Summary
Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.
Abstract
Les voies respiratoires sont en contact direct avec l’environnement extérieur et nécessitent un système immunitaire régulé avec précision pour fournir une protection tout en supprimant les réactions indésirables aux antigènes environnementaux. Les poumons hébergent plusieurs populations de cellules immunitaires innées et adaptatives qui assurent la surveillance immunitaire mais interviennent également dans les réponses immunitaires protectrices. Ces cellules, qui maintiennent le système immunitaire pulmonaire sain en équilibre, participent également à plusieurs conditions pathologiques telles que l’asthme, les infections, les maladies auto-immunes et le cancer. L’expression sélective des protéines de surface et intracellulaires fournit des propriétés immunophénotypiques uniques aux cellules immunitaires du poumon. Par conséquent, la cytométrie en flux joue un rôle déterminant dans l’identification de ces populations cellulaires dans des conditions d’équilibre et pathologiques. Cet article présente un protocole qui décrit une méthode cohérente et reproductible pour identifier les cellules immunitaires qui résident dans les poumons de souris saines dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour identifier les changements dans ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie afin d’aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire.
Introduction
Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent être subclassés par l’expression CD206. Les IM CD206+ peuplent la région péribronchique et périvasculaire, tandis que les IM CD206- sont situés à l’interstitium alvéolaire3. Quelques sous-classifications des GI ont été proposées récemment3,4,5,6. Bien que les MI soient moins étudiées que les AM, des preuves récentes soutiennent leur rôle crucial dans la régulation du système immunitaire du poumon7. En outre, CD206 est également exprimé dans AMs8 activé alternativement.
Les cellules dendritiques pulmonaires (DC) sont un autre groupe hétérogène de cellules immunitaires pulmonaires en ce qui concerne leurs propriétés fonctionnelles, leur emplacement et leur origine. Quatre sous-catégories de DC ont été décrites dans les poumons : les DC CD103+ conventionnels (également connus sous le nom de cDC1), les DC CD11b+ conventionnels (également connus sous le nom de cDC2), les DC dérivés de monocytes (MoDC) et les DC plasmocytoïdes9,10,11,12,13. Les trois premières sous-classes peuvent être définies comme complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II+CD11c+9,10,14,15. Les DC plasmocytoïdes expriment le CMH II et sont moyennement positifs pour cd11c, mais expriment des niveaux élevés de B220 et de PDCA-19,13,16. Dans les poumons murins naïfs, les DC CD103 et CD11b sont situés dans l’interstitium des voies respiratoires, tandis que les DC plasmocytoïdes sont situés dans l’interstitium alvéolaire17.
Deux grandes populations de monocytes résident dans le poumon pendant l’état d’équilibre: les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Les monocytes classiques sont Ly6C+ et sont essentiels pour la réponse inflammatoire initiale. En revanche, les monocytes non classiques sont Ly6C- et ont été largement considérés comme des cellules anti-inflammatoires3,16,18. Récemment, une population supplémentaire de monocytes CD64+CD16.2+ a été décrite, qui proviennent de monocytes Ly6C- et donnent naissance à CD206+ IMs3.
Les éosinophiles apparaissent principalement dans les poumons lors d’une infection à helminthes ou de conditions allergiques. Cependant, il y a un petit nombre d’éosinophiles dans le parenchyme pulmonaire pendant l’état d’équilibre, connus sous le nom d’éosinophiles résidents. Contrairement aux éosinophiles résidents, les éosinophiles inflammatoires se trouvent dans l’interstitium pulmonaire et le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les modèles murins d’acariens de la poussière domestique (HDM), les éosinophiles inflammatoires sont recrutés dans les poumons après une stimulation médiée par l’antigène. Il a été proposé que les éosinophiles résidents pourraient avoir un rôle régulateur dans l’allergie en inhibant la sensibilisation de T helper 2 (Th2) à HDM19.
Contrairement au reste des cellules myéloïdes pulmonaires, les neutrophiles expriment Ly6G mais pas CD68 et sont caractérisés par une signature de l’immunophénotype CD68-Ly6G+16,20,21. Des études de visualisation ont montré qu’à l’état d’équilibre, le poumon réserve un pool de neutrophiles dans le compartiment intravasculaire et héberge un nombre considérable de neutrophiles extravasculaires22. Semblable aux éosinophiles, les neutrophiles ne se trouvent pas dans BAL à l’état d’équilibre; cependant, plusieurs formes de stimulation immunitaire, telles que le défi LPS, l’asthme ou la pneumonie, conduisent les neutrophiles dans la lumière alvéolaire, ce qui entraîne leur présence dans BAL21,22,23.
Un nombre important de cellules CD45+ du poumon représentent un tueur naturel (NK), des cellules T et des cellules B et sont négatives pour la plupart des marqueurs myéloïdes24. Dans les poumons de souris naïves, ces trois types de cellules peuvent être identifiés sur la base de l’expression de CD11b et de CMH II18. Environ 25% des cellules PULMONAIREs CD45+ sont des cellules B, tandis que le pourcentage de cellules NK est plus élevé dans les poumons que les autres tissus lymphoïdes et non lymphoïdes24,25,26. Parmi les lymphocytes T pulmonaires, une fraction considérable est CD4-CD8- et joue un rôle important dans les infections respiratoires26.
Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées16,18,20,27. La stratégie de contrôle décrite ici fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de 9 marqueurs. Des marqueurs supplémentaires ont été utilisés pour valider les résultats. En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification du profil le plus complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Il convient de noter que l’identification des cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326+CD31-), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31+) et les fibroblastes nécessite une approche différente28,29. L’identification de ces populations n’est pas incluse dans le protocole et la méthode décrits ici.
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Protocol
Toutes les études et expériences décrites dans ce protocole ont été menées selon les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center. Des souris C57BL/6 âgées de six à dix semaines de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées pour développer ce protocole.
1. Excision chirurgicale et préparation des tissus
- Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (préparé selon le protocole standard; Tableau des matériaux).
REMARQUE: L’asphyxie au CO2 doit être évitée dans les études pulmonaires, car elle pourrait causer des lésions pulmonaires et altérer les caractéristiques et les propriétés des cellules immunitaires pulmonaires. La luxation cervicale doit également être évitée car elle pourrait causer des lésions mécaniques du poumon. - Transférez la souris dans une zone propre et dédiée pour une opération chirurgicale.
- Stabilisez la face dorsale de la souris vers le bas en utilisant des aiguilles ou du ruban adhésif sur les quatre extrémités. Utilisez 70% d’éthanol pour désinfecter la peau de la zone ventrale.
- Effectuez une incision dans la peau, du cou à l’abdomen. Retirez soigneusement la peau de la région thoracique.
- Retirez soigneusement le sternum et les côtes.
- Rincer les poumons en injectant 10 mL de PBS froid directement dans le ventricule droit, à l’aide d’une aiguille de 18 à 21 G, jusqu’à ce que les poumons deviennent complètement blancs.
- Retirez soigneusement le thymus et le cœur sans toucher les poumons.
- Détachez doucement les poumons des tissus environnants et transférez-les dans un tube avec un tampon BSA froid (tableau 1).
REMARQUE: Un effort doit être fait pour éliminer toute la graisse adjacente des poumons avant de préparer davantage la suspension unicellulaire, car cela pourrait biaiser les lectures.
2. Préparation de la suspension monocellulaire
- Transférer les poumons dans une boîte de Pétri vide et les hacher avec deux scalpels fins. Transférer tous les morceaux du poumon haché dans un nouveau tube conique de 50 mL. Utilisez 5 mL de tampon de digestion pour laver la plaque et ajoutez-la au tube de 50 mL contenant le poumon haché (tableau 1).
REMARQUE: Le tampon de digestion doit être préparé immédiatement avant utilisation. Utilisez 5 mg/mL de collagénase28. La combinaison de 1 ou 5 mg de collagénase avec un tampon BSA ou un PBS sans protéines n’a pas amélioré les résultats (figure supplémentaire S1). - Fixez le couvercle du tube et digérez le poumon pendant 30 min sur un agitateur orbital à une vitesse de 150 tr/min à 37 °C. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de tampon BSA froid.
- Après la digestion, utilisez une aiguille de 18 G pour mélanger et dissoudre les morceaux de poumon. Placez une crépine filtrante de 70 μm au sommet d’un nouveau tube conique de 50 mL.
REMARQUE: L’utilisation d’un filtre micron plus petit peut entraîner la perte de populations myéloïdes majeures. - Transférer lentement le mélange pulmonaire digéré directement sur la passoire. Utilisez le côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 10 mL pour briser les morceaux de poumon restants sur le filtre. Lavez le matériau traité sur le filtre avec un tampon BSA.
- Centrifuger la suspension monocellulaire à 350 × g pendant 8 min à 4 °C.
- Jetez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ACK. Bien mélanger à l’aide d’une pipette de 1 mL et incuber pendant 90 s à température ambiante.
- Ajouter 10 mL de tampon BSA froid pour arrêter la réaction et centrifuger à 350 × g pendant 7 min à 4 °C.Jeter soigneusement le surnageant et remettre la pastille dans le tampon de coloration pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 × 106 cellules/mL et les utiliser pour la coloration de surface (voir rubrique 3).
REMARQUE: À cette fin, plaquez les cellules dans une plaque à fond rond de 96 puits, suivie d’une coloration et d’un lavage des anticorps. Si une centrifugeuse à plaques n’est pas disponible, utilisez des tubes d’écoulement au lieu de plaques. Avec ce protocole, environ 15 à 20 × 106 cellules par poumon peuvent être obtenues à partir d’une souris C57BL / 6 de taille moyenne âgée de 6 à 10 semaines.
3. Coloration des anticorps de surface
- Transférer 1 × 106 cellules dans 200 μL par puits dans une plaque de 96 puits. Centrifuger la plaque à 350 × g pendant 7 min à 4 °C. Entre-temps, préparer la solution de bloc Fc en diluant l’anticorps anti-16/32 (1:100) dans un tampon de coloration (tableau 1).
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de la solution anti-Fc pré-préparée (Table des matériaux) et incuber pendant 15-20 min à 4 °C ou sur glace.
- Ajouter 150 μL de tampon de coloration et centrifuger la plaque à 350 × g pendant 5 min à 4 °C. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps de surface en diluant les anticorps de surface (1:100; Tableau 2) dans le tampon de coloration.
REMARQUE: (i) L’anticorps anti-16/32 pour le blocage fc peut être utilisé avec les anticorps de surface dans le même mélange. ii) Si un colorant de viabilité fixable est utilisé, ajoutez-le au cocktail d’anticorps de surface à une dilution de 1:1 000. - Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé et incuber pendant 30 à 40 min à 4 °C dans l’obscurité. Lavez les cellules avec un tampon de coloration deux fois.
REMARQUE: Si aucune coloration intracellulaire n’est nécessaire, remettez en suspension les cellules dans 200 μL de tampon de coloration et procédez directement à l’acquisition des données sur le cytomètre en flux. Alternativement, les cellules peuvent être fixées et stockées à 4 °C pour une acquisition ultérieure. Nous recommandons d’utiliser les cellules pour la cytométrie en flux dans les 24 heures.
4. Fixation cellulaire et coloration intracellulaire
- Préparer le tampon de fixation/perméabilisation (fix/tampon permanent) en mélangeant trois parties de concentré de fixation/perméabilisation et 1 partie de diluant de fixation/perméabilisation du tampon de coloration FoxP3/Transcription Factor (tableau 1).
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du tampon Fix/Perm pré-préparé par puits de la plaque de 96 puits, où les cellules ont été plaquées comme décrit à la section 3, et les incuber pendant 20-25 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Diluer le tampon de perméabilisation 10x comme 1: 10 dans de l’eau désionisée purifiée pour préparer 1x tampon de perméabilisation.
- Lavez les cellules une fois avec 1x tampon de perméabilisation. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps intracellulaires en diluant les anticorps intracellulaires (1:100) dans 1 mL de tampon de perméabilisation.
- Remettre en suspension les cellules en utilisant 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé par cellule de la plaque de 96 puits et incuber pendant 40 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Lavez les cellules une fois avec un tampon de perméabilisation et une fois avec un tampon de coloration. Après le lavage final, remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration.
REMARQUE: Si aucun cytomètre de flux avec lecteur de plaque n’est disponible, transférez les cellules dans des tubes de cytométrie en flux. - Acquérir un minimum de 1,5 × 106 cellules par échantillon sur le cytomètre en flux.
REMARQUE: Pour les échantillons de contrôle de couleurs uniques et non colorés, 0,5 à 1 × 106 cellules par échantillon suffiront. Il est recommandé de titrer les anticorps individuels utilisés pour obtenir une coloration optimale et réduire les coûts. Le protocole actuel a été optimisé à l’aide du tampon Fix/Perm préparé à l’aide du tampon de coloration FoxP3. Étant donné que CD68 est un cytoplasmique et non un marqueur nucléaire, d’autres solutions de perméabilisation telles qu’une faible concentration de paraformaldéhyde ou de kits cytofix/cytoperme de divers fournisseurs pourraient suffire.
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Representative Results
Stratégie de contrôle
La première étape de notre stratégie de contrôle est l’exclusion des débris et des doublets (Figure 1A). Une exclusion prudente des doublets est essentielle pour éviter les populations faussement positives (figure supplémentaire S2). Ensuite, les cellules immunitaires sont identifiées à l’aide de CD45+, un marqueur des cellules hématopoïétiques (Figure 1B). La tache morte vivante peut être ajoutée pour exclure les cellules mortes. Cependant, ce protocole entraîne la mort de <5 % des cellules CD45+ (figure 1C), alors que davantage de cellules CD45 sont identifiées comme mortes (figure supplémentaire S3).
Pour identifier les monocytes et les neutrophiles, contrairement aux études précédentes qui utilisaient des anticorps spécifiques pour chacune de ces populations16,18, nous préférons utiliser un anticorps anti-GR-1 qui identifie à la fois les cellules Ly6C+ et Ly6G+. L’utilisation de l’anticorps anti-GR-1 avec l’anti-CD68 permet de séparer les cellules immunitaires pulmonaires en trois groupes : CD68-GR-1+, CD68+ (qui peut être identifié comme GR-1+ ou GR-1-), et CD68-GR-1-/int (Figure 1D). CD68 est un marqueur qui est principalement détecté intracellulairement. Surface CD68 a été sondé mais n’a pas pu être détecté sans fixation/perméabilisation (figure supplémentaire S4).
Les cellules polymorphonucléaires (neutrophiles) ont été identifiées comme CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (figure 1E). Ces résultats ont été vérifiés à l’aide de GR1 et d’un anticorps spécifique du Ly6G (Figure 2), un marqueur unique des neutrophiles polymorphonucléaires16,18,27. Au sein de la population CD45+CD68-GR-1-/int, environ 10 à 20 % sont des MHCII- et CD11blow et représentent les cellules NK (Figure 1F). NK1.1, un marqueur unique pour les cellules NK, a été utilisé pour confirmer cela (Figure 3)25,30. La population CD45+CD68-GR1-/intCD11b- est constituée de lymphocytes T MHCII et de lymphocytes MHCII+ B (Figure 1F). Deux anticorps supplémentaires ont été utilisés pour vérifier les lymphocytes T et les lymphocytes B-CD3 et B220, respectivement (figure 3).
Chez les souris en bonne santé dans des conditions d’équilibre, la majorité des cellules CD45+ détectées dans BAL sont des AM, les principaux résidents des voies respiratoires. Par conséquent, BAL a été effectué pour évaluer les marqueurs qui caractérisent AMs20,31. Ces cellules sont CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+ mais, contrairement à d’autres cellules myéloïdes, n’expriment pas de niveaux élevés de CD11b (Figure 4). La même combinaison de marqueurs immunitaires identifie également les AM dans les homogénats des poumons totaux (Figure 1G,H). En plus des AM, dans la porte CD45+CD68+Sigle-F+ (Figure 1G), il existe une population cellulaire distincte qui est positive pour CD11b mais pas pour CD11c. Cette population de leucocytes CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- représente les éosinophiles (Figure 1G)19,32.
Dans la porte avec les cellules CD45+CD68+SiglecF- (Figure 1G), il y a une population CD11c+CMH+ qui représente les DC pulmonaires (Figure 1I). Plusieurs chercheurs identifient les DC pulmonaires comme CD11c + MHCII + CD24 + 16,18. L’expression de CD24 a été évaluée pour confirmer l’identité de cette population (figure 5A). La majorité des DC pulmonaires sont soit CD103+CD11b- ou CD103-CD11b+ (Figure 1J). Les CD CD103+CD11b- DC représentent les DC conventionnels CD103+ et sont identifiés comme CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. En revanche, les DC CD103-CD11b+ sont divisés en DC conventionnels et MoDC basés sur l’expression CD64 (Figure 1K). Par conséquent, les CD CD11b+ conventionnels sont identifiés comme CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64- tandis que les MoDC sont identifiés comme CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . Contrairement aux DC conventionnels, les MoDC sont faiblement positifs pour le marqueur DC CD24 et positifs pour les marqueurs pan-macrophages, y compris F4/80, CD64 et MERTK (Figure 5A)9,10,11,13,33,34.
Les IM et les monocytes classiques et non classiques se trouvent dans la porte CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ (Figure 1L) et sont distingués sur la base de l’expression CD64 et GR-1 (Figure 1M). CD64, un marqueur pan-macrophage, est principalement exprimé par les IM et les AM, ainsi que par un sous-ensemble de DC. Les monocytes classiques sont également connus sous le nom de monocytes Ly6C+ et les monocytes non classiques sous le nom de monocytes Ly6C-. Les monocytes et les IM sont négatifs pour Ly6G; cependant, les monocytes classiques expriment Ly6C et sont donc positifs pour GR-1. En revanche, les macrophages interstitiels et les monocytes non classiques sont négatifs pour GR-1 et Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. De plus, les monocytes non classiques sont CD11cint, tandis que les monocytes classiques sont CD11c-. Bien que cette différence dans l’expression de CD11c soit généralement insignifiante pour distinguer les deux types de monocytes au départ, elle pourrait être critique pour les conditions pathologiques lorsque les monocytes classiques s’accumulent. Sur la base de ce qui précède, les macrophages interstitiels sont définis comme CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64 +, les monocytes classiques comme CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64-, et les monocytes non classiques comme CD45 + CD68 + CD11c -/ intCD11b + GR-1-CD64- . Les AM et les IM sont positifs pour tous les marqueurs de macrophages, y compris CD68, CD64, F4/80 et le proto-oncogène MERTK. Cependant, contrairement aux IM, les AM sont CX3CR1-, contrairement aux IM, ce qui pourrait s’expliquer par la différence d’origine des deux types de macrophages pulmonaires4,37,38,39 (Figure 5B).
Figure 1 : Stratégie de contrôle des cellules immunitaires présentes dans le poumon murin. Après une exclusion minutieuse des débris, des doublets, des cellules mortes et des cellules non immunitaires (CD45-) (A-C), les cellules CD45+ ont été séparées en 3 groupes principaux basés sur l’expression de CD68 et GR-1 (D). Les neutrophiles appartiennent à la population CD68-GR-1+ (E) tandis que la population CD68-GR-1-/int se compose de cellules NK, de cellules B et de cellules T (F). Les cellules CD68+ peuvent être divisées en cellules Siglec F+ (G), qui sont des AM et des éosinophiles (H), et des cellules Siglec F( (G), qui se composent de monocytes, de IM et de DC (I-M). Abréviations : SSC-A = zone de crête de la lumière diffusée latéralement; FSC-A = zone de crête de la lumière diffusée vers l’avant; SSC-H = hauteur maximale de la lumière diffusée latéralement; L/D = coloration vivante/morte; CMH = complexe majeur d’histocompatibilité; SF = Siglec F; GR-1 = marqueur de différenciation myéloïde lié au GPI (Ly-6G); NK = tueur naturel; IM = macrophages interstitiels; DC = cellules dendritiques; AM = macrophages alvéolaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Le ly6G dans le poumon n’est exprimé que par les cellules CD45+CD68-GR-1+CD11b+ identifiées comme des neutrophiles polymorphonucléaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Vérification de l’identification des cellules NK, des lymphocytes T et des lymphocytes B par la stratégie de contrôle. Des marqueurs spécifiques à NK 1.1, CD3 et B220 ont été utilisés pour vérifier l’identification des cellules NK, des lymphocytes T et des lymphocytes B, respectivement. Il convient de noter que les cellules NKT, si elles sont présentes, peuvent tomber dans la population de cellules CD3+ à l’intérieur de la porte cellulaire NK, et la prudence est requise pour éviter la contamination de NK par des cellules NKT. Abréviations: NK = tueur naturel; CMH = complexe majeur d’histocompatibilité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La majorité des cellules immunitaires obtenues par lavage broncho-alvéolaire chez les souris naïves sont des macrophages alvéolaires. Abréviations : AM = macrophages alvéolaires ; DC = cellules dendritiques; IM = macrophage interstitiel; SSC-A = zone de crête de la lumière diffusée latéralement; FSC-A = zone de crête de la lumière diffusée vers l’avant; SSC-H = hauteur maximale de la lumière diffusée latéralement; SF = Siglec F; GR-1 = marqueur de différenciation myéloïde lié au GPI (Ly-6G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Comparaison de l’expression de différents marqueurs dans les cellules immunitaires. (A) Comparaison de l’expression de CD24, CD64, MERTK, F4/80 et CD103 dans les DC pulmonaires. (B) Comparaison de CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b et CX3CR1 dans les macrophages et les monocytes pulmonaires. Abréviations : DC = cellules dendritiques ; MoDC = DC dérivés de monocytes; AM = macrophages alvéolaires; IM = macrophages interstitiels; SF = Siglec F; MERTK = tyrosine kinase myéloïde-épithéliale-reproductrice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Tampon BSA | PBS + 0,5% albumine sérique bovine | ||
| Tampon de digestion | Tampon BSA préavertissé (37 °C) + 5 mg/mL de collagénase de type 1 + 0,2 mg/mL de DNase I | ||
| Tampon de coloration | PBS + 2,5% FBS | ||
| Tampon de réparation/permanente | Trois parties du diluant de fixation/perméabilisation et 1 partie du diluant de fixation/perméabilisation du Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ||
| Tampon de perméabilisation | 10x tampon de perméabilisation de l’ensemble tampon de coloration Foxp3 / Transcription Factor dilué 10 fois dans de l’eau désionisée purifiée | ||
Tableau 1 : Tampons.
| Antigène | Clone | Fluorochrome | Dilution | Surface/intracellulaire |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Surface |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Surface |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intracellulaire |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Surface |
| Siglec F | S17007L | Le | 1:100 | Surface |
| CD11c | N418 | BV650 ou BV510 | 1:100 | Surface |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Surface |
| CMH-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Surface |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Surface |
| Kit de coloration de cellules mortes à lecture lointaine réparable en direct / mort | Farred (APC) ou Aqua (BV510) | 1:1000 | Surface | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | Surface |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Surface |
| NK1.1 | PK136 | Le | 1:100 | Surface |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Surface |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | Surface |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Surface |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Surface |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Surface |
Tableau 2 : Utilisation d’anticorps monoclonaux.
Figure supplémentaire S1: La meilleure dissociation cellulaire est obtenue par 5 mg / mL de collagénase 1 dans le PBS préavertis + 0,5% BSA. Dans toutes les conditions, 0,2 mg de DNAse I a également été inclus. Abréviations : BSA = albumine sérique bovine; FSC-A = zone de crête de la lumière diffusée vers l’avant; L/D = coloration vivante/morte; SF = Siglec F. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : L’inclusion de doublets pourrait entraîner des populations faussement positives. Abréviation : FP = faux positif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Plus de CD45 que de CD45+ ont des caractéristiques compatibles avec les cellules mortes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S4 : La coloration de surface du CD68 n’est pas suffisante pour distinguer correctement les populations individuelles de cellules immunitaires du poumon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’identification des cellules immunitaires pulmonaires peut être difficile en raison des multiples types de cellules immunitaires résidant dans le poumon et de leurs caractéristiques immunophénotypiques uniques par rapport à leurs homologues résidant dans d’autres tissus. Dans plusieurs conditions pathologiques, des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques distinctes apparaissent dans les poumons. Par exemple, les lésions pulmonaires induites par la bléomycine entraînent le recrutement de macrophages circulants dérivés de monocytes dans l’espace alvéolaire, où ils peuvent rester jusqu’à un an et même persister après une fibrose induite par la bléomycine. Contrairement aux AM résidant dans les tissus, les macrophages dérivés des monocytes circulants sont Siglec FlowCD11b+. L’épuisement ciblé des macrophages dérivés des monocytes entraîne l’amélioration de la fibrose pulmonaire médiée par la bléomycine16,40. Des cellules présentant des caractéristiques similaires sont recrutées dans les poumons pendant l’infection grippale et offrent une protection prolongée contre la pneumonie streptococcique15.
Sur la base de l’expression cd11c et MHC II, les IM ont été sous-classés en IM1, IM2 et IM3. Les IM1 sont immunophénotypes définis comme CD11c-CMH II-; IM2 sont définis comme CD11c-CMH II+; et IM3 sont définis comme MHC II+CD11c+. Il a été proposé que IM1, IM2 et IM3 représentent les stades physiologiques de la transition du monocyte au macrophage, plutôt que des catégories distinctes de macrophages, IM3 représentant le compartiment monocytaire41. Comme mentionné ci-dessus, les MoDC sont faiblement positifs pour le marqueur DC CD24 et positifs pour les marqueurs pan-macrophages, y compris F4/80, CD64 et MERTK9,10,11,13,33,34. Cependant, plusieurs études identifient les cellules CD64+MERKT+ comme des macrophages pulmonaires4,10. Les IM3 et les MoDC ont été définis comme CD64+MERKT+MHCII+CD11C+, ce qui suggère que ces deux populations représentent très probablement le même type de cellule. Conformément à cette hypothèse, la stratégie de contrôle présentée ici n’identifie pas de population distincte représentant des cellules IM3, en plus des MoDC.
Les étapes critiques du protocole décrit ici comprennent: 1) l’élimination de toute la graisse adjacente des poumons avant de préparer la suspension unicellulaire, car cela pourrait biaiser les lectures; 2) perméabilisation avant coloration avec l’anticorps anti-CD68. Une limitation du présent protocole est qu’il ne peut pas identifier les cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326+CD31-), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31+) et les fibroblastes. L’identification de ces populations nécessite une approche différente28,29. De plus, le protocole exige une coloration pour CD68, un marqueur intracellulaire, ce qui pourrait poser une limite si l’investigateur n’est pas expérimenté dans la coloration intracellulaire. L’importance du présent protocole et de la stratégie de contrôle par rapport aux méthodes existantes est que cette stratégie fournit une approche simplifiée qui utilise un nombre plus faible de marqueurs tout en permettant une identification reproductible de toutes les populations immunitaires du poumon.
En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification d’un profil complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Bien que le protocole décrit ici décrive la caractérisation et l’identification des populations immunitaires pulmonaires dans des conditions d’équilibre, les applications futures pourraient inclure l’évaluation de ces populations dans divers modèles de maladies où il peut aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire. En conclusion, cet article présente un protocole simple et reproductible pour la préparation d’une seule cellule pulmonaire et un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs pour l’identification de 12 populations de cellules immunitaires différentes.
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Disclosures
V.A.B. détient des brevets sur la voie PD-1 sous licence de Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis et Dako. Les auteurs ne déclarent aucun autre intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01CA238263 et R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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