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方法文章

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

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DOI：

10.3791/63013

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2021年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。

摘要

由选择素介导的相互作用所促进的滚动黏附，是一种高度动态且被动的运动方式，可将白细胞募集至炎症部位。该现象发生于毛细血管后微静脉中，血流推动白细胞在内皮细胞表面呈滚动运动。稳定的滚动依赖于黏附键形成与其受力学驱动解离之间的精细平衡，使细胞在随血流方向滚动的同时仍保持与表面的连接。与其他发生在相对静态环境中的黏附过程不同，滚动黏附具有高度动态性，滚动中的细胞可在每秒数十微米的速度下移动数千微米的距离。因此，传统的力学生物学方法（如牵引力显微镜）由于所需的时间尺度极短且灵敏度要求极高，难以用于测量单个黏附事件及其相关的分子力。本文中，我们描述了黏附足迹检测技术的最新应用，用于在分子水平上成像P-选择素与PSGL-1在滚动黏附过程中的相互作用。该方法利用不可逆的基于DNA的张力阈值系留结构，以荧光轨迹的形式永久记录分子黏附事件的历史。这些轨迹可通过两种方式成像：（1）拼接数千张衍射极限分辨率的图像，获得大视野图像，从而提取每个滚动细胞在长达数千微米路径上的黏附足迹；（2）进行DNA-PAINT成像，在小视野范围内重构荧光轨迹的超分辨率图像。在本研究中，黏附足迹检测被用于研究HL-60细胞在不同剪切应力下的滚动行为。通过该方法，我们能够成像P-选择素与PSGL-1相互作用的空间分布，并通过荧光强度了解其分子受力情况。因此，该技术为在分子水平上定量研究滚动黏附过程中多种细胞-表面相互作用奠定了基础。

引言

滚动黏附级联过程描述了循环细胞如何黏附于血管壁并沿其滚动1。这种被动滚动主要由选择素介导，选择素是一类重要的细胞黏附分子（CAMs）1。在血液剪切流作用下，表达P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）的白细胞与P-选择素形成高度瞬时的结合键，而P-选择素可表达于活化的内皮细胞表面。该过程对白细胞迁移至炎症部位至关重要2。此外，PSGL-1还是一种力学敏感性受体，在与P-选择素结合后可触发滚动黏附级联中后续的牢固黏附阶段3。

影响CAM功能的基因突变可严重损害免疫系统，例如在白细胞黏附缺陷症（LAD）这一罕见疾病中，介导细胞滚动的黏附分子功能异常会导致个体严重免疫缺陷4,5,6。此外，循环肿瘤细胞也被证实通过类似的滚动过程迁移，从而导致转移7,8。然而，由于细胞滚动过程快速且动态，传统的实验性机械生物学方法难以用于研究细胞滚动过程中的分子相互作用。尽管单细胞和单分子操纵技术（如原子力显微镜和光镊）能够在单分子水平上研究分子相互作用，例如P-选择素与PSGL-1之间依赖于力学的相互作用9，但这些方法不适用于研究细胞滚动过程中真实的黏附事件。此外，体外（in vitro）表征的相互作用无法直接回答体内（in vivo）分子黏附的相关问题。例如，当细胞在其天然环境中发挥作用时，何种分子张力范围具有生物学意义？计算方法如黏附动力学模拟10或简单的稳态模型11虽能捕捉某些分子细节及其对滚动行为的影响，但其结果高度依赖于建模参数和假设的准确性。其他技术如牵引力显微镜可检测细胞迁移过程中的作用力，但无法提供足够的空间分辨率或关于分子张力的定量信息。上述所有技术均无法提供对分子力的时间动态、空间分布及大小异质性的直接实验观测，而这些特性直接关系到细胞在其天然环境中的功能与行为。

因此，开发一种能够精确测量选择素介导相互作用的分子力传感器，对于深入理解滚动黏附过程至关重要。本文描述了黏附足迹检测的实验方案12，其中将包被PSGL-1的微球在表面滚动，该表面固定有功能化张力门控拴系（TGTs）的P-选择素13。这些TGTs是以DNA为基础的不可逆分子力传感器，可通过荧光信号永久记录断裂事件的历史。该过程通过断裂TGT（双链DNA，dsDNA），随后用荧光标记的互补链对断裂后的TGT（单链DNA，ssDNA）进行标记来实现。该系统的一个主要优势在于其同时兼容衍射极限成像和超分辨率成像。荧光标记的互补链可采用永久结合（>12 bp）方式用于衍射极限成像，或采用瞬时结合（7–9 bp）方式通过DNA PAINT技术实现超分辨率成像。该系统非常适合研究滚动黏附过程，因为TGTs在主动滚动过程中发生断裂，而荧光信号则在滚动结束后进行分析。两种成像方法也为研究者提供了更大的灵活性来探究滚动黏附行为。通常，衍射极限成像适用于通过荧光强度提取分子断裂力13，而超分辨率成像则可实现对受体密度的定量分析。凭借对滚动黏附这些特性的研究能力，该方法为揭示剪切流条件下滚动细胞分子黏附的力调控机制提供了一个极具前景的研究平台。

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方案

1. 寡核苷酸标记与杂交

  1. 蛋白G二硫键的还原
    1. 将10 mg蛋白G（ProtG）溶解于1 mL超纯水中。
      注意：此处的蛋白G在C末端修饰有一个单一的半胱氨酸残基，并带有N末端多聚组氨酸标签。
    2. 使用P6柱将≥20 µL的ProtG（10 mg/mL）置换至1× PBS缓冲液（pH 7.2）中。
    3. 缓冲液置换后测定蛋白浓度。
      注意：典型浓度为7–8 mg/mL。
    4. 通过将3 mg TCEP溶解于90 µL的1× PBS（pH 7.2）中，再加入10 µL的0.5 M EDTA，配制120 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）。
      注意：TCEP应新鲜配制。
    5. 向20 µL的ProtG（4–5 nmol）中加入4 µL的120 mM TCEP（480 nmol）。
      注意：TCEP与蛋白的摩尔比应约为100:1。
    6. 室温（RT）下反应30分钟。
    7. 使用P6柱去除还原后的ProtG中过量的TCEP（缓冲液置换至1× PBS，pH 7.2）。
    8. 使用紫外-可见分光光度计测定还原后ProtG的浓度，并保存光谱数据。
      注意：典型浓度为3.5–4.5 mg/mL。
  2. 氨基标记单链DNA与磺基-SMCC的反应
    1. 将氨基标记的单链DNA（amine-ssDNA）溶解于无核酸酶水中，配制成1 mM的溶液。使用紫外-可见分光光度计验证其链浓度。
    2. 将2 mg磺基-SMCC溶解于400 µL超纯水中，涡旋混匀，新鲜配制11.5 mM磺基-SMCC溶液（磺基-SMCC是一种含有磺基-NHS酯和马来酰亚胺的异双功能交联剂）。
    3. 将6 µL的1 mM amine-ssDNA（6 nmol）加入5.2 µL的11.5 mM磺基-SMCC（60 nmol）和88.8 µL的1× PBS（pH 7.2）中。涡旋5秒后，在8600 × g下离心3分钟。
    4. 室温下反应30分钟。
    5. 使用P6柱去除SMCC偶联的amine-ssDNA（mal-ssDNA）中过量的磺基-SMCC（缓冲液置换至1× PBS，pH 7.2）。
    6. 使用紫外-可见分光光度计测定mal-ssDNA的浓度，并保存光谱数据。
      注意：典型浓度为35–45 µM。
  3. ProtG-ssDNA偶联
    1. 将21 µL的4.5 mg/mL还原型ProtG（3 nmol）加入mal-ssDNA（约4–5 nmol）中。
      注意：此处的体积和浓度为典型值，应根据具体实验测量结果进行调整。始终确保mal-ssDNA相对于ProtG过量，摩尔比约为1.5:1。
    2. 涡旋5秒，室温下反应3小时。
  4. ProtG-ssDNA的纯化与表征
    1. 通过His标签结合磁性镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）珠对偶联产物ProtG-ssDNA进行纯化。
    2. 使用P6柱去除产物中过量的咪唑（Ni-NTA洗脱缓冲液）（缓冲液置换至1× PBS，pH 7.2）。
      注意：此步骤对偶联效率的定量至关重要，因为咪唑在280 nm处有显著吸收。
    3. 使用紫外-可见分光光度计记录产物ProtG-ssDNA以及Ni-NTA洗脱缓冲液（1×）的光谱。
      注意：典型的ProtG-ssDNA在260 nm和280 nm处的吸光度分别为0.8和0.6。
    4. 为确定偶联效率及ProtG与ssDNA的摩尔比，使用自编的MATLAB脚本（补充代码文件1）基于先前采集的三种光谱（ProtG、SMCC-链、Ni-NTA珠洗脱缓冲液）对最终产物光谱进行分解。
      注意：简而言之，该代码的工作原理如步骤1.4.5–1.4.8所述。典型浓度为4 µM的ProtG-ssDNA，其中ProtG与ssDNA的摩尔比约为1:1（图2A）。
    5. 将ProtG、SMCC-链、Ni-NTA珠洗脱缓冲液以及ProtG-ssDNA的紫外-可见光谱输入MATLAB脚本。
    6. 进行多维无约束非线性最小化，从源光谱（ProtG、SMCC-链和Ni-NTA珠洗脱缓冲液光谱）重建ProtG-ssDNA光谱。
      注意：最小化函数输出三个变换因子，每个源光谱对应一个。
    7. 将各源光谱乘以其对应的变换因子，并叠加变换后的源光谱，重建ProtG-ssDNA光谱。
    8. 将初始的ProtG和SMCC-链浓度分别乘以其对应的变换因子，以确定ProtG-ssDNA产物中SMCC-链和ProtG的浓度。
    9. （可选）根据图2B进行非变性PAGE电泳，以帮助确认各组分及各步骤是否按预期进行。
  5. TGT杂交
    1. 在T50M5缓冲液（10 mM Tris，50 mM NaCl，5 mM MgCl2）中，以1.2:1的摩尔比（浓度分别为240 nM和200 nM）将ProtG-ssDNA（上链）与生物素标记的下链杂交，以形成完整的TGT结构。室温下杂交至少1小时。

2. 表面聚乙二醇化

  1. 表面清洁
    1. 每处理8个盖玻片，需准备一个洁净的锥形瓶和两个染色缸。向每个容器中加入1 M KOH溶液，并在室温下超声处理1小时。随后用超纯水彻底冲洗每个容器，并用N₂吹干2 或在烘箱中。
      注意：将KOH加至顶部，使其接触瓶盖，以便同时清洁瓶盖。
    2. 用超纯水彻底冲洗每张盖玻片，并将其放入一个已清洁的染色缸中。
      注意：确保它们彼此之间或与染色缸壁之间无粘连。
    3. 在通风橱中，通过加入30 mL的过硫酸溶液，新鲜配制piranha溶液 将30%的过氧化氢加入90 mL浓硫酸（95%-98%）中，置于250 mL烧杯内。
      警告：浓硫酸具有强腐蚀性。应将过氧化氢极其缓慢地加入硫酸中，并小心旋转混匀。
    4. 将盖玻片完全浸入染色缸中的piranha溶液中，在通风橱中静置30分钟。
      警告：倾倒前需将piranha溶液冷却至不超过80 °C，以防止染色缸破裂。
    5. 将piranha溶液倒入1000 mL烧杯中，并用玻璃清洗用的1 M KOH中和。
    6. （可选）使用新鲜的食人鱼溶液重复食人鱼清洗步骤（2.1.3–2.1.5）。
    7. 用大量超纯水冲洗盖玻片，以去除所有残留的piranha溶液。每次冲洗时轻轻摇动染色缸以促进残留物的去除（建议冲洗10次）。
    8. 用甲醇冲洗盖玻片3次，以去除盖玻片表面的水分，并保持盖玻片浸没在甲醇中。
  2. 表面硅烷化
    1. 在已清洁并干燥的锥形瓶中，充分混合94 mL甲醇、1 mL氨基硅烷和5 mL冰醋酸，配制1%的氨基硅烷溶液。随后倒入另一个已清洁并干燥的染色缸中。14.
    2. 将浸没在甲醇溶液中的盖玻片转移至含有1%氨基硅烷溶液的染色缸中，并保持染色缸加盖。
      注意：在将盖玻片转移至氨基硅烷的过程中，切勿使其干燥，以减少玻璃表面暴露于空气中的时间。
    3. 将含有盖玻片的染色缸置于70 °C烘箱中，在a-氨基硅烷中孵育1小时15.
    4. 小心地将氨基硅烷溶液倒入单独的废液容器中，然后用甲醇在染色缸中冲洗盖玻片5次，以去除残留的氨基硅烷溶液。
    5. 用超纯水在染色缸中冲洗盖玻片5次，并用N₂吹干2.
    6. 将干燥的盖玻片放入染色缸中，在110 °C烘箱中烘烤20分钟。让盖玻片冷却至室温，然后将其放置于PEG化处理架上。
      注意：烘烤过程中需用盖子盖住染色缸，以尽量减少颗粒物和化学物质在表面的沉积15.
  3. PEG溶液的制备
    1. 将聚乙二醇（PEG）和聚乙二醇-生物素（PEG-biotin）解冻至室温，约30分钟。
      注意：此步骤可最大限度减少水分冷凝，从而避免降解 PEG 上的 NHS 酯。
    2. 将84 mg碳酸氢钠加入10 mL超纯水中，配制PEG缓冲液。该配方应提供pH为8.4的缓冲液。
    3. 对于8个盖玻片，每个盖玻片单面进行PEG修饰，PEG:PEG-生物素比例为20:1：量取100 mg PEG和5 mg PEG-生物素，加入400 µL PEG缓冲液中。涡旋混匀溶液30秒，然后以最大速度（≥18000 × g）离心1分钟 g).
      注意：此步骤对时间敏感，因为SVA NHS-酯的水解反应立即开始，在pH 8.0时半衰期为34分钟，在pH 8.4时半衰期更短。
  4. PEG孵育与盖玻片保存
    1. 设置湿度培养箱，并将盖玻片放入其中。
    2. 在湿润室中的盖玻片上加入90 µL PEG溶液，使用持盖玻片镊子将第二片盖玻片置于PEG溶液上，以均匀铺展PEG溶液。
    3. 确保滴加到盖玻片上的溶液中无气泡。将第二块盖玻片的一端先接触第一块盖玻片，再缓慢放下另一端，避免两块盖玻片之间夹入气泡。
      注意：气泡会导致某些区域聚乙二醇化不充分。
    4. 重复上述步骤，直至所有盖玻片均完成PEG处理（即8个盖玻片形成4个PEG夹心结构）。将PEG溶液置于避光湿润环境中，室温孵育过夜（约12小时）。16.
    5. 将盖玻片成对分开，并放入染色缸中。注意标记出经PEG修饰的一侧。
    6. 用超纯水彻底冲洗盖玻片，并用 N₂ 吹干2.
      注意：用镊子夹住盖玻片并吹入 N2 向镊子方向在表面移动，以防止污染物在表面上干燥。
    7. 用永久性记号笔或金刚石笔在非 PEG 修饰面的一角标记一个点。
    8. 将2个经PEG修饰的盖玻片放入邮寄管中，使PEG修饰面相对放置，以便在使用前识别PEG修饰面。
    9. 抽真空5分钟，然后用N₂回填2用封口膜密封试管。
    10. 将PEG化盖玻片置于密封的邮寄管中，在-20 °C保存，可稳定存放长达6个月。
      ​注意：在芯片组装前，需将储存管恢复至室温。封膜过程中盖玻片上的冷凝水会导致泄漏。

3. 流动腔室的制备

  1. 芯片组装
    1. 用刀片将少量环氧树脂均匀涂抹在双面胶带的两侧。
      注意：环氧树脂过多可能在组装过程中渗入通道内。
    2. 使用激光切割环氧树脂涂层胶带，形成4个通道。将涂有环氧树脂的胶带夹在四孔载玻片与PEG涂层盖玻片之间，制成流动芯片（图1A）。
    3. 使用移液器吸头沿通道长度方向施加轻柔压力，以确保良好密封。将环氧树脂固化至少1小时。
      注意：避免对玻璃施加剪切力，以防玻璃与环氧树脂之间发生滑动。
  2. 腔室组装
    1. 调整芯片位置，使每个通道的开口对准接头的中心位置（图1A）。将两片透明丙烯酸垫片置于芯片上方，在垫块中部施加稳固压力，并在每片垫片两端拧入两颗4-40螺钉。
      注意：切勿强行拧紧螺钉或过度按压垫片，以免芯片破裂。
    2. 在支架的另一侧，将入口接头拧入螺纹孔中。通过透明丙烯酸块观察密封状况。
    3. 当管路与芯片开口接触时，轻轻顺时针旋转管路，以密封连接处。
      注意：入口过紧可能导致流路堵塞，连接过松则会引起泄漏。

4. 表面准备

注意：整体工作流程请参见图1B。

  1. 用于防止非特异性结合的封闭剂
    1. 使用移液器将 200 µL 洗涤缓冲液（10 mM Tris，50 mM NaCl，5 mM MgCl2 和 2 mM CaCl2，0.05% Tween 20）注入反应室，检查是否泄漏。若通道中形成气泡，需强力推入额外 200 µL 以去除气泡。
      注：此步骤未清除的大气泡可能在后续过程中脱落并破坏表面功能化。
    2. 向流控室中加入 40 µL BSA（1% w/v），以防止非特异性结合，并孵育 10 分钟。
    3. 确保每次孵育期间加入足够体积，以填满流控室并在入口和出口处形成液滴。根据需要调整孵育体积，并在湿化室中进行所有孵育步骤。
    4. 向流控室中加入 40 µL Tween 20（5% v/v），孵育 10 分钟，以进一步降低非特异性结合。
    5. （可选）通过向通道中流动聚苯乙烯微球检测表面封闭是否充分。加入 40 µL ProtG 包被的聚苯乙烯微球（0.01% w/v），使用 10 倍物镜的暗场显微镜成像。若微球未黏附于表面，则进入下一步。
    6. 用 200 µL 洗涤缓冲液冲洗通道，以去除所有封闭剂。
  2. 反应室表面功能化
    1. 向流控室中加入 40 µL 链霉亲和素（100 µg/mL），孵育 20 分钟，随后用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤。
    2. 向流控室中加入 40 µL 杂交后的 ProtG-TGT（100 nM），孵育 20 分钟，随后用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤。
    3. 向流控室中加入 40 µL ProtG-TGT 上游链（100 nM），孵育 20 分钟，以完成表面未杂交的 TGT 下游链。用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤。
    4. 向流控室中加入 40 µL P-选择素-Fc（10 µg/mL），孵育 60 分钟，随后用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤。
      ​注：孵育时间至关重要。

5. 实验与成像

  1. 流体系统设置
    1. 用5 mL玻璃注射器吸取滚动缓冲液（含2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、0.1% BSA的HBSS）。通过轻敲注射器侧面以松动气泡，并将其推向针尖排出，确保注射器内无气泡。
    2. 将一根无菌针头（26 G，5/8英寸长）插入约200 mm的聚乙烯管（内径：0.38 mm；外径：1.09 mm）一端，并将针头连接至玻璃注射器。
      注意：确保针头连接处无任何空气滞留。
    3. 将注射器固定在注射泵上，并倾斜注射泵，使活塞侧抬高，防止气泡进入通道。将管子末端插入流动室入口。
      注意：连接时应确保液体与液体接触，可在入口处滴加液滴，并在注射器管路末端保留液滴。在将管路插入入口前，先在末端形成一小滴液体，以确保无气泡进入通道。
    4. 将另一段200 mm聚乙烯管的一端插入出口，另一端浸入废液杯中。
  2. 细胞滚动实验准备
    1. 在含20%胎牛血清和1%抗生素的IMDM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，在25 cm2通气培养瓶中培养HL-60细胞。维持细胞密度在1 × 105–2 × 106 个细胞/mL之间。
    2. （可选）在含1.25% DMSO的完全IMDM培养基中，以初始密度2 × 105 个细胞/mL诱导HL-60细胞分化。孵育5–6天至细胞活性最佳。
    3. 从细胞悬液中取样（1–2 mL），离心（200 × g，3分钟）以收集细胞沉淀。
    4. 弃去上清液，用500 µL滚动缓冲液轻轻重悬细胞。重复洗涤两次，以去除细胞碎片。
    5. 使用血细胞计数板测定细胞密度。用滚动缓冲液将细胞沉淀重悬至密度为2 × 105 个细胞/mL。
    6. 小心断开进出口处的管路，用移液器向流动室中加入40 µL细胞悬液。按前述方法重新连接管路，确保无气泡进入流动通道。
    7. 启动注射泵，在设定的流速下开始细胞滚动实验。
      注意：荧光轨迹的强度取决于剪切应力，较低的细胞速度或剪切应力/细胞速度通常会产生较暗的轨迹（图4A）。避免表面细胞密度过高或滚动时间过长，以确保获得可分辨的单细胞轨迹（图4B、C）。
    8. 使用配备10倍物镜的暗场显微镜观察细胞滚动现象。
    9. 实验结束后，以100 mL/h流速注入滚动缓冲液，清除通道内的细胞，直至表面无细胞残留。
  3. 通过"DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography"（DNA-PAINT）成像局部轨迹
    1. 向通道中加入40 µL DNA-PAINT成像链（500 pM），溶于DNA-PAINT缓冲液（含0.05% Tween-20、5 mM Tris、75 mM MgCl2、1 mM EDTA）中。
    2. 使用100倍油浸TIRF物镜进行全内反射荧光（TIRF）显微成像。使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机，以300的电子倍增（EM）增益，每帧曝光25 ms，采集40000帧以上的图像。
    3. 使用Picasso软件包17对超分辨率图像进行定位与渲染（图4D），操作步骤参照5.3.4–5.3.5。
    4. 将DNA-PAINT视频载入Localize程序，确定每帧中每个荧光分子的定位位置。
      注意：优化盒边长和最小净梯度参数，直到仅准确追踪到荧光分子。最小净梯度参数通常需高于100000才能实现最佳追踪效果。拟合设置：MLE（最大似然估计），采用积分高斯法可获得最佳结果。最后，若视频过长，可将其分割为每组10000帧的堆栈，以便Localize中的预览追踪正常运行，之后再合并为最终的hdf5文件。
    5. 随后，将生成的hdf5文件载入Render程序，进行漂移校正与图像渲染。
      注意：通过Undrift by RCC进行多次漂移校正，以提高最终成像质量。
  4. 通过永久标记成像长轨迹
    1. 加入永久成像链，在T50M5缓冲液中孵育120秒。随后用200 µL洗涤缓冲液冲洗通道。
    2. 在激发激光关闭的情况下拍摄图像，以获取背景相机噪声。通过TIRF显微镜以网格模式拍摄大范围区域图像。
      注意：建议帧与帧之间重叠≥10%，以便后续拼接。
    3. 编程控制显微镜扫描400 × 50张图像（共20000张）。使用FIJI程序将原始数据拆分为单个tiff文件，每个文件最多包含10000张图像。
    4. 使用照明轮廓（图3A–C）对所有图像进行平场校正，操作步骤参照5.4.5–5.4.7。
    5. 从每帧中减去背景相机噪声。对每个去背景后的帧取平均投影（即照明轮廓）。
    6. 将照明轮廓以其最大值归一化。将每个去背景后的帧除以归一化的照明轮廓。
    7. 将校正后的帧重新缩放至对应位深的适当范围。
    8. 使用MIST18进行图像拼接（图3D、E）。

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结果

上述方案描述了黏附足迹实验的实验步骤。整个实验流程如图1所示，包括流室组装（图1A）、表面功能化（图1B）以及实验与成像步骤（图1C）。

图2 是 ProtG-ssDNA 生物偶联表征的代表性结果。在最终偶联反应之前，分别采集了终产物中三种组分——ProtG、mal-ssDNA 和咪唑洗脱缓冲液的紫外/可见光谱（图2A），每种组分均对应已知浓度。这些光谱构成正交基，用于拟合生物偶联产物的光谱，其中三个未知参数即为各组分的浓度。采用 MATLAB 中自定义函数确定各组分浓度。结果表明 ProtG 与 ssDNA 的摩尔比接近 1:1（图2A）。该结果符合预期，因为 ssD...

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讨论

黏附足迹实验能够可视化PSGL-1与P-选择素在细胞滚动黏附过程中的分子黏附事件。该过程由P-选择素介导的捕获启动，随后在流体剪切应力作用下发生滚动。实验过程中可能出现的问题通常包括细胞滚动不良，或即使细胞滚动良好却未能观察到荧光轨迹。这些问题通常源于方案中关键步骤的质量控制不当，详见故障排除表（Table 1）。

生物分子和缓冲液需要经过过滤并在 4 °C 下储存，以防止污染，因为表面制备涉及多个步骤。高质量的表面钝化是实现适当表面功能化密度并减少生物分子非特异性结合的必要条件。生物分子对表面的非特异性结合会产生较高的荧光背景，干扰单分子荧光成像和统计数据分析。多种因素会影响表面钝化效果。氨基硅烷和 PEG-NHS 的水解会显著降低 PEG 化效率。充分的 KOH 清洗和芬顿清洗可通过在玻璃表面生成游离羟基，增强表面亲水性，从而提高化学反应基团的密度。细胞会黏附在钝化不良的表面上。表面钝化的质量可通过在 PEG 化前后使用荧光标记的生物分子检测背景荧光强度来评估。

配体的表面密度是影响细胞滚...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了加拿大创新基金会（CFI 35492）、加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2017-04407）、新研究前沿基金（NFRFE-2018-00969）、迈克尔·史密斯健康研究基金会（SCH-2020-0559）以及不列颠哥伦比亚大学卓越基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
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4通道钻孔导板定制使用ABS线材3D打印
4孔载玻片定制使用Dremel工具配合金刚石涂层钻头，在4通道钻孔导板上钻孔清洁显微镜载玻片，该导板布局与铝夹具上的8-32螺纹孔中心对齐。
丙酮VWRBDH1101-4LP
丙烯酸垫片定制切割两块尺寸为40 mm × 30 mm × 2.5 mm的丙烯酸板。在每块板上钻两个3 mm的孔，精确对准铝制支架上的4-40孔。
铝制芯片支架定制将阳极氧化铝块加工成C形支架，外部尺寸为640 mm × 500 mm × 65 mm，开口尺寸为400 mm × 380 mm × 65 mm。入口和出口处攻有8-32螺纹。
氨基硅烷AlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
抗生素/抗真菌溶液Cytiva HyCloneSV3007901青霉素/链霉素/抗真菌素（Pen/Strep/Fungiezone）
Protein G包被的聚苯乙烯微球SpherotechPGP-60-5
牛血清白蛋白VWR332
DNA PAINT缓冲液0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
T50M5缓冲液10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
滚动缓冲液含2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM Hepes和0.1% BSA的HBSS
洗涤缓冲液10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2和2 mM CaCl2，含0.05% Tween 20
氯化钙VWRBDH9224
细胞培养瓶VWR10062-868
浓硫酸VWRBDH3072-2.5LG95-98%
盖玻片夹持镊子Techni-Tool758TW150
金刚石涂层钻头Abrasive technologyC52505100.75 mm金刚石钻头
DNA，氨基修饰单链DNA（上链）IDT DNA定制寡核苷酸CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA，生物素修饰单链DNA（下链）IDT DNA定制寡核苷酸/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA，DNA-PAINT成像链IDT DNA定制寡核苷酸GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA，永久标记成像链IDT DNA定制寡核苷酸CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
双面胶带Scotch2373/4英寸宽，永久性双面胶带
EDTAThermofisher155750200.5 M EDTA，pH 8.0
环氧树脂Gorilla420015分钟固化时间
胎牛血清（FBS）Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
冰醋酸VWRBDH3094-2.5LG
玻璃，盖玻片Fisher Scientific12-548-5P
玻璃，显微镜载玻片VWR48300-02675 mm × 25 mm × 1 mm
玻璃，染色缸VWR74830-150Wheaton染色缸（900620）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）Lonza04-315Q
血细胞计数板Sigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60细胞ATCCCCL-240
加湿室载玻片支撑架定制使用ABS线材3D打印
过氧化氢VWRBDH7690-130%
咪唑Sigma-AldrichI2399
进样口/出样口定制使用钴钻头在八个8-32紧定螺钉上钻通孔。将1.5 cm 聚乙烯管（Tygon，内径1/32”，外径3/32”）插入每个中空的紧定螺钉中
Isco改良Dulbecco培养基（IMDM）Lonza12-722F
氯化镁VWRBDH9244
磁性Ni-NTA微球Invitrogen10103D
邮寄管EMSEMS71406-10
甲醇VWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6凝胶柱Biorad7326200置于SSC缓冲液中
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-生物素Laysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
氢氧化钾VWR470302-132
蛋白，Protein GAbcamab155724N端His标签和C端半胱氨酸
蛋白，P-选择素-FcR&D System137-PS重组人P-选择素/CD62P Fc嵌合蛋白，CF
蛋白，链霉亲和素CedarlaneCL1005-01-5MG
泵用注射器Harvard Apparatus704801
碳酸氢钠Ward’s Science470302-444
氯化钠VWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
注射器Hamilton81520带PTFE鲁尔锁的5 mL注射器
注射器针头BD305115Precision Glide 26 G，5/8英寸长度
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
管路，连接适配器TygonABW00001配方3350，内径1/32”；外径3/32”
管路，聚乙烯BD Intramedic427406Intramedic（PE20），内径0.38 mm；外径1.09 mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773

参考文献

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