Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63023
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

Abstract

הסוג סטרונגילואידים מורכב ממספר מינים של נמטודות חודרות עור עם טווחי פונדקאים שונים, כולל סטרונגילואידים סטרקורליס ו-סטרונגילואידים ראטי. S. stercoralis הוא נמטודה אנושית-טפילית וחודרת עור המדביקה כ-610 מיליון בני אדם, בעוד שטפיל החולדה S. ratti קשור קשר הדוק ל-S. stercoralis ומשמש לעתים קרובות כמודל מעבדה עבור S. stercoralis. גם S. stercoralis וגם S. ratti ניתנים להתאמה בקלות ליצירת טרנסגניות ונוקאאוטים באמצעות טכניקת העברת חומצות גרעין אקסוגניות של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית, וככאלה, הופיעו כמערכות מודל להלמינתנים טפיליים אחרים שעדיין אינם מקובלים על טכניקה זו.

בוגרים טפיליים של סטרונגילואידים מאכלסים את המעי הדק של הפונדקאי שלהם ומשחררים צאצאים לסביבה דרך הצואה. ברגע שהם נמצאים בסביבה, הזחלים מתפתחים לבוגרים חופשיים, שחיים בצואה ומייצרים צאצאים שחייבים למצוא פונדקאי חדש ולטלוש אליו. דור סביבתי זה הוא ייחודי למין סטרונגילואידים ודומה מספיק במורפולוגיה למודל של נמטודה חופשית Caenorhabditis elegans שניתן להתאים טכניקות שפותחו עבור C. elegans לשימוש עם נמטודות טפיליות אלה, כולל מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית. באמצעות מיקרו-איניג'ינג תוך-גונדלי, ניתן להכניס מגוון רחב של טרנסג'נדרים ל-Strongyloides. רכיבי CRISPR/Cas9 יכולים גם להיות מיקרו-איניג'קטים כדי ליצור זחלי סטרונגילואידים מוטנטיים. כאן מתוארת הטכניקה של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית לתוך סטרונגילואידים, כולל הכנת מבוגרים החיים בחופשיות, הליך ההזרקה ובחירת הצאצאים המהונדסים. תמונות של זחלי סטרונגילואידים מהונדסים שנוצרו באמצעות מוטגנזה של CRISPR/Cas9 כלולות. מטרת מאמר זה היא לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במיקרו-איניג'קציה כדי ליצור סטרונגילואידים מהונדסים ומוטנטיים.

Introduction

סטרקוראליס סטרקורליס סטרונגילואידס כבר מזמן התעלמו ממנו כפתוגן אנושי חשוב בהשוואה לתולעי הקרס המוכרות יותר ולתולעת העגולה Ascaris lumbricoides1. מחקרים קודמים על נטל התולעים לעתים קרובות העריכו באופן חמור את השכיחות של S. stercoralis בשל הרגישות הנמוכה של שיטות אבחון נפוצות עבור S. stercoralis2. בשנים האחרונות, מחקרים אפידמיולוגיים המבוססים על כלי אבחון משופרים העריכו כי השכיחות האמיתית של זיהומי S. stercoralis גבוהה בהרבה ממה שדווח בעבר, כ -610 מיליון אנשים ברחבי העולם2.

גם ל-S. stercoralis וגם למינים אחרים של סטרונגילואידים, כולל טפיל החולדה הקשור באופן הדוק ולמודל המעבדה הנפוץ S. ratti, יש מחזור חיים יוצא דופן שיש לו יתרון למחקרים גנומיים ניסיוניים מכיוון שהוא מורכב מדורות טפיליים וחופשיים (סביבתיים)3 (איור 1). באופן ספציפי, גם S. stercoralis וגם S. ratti יכולים לעבור דרך דור אחד של חיים חופשיים. הדור החי החופשי מורכב מזחלים פוסט-טפיליים המתפתחים לזכרים ונקבות בוגרים בעלי חיים חופשיים; כל צאצאיהם של הבוגרים החיים בחופשיות מתפתחים לזחלים מדביקים, אשר חייבים להדביק פונדקאי כדי להמשיך את מחזור החיים. יתר על כן, ניתן לתמרן באופן ניסיוני את הדור הסביבתי או החופשי הזה במעבדה. מאחר שמבוגרים בעלי חיים חופשיים של סטרונגילואידים ובוגרים של C. elegans חולקים מורפולוגיה דומה, ניתן להתאים טכניקות כגון מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית שפותחו במקור עבור C. elegans לשימוש עם סטרונגילואידים בוגרים חיים חופשיים 4,5. בעוד שדנ"א מוחדר בדרך כלל לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים, גם זכרים וגם נקבות של סטרונגילואידים יכולים להיות מיקרו-איניג'קט6. לפיכך, כלים גנומיים פונקציונליים זמינים כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה של סטרונגילואידים. נמטודות טפיליות אחרות חסרות דור חופשי, וכתוצאה מכך, הן אינן מקובלות באותה מידה על טכניקות גנומיות פונקציונליות3.

Figure 1
איור 1: מחזור החיים של סטרקורליס סטרונגילואידים. הנקבות הטפיליות של S. stercoralis מאכלסות את המעי הדק של מארחי היונקים שלהן (בני אדם, פרימטים שאינם בני אדם, כלבים). הנקבות הטפיליות מתרבות על ידי פרתנוגנזה ומטילות ביצים בתוך המעי הדק. הביצים בוקעות בעודן בתוך הפונדקאי לתוך זחלים פוסט-טפיליים, אשר מועברים לסביבה עם צואה. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם זכרים, הם מתפתחים לזכרים בוגרים שחיים בחופשיות. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם נקבות, הם יכולים להתפתח לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים (התפתחות עקיפה) או לזחלים זיהומיים בשלב השלישי (iL3s; התפתחות ישירה). הזכרים והנקבות החיים בחופשיות מתרבים מינית כדי ליצור צאצאים המוגבלים להפוך ל-iL3s. בתנאים מסוימים, S. stercoralis יכול גם לעבור הדבקה אוטומטית, שבה חלק מהזחלים הפוסט-טפיליים נשארים בתוך המעי המארח במקום לעבור לסביבה בצואה. זחלים אלה יכולים להתפתח לזחלים אוטו-אינפקטיביים (L3a) בתוך הפונדקאי, לחדור דרך דופן המעי, לנדוד דרך הגוף, ובסופו של דבר לחזור למעי כדי להפוך למבוגרים רבייתיים. מחזור החיים של S. ratti דומה, למעט העובדה ש- S. ratti מדביק חולדות ואין לו מחזור אוטו-אינפקטיבי. הדור הסביבתי הוא המפתח לשימוש במיני סטרונגילואידים למחקרים גנטיים. הנקבות הבוגרות החיות באופן חופשי (P0) יכולות להיות מיקרו-איניג'קט; צאצאיהם, שכולם יהפכו ל-iL3s, הם המהונדסים הפוטנציאליים של F1. נתון זה שונה מקסטלטו ואחרים. 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

S. stercoralis חולק היבטים רבים של הביולוגיה שלו עם נמטודות אנושיות-טפיליות אחרות במערכת העיכול, כולל פלישת המארחים ומודולציה של מערכת החיסון המארח. לדוגמה, תולעי קרס אנושיות-טפיליות בסוג Necator ו - Ancylostoma גם נדבקות על ידי חדירת העור, מנווטות באופן דומה בגוף, ובסופו של דבר שוכנות כבוגרים טפיליים במעי הדק7. לפיכך, נמטודות רבות במערכת העיכול ככל הנראה משתמשות בהתנהגויות חושיות נפוצות ובטכניקות התחמקות חיסוניות. כתוצאה מכך, הידע שנאסף מ-Strongyloides ישלים את הממצאים בנמטודות אחרות, שפחות ניתנות לטיפול גנטי, ויוביל להבנה מלאה יותר של הטפילים המורכבים והחשובים האלה.

פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מתווה את השיטה להחדרת דנ"א לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים של סטרונגילואידים כדי ליצור צאצאים מהונדסים ומוטנטיים. מתוארות דרישות תחזוקת המתח, כולל התזמון ההתפתחותי של תולעים בוגרות למיקרו-אינטגרציות ואיסוף צאצאים מהונדסים. פרוטוקולים והדגמה של טכניקת המיקרו-איניג'קציה המלאה, יחד עם פרוטוקולים לגידול וסינון צאצאים מהונדסים, כלולים, יחד עם רשימה של כל הציוד הדרוש וחומרים מתכלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: גרבילים שימשו למעבר S. stercoralis, וחולדות שימשו למעבר S. ratti. כל ההליכים אושרו על ידי המשרד לפיקוח על מחקר בעלי חיים של UCLA (פרוטוקול מס '2011-060-21A), העומד בתקני AAALAC ובמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. את המשימות הבאות יש להשלים לפחות יום אחד לפני המיקרו-איניג'קטינג'ינג: גידול תולעים, הכנת רפידות מיקרו-איניג'קציה, יצירת מבנים לתערובת המיקרו-איניג'קציה והתפשטות חיידקים (E. coli HB101) על לוחות 6 ס"מ של נמטודה גדילה (NGM)8. הנקבות החיות בחופשיות דורשות מינימום של 24 שעות איסוף לאחר הצואה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להתפתח למבוגרים צעירים לפני שניתן יהיה לבצע בהן מיקרו-נקבה. רפידות מיקרו-איניג'קציה חייבות להיות יבשות לחלוטין. צלחות חיידקים חייבות להתייבש ולהקים מדשאה קטנה.

1. הכנת שקופיות מיקרו-אינטגיה: לפחות יום אחד לפני ההזרקה

הערה: תולעים מותקנות על כיסויי מיקרו-איניג'קציה עם רפידות אגר יבשות להזרקה.

  1. הגדר גוש חום ל- 90 °C (85 °F).
  2. הוסף 5 מ"ל של ddH2O, ולאחר מכן 100 מ"ג של אגרוז לצינור זכוכית borosilicate.
  3. מחממים את תערובת האגרוז בצינור מעל להבה עד שהאגרוז מומס.
  4. מקם את הצינור בבלוק חום שנקבע על 90 מעלות צלזיוס כדי לשמור על האגרוז במצב הנוזלי.
  5. זרוק ~ 180 μL של תמיסת האגרוז על כיסוי באמצעות פיפטת פסטר זכוכית או פיפטה עם קצה פלסטיק. מיד הורידו כיסוי שני למעלה כדי לשטח את האגרוז לתוך כרית דקה.
  6. לאחר 5-10 שניות, הסר את הכיסוי העליון על ידי החלקת השניים זה מזה. קבעו באיזו שקופית נמצאת כרית האגר והניחו אותה עם הפנים כלפי מעלה.
  7. בחרו חתיכת זכוכית זעירה מתוך פיסת כיסוי שבורה ולחצו אותה בעדינות לתוך האגר ליד הקצה העליון של המשטח באמצעות מלקחיים (איור משלים S1).
  8. המשך לייצר רפידות מיקרו-איניג'קציה עם תמיסת האגרוז.
  9. מייבשים את רפידות האגרוס למשך הלילה על הספסל או בתנור. יש לאחסן בקופסת הכיסויים.
    הערה: ניתן להשתמש ברפידות האגרוס עד חודשיים, אך הן משמשות רק להפעלת הזרקה אחת.

2. Culturing Strongyloides כדי להשיג תולעים עבור microinjection: 1 - 2 ימים לפני ההזרקה

הערה: פרוטוקול תחזוקת זן ניתן למצוא בחומר המשלים, הכולל תיאור מפורט של אופן ההדבקה של גרבילים וחולדות בנמטודות וקצירת נמטודות מצואה של בעלי חיים נגועים.

  1. יומיים לפני יום ההזרקה, הניחו את בעלי החיים הנגועים 9,10 בכלובי איסוף למשך הלילה.
  2. למחרת בבוקר, אספו צואה שורצת והכינו צלחות פחם צואה 9,10.
  3. הניחו צלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר לתולעים החופשיות להתפתח למבוגרים צעירים.
  4. בלילה שלפני יום ההזרקה, הניחו בעלי חיים מארחים לא נגועים בכלובי איסוף.
  5. ביום ההזרקה, אספו צואה לא שורצת לצורך גידול לאחר ההזרקה.

3. ביצוע תערובת המיקרו-איניג'קציה: לפני או ביום ההזרקה או ביום ההזרקה

הערה: תערובת המיקרו-איניג'קציה מורכבת מהפלסמידים בעלי העניין המדוללים לריכוז הרצוי בתמלחת התולעת (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.

  1. לקבוע את הריכוז של מניות הפלסמיד ואת הריכוז הרצוי בתערובת המיקרו-איניג'קציה (טבלה 1).
תמהיל מיקרו-איניג'קציה: מבנה כתבים
רכיב ריכוז מלאי כמות ריכוז סופי
pMLC30 gpa-3::gfp 300 ננוגרם/מיקרול 1.7 μL 50 ננוגרם/מיקרול
ב.א. נה 8.3 מיקרול נה
סך 10 μL 50 ננוגרם/מיקרול
תערובת מיקרו-איניג'קציה: מוטגנזה של CRISPR/Cas9
רכיב ריכוז מלאי כמות ריכוז סופי
pMLC47 מס-4 sgRNA 300 ננוגרם/מיקרול 2.7 מיקרול' 80 ננוגרם/μL
pEY11 Ss-tax-4 HDR פלסמיד 400 ננוגרם/מיקרול 2.0 μL 80 ננוגרם/μL
pPV540 strCas9 פלסמיד 350 ננוגרם/מיקרול 1.1 מיקרול 40 ננוגרם/μL
ב.א. נה 4.2 מיקרול נה
סך 10 μL 200 ננוגרם/μL
תערובת מיקרו-אינטגרציה: אינטגרציה piggyBac
רכיב ריכוז מלאי כמות ריכוז סופי
pMLC30 gpa3::gfp 300 ננוגרם/מיקרול 2.0 μL 60 ננוגרם/μL
pPV402 טרנספוסאז פלסמיד 450 ננוגרם/μL 0.9 μL 40 ננוגרם/μL
ב.א. נה 7.1 מיקרול נה
סך 10 μL 100 ננוגרם/μL

טבלה 1: דוגמאות לתערובות מיקרו-איניג'קציה. הפלסמידים והריכוזים עבור שלושה תערובות מיקרו-איניג'קציה לדוגמה: אחד עבור כתב gpa-3::GFP מבנה10, אחד עבור שיבוש בתיווך CRISPR/Cas9 של לוקוס Ss-tax-4 14,15, ואחד עבור אינטגרציה בתיווך piggyBac של מבנה Ss-gpa-3::GFP 13,17,18. strCas9 מציין את הגן Cas9 המותאם לקודון סטרונגילואידס. הריכוזים הסופיים המפורטים משמשים בדרך כלל בתערובות מיקרו-איניג'קציה של סטרונגילואידים.

  1. דיללו את הפלסמידים ב-BU לנפח כולל של 10-20 מיקרול'.
  2. סובבו את התערובת דרך עמודת סינון ב-5,000 × גרם למשך 1-2 דקות.
  3. השתמש בתערובת המיקרו-איניג'קציה באופן מיידי או אחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

4. לאסוף צעירים סטרונגילואידים למיקרו-איניג'קציה: בוקר יום ההזרקה

  1. הגדירו את מנגנון בארמן עם צלחת פחם-צואה אחת של סטרונגילואידים בוגרים צעירים (איור 2).
    הערה: צלחת הצואה-פחם עשויה להכיל זחלים מזהמים מסוימים. ציוד מגן אישי מורכב ממעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים. אין לחשוף עור בין הכפפה לשרוול מעיל המעבדה.

Figure 2
איור 2: מנגנון בארמן שימש לאיסוף תולעים טפיליות מתרבויות10. התוכן של צלחת צואה-פחם ממוקמים בראש עמוד של מים חמים. התולעים נודדות למים ונלקטות בתחתית המשפך. (A) כדי להקים את מנגנון בארמן, המעמד של משפך בארמן מהודק לספסל עם מהדק C. צינור גומי המחובר לקצה המשפך סגור במהדקי צביטה, ודלי תפיסה מונח מתחת לצינור לטפטוף. מים חמים מתווספים למשפך הזכוכית. (B) מחזיק טבעת הפלסטיק לתערובת הצואה-פחם מרופד לאחר מכן ב-3 פיסות של רקמות מעבדה (משמאל). מקל עץ או מדכא לשון (באמצע) משמש להעברת התוכן של צלחת פחם צואה (מימין) למחזיק טבעת הפלסטיק. (C) תקריב של החלק התחתון של מחזיק טבעת הפלסטיק לתערובת הצואה-פחם, המציג את השכבה הכפולה של טול הניילון המציפה את החלק התחתון של המחזיק. (D) מחזיק הצואה-פחם ממוקם לאחר מכן על החלק העליון של משפך הזכוכית. (E) רקמת המעבדה נרטבת במים ונסגרת מעל תערובת הצואה-פחם. מים חמים יותר מתווספים בעיקר כדי להטביע את פחם הצואה. (F) מערך בארמן השלם, עם תרבות הצואה-פחם שקועה מתחת למים חמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. התקינו משפך זכוכית עם צינורות איסוף גומי על מעמד טבעת באמצעות טבעת O והצמידו אותו למהדק. סגור את צינורות הקולקציה עם 2 מלחצי צביטה (איור 2A).
  2. הניחו דלי תפיסה מתחת למשפך כדי לתפוס טפטופים.
  3. מוסיפים מים חמים (כ-40 מעלות צלזיוס) למשפך עד 5 ס"מ מתחת לשפה. ודא שהמערכת אינה דולפת.
  4. מרפדים את מחזיק ה-Baermann, מסננת העשויה מ-2 טבעות פלסטיק עם 2 שכבות של רשת ניילון טול מאובטחת ביניהן, עם 3 פיסות חופפות של רקמת מעבדה. הוסיפו את תערובת הצואה-פחם למחזיק ה-Baermann (איור 2B,C).
  5. מניחים את מחזיק ה-Baermann עם תערובת הצואה-פחם במשפך. קפלו את הרקמות סביב תערובת הצואה-פחם והוסיפו מספיק מים כדי להטביע את רוב הצואה-פחם. אין למלא מעל 2 ס"מ משפת המשפך (איור 2D,E).
  6. מעל המשפך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ כדי להכיל את הריח. תייג את המשפך לפי הצורך (איור 2F).
  7. המתן 30 דקות עד שעה אחת כדי לאסוף את התולעים ממנגנון בארמן.
  8. החזק צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל מתחת לצינורות הגומי בתחתית המשפך. פתח בזהירות את המהדקים בתחתית כדי לחלק 30-40 מ"ל של מים המכילים תולעים לתוך צינור 50 מ"ל.
  9. העבר 15 מ"ל של מי בארמן המכילים את התולעים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו את צינור הצנטריפוגה 15 מ"ל למשך דקה אחת במהירות של כ-750 × גרם (איטי). לחלופין, אפשרו לתולעים להסתפק ב-10-15 דקות.
  10. מוציאים את ה-supernatant ל-~2 מ"ל ומשליכים את ה-supernatant לתוך מיכל נוזל פסולת עם יוד כדי להרוג תולעים.
  11. מוסיפים עוד מי בארמן לצינור האיסוף של 15 מ"ל וחוזרים על הסיבוב. הסר את ה-supernatant ל-~2 מ"ל והשליך כמו בשלב 4.11.
  12. חזור על שלבים 4.11 ו- 4.12 עד שכל התולעים נאספות בצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל. לאחר הסיבוב הסופי, הסר כמה שיותר מים.
  13. בדוק את גלולת התולעים (40-100 μL) בתחתית הצינור. אם לא ניתן לראות תולעים, חכו עוד 1-2 שעות ונסו לאסוף תולעים נוספות ממנגנון בארמן.
  14. מעבירים את התולעים בכמה שפחות מים לצלחת NGM של 6 ס"מ 2% עם מדשאה של E. coli HB101. השתמש בצלחת זו כצלחת המקור למיקרו-איניג'קציה.
  15. יש להשליך את תערובת הצואה-פחם על ידי טיפול בה ביוד מדולל (דילול של 50% של היוד של לוגול במים), לעטוף אותו בסרט פלסטיק כדי לתפוס טפטופים, ולהניח אותו במיכל פסולת ביו-האזרד.
  16. מוסיפים 10 מ"ל של יוד מדולל לדלי התפיסה ומנקזים לתוכו את עודפי המים מהברמן.
  17. שטפו את הרכיבים הרב-פעמיים (המשפך, דלי התפיסה, מחזיק הפלסטיק בטול, מכסה הפלסטיק והמהדקים) ב-10% אקונומיקה ושטפו היטב.

5. משיכה וטעינה של מחטי מיקרו-ייצור: רגע לפני ההזרקה

  1. הכן מחטים microinjection על ידי משיכת צינורות נימי זכוכית באמצעות מושך מחט.
    הערה: הגדרות לדוגמה עבור מושך מחט מסחרי המצויד בחוט פלטינה/אירידיום 3 מ"מ הן חום = 810-820, משיכה = 800-820, מיקרומטר = 2.5.
  2. צפו בטיפים מתחת למיקרוסקופ ניתוח. אם למחטים יש את הצורה הרצויה (איור 3A-F), משכו 4-6 מחטים (2-3 צינורות נימיים). כדי להשיג את צורת המחט הנכונה, שנה את ההגדרות לפי הצורך: התאם את הגדרות החום או המשיכה ב- 10 ומשך מחטים חדשות עד שצורת המחדד והפיר מתאימים יותר.

Figure 3
איור 3: מחטי מיקרו-איניג'קציה ונקבה בוגרת סטרקורליס סטרקורליס סטרונגילואידית עם אתרים אופטימליים למיקרו-איניג'קציה שזוהו. (א-ב) מחדד הפיר (A) וקצה (B) של מחט שצורתה נכונה למיקרו-זירה. הקצה חד מספיק כדי לחדור את הציפורן וצר מספיק כדי לא לגרום נזק מוגזם. (ג-ד) הפיר מתחדד (C) וקצה (D) של מחט מיקרו-איניג'קציה המעוצבת באופן שגוי למיקרו-איניג'קט. הקצה בוטה ורחב מדי, ויגרום נזק מוגזם לתולעת. (ה-ו-ו) מחדד הפיר (E) וקצה (F) של מחט שככל הנראה ארוכה ודקה מכדי לעבוד עבור מיקרו-אינגיה. הקצה ב-F דומה מאוד לקצה ב-D. עם זאת, הפיר צר וגמיש מכדי לחדור ביעילות את הציפורן. בנוסף, מחטים דקות מאוד נסתמות בקלות. (G) תמונה של התולעת כולה הממוקמת כהלכה לצורך מיקרו-אינץ', בהנחה שהמחט נכנסת מימין. קדמי הוא למטה ומשמאל; הפות מסומן על ידי ראש החץ. הגונד נראה לאורך הצד הימני של הנקבה. לנקבה זו יש רק ביצית אחת ברחם שלה (מסומנת על ידי הכוכבית). (ח, א) תצוגות מוגדלות של אתרי המיקרו-איניג'קציה. זווית החץ מעריכה את זווית מחט ההזרקה. הפות יכול לשמש כנקודת ציון; הוא נמצא בצד הנגדי של התולעת מזרועות הגונד. זרועות הגונד מתעקלות סביב המעי, והקצוות עם הגרעינים המפרידים נמצאים מול הפות. (ח) הזרוע האחורית של הגונד; (I) הזרוע הקדמית. ניתן להזריק את אחת הזרועות או את שתיהן. עבור H, I, מוסכמות הן כמו ב-G. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B, D, F, H, I); 100 מיקרומטר (A, C, E, G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. אחסנו את המחטים המשוכות בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ עם חתיכת סרט מגולגל כדי לאבטח את המחטים ולמנוע הצטברות אבק על הקצוות.
  2. מניחים טיפה של 0.7 μL של תערובת המיקרו-איניג'קציה על הקצה הפתוח של הפיר. תלו את המחט בניצב למדף באמצעות פיסת נייר דבק מגולגלת כדי למלא את הפיר המחודד בתערובת תוך 10 דקות. להכין 2 מחטים בכל פעם במקרה הראשון לא עובד.

6. הכנת המיקרוסקופ ושבירת המחט

הערה: Microinjection משתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרות פי 5 ו-40x המצוידות במערך מיקרו-איניג'קטור כדי לשלוט בתנועת המחט. יש להניח את המיקרוסקופ ההפוך על שולחן כבד או על שולחן אוויר נגד רעידות כדי להפחית את רעשי הרטט. מחזיק המחט של המיקרו-איניג'קטור מחובר לגז חנקן שמפעיל את הלחץ הדרוש כדי לספק את תערובת המיקרו-איניג'קטור. מיקרוסקופ ניתוח קטן יותר בקרבת מקום משמש להעברת התולעים.

  1. הגדר את לחץ מיכל הדלק ל~ 40-60 psi לשבירת המחט ול~ 30-50 psi למיקרו-איניג'קט, בהתאם לזרימת הנוזל.
  2. במיקרוסקופ הניתוח, כסו את שברי הזכוכית על כרית המיקרו-איניג'קציה המכסה בשמן הלוקרבון באמצעות פיק תולעי פלטינה סטנדרטי.
  3. מניחים את כרית המיקרו-איניג'קציה על היקף המיקרו-איניג'קציה ומאתרים את שברי הזכוכית המכוסים בשמן. יישמו את רסיס הזכוכית כך שקצה יהיה מאונך לכיוון המחט כדי לשמש כמשטח המשמש לשבירת המחט.
  4. ודא שלמחט אין בועות או פסולת בפיר המחודד באמצעות מיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, אבטח את המחט 1-1.5 ס"מ לתוך מחזיק הלחץ.
  5. מקם את קצה המחט במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ בעין. לאחר מכן, תחת הגדלה נמוכה, מקם את קצה המחט בשדה הראייה, בניצב לצד רסיס הזכוכית.
  6. עברו לעוצמה גבוהה ויישרו את קצה המחט עם קצה הזכוכית, בסמוך אליה אך לא נוגעים בה.
    הערה: כאשר מושכים, המחטים מתמזגות סגורות.
  7. כדי לשבור את קצה המחט כדי לאפשר זרימת נוזלים, הקישו עליה בעדינות על דופן פיסת הזכוכית תוך הפעלת לחץ רציף מהגז (איור משלים S1). ברגע שהנוזל מתחיל לזרום, בדקו את צורת הקצה וודאו שהוא חד עם נוזל זורם בקלות.
    הערה: אם הנוזל זורם מהר מדי או שהקצה קהה מדי, התולעים יינזקו במהלך מיקרו-איניג'ינג (וידאו 1 ואיור 3A-F).
  8. כאשר הנוזל זורם היטב מהמחט, הזיזו את שקופית המיקרו-איניג'קציה להיקף הניתוח והניחו טיפות של שמן הלוקרבון 1-2 μL על כרית האגר למיקום התולעים.
  9. העבירו 20-30 סטרונגילואידים צעירים לצלחת 2% NGM ללא חיידקים למשך 5 דקות לפחות כדי להסיר עודפי חיידקים על פני השטח ולבחור תולעים בודדות למיקרו-זירה. הוסיפו עוד תולעים לצלחת ה-NGM לפי הצורך בזמן ההזרקה.

7. מיקרו-איניג'קטינג סטרונגילואידים

  1. השתמשו בכמות קטנה של שמן הלוקרבון על פיק תולעת כדי לבחור נקבה בוגרת צעירה של סטרונגילואידס עם 1-4 ביצים בגונד שלה מתוך צלחת 2% NGM ללא חיידקים.
  2. מעבירים את התולעת לתוך טיפת שמן זעירה על כרית האגר. באמצעות בחירת התולעת, מקם בעדינות את התולעת כך שהיא לא תהיה מפותלת והגונדה תהיה גלויה וקלה לגישה. שימו לב לכיוון הגונד (איור 3G).
  3. מקם את התולעת בשדה הראייה של מיקרוסקופ המיקרו-איניג'קציה. ודאו שהגונאד נמצא באותו צד של המחט וממוקם כך שהמחט תיצור קשר עם הגונד בזווית קלה (איור 3H,I).
  4. הביאו את קצה המחט לצד התולעת באותו מישור מוקד. כוון לזרוע הגונד ליד מרכז התולעת. השתמש במיקרו-איניג'קטור כדי להכניס את המחט בעדינות לתוך הגונד (וידאו 2).
  5. מיד להפעיל לחץ על המחט כדי למלא בעדינות את כל זרוע gonad עם תמיסת DNA. קבעו בעין מתי הוזרק מספיק נוזל (וידאו 2).
    הערה: ייתכן שיחלפו עד 2 שניות כדי למלא את הגונד.
  6. הסר את המחט ובדוק כדי לקבוע שהפצע נסגר.
    הערה: התולעת פגומה מכדי לייצר צאצאים אם הגונד בולט דרך דופן הגוף (סרטון משלים S1).
  7. חזור על הפעולה עם הזרוע השנייה של הגונד אם היא נראית לעין.
  8. בסיום ההזרקה, ודא במהירות שהמחט אינה סתומה על ידי הפעלת לחץ עם קצה המחט על כרית האגר. העבר את המגלשה עם התולעת המוזרקת למיקרוסקופ הניתוח.
  9. כדי לשחזר את התולעת המוזרקת, תחילה הניחו כמה טיפות BU על התולעת כדי להציף אותה מעל כרית האגר.
  10. אספו כמות קטנה של חיידקי HB101 על קטיף תולעים. געו בתולעת עם החיידקים הדבקים על פיק התולעת כדי להסיר אותה מהנוזל.
  11. מעבירים בעדינות את התולעת לצלחת ההתאוששות, לוחית NGM של 2% המכילה מדשאת HB101.
    הערה: התולעת אמורה להתחיל לזחול תוך דקות ספורות.
  12. לאחר שהוזרקו כמה נקבות, הוסיפו כמה זכרים לא מזוהים מלוחית המקור.
    הערה: מינימום של זכר אחד לחמש נקבות הוא בסיס טוב; עדיף עודף של זכרים.
  13. חזרו על כל השלבים עד שיוזרקו מספיק נקבות לניסוי.
  14. השאירו את המבוגרים על צלחת ההחלמה לפחות שעה אחת לאחר ההזרקה כדי לאפשר לתולעים להתאושש ולהזדווג.

8. התאוששות והתרבות של סטרונגילואידים מוזרקים

  1. אספו צואה במהלך הלילה מבעלי חיים פונדקאים לא נגועים, תוך שימוש באותו פרוטוקול כמו עבור בעלי חיים נגועים.
  2. מערבבים את הצואה הלא שורצת עם כמות קטנה של פחם (יחס צואה לפחם של כ-2 ל-1 עבור צלחות אלה).
  3. יוצקים כמות קטנה של תערובת פחם-צואה לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ מרופדת בנייר מסנן לח. יש לוודא שהתערובת אינה נוגעת במכסה של המנה.
  4. הצפת את צלחת ההתאוששות ב- BU. באמצעות פיפטה שנקבעה על 3 μL, העבר את התולעים לצואה בצלחת הפחם-צואה. מניחים את התולעים ישירות על הצואה, לא על הפחם.
  5. ודא שהבוגרים נמצאים על צלחת הצואה-פחם באמצעות היקף ניתוח.
  6. כדי לתרבת את התולעים, הניחו את הצלחת בחדר לח, כלומר קופסת פלסטיק עם מכסה צמוד מרופד במגבות נייר לחות.
    הערה: לאחר יומיים, יהיה שילוב של שלבי זחל. לאחר 5 ימים, רוב הזחלים יתפתחו ל-iL3s; כמה זחלים צעירים יותר יישארו. לאחר 7 ימים, כל הזחלים צריכים להיות iL3s.

9. איסוף וסינון של זחלי F 1 לשחזור זחלים מהונדסים/נוקאאוטים

  1. באמצעות מערך בארמן, אספו את הזחלים מלוחות גידול הצואה-פחם בקנה מידה קטן לאחר ההזרקה. כדי להשיג כמה שיותר זחלים, יש להמתין לפחות שעתיים לפני שתחלימו את התולעים ממנגנון בארמן.
  2. ריכז את הזחלים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל כמו בשלבים 4.10-4.14 והעביר את הזחלים לכוס שעון קטנה עם BU.
  3. אם הזחלים ישמשו לניסויים התנהגותיים, השתמשו ב-2% לוחות NGM עם מדשאה עבה של HB101 להקרנה.
    1. העברת 20-30 זחלים למדשאת HB101.
      הערה: החיידקים יאטו את תנועת הזחלים.
    2. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, זהה את הזחלים המבטאים את הטרנסג'ין המעניין. השתמשו בבחירת תולעים כדי לבחור את הזחלים המהונדסים ולהעביר אותם לכוס שעון קטנה עם BU.
    3. השתמש בלוח HB101 חדש כדי לסנן קבוצה קטנה נוספת של זחלים. כאשר נאספו מספיק זחלים לשימוש ניסיוני, טפלו בצלחות HB101 ובתולעים העודפות עם יוד מדולל (50% היוד של לוגול מדולל במים) והשליכו אותם כפסולת ביו-האזרד. לחלופין, הרגו את התולעים העודפות באמצעות מנקה מלונה מרוכז המכיל אלקיל בנזיל אמוניום כלוריד.
    4. השתמשו בתולעים באופן מיידי או השאירו אותן בכוס שעון רדודה בכמות קטנה של BU למשך הלילה.
      הערה: תולעים עלולות להפוך היפוקסיות אם הנוזל עמוק מדי. ייתכן כי השארת זחלים ב- BU למשך הלילה עשויה להשפיע על התנהגויות מסוימות; לכן, השתמש בזחלים לניסויים התנהגותיים תוך 6 שעות.
  4. אם הזחלים ישמשו למיקרוסקופיה ולא לבדיקות התנהגותיות, אז ישתקו את התולעים על ידי שיתוק ניקוטין באופן הפיך להקרנה.
    1. באמצעות סכין גילוח, הצמידו רשת לתחתית הפלסטיק של צלחת chemotaxisבקוטר 10 ס"מ 12 כדי להקל על המעקב אחר מיקום התולעים בצלחת.
    2. זרוק ~ 3 μL של זחלים ב- BU לתוך ריבוע ברשת. מלאו כמה ריבועים לפי הצורך. אין להשתמש באלה הסמוכים לשולי הצלחת, שכן הזחלים עשויים לזחול לצידי הצלחת.
    3. מוסיפים טיפות של 15-20 μL של 1% ניקוטין במים לטיפות התולעת.
      הערה: לאחר 4 דקות, התולעים יהיו משותקות.
    4. המסך את התולעים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי.
    5. השתמש בחריק תולעים כדי להעביר את הזחלים המהונדסים לכוס שעון קטנה עם 1-2 מ"ל של BU.
      הערה: הזחלים יהיו משותקים במשך מספר שעות וניתן יהיה להרכיבם בקלות על שקופיות מיקרוסקופ לצורך מיקרוסקופיה. אם יישארו במשך הלילה ב-BU, ה-iL3s יתאוששו וניתן יהיה להשתמש בהם לבדיקות מסוימות או לזיהום מארח של יונקים. עם זאת, שיתוק ניקוטין ודגירה לילית ב- BU עשויים להשפיע על התנהגויות מסוימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אם הניסוי היה מוצלח, הזחלים F1 יבטאו את הפנוטיפ הטרנסגני ו/או המוטנטי המעניין (איור 4). עם זאת, שיעורי הטרנספורמציה משתנים מאוד ותלויים במבנים, בבריאות התולעים, בתנאי התרבות שלאחר ההזרקה ובמיומנות של הנסיין. באופן כללי, ניסוי מוצלח יניב זחלים >15 F 1 לכל נקבה מוזרקת ושיעור טרנספורמציה של >3% עבור סמנים פלואורסצנטיים. אם המספר הכולל של צאצאים חיים מגיע בממוצע לפחות מ-10 זחלים/נקבות, ייתכן שהמבנה רעיל, והזחלים שהשתנו לא שורדים. מציאת מספר גדול של ביצים פלואורסצנטיות אך לא זחלים פלואורסצנטיים היא אינדיקציה נוספת לכך שתערובת ההזרקה עשויה להיות רעילה. כאשר לומדים לראשונה את הטכניקה, מומלץ להשתמש במבנה שמבטא היטב, כגון act-2::mRFPmars, מה שמניע ביטוי חזק בשריר דופן הגוף13 (איור 4).

בעת יצירת מוטנטים על ידי מוטגנזה ממוקדת בתיווך CRISPR/Cas9, מומלץ להשתמש בתבנית תיקון המכילה act-2::mRFPmars או act-2::GFP transgene13, כך שניתן יהיה לזהות מוטנטים פוטנציאליים על סמך פלואורסצנציה 9,14,15. חשוב לציין שמכיוון ש-Strongyloides מבטאים טרנסגנים ממערכים חוץ-כרומוזומליים, צאצאי F1 פלואורסצנטיים עשויים לבטא mRFPmars או GFP מהמערך בלבד או לבטא mRFPmars או GFP הן מהמערך והן מטרנסגן משולב 3,9,16. ניתן לזהות זחלים שסביר יותר שיהיו להם טרנסגנים משולבים על סמך תבנית הביטוי הפלואורסצנטי: ביטוי "מטושטש" בשריר דופן הגוף (איור 4A) נפוץ יותר כאשר הטרנסגן אינו משולב בגנום, בעוד שביטוי עקבי בכל שריר דופן הגוף (איור 4B) ) לעתים קרובות, אך לא תמיד, מציין כי הטרנסגן השתלב בגנום. עם זאת, לא ניתן להשתמש בדפוסי ביטוי לבדם כדי לזהות באופן חד משמעי מוטנטים - תולעים מסוימות עם ביטוי עקבי בכל שריר דופן הגוף עשויות שלא לכלול אירועי אינטגרציה. יתר על כן, דפוסי ביטוי אינם יכולים להבחין בין מוטנטים שהם הומוזיגוטיים לבין אלה שהם הטרוזיגוטיים או פסיפס. לפיכך, כל תולעת חייבת להיות גנוטיפית PCR 9,14,15. כאשר משבשים גנים שמניבים פנוטיפים הנראים לעין בקלות, ייתכן שאין צורך להשתמש בתבנית תיקון. לדוגמה, שיבוש של הגן Strongyloides unc-22 גורם לפנוטיפ "עוויתות" דומיננטי, עם שיעורים של שיבושים הטרוזיגוטיים או הומוזיגוטיים מעל 10%9.

Figure 4
איור 4: זחלי סטרקורליס סטרקורליס סטרקורליס מהונדסים (A, B) S. stercoralis larvae המבטאים מעשה-2::mRFPmars transgene, המתבטא בשריר דופן הגוף13. הטרנסג'ין שולב בתבנית תיקון לשיבוש בתיווך CRISPR/Cas9 של Ss-unc-22 locus9. (A) זחל S. stercoralis בעל תבנית ביטוי לא שלמה, או "מטושטשת", של פעולה 2::mRFPmars שעשויה להצביע על ביטוי ממערך חוץ-כרומוזומלי. (B) S. stercoralis iL3 המבטא את תבנית הביטוי השלמה יותר של act-2::mRFPmars שעשויה להצביע על הפרעה גנטית ואינטגרציה של תבנית התיקון. עבור A, B, לוחות מציגים ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (משמאל), פלואורסצנטיות (אמצע) ותמונות ממוזגות (מימין). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1: הדגמת תהליך שבירת המחט כדי ליצור מחט שמישה. קצה המחט מודבק על קצהו של רסיס זכוכית (חפץ בקצה השמאלי). כאשר נוזל מגיח, המחט נשלפת לאחור ומועברת למטה על האגר. קצה המחט מגיע לנקודה חדה, והנוזל זורם במהירות מתונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2: הדגמה של זריקה מוצלחת. הזרוע האחורית של הגונד נראית כמבנה אפור בהיר מימין. קצה המחט והגונד חייבים להיות באותו מישור מוקד. אם המחט מחליקה מעל או מתחת לתולעת או לאורך הגוף מבלי לתפוס, התאימו את התנוחה. קצה המחט יכניס מעט פנימה את דופן הגוף. הקשה מהירה על מחזיק המחט המחובר למיקרומניפולטור תדחוף בעדינות את הקצה דרך דופן הגוף ולתוך הגונד. ברגע שהמחט נמצאת בתוך הגונד, הפעילו לחץ והזיקו את תמיסת הדנ"א. הנוזל אמור להציף את הגונד. אם הפצע נסגר כאשר מסירים את קצה המחט, סביר להניח שהתולעת תשרוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

חומר משלים: תחזוקת זן סטרונגילואידים. פרוטוקול זה מתווה את הליך התחזוקה של S. stercoralis בגרבילים ו- S. ratti בחולדות. הוא כולל את המינון ההדבקה המשמש לכל נמטודה ופונדקאי. המארחים נדבקים באמצעות זריקות תת עוריות בהרדמה. ההתקדמות של זיהומים מפטנסי לתפוקת זחל שיא לאובדן טפיחות מתוארת עבור כל שילוב של נמטודה-מארח. מתואר גם הפרוטוקול המשמש לאיסוף צואה שורצת ולייצור לוחות גידול הצואה-פחם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S1 משלים: תמונה של מגלשת מיקרו-איניג'קציה המורכבת מרפידת אגר מיובשת על מכסה עם רסיס זכוכית קטן לשבירת מחט המיקרו-איניג'קציה. מתווה האגר ומתווה הרסיסים מתווספים כאן לבהירות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים S1: הדגמה של זריקה וכתוצאה מכך גונד פגום. הזרוע הקדמית של הגונד נמצאת בפוקוס. הפעלת לחץ קל מראה שהתמיסה במחט עדיין זורמת בחופשיות. קצה המחט נמצא באותו מישור מוקד כמו הגונד ומכוון לזווית קלה. לאחר החדרת קצה המחט, הפתרון מוזרק לתולעת וממלא את הגונד. עם זאת, כאשר המחט מוסרת, חתיכה של gonad בולט דרך הפצע בציפורן. החומר זורם באופן גלוי החוצה. תולעת זו לא צפויה לשרוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מפרט את השיטות להחדרת מבנים לטרנסגנזה ומוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 לתוך S. stercoralis ו-S. ratti. הן עבור S. stercoralis והן עבור S. ratti, ההישרדות לאחר ההזרקה ושיעור הטרנסגנזה או המוטגנזה כפופים למספר משתנים הניתנים לכוונון עדין.

השיקול הקריטי הראשון לטרנסגנזה מוצלחת הוא האופן שבו טרנסג'נדרים פלסמידים נבנים. מחקרים קודמים מצאו כי ביטוי של טרנסגנים אקסוגניים ב-Strongyloides דורש שימוש במקדמי Strongyloides 5' וב-3' אלמנטים UTR 3,13,19. בדומה למבנים של C. elegans, מבנים סטרונגילואידים משתמשים בדרך כלל במקדם ספציפי לגנים וב-UTR משותף של 3', כמו זה מהגן Ss-era-13. אופטימיזציה של קודון של אזור הקידוד עשויה להיות חשובה גם לביטוי ב-Strongyloides. לאחרונה, מתאם קודון תולעת הבר, אפליקציה מבוססת אינטרנט המייעלת את רצפי הקידוד של קודון עבור סטרונגילואידים ונמטודות אחרות, פותחה20. לבסוף, אף על פי שלא נבדקו בקפדנות ב-Strongyloides, הודגם כי אינטרונים מגבירים את הביטוי של טרנסגנים אקסוגניים הן ב-C. elegans21 והן בנמטודה Pristionchus pacificus22 הקשורה לחרקים, ויש להניח שהם מגבירים את הביטוי גם ב-Strongyloides. למתאם קודון תולעת הבר יש אפשרויות לכלול עד שלושה אינטרונים ברצף20 שהשתנה.

ההרכב והמסירה של תערובת המיקרו-איניג'קציה משפיעים על קצב הטרנסגנזה ועל הישרדותם של צאצאי F1 . מלח BU משמש באופן שגרתי כדילול עבור תערובות, אם כי שימוש ddH2O הוא גם אופציה. ניתן להתאים את הריכוזים ו/או היחס בין הרכיבים בתמהיל כדי לשפר את קצב הטרנספורמציה. ריכוזים גבוהים יותר של פלסמידי העניין יכולים להגדיל את שיעור הטרנסגנזה, אך לעתים קרובות לגרום לפחות צאצאים כוללים. אם לא נצפה ביטוי טרנסגני או רק ביצים מהונדסות מתות נמצאות, ייתכן כי הטרנסגנים רעילים, או שמשהו במלאי הפלסמיד גורם למותם של המהונדסים. במקרה האחרון, הכנת מלאי פלסמידים חדשים בשיטה אחרת (למשל, באמצעות ערכת מיני-פרפ שונה) עשויה להספיק לקבלת חומרים מהונדסים. הוספת ליפופקטאמין לתערובת המיקרו-אינדקציה עשויה גם לשפר את קצב הטרנסגנזה23.

הצורה של מחט המיקרו-איניג'קציה שמספקת את התמהיל משפיעה גם על שיעורי ההישרדות וההתעלות (איור 3A-F, וידאו 1, וידאו 2 ווידאו משלים S1). המחט חייבת להיות חדה מספיק כדי לחדור את הציפורן וצרה מספיק כדי לא לגרום לנזק מוגזם. מומלץ למשוך מחטים רגע לפני השימוש שכן מחטים המאוחסנות במשך יותר מיום עלולות לצבור פסולת ולהסתתם במהלך מיקרו-זיהומים. שחזור נקבות מוזרקות מתוך כרית המיקרו-איניג'קציה מבלי לפגוע בהן יכול להתבצע בכמה שיטות שונות. טכניקה אחת היא להציף את התולעים ממשטח ההזרקה בטיפה של BU, ולאחר מכן להשתמש ב-HB101 על פיק תולעים כדי לאסוף את התולעים. טכניקות אחרות לשחזור כוללות הצף את התולעים ב-BU ואיסוף שלהן באמצעות קצה פיפטה או מברשת צבע קטנה או פשוט שימוש בקטיף תולעים לבדו כדי להעביר את התולעים לצלחת התאוששות.

אם לא התקבלו צאצאים מהנקבות הזעירות, הדבר מצביע על כך שהנקבות שהוזרקו נפגעו בתהליך המיקרו-איניג'קציה או שתנאי התרבות שלאחר ההזרקה היו לא אופטימליים. ישנם מספר מצבים שונים של התרבות לאחר ההזרקה שניתן לנסות. תרביות הצואה-פחם בקנה מידה קטן שתוארו לעיל תומכות בדרך כלל בהישרדות טובה יותר של תולעים מאשר לוחות NGM עם HB101. עם זאת, זה יכול להיות קשה לעקוב אחר הישרדותן של התולעים המוזרקות והתפתחות הזחלים F1 על צלחות פחם צואה, וביצים אינן נראות על צלחות אלה. יתרון של גידול תולעים על צלחות NGM עם HB101 במקום לוחות פחם צואה הוא לאפשר תצפית זהירה על הטלת ביצים ופיתוח זחלים, אשר יכול להיות שימושי לפתרון בעיות. לוחות V12 עם HB101 יכולים לשמש גם כדי להגדיל את ההישרדות24. לבסוף, צלחת chemotaxis12 עם כדור צואה של חולדה בודדת יכולה לשמש עבור Culturing S. ratti לאחר ההזרקה. הזכרים והנקבות המוזרקות מועברים ישירות לכדור הצואה של החולדה. תוך 5-7 ימים נאספות תולעים מהאגר והצואה באמצעות מנגנון בארמן, כפי שתואר לעיל.

כדי להשיג מבוגרים סטרונגילואידים למיקרו-איניג'קציה, ניתן לדגום צלחות פחם-צואה טריות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. עם זאת, אם הנקבות צעירות מדי, ייתכן שהן לא ישרדו את תהליך המיקרו-אינטגיה. בוגרים שנאספו מלוחות פחם-צואה שהודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך כ-48 שעות, נוטים יותר לסבול את תהליך המיקרו-פחם. עם זאת, מכיוון שמבוגרים אלה הם מבוגרים יותר ממבוגרים המתקבלים מדגירה של 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, הם אינם נקבים באותה מידה ועשויים להיות בעלי קצב טרנספורמציה נמוך יותר. טירונים עשויים להעדיף להתחיל עם מבוגרים ואז לעבור למבוגרים מעט צעירים יותר ככל שהמיומנויות משתפרות.

בדומה ל-C. elegans, מינים של סטרונגילואידים יכולים לבטא טרנסג'נים ממערכים חוץ-כרומוזומליים ומבנים משולבי גנום בדור F1 . שלא כמו C. elegans, מיני סטרונגילואידים יבטאו רק טרנסגנים משולבי גנום ב-F2 ובדורות הבאים, למרות שהמערכים החוץ-כרומוזומליים עדיין ניתנים לזיהוי על ידי PCR13. הזחלים המהונדסים F1 המבטאים מערכים חוץ-כרומוזומליים יכולים לשמש לניסויים שאינם דורשים אינטגרציה גנומית או למספר רב של תולעים מהונדסות. אינטגרציית גנום עשויה להידרש לניסויים הדורשים תיוג גנים אנדוגניים או בדיקת מספר גדול של תולעים במבחנים מבוססי אוכלוסייה. ישנן שתי שיטות לשילוב גנום של טרנסג'נדרים ב-Strongyloides: אינטגרציה בתיווך טרנספוזון piggyBac17 ואינטגרציה בתיווך CRISPR/Cas99. אינטגרציה בתיווך טרנספוזון piggyBac משתמשת בטרנספוזאז piggyBac כדי לכוון מטען לאתרי TTAA בגנום26. מאחר שמוטיב ה-TTAA נפוץ למדי בגנום העשיר ב-AT של מיני סטרונגילואידים , האינטגרציה נמצאת לעתים קרובות ביותר מאתר אחד בגנום. לעומת זאת, ניתן להשתמש באינטגרציה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לשלב טרנסג'נדרים במוקד יעד מסוים9.

מערכת הקריספר/Cas9 יכולה לשמש גם ליצירת נוקאאוטים ממוקדי גנים 9,27. בשל עושר ה-AT של הגנום של סטרונגילואידים, מציאת אתרי מטרה Cas9 שמישים המכילים את הרצף האופטימלי של 5'-N18GGNGG-3' עבור נמטודות28 היא אתגר. לעתים קרובות, יש רק אתר אחד או שניים בגן למיקוד. השיטה המועדפת כוללת שילוב של תבנית תיקון המכילה טרנסגן עם סמן פלואורסצנטי על ידי תיקון מכוון הומולוגיה לתוך הלוקוס הגנומי, וכתוצאה מכך הפרעה מוחלטת של הגן. ניתן לזהות נוקאאוטים פוטנציאליים על ידי ביטוי של הטרנסג'נדר 9,14,15,29. עם זאת, ביטוי טרנסג'נדרים לבדו אינו מעיד על גנוטיפ שכן ביטוי ממערכים לעומת טרנסג'נדרים משולבים הוא לעתים קרובות בלתי ניתן להבחנה. לפיכך, הזחלים המהונדסים F1 דורשים גנוטיפ פוסט-הוק כדי לזהות נוקאאוטים הומוזיגוטיים9. בהיעדר תבנית תיקון, מוטגנזה של מוקד המטרה מתרחשת בתדירות גבוהה אך עלולה לגרום למחיקות גדולות9.

אף על פי שיצירת זחלי F1 מהונדסים או מוטנטיים היא פשוטה יחסית ב-S. stercoralis, יצירת קווים יציבים היא קשה ביותר בגלל הצורך במעבר מארח. במעבדה, הגרביל המונגולי הוא פונדקאי מתירני עבור S. stercoralis אך דורש מינון גבוה של תולעים כדי ליצור זיהום המסוגל לייצר מספיק זחלי F2 כדי להקים את הקו30. רק כ-6% מהזחלים המזהמים הופכים לנקבות טפיליותבנות 30. יתר על כן, אם לזחלים המהונדסים יש ביטוי מערך ללא אינטגרציה גנומית, הם לא ייצרו את הצאצאים המבטאים טרנסגנים הנדרשים כדי להדביק פונדקאי גרביל שני. כדי להגדיל את הסיכוי שמספר מספיק של זחלים משולבי גנום יהפכו למבוגרים טפיליים רבייתיים, מומלץ לפחות 400-500 זחלים מהונדסים באינוקולום הראשוני. ייתכן שניתן יהיה להפחית את מספר הזחלים הנדרשים לביסוס זיהום פטנט על ידי טיפול בגרבילים עם פרדניזון30. עם זאת, סביר להניח שיהיה קשה לצבור מספיק תולעים מהונדסות או מוטנטיות משולבות כדי לבסס בהצלחה קו יציב של S. stercoralis. עם זאת, בדרך כלל ניתן לצבור מספר מספיק של זחלי S. stercoralis F1 מהונדסים עבור מבחני תולעים בודדות14,15.

ל-Strongyloides ratti יש את היתרון המובהק של ההיתכנות הגדולה יותר של יצירת קווים מהונדסים או נוקאאוט יציבים 17,31. S. ratti נקבות בוגרות החיות בחופשיות סובלניות פחות לתהליך המיקרו-זירה מאשר נקבות בוגרות S. stercoralis שחיות בחופשיות; נקבות S. ratti מייצרות בדרך כלל פחות זחלים כוללים מאשר נקבות S. stercoralis, וגם קצב הטרנספורמציה נמוך יותרמ-31. עם זאת, רק כמה זחלי F1 מהונדסים או נוקאאוט נדרשים כדי ליצור קו יציב של S. ratti. מכיוון ש- S. ratti הוא טפיל טבעי של חולדות, רק זחלים נגועים בודדים של S. ratti מספיקים כדי לבסס זיהום פטנט32. לכן, בדרך כלל ניתן לצבור מספר מספיק של זחלים מהונדסים או מוטנטיים כדי ליצור קו יציב. מאחר שמיני סטרונגילואידים לא יבטאו מערכים חוץ-כרומוזומליים מעבר לדור F1, רק זחלי F1 המשולבים בגנום יכולים לייצר קו מהונדס יציב13. בדרך כלל אי אפשר לזהות תולעים עם טרנסגנים משולבים לפני גנוטיפ, ולכן הפרוטוקול הוא לאסוף את כל זחלי F1 המהונדסים ולהזריק אותם לחולדה. אחוז קטן מהזחלים הללו יזכה לאירוע האינטגרציה הרצוי; זחלים אלה יהוו את הבסיס לקו היציב. מכיוון ששיטת piggyBac גורמת לעתים קרובות ליותר מאירוע אינטגרציה אחד בכל תולעת בודדת, כמעט 100% העברה של הטרנסגן יכולה להיות מושגת לאחר כמה סבבים של זחלים מהונדסים חולדה דרך חולדה17.

לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי ליצור מהונדסים או נוקאאוט S. stercoralis ו- S. ratti. זה מאפשר למגוון רחב של ניסויים פוטנציאליים, כולל אך לא מוגבל לביטוי הספציפי לתא של טרנסגנים, יצירת מוטנטים ותיוג אנדוגני של חלבונים כדי לקבוע פונקציות מרחביות וטמפורליות 14,15,29,33,34,35. בטווח הארוך, ניתן להשתמש בידע שנצבר מהשימוש ב-Strongyloides מהונדסים כדי לפתח אסטרטגיות חדשות למאבק בזיהומים אנושיים באמצעות S. stercoralis ונמטודות טפיליות אחרות במעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

pPV540 ו- pPV402 היו מתנות חביבות מד"ר ג'יימס לוק מאוניברסיטת פנסילבניה. אנו מודים לאסטרה בראיינט על הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי חוקרי קרן בורוז-וולקום בפרס הפתוגנזה של מחלות, פרס חוקר הפקולטה של המכון הרפואי ע"ש הווארד יוז, והמכונים הלאומיים לבריאות R01 DC017959 (E.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid Sigma-Aldrich N3876-5ML nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) VWR 470121-790 C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE Phenix RBA-500 agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh Ebonex n/a charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh Reade bonechar10x28 charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator Narishige MMN-1 coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Fisher 07-200-385 microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness Brain Research Lab 4860-1 coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter VWR 82050-918 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod Fisher 12-000-101 stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips VWR 89009-310 for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads Fisher 14-206-62 bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings Fisher 14-050CQ Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe McMaster-Carr 7541A51 glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-50ML halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD McMaster-Carr 3038K24 tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase VWR 89001-414 Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors Fisher 15-235-101 bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence Leica M165 FC GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder Tritech MINJ-4 microinjection needle holder
microINJECTOR system Tritech MINJ-1 microinjection system
Mongolian Gerbils Charles River Laboratories 213-Mongolian Gerbil gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz VWR 11216-776 Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh) Jo-Ann Fabrics zprd_14061949a nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch Thomas Scientific 1233S72 platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) VWR 62505-007 wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley Envigo 002 Hsd:Sprague Dawley SD rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office Depot 452369 plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches Newco 999589 techboard
Stainless steel raised wire floor Ancare R20SSRWF wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 Office Depot 9587303 spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm Carolina (Science) 741012 watch glasses (small, round)
Stereomicroscope Motic K-400 LED dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite Grainger 53GN16 plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller Sutter P-30/P needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses Fisher S34826 watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps Fisher 05-769-2Q funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator Narishige MM0-4 fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps Fisher S99422 Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) Tritech Research T3308P 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers VWR 82003-820 lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in Carolina (Science) 742300 watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter Fisher 09-805B filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter Fisher 09-805D filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in Fisher 50-821-813 glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade Office Depot 238816 X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1 Zeiss n/a inverted microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
  2. Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
  3. Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
  4. Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
  5. Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
  6. Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
  7. Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  9. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
  10. Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
  11. Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
  12. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  13. Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
  14. Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
  15. Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
  16. Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
  17. Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
  18. Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
  19. Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
  20. Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
  21. Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
  22. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  23. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
  24. Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
  25. Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
  26. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
  27. Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
  28. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  29. Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
  30. Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
  31. Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
  32. Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
  33. Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
  34. Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
  35. Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 176
יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים <em>סטרונגילואידים</em> על ידי מיקרו-אינטגרציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castelletto, M. L., Hallem, E. A.… More

Castelletto, M. L., Hallem, E. A. Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection. J. Vis. Exp. (176), e63023, doi:10.3791/63023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter