Summary
In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.
Abstract
Die Atemwege stehen in direktem Kontakt mit der äußeren Umgebung und benötigen ein präzise reguliertes Immunsystem, um Schutz zu bieten und gleichzeitig unerwünschte Reaktionen auf Umweltantigene zu unterdrücken. Lungen beherbergen mehrere Populationen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die Immunüberwachung bieten, aber auch schützende Immunantworten vermitteln. Diese Zellen, die das gesunde Lungenimmunsystem im Gleichgewicht halten, nehmen auch an mehreren pathologischen Zuständen wie Asthma, Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebs teil. Die selektive Expression von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen verleiht den Immunzellen der Lunge einzigartige immunphänotypische Eigenschaften. Folglich spielt die Durchflusszytometrie eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung solcher Zellpopulationen während stationärer und pathologischer Zustände. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das eine konsistente und reproduzierbare Methode beschreibt, um die Immunzellen zu identifizieren, die sich in den Lungen gesunder Mäuse unter stationären Bedingungen befinden. Dieses Protokoll kann jedoch auch verwendet werden, um Veränderungen in diesen Zellpopulationen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu identifizieren, um krankheitsspezifische Veränderungen in der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren.
Introduction
Die murinen Atemwege enthalten ein einzigartiges Immunsystem, das für die Bekämpfung von Krankheitserregern und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich ist. Das pulmonale Immunsystem besteht aus zellulären Populationen mit signifikanter Heterogenität in ihrem Phänotyp, ihrer Funktion, ihrem Ursprung und ihrem Standort. Residente alveoläre Makrophagen (AMs), die hauptsächlich aus fetalen Monozyten stammen, befinden sich im alveolären Lumen1, während sich aus dem Knochenmark stammende interstitielle Makrophagen (IMs) im Lungenparenchym befinden2. Sofortnachrichten können durch den Ausdruck CD206 weiter unterteilt werden. CD206+ IMs bevölkern den peribronchialen und perivaskulären Bereich, während sich CD206-IMs am alveolären Interstitium befinden3. In jüngster Zeit wurden einige Unterklassifizierungen von Sofortnachrichten vorgeschlagen3,4,5,6. Obwohl IMs weniger untersucht werden als AMs, unterstützen jüngste Beweise ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung des Immunsystems der Lunge7. Darüber hinaus wird CD206 auch in alternativ aktivierten AMs8 ausgedrückt.
Pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind eine weitere heterogene Gruppe von Lungenimmunzellen in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften, ihren Ort und ihre Herkunft. Vier Unterkategorien von DCs wurden in der Lunge beschrieben: konventionelle CD103+ DCs (auch bekannt als cDC1), konventionelle CD11b+ DCs (auch bekannt als cDC2), Monozyten-abgeleitete DCs (MoDCs) und plasmazytoide DCs9,10,11,12,13. Die ersten drei Unterklassen können als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15 definiert werden. Plasmazytoide DCs exprimieren MHC II und sind mittelmäßig positiv für CD11c, exprimieren aber hohe Konzentrationen von B220 und PDCA-19,13,16. In naiven murinen Lungen befinden sich CD103-DCs und CD11b-DCs im Interstitium der Atemwege, während sich plasmazytoide DCs im alveolären Interstitium befinden17.
Zwei Hauptpopulationen von Monozyten befinden sich im stationären Zustand in der Lunge: klassische Monozyten und nicht-klassische Monozyten. Klassische Monozyten sind Ly6C + und sind entscheidend für die anfängliche Entzündungsreaktion. Im Gegensatz dazu sind nicht-klassische Monozyten Ly6C- und wurden weithin als entzündungshemmende Zellen angesehen3,16,18. Kürzlich wurde eine zusätzliche Population von CD64+CD16.2+ Monozyten beschrieben, die aus Ly6C- Monozyten stammen und CD206+ IMs3 entstehen lassen.
Eosinophile treten hauptsächlich in der Lunge während einer Helmintheninfektion oder allergischen Erkrankungen auf. Es gibt jedoch eine kleine Anzahl von Eosinophilen im Lungenparenchym während des stationären Zustands, die als ansässige Eosinophile bekannt sind. Im Gegensatz zu den ansässigen Eosinophilen finden sich entzündliche Eosinophile im Lungeninterstitium und in der bronchoalveolären Lavage (BAL). In Mausmodellen der Hausstaubmilbe (HDM) werden entzündliche Eosinophile nach Antigen-vermittelter Stimulation in die Lunge rekrutiert. Es wurde vorgeschlagen, dass ansässige Eosinophile eine regulatorische Rolle bei der Allergie spielen könnten, indem sie die Sensibilisierung von T helper 2 (Th2) gegenüber HDM19 hemmen.
Im Gegensatz zum Rest der lungenmyeloischen Zellen exprimieren Neutrophile Ly6G, aber nicht CD68 und zeichnen sich durch eine Signatur des CD68-Ly6G+-Immunphänotyps16,20,21 aus. Visualisierungsstudien haben gezeigt, dass die Lunge im stationären Zustand einen Pool von Neutrophilen im intravaskulären Kompartiment reserviert und eine beträchtliche Anzahl extravaskulärer Neutrophilen beherbergt22. Ähnlich wie Eosinophile werden Neutrophile in BAL im stationären Zustand nicht gefunden; Verschiedene Formen der Immunstimulation, wie LPS-Challenge, Asthma oder Lungenentzündung, treiben jedoch Neutrophile in das Alveolarlumen, was zu ihrer Anwesenheit in BAL21,22,23 führt.
Eine beträchtliche Anzahl von CD45+-Zellen der Lunge stellt einen natürlichen Killer (NK), T-Zellen und B-Zellen dar und ist für die meisten myeloischen Marker negativ24. In den Lungen naiver Mäuse können diese drei Zelltypen anhand der Expression von CD11b und MHC II18 identifiziert werden. Etwa 25% der pulmonalen CD45+-Zellen sind B-Zellen, während der Prozentsatz der NK-Zellen in der Lunge höher ist als bei anderen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben24,25,26. Unter den pulmonalen T-Zellen ist ein beträchtlicher Anteil CD4-CD8- und spielt eine wichtige Rolle bei Atemwegsinfektionen26.
Da die Lunge ein sehr komplexes und einzigartiges Immunsystem beherbergt, wurden mehrere Gating-Strategien zur Identifizierung von Lungenimmunzellen entwickelt und berichtet16,18,20,27. Die hierin beschriebene Gating-Strategie bietet eine umfassende und reproduzierbare Möglichkeit, bis zu 12 verschiedene pulmonale myeloische und nicht-myeloische Immunpopulationen mit 9 Markern zu identifizieren. Zusätzliche Marker wurden verwendet, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus wird eine detaillierte Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension bereitgestellt, die den Zelltod minimiert und die Identifizierung des vollständigsten Profils des Immunzellkompartiments der Lunge ermöglicht. Es sollte beachtet werden, dass die Identifizierung von Nicht-Immunzellen der Lunge, wie Epithelzellen (CD45-CD326+CD31-), Endothelzellen (CD45-CD326-CD31+), und Fibroblasten einen anderen Ansatz erfordert28,29. Die Identifizierung solcher Populationen ist in dem hier beschriebenen Protokoll und Verfahren nicht enthalten.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Studien und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Sechs bis zehn Wochen alte C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts wurden verwendet, um dieses Protokoll zu entwickeln.
1. Chirurgische Exzision und Gewebevorbereitung
- Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Tribromethanol (hergestellt nach Standardprotokoll; Tabelle der Materialien).
HINWEIS: CO2-Erstickung sollte in Lungenstudien vermieden werden, da sie Lungenverletzungen verursachen und die Eigenschaften und Eigenschaften von Lungenimmunzellen verändern kann. Zervikale Dislokationen sollten ebenfalls vermieden werden, da sie zu mechanischen Verletzungen der Lunge führen können. - Übertragen Sie die Maus für chirurgische Eingriffe in einen sauberen und speziellen Bereich.
- Stabilisieren Sie die dorsale Seite der Maus nach unten, indem Sie Nadeln oder Klebeband an den vier Extremitäten verwenden. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Haut des ventralen Bereichs zu desinfizieren.
- Führen Sie einen Schnitt in der Haut durch, vom Hals bis zum Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Haut aus dem Brustbereich.
- Entfernen Sie vorsichtig das Brustbein und die Rippen.
- Spülen Sie die Lunge, indem Sie 10 ml kaltes PBS direkt in den rechten Ventrikel injizieren, mit einer 18-21 G Nadel, bis die Lunge vollständig weiß wird.
- Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Herz, ohne die Lunge zu berühren.
- Lösen Sie die Lunge vorsichtig vom umgebenden Gewebe und übertragen Sie sie in eine Röhre mit kaltem BSA-Puffer (Tabelle 1).
HINWEIS: Es sollten Anstrengungen unternommen werden, um das gesamte angrenzende Fett aus der Lunge zu entfernen, bevor die Einzelzellsuspension weiter vorbereitet wird, da dies die Auslesungen verzerren könnte.
2. Herstellung der Einzelzellsuspension
- Die Lungen in eine leere Petrischale geben und mit zwei feinen Skalpellen zerkleinern. Übertragen Sie alle Teile der gehackten Lunge in ein neues 50 ml konisches Rohr. Verwenden Sie 5 ml Verdauungspuffer, um die Platte zu waschen und sie dem 50-ml-Röhrchen hinzuzufügen, das die gehackte Lunge enthält (Tabelle 1).
HINWEIS: Der Verdauungspuffer sollte unmittelbar vor dem Gebrauch vorbereitet werden. Verwenden Sie 5 mg/ml Kollagenase28. Die Kombination von 1 oder 5 mg Kollagenase mit BSA-Puffer oder proteinfreiem PBS verbesserte die Ergebnisse nicht (Ergänzende Abbildung S1). - Befestigen Sie den Deckel des Schlauches und verdauen Sie die Lunge für 30 min auf einem Orbitalschüttler mit einer Geschwindigkeit von 150 U / min bei 37 ° C. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzufügen.
- Verwenden Sie nach der Verdauung eine 18-G-Nadel, um die Lungenstücke zu mischen und aufzulösen. Legen Sie ein 70-μm-Filtersieb an die Oberseite eines neuen konischen 50-ml-Rohrs.
HINWEIS: Die Verwendung eines kleineren Mikron-Filters kann zum Verlust wichtiger myeloischer Populationen führen. - Übertragen Sie die verdaute Lungenmischung langsam direkt auf das Sieb. Verwenden Sie die Gummiseite eines 10-ml-Spritzenkolbens, um die verbleibenden Lungenstücke auf dem Filter zu zerschlagen. Waschen Sie das verarbeitete Material auf dem Filter mit BSA-Puffer.
- Die Einzelzellsuspension wird 8 min bei 350 × g bei 4 °C zentrifugiert.
- Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml ACK-Lysepuffer. Mit einer 1-ml-Pipette gut mischen und bei Raumtemperatur 90 s inkubieren.
- Fügen Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 350 × g für 7 min bei 4 °C.Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet im Färbepuffer, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml und verwenden Sie sie zur Oberflächenfärbung (siehe Abschnitt 3).
HINWEIS: Zu diesem Zweck beschichten Sie die Zellen in einer 96-Well-Rundbodenplatte, gefolgt von Antikörperfärbungen und Waschen. Wenn keine Plattenzentrifuge verfügbar ist, verwenden Sie Durchflussrohre anstelle von Platten. Mit diesem Protokoll können ~ 15-20 × 106 Zellen pro Lunge von einer 6-10 Wochen alten C57BL / 6-Maus mittlerer Größe erhalten werden.
3. Oberflächen-Antikörper-Färbung
- Übertragen Sie 1 × 106 Zellen in 200 μL pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 350 × g für 7 min bei 4 °C. In der Zwischenzeit wird die Fc-Blocklösung durch Verdünnung des Anti-16/32-Antikörpers (1:100) im Färbepuffer hergestellt (Tabelle 1).
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL der vorgefertigten Fc-blockierenden Lösung (Table of Materials) und inkubieren Sie für 15-20 min bei 4 °C oder auf Eis.
- 150 μL Färbepuffer zugeben und die Platte bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit den Oberflächenantikörpercocktail vor, indem Sie Oberflächenantikörper verdünnen (1:100; Tabelle 2) im Färbepuffer.
HINWEIS: (i) Anti-16/32-Antikörper zur FC-Blockierung können mit den Oberflächenantikörpern in derselben Mischung verwendet werden. (ii) Wenn fixierbarer Lebensfähigkeitsfarbstoff verwendet wird, fügen Sie ihn dem Oberflächenantikörpercocktail bei einer Verdünnung von 1:1.000 hinzu. - Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL des vorgefertigten Oberflächenantikörpercocktails und inkubieren Sie für 30-40 min bei 4 °C im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Färbepuffer.
HINWEIS: Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL Färbepuffer und fahren Sie direkt mit der Erfassung von Daten auf dem Durchflusszytometer fort. Alternativ können Zellen fixiert und bei 4 °C gelagert werden, um sie später zu erfassen. Wir empfehlen, die Zellen innerhalb von 24 Stunden für die Durchflusszytometrie zu verwenden.
4. Zellfixierung und intrazelluläre Färbung
- Bereiten Sie den Fixations-/Permeabilisierungspuffer (Fix/Perm-Puffer) vor, indem Sie drei Teile des Fixations-/Permeabilisierungskonzentrats und 1 Teil des Fixations-/Permeabilisierungsverdünnungsmittels des FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set mischen (Tabelle 1).
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL des vorgefertigten Fix/Perm-Puffers pro Vertiefung der 96-Well-Platte, wo die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben plattiert wurden, und inkubieren Sie sie für 20-25 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Verdünnen Sie den 10-fachen Permeabilisierungspuffer als 1: 10 in gereinigtem entionisiertem Wasser, um einen 1x-Permeabilisierungspuffer herzustellen.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x Permeabilisierungspuffer. In der Zwischenzeit bereiten Sie den intrazellulären Antikörpercocktail vor, indem Sie intrazelluläre Antikörper (1:100) in 1 ml Permeabilisierungspuffer verdünnen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μL des vorgefertigten Oberflächenantikörpercocktails pro Zelle der 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 40 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit Permeabilisierungspuffer und einmal mit Färbepuffer. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL Färbepuffer.
HINWEIS: Wenn kein Durchflusszytometer mit Plattenleser verfügbar ist, übertragen Sie die Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen. - Erwerben Sie mindestens 1,5 × 106 Zellen pro Probe auf dem Durchflusszytometer.
HINWEIS: Für einzelne Farben und ungefärbte Kontrollproben sind 0,5-1 × 106 Zellen pro Probe ausreichend. Es wird empfohlen, die einzelnen verwendeten Antikörper zu titern, um eine optimale Färbung zu erreichen und die Kosten zu senken. Das vorliegende Protokoll wurde mit Fix/Perm Buffer optimiert, das mit dem FoxP3-Färbepuffersatz erstellt wurde. Da CD68 ein zytoplasmatischer und kein nuklearer Marker ist, können andere Permeabilisierungslösungen wie eine niedrige Konzentration von Paraformaldehyd oder Cytofix/Cytoperm-Kits verschiedener Anbieter ausreichen.
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Representative Results
Gating-Strategie
Der erste Schritt unserer Gating-Strategie ist der Ausschluss der Ablagerungen und Dubletten (Abbildung 1A). Der sorgfältige Ausschluss von Dubletten ist entscheidend, um falsch-positive Populationen zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S2). Anschließend werden Immunzellen mit CD45+, einem Marker für hämatopoetische Zellen, identifiziert (Abbildung 1B). Der lebende tote Fleck kann hinzugefügt werden, um tote Zellen auszuschließen. Dieses Protokoll führt jedoch zum Tod von <5% der CD45+-Zellen (Abbildung 1C), während mehr CD45-Zellen als tot identifiziert werden (Ergänzende Abbildung S3).
Um Monozyten und Neutrophile zu identifizieren, bevorzugen wir im Gegensatz zu früheren Studien, die spezifische Antikörper für jede dieser Populationen verwendeten16,18, einen Anti-GR-1-Antikörper, der sowohl Ly6C + - als auch Ly6G + -Zellen identifiziert. Die Verwendung des Anti-GR-1-Antikörpers zusammen mit Anti-CD68 ermöglicht die Trennung der Lungenimmunzellen in drei Cluster: CD68-GR-1+, CD68+ (die weiter als GR-1+ oder GR-1- identifiziert werden können) und CD68-GR-1-/int (Abbildung 1D). CD68 ist ein Marker, der überwiegend intrazellulär nachgewiesen wird. Oberflächen-CD68 wurde untersucht, konnte aber ohne Fixierung/Permeabilisierung nicht nachgewiesen werden (Ergänzende Abbildung S4).
Polymorphkernige Zellen (Neutrophile) wurden als CD45+CD68-GR-1+CD11b+ identifiziert (Abbildung 1E). Diese Ergebnisse wurden mit GR1 zusammen mit einem Antikörper verifiziert, der spezifisch für Ly6G ist (Abbildung 2), einem einzigartigen Marker für polymorphkernige Neutrophile16,18,27. Innerhalb der CD45+CD68-GR-1-/int-Population sind ca. 10-20% MHCII- und CD11blow und repräsentieren die NK-Zellen (Abbildung 1F). NK1.1, ein eindeutiger Marker für NK-Zellen, wurde verwendet, um dies zu bestätigen (Abbildung 3)25,30. Die CD45+CD68-GR1-/intCD11b- Population besteht aus MHCIIt-Zellen und MHCII+ B-Zellen (Abbildung 1F). Zwei zusätzliche Antikörper wurden verwendet, um T-Zellen bzw. B-Zellen - CD3 bzw. B220 zu verifizieren (Abbildung 3).
Bei gesunden Mäusen unter stationären Bedingungen sind die meisten CD45+-Zellen, die in BAL nachgewiesen wurden, AMs, die Hauptbewohner der Atemwege. Daher wurde BAL durchgeführt, um die Marker zu bewerten, die AMs20,31 charakterisieren. Diese Zellen sind CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c +, exprimieren aber im Gegensatz zu anderen myeloischen Zellen keine hohen CD11b-Spiegel (Abbildung 4). Die gleiche Kombination von Immunmarkern identifiziert auch AMs in Homogenaten der gesamten Lunge (Abbildung 1G, H). Zusätzlich zu AMs gibt es im CD45+CD68+Sigle-F+-Gatter (Abbildung 1G) eine ausgeprägte Zellpopulation, die für CD11b, aber nicht für CD11c positiv ist. Diese CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- Population von Leukozyten repräsentiert Eosinophile (Abbildung 1G)19,32.
Im Gatter mit den CD45+CD68+SiglecF-Zellen (Abbildung 1G) befindet sich eine CD11c+MHC+-Population, die pulmonale DCs darstellt (Abbildung 1I). Mehrere Forscher identifizieren pulmonale DCs als CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. Die CD24-Expression wurde bewertet, um die Identität dieser Population zu bestätigen (Abbildung 5A). Die Mehrheit der Lungen-DCs sind entweder CD103+CD11b- oder CD103-CD11b+ (Abbildung 1J). Die CD103+CD11b- DCs repräsentieren die CD103+ konventionellen DCs und sind als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b- gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu werden CD103-CD11b+ DCs basierend auf der CD64-Expression in konventionelle DCs und MoDCs unterteilt (Abbildung 1K). Daher werden herkömmliche CD11b+ DCs als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64- identifiziert, während die MoDCs als CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ identifiziert werden. . Im Gegensatz zu herkömmlichen DCs sind MoDCs für den DC-Marker CD24 niedrig-positiv und für Pan-Makrophagenmarker, einschließlich F4/80, CD64 und MERTK (Abbildung 5A)9,10,11,13,33,34.
IMs und klassische und nicht-klassische Monozyten befinden sich im CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+-Gatter (Abbildung 1L) und werden anhand des CD64- und GR-1-Ausdrucks unterschieden (Abbildung 1M). CD64, ein Panmakrophagenmarker, wird hauptsächlich durch IMs und AMs sowie eine Teilmenge von DCs exprimiert. Klassische Monozyten sind auch als Ly6C+-Monozyten und nicht-klassische Monozyten als Ly6C-Monozyten bekannt. Sowohl Monozyten als auch IMs sind negativ für Ly6G; Klassische Monozyten exprimieren jedoch Ly6C und sind daher positiv für GR-1. Im Gegensatz dazu sind sowohl interstitielle Makrophagen als auch nicht-klassische Monozyten negativ für GR-1 und Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Darüber hinaus sind nicht-klassische Monozyten CD11cint, während klassische Monozyten CD11c- sind. Obwohl dieser Unterschied in der CD11c-Expression für die Unterscheidung der beiden Arten von Monozyten zu Studienbeginn im Allgemeinen unbedeutend ist, könnte er für pathologische Zustände kritisch sein, wenn sich klassische Monozyten ansammeln. Basierend auf dem oben Gesagten sind interstitielle Makrophagen definiert als CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64+, klassische Monozyten als CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64- und nicht-klassische Monozyten als CD45 + CD68 + CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64- . Sowohl AMs als auch IMs sind positiv für alle Makrophagenmarker, einschließlich CD68, CD64, F4/80 und MERTK Proto-Onkogen. Im Gegensatz zu IMs sind AMs jedoch CX3CR1-, im Gegensatz zu IMs, was durch den Unterschied in der Herkunft der beiden Arten von Lungenmakrophagen4,37,38,39 erklärt werden könnte (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Gating-Strategie von Immunzellen, die in der murinen Lunge vorhanden sind. Nach sorgfältigem Ausschluss von Trümmern, Dubletten, toten Zellen und den Nicht-Immunzellen (CD45-) (A-C) wurden CD45+-Zellen basierend auf der Expression von CD68 und GR-1 (D) in 3 Hauptcluster getrennt. Neutrophile gehören zur CD68-GR-1+-Population (E), während die CD68-GR-1-/int-Population aus NK-Zellen, B-Zellen und T-Zellen (F) besteht. CD68+-Zellen können weiter unterteilt werden in Siglec F+-Zellen (G), bei denen es sich um AMs und Eosinophile (H) handelt, und Siglec-F-Zellen (G), die aus Monozyten, IMs und DCs (I-M) bestehen. Abkürzungen: SSC-A = Peakfläche des seitlich gestreuten Lichts; FSC-A = Spitzenfläche des vorwärts gestreuten Lichts; SSC-H = Spitzenhöhe des seitlich gestreuten Lichts; L/D = Lebend-/Totenfleck; MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-verknüpfter myeloischer Differenzierungsmarker (Ly-6G); NK = natürlicher Killer; IMs = interstitielle Makrophagen; DCs = dendritische Zellen; AMs = alveoläre Makrophagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ly6G in der Lunge wird nur von CD45+CD68-GR-1+CD11b+-Zellen exprimiert, die als polymorphkernige Neutrophile identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Überprüfung der Identifizierung von NK-Zellen, T-Zellen und B-Zellen durch die Gating-Strategie. Marker speziell für NK 1.1, CD3 und B220 wurden verwendet, um die Identifizierung von NK-Zellen, T-Zellen bzw. B-Zellen zu überprüfen. Es sollte beachtet werden, dass NKT-Zellen, falls vorhanden, in die CD3 + -Zellpopulation innerhalb des NK-Zelltors fallen könnten, und Vorsicht ist geboten, um eine Kontamination von NK mit NKT-Zellen zu vermeiden. Abkürzungen: NK = natürlicher Killer; MHC = Major Histocompatibility Complex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Mehrheit der Immunzellen, die durch bronchoalveoläre Lavage in naiven Mäusen gewonnen werden, sind alveoläre Makrophagen. Abkürzungen: AMs = alveoläre Makrophagen; DCs = dendritische Zellen; IM = interstitieller Makrophagen; SSC-A = Spitzenfläche des seitlich gestreuten Lichts; FSC-A = Spitzenfläche des vorwärts gestreuten Lichts; SSC-H = Spitzenhöhe des seitlich gestreuten Lichts; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-verknüpfter myeloischer Differenzierungsmarker (Ly-6G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich der Expression verschiedener Marker in Immunzellen. (A) Vergleich der CD24-, CD64-, MERTK-, F4/80- und CD103-Expression in pulmonalen DCs. (B) Vergleich von CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b und CX3CR1 in Lungenmakrophagen und Monozyten. Abkürzungen: DCs = dendritische Zellen; MoDCs = Monozyten-abgeleitete DCs; AMs = alveoläre Makrophagen; IMs = interstitielle Makrophagen; SF = Siglec F; MERTK = Myeloid-Epithel-reproduktive Tyrosinkinase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| BSA-Puffer | PBS + 0,5% Rinderserumalbumin | ||
| Verdauungspuffer | Vorgewärmter (37 °C) BSA-Puffer + 5 mg/ml Kollagenase Typ 1 + 0,2 mg/ml DNase I | ||
| Färbepuffer | PBS + 2,5% FBS | ||
| Fix/Perm-Puffer | Drei Teile des Fixations-/Permeabilisierungsverdünnungsmittels und 1 Teil des Fixations-/Permeabilisierungsverdünnungsverdünners des Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffersatzes | ||
| Permeabilisierungspuffer | 10x Permeabilisierungspuffer aus dem Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepufferset 10-fach verdünnt in gereinigtem entionisiertem Wasser | ||
Tabelle 1: Puffer.
| Antigen | Klonen | Fluorochrom | Verdünnung | Oberfläche/intrazellulär |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Oberfläche |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Oberfläche |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5,5 | 1:100 | intrazellulär |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Oberfläche |
| Siglec F | S17007L | FITC (FITC) | 1:100 | Oberfläche |
| CD11c | N418 | BV650 oder BV510 | 1:100 | Oberfläche |
| CD64 | X54-5/7,1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Oberfläche |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Oberfläche |
| CD103 | 2,00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Oberfläche |
| Live / Dead Fixable Far Read Dead Cell Flecken-Kit | FarRed (APC) oder Aqua (BV510) | 1:1000 | Oberfläche | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | Oberfläche |
| B-220 | RA3-6B2 | AF-488 | 1:100 | Oberfläche |
| NK1,1 | PK-136 | FITC (FITC) | 1:100 | Oberfläche |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Oberfläche |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | Oberfläche |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Oberfläche |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Oberfläche |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Oberfläche |
Tabelle 2: Verwendung von monoklonalen Antikörpern.
Ergänzende Abbildung S1: Die beste zelluläre Dissoziation wird durch 5 mg/ml Kollagenase 1 bei vorgewärmtem PBS + 0,5% BSA erreicht. Unter allen verschiedenen Bedingungen wurden auch 0,2 mg DNAse I eingeschlossen. Abkürzungen: BSA = Rinderserumalbumin; FSC-A = Spitzenfläche des vorwärts gestreuten Lichts; L/D = Lebend-/Totenfleck; SF = Siglec F. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Die Einbeziehung von Dubletten kann zu falsch-positiven Populationen führen. Abkürzung: FP = false positive. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Mehr CD45- als CD45+ haben Merkmale, die mit toten Zellen übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Die Oberflächenfärbung für CD68 reicht nicht aus, um die einzelnen Immunzellpopulationen der Lunge richtig zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Identifizierung pulmonaler Immunzellen kann aufgrund der in der Lunge lebenden multiplen Immunzelltypen und ihrer einzigartigen immunphänotypischen Eigenschaften im Vergleich zu ihren in anderen Geweben lebenden Gegenstücken eine Herausforderung darstellen. Unter verschiedenen pathologischen Bedingungen treten Zellen mit ausgeprägten phänotypischen Merkmalen in der Lunge auf. Zum Beispiel führt eine Bleomycin-induzierte Lungenverletzung zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten-abgeleiteten Makrophagen im Alveolarraum, wo sie bis zu einem Jahr bleiben und sogar nach einer Bleomycin-induzierten Fibrose bestehen bleiben können. Im Gegensatz zu geweberesidenten AMs sind die zirkulierenden Monozyten-abgeleiteten Makrophagen Siglec FlowCD11b+. Eine gezielte Erschöpfung der Monozyten-abgeleiteten Makrophagen führt zur Verbesserung der Bleomycin-vermittelten Lungenfibrose16,40. Zellen mit ähnlichen Merkmalen werden während einer Influenza-Infektion in die Lunge rekrutiert und bieten einen längeren Schutz vor Streptokokken-Pneumonie15.
Basierend auf dem CD11c- und MHC II-Ausdruck wurden IMs weiter in IM1, IM2 und IM3 unterteilt. IM1 sind immunphänotypisch definiert als CD11c-MHC II-; IM2 sind definiert als CD11c-MHC II+; und IM3 sind definiert als MHC II+CD11c+. Es wurde vorgeschlagen, dass IM1, IM2 und IM3 die physiologischen Stadien des Monozyten-zu-Makrophagen-Übergangs und nicht unterschiedliche Makrophagenkategorien darstellen, wobei IM3 das monozytäre Kompartiment darstellt41. Wie oben erwähnt, sind MoDCs für den DC-Marker CD24 niedrig-positiv und für Pan-Makrophagenmarker, einschließlich F4/80, CD64 und MERTK9,10,11,13,33,34, positiv. Mehrere Studien identifizieren CD64+MERKT+-Zellen jedoch als pulmonale Makrophagen4,10. Sowohl IM3 als auch MoDCs wurden als CD64+MERKT+MHCII+CD11C+ definiert, was darauf hindeutet, dass diese beiden Populationen höchstwahrscheinlich denselben Zelltyp repräsentieren. Im Einklang mit dieser Hypothese identifiziert die hier vorgestellte Gating-Strategie keine eindeutige Population, die neben MoDCs auch IM3-Zellen darstellt.
Zu den hier beschriebenen kritischen Schritten des Protokolls gehören: 1) die Entfernung aller angrenzenden Fette aus der Lunge vor der Vorbereitung der Einzelzellsuspension, da dies die Auslesungen verzerren könnte; 2) Permeabilisierung vor der Färbung mit dem Anti-CD68-Antikörper. Eine Einschränkung des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es Nicht-Immunzellen der Lunge, wie Epithelzellen (CD45-CD326 + CD31-), Endothelzellen (CD45-CD326-CD31+) und Fibroblasten, nicht identifizieren kann. Die Identifizierung solcher Populationen erfordert einen anderen Ansatz28,29. Darüber hinaus erfordert das Protokoll eine Färbung für CD68, einen intrazellulären Marker, der eine Einschränkung darstellen kann, wenn der Prüfarzt keine Erfahrung mit intrazellulärer Färbung hat. Die Bedeutung des vorliegenden Protokolls und der Gating-Strategie in Bezug auf bestehende Methoden besteht darin, dass diese Strategie einen optimierten Ansatz bietet, der eine geringere Anzahl von Markern verwendet und gleichzeitig eine reproduzierbare Identifizierung aller Immunpopulationen der Lunge ermöglicht.
Darüber hinaus wird eine detaillierte Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension bereitgestellt, die den Zelltod minimiert und die Identifizierung eines vollständigen Profils des Immunzellkompartiments der Lunge ermöglicht. Obwohl das hier skizzierte Protokoll die Charakterisierung und Identifizierung von Lungenimmunpopulationen unter stationären Bedingungen beschreibt, können zukünftige Anwendungen die Bewertung dieser Populationen in verschiedenen Krankheitsmodellen umfassen, wo es helfen kann, krankheitsspezifische Veränderungen in der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren. Abschließend stellt dieser Artikel ein einfaches und reproduzierbares Protokoll für die Einzelzellpräparation der Lunge und ein 9-farbiges Durchflusszytometrie-Panel zur Identifizierung von 12 verschiedenen Immunzellpopulationen vor.
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Disclosures
V.A.B. hat Patente auf den PD-1-Signalweg, die von Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis und Dako lizenziert wurden. Die Autoren erklären keine anderen konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01CA238263 und R01CA229784 (VAB) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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