成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

摘要

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。

摘要

由选择素介导的相互作用所促进的滚动黏附，是一种高度动态且被动的运动方式，可将白细胞募集至炎症部位。该现象发生于毛细血管后微静脉中，血流推动白细胞在内皮细胞表面呈滚动运动。稳定的滚动依赖于黏附键形成与其受力学驱动解离之间的精细平衡，使细胞在随血流方向滚动的同时仍保持与表面的连接。与其他发生在相对静态环境中的黏附过程不同，滚动黏附具有高度动态性，滚动中的细胞可在每秒数十微米的速度下移动数千微米的距离。因此，传统的力学生物学方法（如牵引力显微镜）由于所需的时间尺度极短且灵敏度要求极高，难以用于测量单个黏附事件及其相关的分子力。本文中，我们描述了黏附足迹检测技术的最新应用，用于在分子水平上成像P-选择素与PSGL-1在滚动黏附过程中的相互作用。该方法利用不可逆的基于DNA的张力阈值系留结构，以荧光轨迹的形式永久记录分子黏附事件的历史。这些轨迹可通过两种方式成像：（1）拼接数千张衍射极限分辨率的图像，获得大视野图像，从而提取每个滚动细胞在长达数千微米路径上的黏附足迹；（2）进行DNA-PAINT成像，在小视野范围内重构荧光轨迹的超分辨率图像。在本研究中，黏附足迹检测被用于研究HL-60细胞在不同剪切应力下的滚动行为。通过该方法，我们能够成像P-选择素与PSGL-1相互作用的空间分布，并通过荧光强度了解其分子受力情况。因此，该技术为在分子水平上定量研究滚动黏附过程中多种细胞-表面相互作用奠定了基础。

引言

滚动黏附级联过程描述了循环细胞如何黏附于血管壁并沿其滚动¹。这种被动滚动主要由选择素介导，选择素是一类重要的细胞黏附分子（CAMs）¹。在血液剪切流作用下，表达P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）的白细胞与P-选择素形成高度瞬时的结合键，而P-选择素可表达于活化的内皮细胞表面。该过程对白细胞迁移至炎症部位至关重要²。此外，PSGL-1还是一种力学敏感性受体，在与P-选择素结合后可触发滚动黏附级联中后续的牢固黏附阶段³。

影响CAM功能的基因突变可严重损害免疫系统，例如在白细胞黏附缺陷症（LAD）这一罕见疾病中，介导细胞滚动的黏附分子功能异常会导致个体严重免疫缺陷^4,5,6。此外，循环肿瘤细胞也被证实通过类似的滚动过程迁移，从而导致转移^7,8。然而，由于细胞滚动过程快速且动态，传统的实验性机械生物学方法难以用于研究细胞滚动过程中的分子相互作用。尽管单细胞和单分子操纵技术（如原子力显微镜....

方案

1. 寡核苷酸标记与杂交

1. 蛋白G二硫键的还原
   1. 将10 mg蛋白G（ProtG）溶解于1 mL超纯水中。
      注意：此处的蛋白G在C末端修饰有一个单一的半胱氨酸残基，并带有N末端多聚组氨酸标签。
   2. 使用P6柱将≥20 µL的ProtG（10 mg/mL）置换至1× PBS缓冲液（pH 7.2）中。
   3. 缓冲液置换后测定蛋白浓度。
      注意：典型浓度为7–8 mg/mL。
   4. 通过将3 mg TCEP溶解于90 µL的1× PBS（pH 7.2）中，再加入10 µL的0.5 M EDTA，配制120 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）。
      注意：TCEP应新鲜配制。
   5. 向20 µL的ProtG（4–5 nmol）中加入4 µL的120 mM TCEP（480 nmol）。
      注意：TCEP与蛋白的摩尔比应约为100:1。
   6. 室温（RT）下反应30分钟。
   7. 使用P6柱去除还原后的ProtG中过量的TCEP（缓冲液置换至1× PBS，pH 7.2）。
   8. 使用紫外-可见分光光度计测定还原后ProtG的浓度，并保存光谱数据。
      注意：典型浓度为3.5–4.5 mg/mL。
2. 氨基标记单链DNA与磺基-SMCC的反应 ....

结果

上述方案描述了黏附足迹实验的实验步骤。整个实验流程如图1所示，包括流室组装（图1A）、表面功能化（图1B）以及实验与成像步骤（图1C）。

图2 是 ProtG-ssDNA 生物偶联表征的代表性结果。在最终偶联反应之前，分别采集了终产物中三种组分——ProtG、mal-ssDNA 和咪唑洗脱缓冲液的紫外/可见光谱（图2A），每种组分均对应已知浓度。这些光谱构成正交基，用于拟合生物偶联产物的光谱，其中三个未知参数即为各组分的浓度。采用 MATLAB 中自定义函数确定各组分浓度。结果表明 ProtG 与 ssDNA 的摩尔比接近 1:1（图2A）。该结果符合预期，因为 ssD.......

讨论

黏附足迹实验能够可视化PSGL-1与P-选择素在细胞滚动黏附过程中的分子黏附事件。该过程由P-选择素介导的捕获启动，随后在流体剪切应力作用下发生滚动。实验过程中可能出现的问题通常包括细胞滚动不良，或即使细胞滚动良好却未能观察到荧光轨迹。这些问题通常源于方案中关键步骤的质量控制不当，详见故障排除表（Table 1）。

生物分子和缓冲液需要经过过滤并在 4 °C 下储存，以防止污染，因为表面制备涉及多个步骤。高质量的表面钝化是实现适当表面功能化密度并减少生物分子非特异性结合的必要条件。生物分子对表面的非特异性结合会产生较高的荧光背景，干扰单分子荧光成像和统计数据分析。多种因素会影响表面钝化效果。氨基硅烷和 PEG-NHS 的水解会显著降低 PEG 化效率。充分的 KOH 清洗和芬顿清洗可通过在玻璃表面生成游离羟基，增强表面亲水性，从而提高化学反应基团的密度。细胞会黏附在钝化不良的表面上。表面钝化的质量可通过在 PEG 化前后使用荧光标记的生物分子检测背景荧光强度来评估。

配体的表面密度是影响细胞滚.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4通道钻孔导板	定制		使用ABS线材3D打印
4孔载玻片	定制		使用Dremel工具配合金刚石涂层钻头，在4通道钻孔导板上钻孔清洁显微镜载玻片，该导板布局与铝夹具上的8-32螺纹孔中心对齐。
丙酮	VWR	BDH1101-4LP
丙烯酸垫片	定制		切割两块尺寸为40 mm × 30 mm × 2.5 mm的丙烯酸板。在每块板上钻两个3 mm的孔，精确对准铝制支架上的4-40孔。
铝制芯片支架	定制		将阳极氧化铝块加工成C形支架，外部尺寸为640 mm × 500 mm × 65 mm，开口尺寸为400 mm × 380 mm × 65 mm。入口和出口处攻有8-32螺纹。
氨基硅烷	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
抗生素/抗真菌溶液	Cytiva HyClone	SV3007901	青霉素/链霉素/抗真菌素（Pen/Strep/Fungiezone）
Protein G包被的聚苯乙烯微球	Spherotech	PGP-60-5
牛血清白蛋白	VWR	332
DNA PAINT缓冲液			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
T50M5缓冲液			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
滚动缓冲液			含2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM Hepes和0.1% BSA的HBSS
洗涤缓冲液			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2和2 mM CaCl2，含0.05% Tween 20
氯化钙	VWR	BDH9224
细胞培养瓶	VWR	10062-868
浓硫酸	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
盖玻片夹持镊子	Techni-Tool	758TW150
金刚石涂层钻头	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm金刚石钻头
DNA，氨基修饰单链DNA（上链）	IDT DNA	定制寡核苷酸	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA，生物素修饰单链DNA（下链）	IDT DNA	定制寡核苷酸	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA，DNA-PAINT成像链	IDT DNA	定制寡核苷酸	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA，永久标记成像链	IDT DNA	定制寡核苷酸	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
双面胶带	Scotch	237	3/4英寸宽，永久性双面胶带
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA，pH 8.0
环氧树脂	Gorilla	42001	5分钟固化时间
胎牛血清（FBS）	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
冰醋酸	VWR	BDH3094-2.5LG
玻璃，盖玻片	Fisher Scientific	12-548-5P
玻璃，显微镜载玻片	VWR	48300-026	75 mm × 25 mm × 1 mm
玻璃，染色缸	VWR	74830-150	Wheaton染色缸（900620）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）	Lonza	04-315Q
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60细胞	ATCC	CCL-240
加湿室载玻片支撑架	定制		使用ABS线材3D打印
过氧化氢	VWR	BDH7690-1	30%
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399
进样口/出样口	定制		使用钴钻头在八个8-32紧定螺钉上钻通孔。将1.5 cm 聚乙烯管（Tygon，内径1/32”，外径3/32”）插入每个中空的紧定螺钉中
Isco改良Dulbecco培养基（IMDM）	Lonza	12-722F
氯化镁	VWR	BDH9244
磁性Ni-NTA微球	Invitrogen	10103D
邮寄管	EMS	EMS71406-10
甲醇	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6凝胶柱	Biorad	7326200	置于SSC缓冲液中
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-生物素	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
氢氧化钾	VWR	470302-132
蛋白，Protein G	Abcam	ab155724	N端His标签和C端半胱氨酸
蛋白，P-选择素-Fc	R&D System	137-PS	重组人P-选择素/CD62P Fc嵌合蛋白，CF
蛋白，链霉亲和素	Cedarlane	CL1005-01-5MG
泵用注射器	Harvard Apparatus	704801
碳酸氢钠	Ward’s Science	470302-444
氯化钠	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
注射器	Hamilton	81520	带PTFE鲁尔锁的5 mL注射器
注射器针头	BD	305115	Precision Glide 26 G，5/8英寸长度
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
管路，连接适配器	Tygon	ABW00001	配方3350，内径1/32”；外径3/32”
管路，聚乙烯	BD Intramedic	427406	Intramedic（PE20），内径0.38 mm；外径1.09 mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773