البليومايسين. على النقيض من AMs المقيمة في الأنسجة ، فإن البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية المتداولة هي Siglec FlowCD11b +. يؤدي النضوب المستهدف للبلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية إلى تحسين التليف الرئوي بوساطة بليوميسين16,40. يتم تجنيد الخلايا ذات السمات المماثلة إلى الرئتين أثناء عدوى الأنفلونزا وتوفر حماية طويلة الأمد ضد الالتهاب الرئوي بالمكورات العقدية15.
استنادا إلى تعبير CD11c وMHC II ، تم تصنيف الرسائل الفورية إلى IM1 و IM2 و IM3. IM1 هي المظهرية المناعية التي تعرف عادة بأنها CD11c-MHC II-؛ يتم تعريف IM2 على أنه CD11c-MHC II + ؛ يتم تعريف IM3 على أنها MHC II + CD11c +. وقد اقترح أن IM1 و IM2 و IM3 تمثل المراحل الفسيولوجية لانتقال الخلية الأحادية إلى البلاعم ، بدلا من فئات البلاعم المتميزة ، حيث تمثل IM3 المقصورة الوحيدة41. كما ذكر أعلاه ، فإن MoDCs منخفضة الإيجابية لعلامة DC CD24 وإيجابية لعلامات عموم البلاعم ، بما في ذلك F4/80 و CD64 و MERTK9,10,11,13,33,34. ومع ذلك ، تحدد العديد من الدراسات خلايا CD64 + MERKT + كبلاعم رئوية4,10. تم تعريف كل من IM3 و MoDCs على أنهما CD64 + MERKT + MHCII + CD11C + ، مما يشير إلى أن هاتين المجموعتين تمثلان على الأرجح نفس نوع الخلية. وتمشيا مع هذه الفرضية، فإن استراتيجية البوابات المعروضة هنا لا تحدد مجموعة متميزة تمثل خلايا IM3، بالإضافة إلى MoDCs.
وتشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول الموصوف هنا ما يلي: 1) إزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل إعداد تعليق الخلية الواحدة، لأن هذا يمكن أن ينحاز إلى القراءات؛ و 1) إزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل إعداد تعليق الخلية الواحدة؛ و 1) إزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل إعداد تعليق الخلية الواحدة، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تحيز القراءات؛ و 1) إزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل إعداد تعليق الخلية الواحدة؛ و 1) إزالة جميع الدهون المجاورة من الرئ 2) نفاذية قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة CD68 المضادة. أحد قيود البروتوكول الحالي هو أنه لا يستطيع تحديد الخلايا غير المناعية في الرئة ، مثل الخلايا الظهارية (CD45-CD326 + CD31-) ، والخلايا البطانية (CD45-CD326-CD31 +) ، والخلايا الليفية. ويتطلب تحديد هؤلاء السكان نهجا مختلفا28،29. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب البروتوكول تلطيخ CD68 ، وهي علامة داخل الخلايا ، والتي قد تشكل قيدا إذا لم يكن الباحث من ذوي الخبرة في التلطيخ داخل الخلايا. تكمن أهمية البروتوكول الحالي واستراتيجية البوابات فيما يتعلق بالأساليب الحالية في أن هذه الاستراتيجية توفر نهجا مبسطا يستخدم عددا أقل من العلامات مع السماح بتحديد جميع المجموعات المناعية للرئة القابلة للتكرار.
علاوة على ذلك ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد تعليق أحادي الخلية يقلل من موت الخلايا ويسمح بتحديد ملف تعريف كامل لحجرة الخلايا المناعية في الرئة. على الرغم من أن البروتوكول الموضح هنا يصف توصيف وتحديد مجموعات المناعة الرئوية في ظل ظروف الحالة الثابتة ، إلا أن التطبيقات المستقبلية قد تشمل تقييم هؤلاء السكان في نماذج الأمراض المختلفة حيث يمكن أن يساعد في تحديد التغيرات الخاصة بالمرض في المشهد المناعي للرئة. في الختام ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكرار لإعداد خلية واحدة في الرئة ولوحة قياس التدفق الخلوي القائمة على 9 ألوان لتحديد 12 مجموعة مختلفة من الخلايا المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تمتلك V.A.B. براءات اختراع على مسار PD-1 مرخص من قبل بريستول مايرز سكويب وروش وميرك وإي إم دي سيرونو وبوهرنجر إنجلهايم وأسترازينيكا ونوفارتيس وداكو. ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية أخرى متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA238263 و R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
