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Immunology and Infection

माइक्रोइंजेक्शन द्वारा स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों में ट्रांसजेनिक्स और नॉकआउट उत्पन्न करना

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63023
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

परजीवी नेमाटोड स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस और स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती के लिए कार्यात्मक जीनोमिक टूलकिट में ट्रांसजेनेसिस, सीआरआईएसपीआर / यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करेगा कि ट्रांसजेन और सीआरआईएसपीआर घटकों को एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती में पेश करने के लिए इंट्रागोनाडल माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कैसे किया जाए।

Abstract

जीनस स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में विभिन्न मेजबान श्रेणियों के साथ त्वचा-मर्मज्ञ नेमाटोड की कई प्रजातियां होती हैं, जिनमें स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस और स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती शामिल हैं। एस स्टरकोरलिस एक मानव-परजीवी, त्वचा-मर्मज्ञ सूत्रकृमि है जो लगभग 610 मिलियन लोगों को संक्रमित करता है, जबकि चूहा परजीवी एस रत्ती एस स्टरकोरलिस से निकटता से संबंधित है और अक्सर एस स्टरकोरलिस के लिए प्रयोगशाला मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। रत्ती दोनों इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन की बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड डिलीवरी तकनीक के माध्यम से ट्रांसजेनिक्स और नॉकआउट की पीढ़ी के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं, और इस तरह, अन्य परजीवी हेल्मिंथ के लिए मॉडल सिस्टम के रूप में उभरे हैं जो अभी तक इस तकनीक के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

परजीवी स्ट्रॉन्गिलॉइड्स वयस्क अपने मेजबान की छोटी आंत में निवास करते हैं और मल के माध्यम से पर्यावरण में संतान को छोड़ते हैं। एक बार पर्यावरण में, लार्वा मुक्त रहने वाले वयस्कों में विकसित होता है, जो मल में रहते हैं और संतान पैदा करते हैं जिन्हें एक नए मेजबान को ढूंढना और आक्रमण करना चाहिए। यह पर्यावरणीय पीढ़ी स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों के लिए अद्वितीय है और मॉडल मुक्त-जीवित सूत्रकृमि केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के लिए आकृति विज्ञान में काफी समान है कि सी एलिगेंस के लिए विकसित तकनीकों को इन परजीवी सूत्रकृमि के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन भी शामिल है। इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके, विभिन्न प्रकार के ट्रांसजेन को स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में पेश किया जा सकता है। कैस 9 घटकों को उत्परिवर्ती स्ट्रॉन्गिलॉइड्स लार्वा बनाने के लिए माइक्रोइंजेक्ट भी किया जा सकता है। यहां, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक, जिसमें मुक्त रहने वाले वयस्कों की तैयारी, इंजेक्शन प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक संतान का चयन शामिल है, का वर्णन किया गया है। कैस 9 उत्परिवर्तजन का उपयोग करके बनाए गए ट्रांसजेनिक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स लार्वा की छवियां शामिल हैं। इस पेपर का उद्देश्य अन्य शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती स्ट्रॉन्गिलॉइड्स बनाने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करने में सक्षम बनाना है।

Introduction

स्ट्रॉन्गाइलॉइड्स स्टरकोरलिस को लंबे समय से अधिक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त हुकवर्म और राउंडवॉर्म एस्केरिस लुम्ब्रिकोइड्स की तुलना में एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ के रूप में अनदेखा किया गया है। कृमि के बोझ के पिछले अध्ययनों ने अक्सर एस स्टरकोरलिस के लिए सामान्य नैदानिक तरीकों की कम संवेदनशीलता के कारण एस स्टरकोरलिस के प्रसार को गंभीर रूप से कम करके आंका। हाल के वर्षों में, बेहतर नैदानिक उपकरणों के आधार पर महामारी विज्ञान के अध्ययन ने अनुमान लगाया है कि एस स्टरकोरलिस संक्रमण का वास्तविक प्रसार पहले की रिपोर्ट की तुलना में बहुत अधिक है, दुनिया भर में लगभग 610 मिलियन लोग2.

स्टरकोरलिस और अन्य स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियां, जिनमें बारीकी से संबंधित चूहा परजीवी और सामान्य प्रयोगशाला मॉडल एस रत्ती शामिल हैं, में एक असामान्य जीवन चक्र है जो प्रयोगात्मक जीनोमिक अध्ययनों के लिए फायदेमंद है क्योंकि इसमें परजीवी और मुक्त-जीवित (पर्यावरण) दोनों पीढ़ियां3 (चित्रा 1) शामिल हैं। विशेष रूप से, एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती दोनों एक एकल मुक्त रहने वाली पीढ़ी के माध्यम से चक्र कर सकते हैं। मुक्त रहने वाली पीढ़ी में पोस्ट-परजीवी लार्वा होते हैं जो मुक्त रहने वाले वयस्क पुरुषों और महिलाओं में विकसित होते हैं; मुक्त रहने वाले वयस्कों की सभी संतान संक्रामक लार्वा में विकसित होती हैं, जिन्हें जीवन चक्र को जारी रखने के लिए एक मेजबान को संक्रमित करना चाहिए। इसके अलावा, इस पर्यावरणीय या मुक्त रहने वाली पीढ़ी को प्रयोगशाला में प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। क्योंकि मुक्त रहने वाले स्ट्रॉन्गिलॉइड्स वयस्क और सी एलिगेंस वयस्क समान आकृति विज्ञान साझा करते हैं, इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन जैसी तकनीकें जो मूल रूप से सी एलिगेंस के लिए विकसित की गई थीं, उन्हें मुक्त रहने वाले वयस्क स्ट्रॉन्गिलॉइड्स 4,5 के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि डीएनए को आम तौर पर मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं में पेश किया जाता है, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स के पुरुषों और महिलाओं दोनों को माइक्रोइंजेक्ट किया जा सकता है6. इस प्रकार, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स के जीव विज्ञान के कई पहलुओं से पूछताछ करने के लिए कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण उपलब्ध हैं। अन्य परजीवी सूत्रकृमि में मुक्त रहने वाली पीढ़ी की कमी होती है, और परिणामस्वरूप, कार्यात्मक जीनोमिकतकनीकों के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं होते हैं 3.

Figure 1
चित्र 1: स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस जीवन चक्र। स्टरकोरलिस परजीवी मादाएं अपने स्तनधारी मेजबानों (मनुष्य, गैर-मानव प्राइमेट, कुत्तों) की छोटी आंत में निवास करती हैं। परजीवी मादाएं पार्थेनोजेनेसिस द्वारा प्रजनन करती हैं और छोटी आंत के भीतर अंडे देती हैं। अंडे मेजबान के अंदर पोस्ट-परजीवी लार्वा में अभी भी हैच करते हैं, जो तब मल के साथ पर्यावरण में पारित होते हैं। यदि पोस्ट-परजीवी लार्वा नर हैं, तो वे मुक्त रहने वाले वयस्क पुरुषों में विकसित होते हैं। यदि पोस्ट-परजीवी लार्वा मादा हैं, तो वे या तो मुक्त-जीवित वयस्क महिलाओं (अप्रत्यक्ष विकास) या तीसरे चरण के संक्रामक लार्वा (आईएल 3 एस; प्रत्यक्ष विकास) में विकसित हो सकते हैं। मुक्त रहने वाले नर और मादा संतान बनाने के लिए यौन प्रजनन करते हैं जो आईएल 3 बनने के लिए विवश होते हैं। कुछ शर्तों के तहत, एस स्टरकोरलिस भी ऑटोइंफेक्शन से गुजर सकता है, जिसमें कुछ पोस्ट-परजीवी लार्वा मल में पर्यावरण में जाने के बजाय मेजबान आंत के अंदर रहते हैं। ये लार्वा मेजबान के अंदर ऑटोइंफेक्टिव लार्वा (एल 3 ए) में विकसित हो सकते हैं, आंतों की दीवार के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं, शरीर के माध्यम से पलायन कर सकते हैं, और अंततः प्रजनन वयस्क बनने के लिए आंत में लौट सकते हैं। एस रत्ती का जीवन चक्र समान है, सिवाय इसके कि एस रत्ती चूहों को संक्रमित करता है और इसमें एक ऑटोइंफेक्टिव चक्र नहीं होता है। पर्यावरण यी पीढ़ी आनुवंशिक अध्ययन के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं (पी0) को माइक्रोइंजेक्ट किया जा सकता है; उनकी संतान, जो सभी आईएल 3 एस बन जाएंगी, संभावित एफ1 ट्रांसजेनिक्स हैं। इस आंकड़े को कास्टेलेटो एट अल से संशोधित किया गया है। 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टरकोरलिस मेजबान आक्रमण और मेजबान प्रतिरक्षा मॉडुलन सहित अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मानव-परजीवी नेमाटोड के साथ अपने जीव विज्ञान के कई पहलुओं को साझा करता है। उदाहरण के लिए, जेनेरा नेकेटर और एन्सिलोस्टोमा में मानव-परजीवी हुकवर्म भी त्वचा के प्रवेश से संक्रमित होते हैं, शरीर के माध्यम से समान रूप से नेविगेट करते हैं, और अंततः छोटी आंत में परजीवी वयस्कों के रूप में रहते हैं7. इस प्रकार, कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल नेमाटोड संभवतः सामान्य संवेदी व्यवहार और प्रतिरक्षा अपवंचन तकनीकों का उपयोग करते हैं। नतीजतन, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स से प्राप्त ज्ञान अन्य कम आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल नेमाटोड में निष्कर्षों का पूरक होगा और इन जटिल और महत्वपूर्ण परजीवियों की अधिक पूर्ण समझ का कारण बनेगा।

यह माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती संतान बनाने के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं में डीएनए पेश करने की विधि को रेखांकित करता है। माइक्रोइंजेक्शन के लिए वयस्क कीड़े के विकास के समय और ट्रांसजेनिक संतानों के संग्रह सहित तनाव रखरखाव आवश्यकताओं का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल और पूर्ण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन, संवर्धन और स्क्रीनिंग ट्रांसजेनिक संतान के लिए प्रोटोकॉल के साथ, सभी आवश्यक उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों की सूची के साथ शामिल हैं।

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Protocol

नोट: गेरबिल्स का उपयोग एस स्टरकोरलिस को पारित करने के लिए किया गया था, और चूहों का उपयोग एस रत्ती को पारित करने के लिए किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को यूसीएलए पशु अनुसंधान निरीक्षण कार्यालय (प्रोटोकॉल नंबर 2011-060-21 ए) द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो एएएएलएसी मानकों और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड का पालन करता है। निम्नलिखित कार्यों को माइक्रोइंजेक्टिंग से कम से कम एक दिन पहले पूरा किया जाना चाहिए: कृमि संवर्धन, माइक्रोइंजेक्शन पैड तैयार करना, माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण के लिए निर्माण बनाना, और 6 सेमी नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर बैक्टीरिया (ई कोलाई एचबी 101) फैलाना8. मुक्त रहने वाली महिलाओं को माइक्रोइंजेक्ट किए जाने से पहले युवा वयस्कों में विकसित होने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 24 घंटे पोस्ट-फेकल संग्रह की आवश्यकता होती है। माइक्रोइंजेक्शन पैड पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। बैक्टीरियल प्लेटों को सूखना चाहिए और एक छोटा लॉन स्थापित करना चाहिए।

1. माइक्रोइंजेक्शन स्लाइड की तैयारी: इंजेक्शन लगाने से कम से कम एक दिन पहले

नोट: कीड़े इंजेक्शन के लिए सूखे अगर पैड के साथ माइक्रोइंजेक्शन कवरलिप्स पर घुड़सवार हैं।

  1. 90 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्मी ब्लॉक सेट करें।
  2. डीडीएच2ओ के 5 मिलीलीटर जोड़ें, फिर बोरोसिलिकेट ग्लास ट्यूब में 100 मिलीग्राम एगरोज जोड़ें।
  3. एगरोज़ मिश्रण को एक आंच पर ट्यूब में गर्म करें जब तक कि एगरोज़ भंग न हो जाए।
  4. तरल अवस्था में एगरोज को बनाए रखने के लिए ट्यूब को 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीट ब्लॉक में रखें।
  5. एक ग्लास पाश्चर पिपेट या प्लास्टिक टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके कवरस्लिप पर एगरोज़ समाधान के ~ 180 μL ड्रॉप करें। तुरंत एक पतली पैड में एगरोज़ को समतल करने के लिए शीर्ष पर एक दूसरा कवरस्लिप छोड़ दें।
  6. 5-10 सेकंड के बाद, दोनों को अलग करके शीर्ष कवरस्लिप को हटा दें। निर्धारित करें कि अगर पैड किस स्लाइड पर है और इसे चेहरे पर रखें।
  7. एक टूटी हुई कवरस्लिप से ग्लास शार्ड का एक छोटा टुकड़ा चुनें और धीरे संदंश (पूरक चित्रा एस 1) का उपयोग कर पैड के शीर्ष किनारे के पास अगर में इसे दबाएं।
  8. एगरोज़ समाधान के साथ माइक्रोइंजेक्शन पैड बनाना जारी रखें।
  9. बेंच पर या ओवन में रात भर एगरोज़ पैड को सुखाएं। कवरस्लिप बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: एगरोज़ पैड का उपयोग 2 महीने तक किया जा सकता है लेकिन केवल एक इंजेक्शन रन के लिए उपयोग किया जाता है।

2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए कीड़े प्राप्त करने के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स की खेती: इंजेक्शन से 1 - 2 दिन पहले

नोट: एक तनाव रखरखाव प्रोटोकॉल पूरक सामग्री में पाया जा सकता है, जिसमें संक्रमित जानवरों के मल से नेमाटोड और फसल नेमाटोड के साथ गेरबिल और चूहों को संक्रमित करने का विस्तृत विवरण शामिल है।

  1. इंजेक्शन के दिन से दो दिन पहले, संक्रमित जानवरों को रात भर संग्रह पिंजरों में 9,10 रखें।
  2. अगली सुबह, संक्रमित मल इकट्ठा करें और फेकल-चारकोल प्लेटें 9,10 बनाएं।
  3. मुक्त रहने वाले कीड़े को युवा वयस्कों में विकसित करने की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लेट रखें।
  4. इंजेक्शन के दिन से पहले की रात, संग्रह पिंजरों में असंक्रमित मेजबान जानवरों को रखें।
  5. इंजेक्शन के दिन, इंजेक्शन के बाद की खेती के लिए बिना संक्रमित मल इकट्ठा करें।

3. माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण बनाना: इंजेक्शन से पहले या उस दिन

नोट: माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण में कृमि बफर खारा (बीयू) (50 एमएम एनए 2 एचपीओ 4,22एमएम केएच2पीओ 4, 70 एमएम एनएसीएल) 11 में वांछित एकाग्रता के लिए पतला ब्याज के प्लास्मिड होते हैं।

  1. प्लास्मिड स्टॉक की एकाग्रता और माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण (तालिका 1) में वांछित एकाग्रता का निर्धारण करें।
माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण: रिपोर्टर निर्माण
घटक स्टॉक एकाग्रता राशि अंतिम एकाग्रता
पीएमएलसी 30 जीपीए -3:: जीएफपी 300 एनजी/μL 1.7 μL 50 एनजी/μL
बू ना 8.3 μL ना
कुल 10 μL 50 एनजी/μL
माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण: सीआरआईएसपीआर /
घटक स्टॉक एकाग्रता राशि अंतिम एकाग्रता
पीएमएलसी 47 टैक्स -4 एसजीआरएनए 300 एनजी/μL 2.7 μL 80 एनजी/μL
पीई 11 एसएस-टैक्स -4 एचडीआर प्लास्मिड 400 एनजी/μL 2.0 μL 80 एनजी/μL
पीपीवी 540 एसआरसीएएस 9 प्लास्मिड 350 एनजी/μL 1.1 μL 40 एनजी/μL
बू ना 4.2 μL ना
कुल 10 μL 200 एनजी/μL
माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण: गुल्लक एकीकरण
घटक स्टॉक एकाग्रता राशि अंतिम एकाग्रता
पीएमएलसी 30 जीपीए 3:: जीएफपी 300 एनजी/μL 2.0 μL 60 एनजी/μL
पीपीवी 402 ट्रांसपोसेस प्लास्मिड 450 एनजी/μL 0.9 μL 40 एनजी/μL
बू ना 7.1 μL ना
कुल 10 μL 100 एनजी/μL

तालिका 1: माइक्रोइंजेक्शन मिक्स के उदाहरण। तीन उदाहरण माइक्रोइंजेक्शन मिक्स के लिए प्लास्मिड और सांद्रता: एक जीपीए -3 के लिए: जीएफपी रिपोर्टर निर्माण10, एसएस-टैक्स -4 लोकस14,15 के सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता व्यवधान के लिए एक, और एसएस-जीपीए -3 के गुल्लक-मध्यस्थता एकीकरण के लिए एक:: जीएफपी निर्माण 13,17,18। स्ट्रैकस 9 स्ट्रॉन्गिलॉइड्स कोडन-अनुकूलित कैस 9 जीन को दर्शाता है। सूचीबद्ध अंतिम सांद्रता आमतौर पर स्ट्रॉन्गिलॉइड्स माइक्रोइंजेक्शन मिक्स में उपयोग की जाती है।

  1. बीयू में प्लास्मिड को 10-20 μL की कुल मात्रा में पतला करें।
  2. 1-2 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर एक फिल्टर कॉलम के माध्यम से मिश्रण स्पिन।
  3. माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण का तुरंत उपयोग करें या भविष्य के उपयोग के लिए इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. माइक्रोइंजेक्शन के लिए युवा वयस्क स्ट्रॉन्गिलॉइड्स इकट्ठा करें: इंजेक्शन दिन की सुबह

  1. युवा वयस्क स्ट्रॉन्गिलॉइड्स (चित्रा 2) के 1 फेकल-चारकोल प्लेट के साथ बेयरमैन तंत्र स्थापित करें।
    नोट: फेकल-चारकोल प्लेट में कुछ संक्रामक लार्वा हो सकते हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण में एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और आंखों की सुरक्षा होती है। दस्ताने और प्रयोगशाला कोट की आस्तीन के बीच कोई त्वचा उजागर नहीं की जानी चाहिए।

Figure 2
चित्रा 2: संस्कृतियों से परजीवी कीड़े इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बेर्मन तंत्र10. फेकल-चारकोल प्लेट की सामग्री को गर्म पानी के स्तंभ के शीर्ष पर रखा जाता है। कीड़े पानी में चले जाते हैं और फ़नल के तल पर इकट्ठा होते हैं। (ए) बेयरमैन तंत्र स्थापित करने के लिए, बेर्मन फ़नल के लिए स्टैंड को सी-क्लैंप के साथ बेंच पर क्लैंप किया जाता है। फ़नल के अंत से जुड़ी एक रबर ट्यूब को चुटकी क्लैंप के साथ बंद कर दिया जाता है, और ड्रिप के लिए ट्यूब के नीचे एक कैच बाल्टी रखी जाती है। ग्लास फ़नल में गर्म पानी डाला जाता है। (बी) फेकल-चारकोल मिश्रण के लिए प्लास्टिक की अंगूठी धारक को प्रयोगशाला ऊतकों (बाएं) के 3 टुकड़ों के साथ पंक्तिबद्ध किया जाता है। एक लकड़ी की छड़ी या जीभ अवसादक (मध्य) का उपयोग फेकल-चारकोल प्लेट (दाएं) की सामग्री को प्लास्टिक की अंगूठी धारक में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। (सी) फेकल-लकड़ी का कोयला मिश्रण के लिए प्लास्टिक की अंगूठी धारक के तल का क्लोज-अप, धारक के नीचे अस्तर नायलॉन ट्यूल की डबल परत दिखा रहा है। (डी) फेकल-चारकोल धारक को तब ग्लास फ़नल के शीर्ष पर रखा जाता है। (ई) प्रयोगशाला ऊतक पानी से गीला हो जाता है और फेकल-चारकोल मिश्रण पर बंद हो जाता है। ज्यादातर फेकल-चारकोल को डुबोने के लिए अधिक गर्म पानी जोड़ा जाता है। (एफ) पूर्ण बेयरमैन सेटअप, गर्म पानी के नीचे डूबे फेकल-चारकोल संस्कृति के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एक ओ-रिंग का उपयोग करके रिंग स्टैंड पर रबर कलेक्शन ट्यूबिंग के साथ एक ग्लास फ़नल स्थापित करें और इसे क्लैंप के साथ सुरक्षित करें। 2 चुटकी क्लैंप (चित्रा 2 ए) के साथ संग्रह ट्यूबिंग बंद करें।
  2. ड्रिप को पकड़ने के लिए फ़नल के नीचे एक कैच बाल्टी रखें।
  3. रिम के नीचे 5 सेमी तक फ़नल में गर्म (लगभग 40 डिग्री सेल्सियस) पानी जोड़ें। सत्यापित करें कि सिस्टम लीक नहीं हो रहा है।
  4. बेयरमैन धारक को लाइन करें, 2 प्लास्टिक के छल्ले से बनी एक छलनी जिसमें नायलॉन ट्यूल नेटिंग की 2 परतें हैं, उनके बीच सुरक्षित हैं, प्रयोगशाला ऊतक के 3 अतिव्यापी टुकड़े हैं। बेर्मन धारक (चित्रा 2 बी, सी) में फेकल-लकड़ी का कोयला मिश्रण जोड़ें।
  5. फ़नल में फेकल-चारकोल मिश्रण के साथ बेर्मन धारक रखें। फेकल-चारकोल मिश्रण के चारों ओर ऊतकों को मोड़ो और अधिकांश फेकल-लकड़ी का कोयला जलमग्न करने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें। फ़नल (चित्रा 2 डी, ई) के रिम से 2 सेमी से ऊपर न भरें।
  6. गंध को शामिल करने के लिए 15 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन के साथ फ़नल को ऊपर रखें। आवश्यकतानुसार फ़नल लेबल करें (चित्रा 2 एफ)।
  7. बेर्मन तंत्र से कीड़े इकट्ठा करने के लिए 30 मिनट से 1 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  8. फ़नल के तल पर रबर ट्यूबिंग के नीचे 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पकड़ो। 50 मिलीलीटर ट्यूब में कीड़े युक्त 30-40 मिलीलीटर पानी वितरित करने के लिए नीचे क्लैंप को सावधानीपूर्वक खोलें।
  9. कीड़े युक्त बेर्मन पानी के 15 मिलीलीटर को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। ~ 750 × ग्राम (धीमी गति से) पर 1 मिनट के लिए 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब स्पिन। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को गुरुत्वाकर्षण को 10-15 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  10. सतह पर तैरनेवाला ~ 2 एमएल के लिए निकालें और किसी भी कीड़े को मारने के लिए आयोडीन के साथ एक अपशिष्ट तरल कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. 15 एमएल संग्रह ट्यूब में अधिक बेर्मन पानी जोड़ें और स्पिन दोहराएं। ~ 2 एमएल के लिए सतह पर तैरनेवाला निकालें और चरण 4.11 के रूप में त्यागें।
  12. चरण 4.11 और 4.12 दोहराएं जब तक कि सभी कीड़े 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र नहीं किए जाते। अंतिम स्पिन के बाद, जितना संभव हो उतना पानी निकालें।
  13. ट्यूब के तल पर कीड़े (40-100 μL) की गोली का निरीक्षण करें। यदि कोई कीड़े दिखाई नहीं देते हैं, तो एक और 1-2 घंटे की प्रतीक्षा करें और बेर्मन तंत्र से अधिक कीड़े इकट्ठा करने का प्रयास करें।
  14. ई कोलाई एचबी 101 के लॉन के साथ 6 सेमी 2% एनजीएम प्लेट में जितना संभव हो उतना कम पानी में कीड़े स्थानांतरित करें। माइक्रोइंजेक्शन के लिए स्रोत प्लेट के रूप में इस प्लेट का उपयोग करें।
  15. पतला आयोडीन (पानी में लुगोल के आयोडीन का 50% कमजोर पड़ने) के साथ इलाज करके फेकल-चारकोल मिश्रण को त्यागें, इसे ड्रिप पकड़ने के लिए प्लास्टिक की फिल्म में लपेटें, और इसे बायोहाज़र्ड अपशिष्ट कंटेनर में रखें।
  16. कैच बाल्टी में 10 मिलीलीटर पतला आयोडीन जोड़ें और इसमें बेर्मन से अतिरिक्त पानी निकालें।
  17. पुन: प्रयोज्य घटकों (फ़नल, कैच बाल्टी, ट्यूल के साथ प्लास्टिक धारक, प्लास्टिक ढक्कन और क्लैंप) को 10% ब्लीच के साथ धो लें और अच्छी तरह से कुल्ला करें।

5. माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचना और लोड करना: इंजेक्शन से ठीक पहले

  1. सुई खींचने वाले का उपयोग करके ग्लास केशिका ट्यूबों को खींचकर माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को तैयार करें।
    नोट: 3 मिमी प्लैटिनम/इरिडियम फिलामेंट से लैस एक वाणिज्यिक सुई खींचने वाले के लिए उदाहरण सेटिंग्स हीट = 810-820, पुल = 800-820, माइक्रोमीटर = 2.5 हैं।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत युक्तियाँ देखें। यदि सुइयों में वांछित आकार (चित्रा 3 ए-एफ) है, तो 4-6 सुइयों (2-3 केशिका ट्यूब) खींचें। उचित सुई आकार प्राप्त करने के लिए, आवश्यकतानुसार सेटिंग्स बदलें: हीट या पुल सेटिंग्स को 10 तक समायोजित करें और नई सुइयों को तब तक खींचें जब तक कि टेपर और शाफ्ट का आकार अधिक उपयुक्त न हो।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोइंजेक्शन सुइयों और माइक्रोइंजेक्शन के लिए इष्टतम साइटों के साथ एक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस वयस्क महिला की पहचान की गई। (ए-बी) शाफ्ट टेपर (ए) और एक सुई की नोक (बी) जो माइक्रोइंजेक्शन के लिए सही ढंग से आकार का है। टिप छल्ली को छेदने के लिए पर्याप्त तेज है और अत्यधिक नुकसान का कारण नहीं बनने के लिए पर्याप्त संकीर्ण है। (सी-डी) शाफ्ट टेपर (सी) और माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक (डी) जो माइक्रोइंजेक्टिंग के लिए गलत तरीके से आकार दिया गया है। टिप बहुत कुंद और चौड़ी है, और कीड़े को अत्यधिक नुकसान पहुंचाएगी। (ई-एफ) शाफ्ट टेपर (ई) और एक सुई की नोक (एफ) जो माइक्रोइंजेक्शन के लिए काम करने के लिए बहुत लंबी और पतली होने की संभावना है। एफ में टिप डी में टिप के समान है। हालांकि, शाफ्ट छल्ली को प्रभावी ढंग से छेदने के लिए संकीर्ण और बहुत लचीला है। इसके अलावा, बहुत पतली सुइयां आसानी से चिपक जाती हैं। (जी) माइक्रोइंजेक्शन के लिए सही ढंग से तैनात पूरे कीड़े की एक छवि, यह मानते हुए कि सुई दाईं ओर से आ रही है। पूर्वकाल नीचे और बाईं ओर है; वल्वा को तीरहेड द्वारा इंगित किया जाता है। गोनाड मादा के दाईं ओर दिखाई देता है। इस मादा के गर्भाशय में केवल एक अंडा होता है (तारांकन चिह्न द्वारा इंगित)। (एच, आई) माइक्रोइंजेक्शन साइटों के आवर्धित दृश्य। तीर का कोण इंजेक्शन सुई के कोण का अनुमान लगाता है। वल्वा को लैंडमार्क के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; यह गोनाड की बाहों से कीड़े के विपरीत तरफ है। आंत के चारों ओर गोनाड वक्र की भुजाएं, और विभाजित नाभिक के साथ छोर वल्वा के विपरीत होते हैं। (एच) गोनाड की पीछे की भुजा; (I) पूर्वकाल भुजा। या तो या दोनों हाथों को इंजेक्ट किया जा सकता है। एच, आई के लिए, सम्मेलन जी में हैं। स्केल सलाखों = 50 μm (बी, डी, एफ, एच, मैं); 100 μm (ए, सी, ई, जी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. सुइयों को सुरक्षित करने और युक्तियों पर धूल संचय से बचने के लिए लुढ़का हुआ टेप के एक टुकड़े के साथ 15 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश में खींची गई सुइयों को स्टोर करें।
  2. शाफ्ट के खुले छोर पर माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण की 0.7 μL बूंद रखें। 10 मिनट के भीतर मिश्रण के साथ पतला शाफ्ट भरने के लिए टेप के एक लुढ़का हुआ टुकड़ा का उपयोग कर एक शेल्फ के लिए लंबवत सुई लटका। पहली बार काम नहीं करने की स्थिति में एक बार में 2 सुइयों को तैयार करें।

6. माइक्रोस्कोप तैयार करना और सुई को तोड़ना

नोट: माइक्रोइंजेक्शन सुई के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर सेटअप से लैस 5x और 40x उद्देश्यों के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है। कंपन शोर को कम करने के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप को भारी टेबल या एंटी-कंपन एयर टेबल पर रखा जाना चाहिए। माइक्रोइंजेक्टर सुई धारक नाइट्रोजन गैस से जुड़ा हुआ है जो माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण देने के लिए आवश्यक दबाव लागू करता है। कीड़े को स्थानांतरित करने के लिए पास में एक छोटा विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है।

  1. सुई को तोड़ने के लिए गैस टैंक दबाव ~ 40-60 पीएसआई और तरल प्रवाह के आधार पर माइक्रोइंजेक्टिंग के लिए ~ 30-50 पीएसआई पर सेट करें।
  2. विदारक माइक्रोस्कोप पर, एक मानक प्लैटिनम वर्म पिक का उपयोग करके हेलोकार्बन तेल के साथ माइक्रोइंजेक्शन पैड कवरस्लिप पर ग्लास के शार्ड को कवर करें।
  3. माइक्रोइंजेक्शन पैड कवरस्लिप को माइक्रोइंजेक्शन स्कोप पर रखें और तेल में ढके ग्लास के शार्ड का पता लगाएं। ग्लास शार्ड को इस तरह संरेखित करें कि सुई को तोड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली सतह के रूप में सेवा करने के लिए एक किनारा सुई की दिशा में लंबवत हो।
  4. सत्यापित करें कि सुई विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पतला शाफ्ट में कोई बुलबुले या मलबे है। फिर, दबाव धारक में सुई 1-1.5 सेमी सुरक्षित करें।
  5. आंख से देखने के सूक्ष्मदर्शी क्षेत्र के केंद्र में सुई की नोक की स्थिति। फिर कम आवर्धन के तहत, सुई की नोक को देखने के क्षेत्र में रखें, ग्लास शार्ड के किनारे लंबवत।
  6. उच्च शक्ति पर स्विच करें और सुई की नोक को कांच के किनारे के साथ संरेखित करें, पास लेकिन इसे स्पर्श न करें।
    नोट: जब खींचा जाता है, तो सुइयों को बंद कर दिया जाता है।
  7. तरल प्रवाह की अनुमति देने के लिए सुई की नोक को तोड़ने के लिए, गैस (पूरक चित्रा एस 1) से निरंतर दबाव लागू करते समय धीरे-धीरे इसे कांच के टुकड़े के किनारे टैप करें। एक बार जब तरल प्रवाह शुरू हो जाता है, तो टिप के आकार की जांच करें और सुनिश्चित करें कि यह आसानी से बहने वाले तरल के साथ तेज है।
    नोट: यदि तरल बहुत तेजी से बह रहा है या अंत बहुत कुंद है, तो कीड़े माइक्रोइंजेक्शन (वीडियो 1 और चित्रा 3 ए-एफ) के दौरान क्षतिग्रस्त हो जाएंगे।
  8. जब तरल सुई से अच्छी तरह से बह रहा है, तो माइक्रोइंजेक्शन स्लाइड को विदारक दायरे में ले जाएं और कीड़े के प्लेसमेंट के लिए अगर पैड पर 1-2 μL हेलोकार्बन तेल की बूंदें रखें।
  9. अतिरिक्त सतह बैक्टीरिया को हटाने और माइक्रोइंजेक्शन के लिए एकल कीड़े का चयन करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए बैक्टीरिया के बिना 2% एनजीएम प्लेट में 20-30 युवा वयस्क स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्थानांतरित करें। इंजेक्शन लगाते समय आवश्यकतानुसार एनजीएम प्लेट में अधिक कीड़े जोड़ें।

7. माइक्रोइंजेक्टिंग स्ट्रॉन्गाइलॉइड्स

  1. बैक्टीरिया के बिना 2% एनजीएम प्लेट से उसके गोनाड में 1-4 अंडे के साथ एक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स युवा वयस्क मादा का चयन करने के लिए एक कृमि पिक पर हेलोकार्बन तेल की एक छोटी मात्रा का उपयोग करें।
  2. अगर पैड पर तेल की एक छोटी बूंद में कीड़े को स्थानांतरित करें। कृमि पिक का उपयोग करके, धीरे-धीरे कृमि की स्थिति रखें ताकि यह कुंडलित न हो और गोनाड दिखाई दे और पहुंचने में आसान हो। गोनाड (चित्रा 3 जी) की दिशा पर ध्यान दें।
  3. देखने के माइक्रोइंजेक्शन माइक्रोस्कोप क्षेत्र में कृमि की स्थिति। सुनिश्चित करें कि गोनाड सुई के समान तरफ है और तैनात है ताकि सुई मामूली कोण (चित्रा 3 एच, आई) पर गोनाड से संपर्क करेगी।
  4. सुई की नोक को एक ही फोकल प्लेन में कीड़े के किनारे पर लाएं। कीड़े के बीच के पास गोनाड बांह के लिए निशाना लगाओ। गोनाड (वीडियो 2) में सुई को धीरे से सम्मिलित करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करें।
  5. डीएनए समाधान के साथ पूरे गोनाड हाथ को धीरे से भरने के लिए सुई पर तुरंत दबाव लागू करें। आंखों से निर्धारित करें कि पर्याप्त तरल पदार्थ कब इंजेक्ट किया गया है (वीडियो 2)।
    नोट: गोनाड को भरने में 2 एस तक का समय लग सकता है।
  6. सुई निकालें और यह निर्धारित करने के लिए जांचें कि घाव बंद हो जाता है।
    नोट: कीड़ा संतान पैदा करने के लिए बहुत क्षतिग्रस्त है यदि गोनाड शरीर की दीवार (पूरक वीडियो एस 1) के माध्यम से फैलता है।
  7. यदि यह दिखाई दे रहा है तो गोनाड के दूसरे हाथ से दोहराएं।
  8. इंजेक्शन समाप्त होने पर, जल्दी से सत्यापित करें कि अगर पैड पर सुई की नोक के साथ दबाव डालकर सुई भरी नहीं है। विदारक माइक्रोस्कोप के लिए इंजेक्शन कीड़े के साथ स्लाइड स्थानांतरण।
  9. इंजेक्शन कीड़े को ठीक करने के लिए, पहले अगर पैड से तैरने के लिए कीड़े पर बीयू की कुछ बूंदें रखें।
  10. एक कृमि पिक पर एचबी 101 बैक्टीरिया की एक छोटी राशि इकट्ठा करें। तरल से इसे हटाने के लिए कृमि पिक पर अनुयायी बैक्टीरिया के साथ कीड़े को स्पर्श करें।
  11. धीरे-धीरे कीड़े को रिकवरी प्लेट में स्थानांतरित करें, एक 2% एनजीएम प्लेट जिसमें एचबी 101 लॉन होता है।
    नोट: कीड़ा मिनटों के भीतर रेंगना शुरू करना चाहिए।
  12. कुछ मादाओं को इंजेक्शन दिए जाने के बाद, स्रोत प्लेट से कुछ बिना इंजेक्शन वाले पुरुषों को जोड़ें।
    नोट: पांच महिलाओं के लिए कम से कम एक पुरुष एक अच्छी आधार रेखा है; पुरुषों की अधिकता को प्राथमिकता दी जाती है।
  13. प्रयोग के लिए पर्याप्त महिलाओं को इंजेक्शन दिए जाने तक सभी चरणों को दोहराएं।
  14. कीड़े को ठीक करने और संभोग करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के बाद इंजेक्शन के लिए वसूली प्लेट पर वयस्कों को छोड़ दें।

8. इंजेक्शन स्ट्रॉन्गिलॉइड्स की वसूली और संवर्धन

  1. संक्रमित जानवरों के लिए के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर, असंक्रमित मेजबान जानवरों से रात भर मल ले लीजिए।
  2. लकड़ी का कोयला की एक छोटी मात्रा (इन प्लेटों के लिए लगभग 2 से 1 के लकड़ी का कोयला अनुपात) के साथ बिना संक्रमित मल को मिलाएं।
  3. नम फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध 6 सेमी पेट्री डिश में फेकल-चारकोल मिश्रण की एक छोटी मात्रा डालें। सुनिश्चित करें कि मिश्रण पकवान के ढक्कन को स्पर्श नहीं करता है।
  4. बीयू के साथ रिकवरी प्लेट को बाढ़ दें 3 μL पर एक पिपेट सेट का उपयोग करके, मल-लकड़ी का कोयला प्लेट में मल में कीड़े स्थानांतरित करें। कीड़े को सीधे मल पर रखें, लकड़ी के कोयले पर नहीं।
  5. सत्यापित करें कि वयस्क एक विदारक गुंजाइश का उपयोग करके फेकल-चारकोल प्लेट पर हैं।
  6. कीड़े संस्कृति के लिए, प्लेट को एक आर्द्र कक्ष में रखें, यानी, नम पेपर तौलिए के साथ रेखांकित एक तंग-फिटिंग ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक बॉक्स।
    नोट: 2 दिनों के बाद, लार्वा चरणों का मिश्रण होगा। 5 दिनों के बाद, अधिकांश लार्वा आईएल 3 एस में विकसित हो जाएंगे; कुछ छोटे लार्वा बने रहेंगे। 7 दिनों के बाद, सभी लार्वा आईएल 3 एस होना चाहिए।

9. ट्रांसजेनिक्स /नॉकआउट को पुनर्प्राप्त करने के लिए एफ 1 लार्वा एकत्र करना और स्क्रीनिंग करना

  1. एक बेयरमैन सेटअप का उपयोग करके, पोस्ट-इंजेक्शन छोटे पैमाने पर फेकल-चारकोल संवर्धन प्लेटों से लार्वा एकत्र करें। जितना संभव हो उतने लार्वा प्राप्त करने के लिए, बेर्मन तंत्र से कीड़े को ठीक करने से पहले कम से कम 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  2. चरण 4.10-4.14 के रूप में 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में लार्वा को केंद्रित करें और लार्वा को बीयू के साथ एक छोटी घड़ी के गिलास में स्थानांतरित करें।
  3. यदि लार्वा का उपयोग व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जाएगा, तो स्क्रीनिंग के लिए एचबी 101 के मोटे लॉन के साथ 2% एनजीएम प्लेटों का उपयोग करें।
    1. एचबी 101 लॉन में 20-30 लार्वा स्थानांतरित करें।
      नोट: बैक्टीरिया लार्वा के आंदोलन को धीमा कर देगा।
    2. प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ब्याज के ट्रांसजीन को व्यक्त करने वाले लार्वा की पहचान करें। ट्रांसजेनिक लार्वा का चयन करने के लिए एक कीड़ा पिक का उपयोग करें और उन्हें बीयू के साथ एक छोटी घड़ी के गिलास में ले जाएं।
    3. लार्वा के एक और छोटे बैच को स्क्रीन करने के लिए एक नई एचबी 101 प्लेट का उपयोग करें। जब प्रयोगात्मक उपयोग के लिए पर्याप्त लार्वा एकत्र किए जाते हैं, तो पतला आयोडीन (पानी में पतला 50% लुगोल का आयोडीन) के साथ एचबी 101 प्लेटों और अतिरिक्त कीड़े का इलाज करें और उन्हें बायोहाज़र्ड कचरे के रूप में त्याग दें। वैकल्पिक रूप से, अल्काइल बेंजिल अमोनियम क्लोराइड युक्त केंद्रित केनेल क्लीनर का उपयोग करके अतिरिक्त कीड़े को मार डालें।
    4. कीड़े का तुरंत उपयोग करें या उन्हें रात भर बीयू की थोड़ी मात्रा में उथले घड़ी के गिलास में छोड़ दें।
      नोट: यदि तरल बहुत गहरा है तो कीड़े हाइपोक्सिक हो सकते हैं। यह संभव है कि रात भर बीयू में लार्वा छोड़ने से कुछ व्यवहार प्रभावित हो सकते हैं; इसलिए, 6 घंटे के भीतर व्यवहार प्रयोगों के लिए लार्वा का उपयोग करें।
  4. यदि लार्वा का उपयोग माइक्रोस्कोपी के लिए किया जाएगा और व्यवहार परख नहीं, तो स्क्रीनिंग के लिए निकोटीन पक्षाघात द्वारा कीड़े को स्थिर करें।
    1. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, प्लेट पर कीड़े के स्थान का ट्रैक रखना आसान बनाने के लिए 10 सेमी केमोटैक्सिस प्लेट12 के प्लास्टिक तल पर एक ग्रिड स्कोर करें।
    2. ग्रिड पर एक वर्ग में बीयू में लार्वा के ~ 3 μL ड्रॉप। आवश्यकतानुसार कई वर्ग भरें। प्लेट के किनारों के पास वाले लोगों का उपयोग न करें, क्योंकि लार्वा प्लेट के किनारों पर क्रॉल कर सकता है।
    3. कृमि की बूंदों में पानी में 1% निकोटीन की 15-20 μL बूंदें जोड़ें।
      नोट: 4 मिनट के बाद, कीड़े लकवाग्रस्त हो जाएगा।
    4. एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कीड़े स्क्रीन।
    5. बीयू के 1-2 एमएल के साथ ट्रांसजेनिक लार्वा को एक छोटे घड़ी के गिलास में स्थानांतरित करने के लिए एक कृमि पिक का उपयोग करें।
      नोट: लार्वा कई घंटों के लिए लकवाग्रस्त हो जाएगा और माइक्रोस्कोपी के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर आसानी से घुड़सवार किया जा सकता है। यदि बीयू में रात भर छोड़ दिया जाता है, तो आईएल 3 एस ठीक हो जाएगा और इसका उपयोग कुछ परख या स्तनधारी मेजबान संक्रमण के लिए किया जा सकता है। हालांकि, निकोटीन पक्षाघात और बीयू में रात भर इनक्यूबेशन कुछ व्यवहारों को प्रभावित कर सकता है।

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Representative Results

यदि प्रयोग सफल रहा, तो एफ1 लार्वा ट्रांसजीन और / या ब्याज के उत्परिवर्ती फेनोटाइप (चित्रा 4) को व्यक्त करेगा। हालांकि, परिवर्तन दर अत्यधिक परिवर्तनशील हैं और निर्माण, कीड़े के स्वास्थ्य, इंजेक्शन संवर्धन के बाद की स्थिति और प्रयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर करती हैं। सामान्य तौर पर, एक सफल प्रयोग प्रति इंजेक्शन महिला >15 एफ1 लार्वा और फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए >3% की परिवर्तन दर पैदा करेगा। यदि जीवित संतानों की कुल संख्या औसतन 10 से कम लार्वा / महिला है, तो यह संभव है कि निर्माण विषाक्त है, और परिवर्तित लार्वा जीवित नहीं हैं। बड़ी संख्या में फ्लोरोसेंट अंडे ढूंढना लेकिन फ्लोरोसेंट लार्वा नहीं एक और संकेत है कि इंजेक्शन मिश्रण विषाक्त हो सकता है। जब पहली बार तकनीक सीखते हैं, तो एक ऐसे निर्माण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो अच्छी तरह से व्यक्त करता है, जैसे कि अधिनियम -2:: एमआरएफपीएम, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों में मजबूत अभिव्यक्ति चलाता है13 (चित्रा 4)।

कैस 9-मध्यस्थता लक्षित उत्परिवर्तन द्वारा उत्परिवर्ती उत्पन्न करते समय, एक मरम्मत टेम्पलेट के उपयोग की सिफारिश की जाती है जिसमें एक अधिनियम -2:: एमआरएफपीएमर्स या अधिनियम -2:: जीएफपी ट्रांसजीन 13 होता है ताकि प्रतिदीप्ति 9,14,15 के आधार पर संभावित म्यूटेंट की पहचान की जा सके। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्योंकि स्ट्रॉन्गिलॉइड्स एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणियों से ट्रांसजेन व्यक्त करते हैं, फ्लोरोसेंट एफ1 संतान अकेले सरणी से एमआरएफपीमर या जीएफपी व्यक्त कर सकती है या सरणी और एक एकीकृत ट्रांसजीन 3,9,16 दोनों से एमआरएफपीमर या जीएफपी व्यक्त कर सकती है। लार्वा की पहचान करना संभव है जो फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति के पैटर्न के आधार पर एकीकृत ट्रांसजीन होने की अधिक संभावना है: शरीर की दीवार की मांसपेशियों (चित्रा 4 ए) में "पैची" अभिव्यक्ति अधिक आम है जब ट्रांसजीन जीनोम में एकीकृत नहीं होता है, जबकि पूरे शरीर की दीवार की मांसपेशियों में लगातार अभिव्यक्ति (चित्रा 4 बी) ) अक्सर, लेकिन हमेशा नहीं, इंगित करता है कि ट्रांसजीन जीनोम में एकीकृत हो गया है। हालांकि, अकेले अभिव्यक्ति पैटर्न का उपयोग निर्णायक रूप से म्यूटेंट की पहचान करने के लिए नहीं किया जा सकता है- शरीर की दीवार की मांसपेशियों में लगातार अभिव्यक्ति वाले कुछ कीड़े में एकीकरण की घटनाएं नहीं हो सकती हैं। इसके अलावा, अभिव्यक्ति पैटर्न उन म्यूटेंट को अलग नहीं कर सकते हैं जो विषमयुग्मजी या मोज़ेक हैं। इस प्रकार, प्रत्येक कीड़े को पीसीआर-जीनोटाइप 9,14,15 होना चाहिए। आसानी से दिखाई देने वाले फेनोटाइप उत्पन्न करने वाले जीन को बाधित करते समय, मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग करना आवश्यक नहीं हो सकता है। उदाहरण के लिए, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स यूएनसी -22 जीन के विघटन के परिणामस्वरूप एक प्रमुख "ट्विचर" फेनोटाइप होता है, जिसमें विषमयुग्मजी या समरूप व्यवधानों की दर 10% 9 से ऊपर होती है।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसजेनिक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस लार्वा (ए, बी) एस स्टरकोरलिस लार्वा एक अधिनियम -2:: एमआरएफपीएमर्स ट्रांसजीन व्यक्त करता है, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों में व्यक्त करता है13. ट्रांसजीन को एसएस-यूएनसी -22 लोकस 9 के सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता व्यवधान के लिए एक मरम्मत टेम्पलेट में शामिल किया गया था। (ए) एक अधूरा, या "पैची" के साथ एक एस स्टरकोरलिस लार्वा, अधिनियम -2:: एमआरएफपीमर्स अभिव्यक्ति पैटर्न जो एक एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणी से अभिव्यक्ति का संकेत दे सकता है। (बी) एक एस स्टरकोरलिस आईएल 3 अधिक पूर्ण अधिनियम -2:: एमआरएफपीमर्स अभिव्यक्ति पैटर्न को व्यक्त करता है जो जीन व्यवधान और मरम्मत टेम्पलेट के एकीकरण का संकेत दे सकता है। ए, बी के लिए, पैनल अंतर हस्तक्षेप विपरीत (बाएं), फ्लोरोसेंट (मध्य), और विलय (दाएं) छवियों को दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: उपयोग करने योग्य सुई बनाने के लिए सुई तोड़ने की प्रक्रिया का प्रदर्शन। सुई की नोक को ग्लास शार्ड (दूर बाईं ओर वस्तु) के किनारे के खिलाफ टैप किया जाता है। जब तरल निकलता है, तो सुई को वापस खींच लिया जाता है और अगर पर नीचे ले जाया जाता है। सुई टिप एक तेज बिंदु पर आती है, और तरल मध्यम रूप से तेजी से बहता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: एक सफल इंजेक्शन का प्रदर्शन। गोनाड का पीछे का हाथ दाईं ओर एक हल्के भूरे रंग की संरचना के रूप में दिखाई देता है। सुई और गोनाड की नोक एक ही फोकल विमान में होनी चाहिए। यदि सुई कीड़े के ऊपर या नीचे या शरीर के साथ पकड़ने के बिना स्लाइड करती है, तो स्थिति को समायोजित करें। सुई की नोक शरीर की दीवार को थोड़ा इंडेंट करेगी। माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़ी सुई धारक पर एक त्वरित टैप धीरे-धीरे शरीर की दीवार के माध्यम से और गोनाड में टिप को धक्का देगा। एक बार सुई गोनाड के अंदर है, दबाव लागू करें और डीएनए समाधान इंजेक्ट करें। तरल को स्पष्ट रूप से गोनाड में बाढ़ आनी चाहिए। यदि सुई की नोक को हटाने पर घाव बंद हो जाता है, तो कीड़ा जीवित रहने की संभावना है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक सामग्री: स्ट्रॉन्गिलॉइड्स तनाव रखरखाव। यह प्रोटोकॉल गेरबिल्स में एस स्टरकोरलिस और चूहों में एस रत्ती के लिए रखरखाव प्रक्रिया को रेखांकित करता है। इसमें प्रत्येक सूत्रकृमि और मेजबान के लिए उपयोग की जाने वाली संक्रामक खुराक शामिल है। मेजबान संज्ञाहरण के तहत चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से संक्रमित होते हैं। पैटेंसी से पीक लार्वा आउटपुट से पेटेंसी के नुकसान तक संक्रमण की प्रगति प्रत्येक नेमाटोड-होस्ट संयोजन के लिए वर्णित है। संक्रमित मल इकट्ठा करने और फेकल-लकड़ी का कोयला खेती प्लेटों को बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: माइक्रोइंजेक्शन सुई को तोड़ने के लिए एक छोटे ग्लास शार्ड के साथ कवरस्लिप पर सूखे अगर पैड से युक्त माइक्रोइंजेक्शन स्लाइड की एक छवि। स्पष्टता के लिए अगर रूपरेखा और शार्ड रूपरेखा यहां जोड़ी गई है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक मूवी एस 1: एक इंजेक्शन का प्रदर्शन जिसके परिणामस्वरूप एक क्षतिग्रस्त गोनाड होता है। गोनाड का पूर्वकाल हाथ फोकस में है। मामूली दबाव लगाने से पता चलता है कि सुई में समाधान अभी भी स्वतंत्र रूप से बह रहा है। सुई की नोक गोनाड के समान फोकल विमान में है और इसका उद्देश्य मामूली कोण है। एक बार सुई की नोक डालने के बाद, समाधान को कीड़े में इंजेक्ट किया जाता है और गोनाड को भर देता है। हालांकि, जब सुई को हटा दिया जाता है, तो गोनाड का एक टुकड़ा छल्ली में घाव के माध्यम से फैलता है। सामग्री स्पष्ट रूप से बाहर बह रही है। इस कीड़े के जीवित रहने की संभावना नहीं है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनेसिस और सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता उत्परिवर्तन के लिए एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती में निर्माण शुरू करने के तरीकों का विवरण देता है। रत्ती, इंजेक्शन के बाद जीवित रहने और ट्रांसजेनेसिस या उत्परिवर्तन की दर कई चर के अधीन है जिन्हें ठीक किया जा सकता है।

सफल ट्रांसजेनेसिस के लिए पहला महत्वपूर्ण विचार यह है कि प्लास्मिड ट्रांसजेन का निर्माण कैसे किया जाता है। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में बहिर्जात ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स 5 'प्रमोटरों और 3' यूटीआर तत्वों 3,13,19 के उपयोग की आवश्यकता होती है। एलिगेंस निर्माणों के समान, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स निर्माण आम तौर पर एक जीन-विशिष्ट प्रमोटर और एक सामान्य 3 'यूटीआर का उपयोग करते हैं, जैसे कि एसएस-युग -1 जीन13 से एक। कोडिंग क्षेत्र का कोडन-अनुकूलन स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में अभिव्यक्ति के लिए भी महत्वपूर्ण हो सकता है। हाल ही में, वाइल्ड वर्म कोडन एडाप्टर, एक वेब-आधारित ऐप जो स्ट्रॉन्गिलॉइड्स और अन्य नेमाटोड के लिए कोडिंग अनुक्रमों को कोडन-ऑप्टिमाइज़ करता है,20 विकसित किया गया था। अंत में, जबकि स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में कड़ाई से परीक्षण नहीं किया गया है, इंट्रॉन को सी एलिगेंस21 और कीट से जुड़े नेमाटोड प्रिस्टियनकस पैसिफिकस22 दोनों में बहिर्जात ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में भी अभिव्यक्ति बढ़ाने के लिए माना जाता है। वाइल्ड वर्म कोडन एडाप्टर में संशोधित अनुक्रम20 में तीन इंट्रॉन शामिल करने के विकल्प हैं।

माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण की संरचना और वितरण ट्रांसजेनेसिस दर और एफ1 संतान के अस्तित्व को प्रभावित करता है। बीयू खारा नियमित रूप से मिश्रण के लिए पतला के रूप में उपयोग किया जाता है, हालांकि डीडीएच2ओ का उपयोग करना भी एक विकल्प है। मिश्रण में घटकों की सांद्रता और / या अनुपात को परिवर्तन दर में सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। ब्याज के प्लास्मिड की उच्च सांद्रता ट्रांसजेनेसिस की दर को बढ़ा सकती है लेकिन अक्सर कम कुल संतान होती है। यदि कोई ट्रांसजीन अभिव्यक्ति नहीं देखी जाती है या केवल मृत ट्रांसजेनिक अंडे पाए जाते हैं, तो यह संभव है कि ट्रांसजीन विषाक्त हों, या प्लास्मिड स्टॉक में कुछ ट्रांसजेनिक्स की मृत्यु का कारण बन रहा है। बाद के मामले में, एक अलग विधि का उपयोग करके नए प्लास्मिड स्टॉक बनाना (उदाहरण के लिए, एक अलग मिनीप्रेप किट का उपयोग करना) ट्रांसजेनिक्स प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण में लिपोफेक्टामाइन जोड़ने से ट्रांसजेनेसिस23 की दर में भी सुधार हो सकता है।

मिश्रण देने वाली माइक्रोइंजेक्शन सुई का आकार अस्तित्व और ट्रांसजेनेसिस दरों (चित्रा 3 ए-एफ, वीडियो 1, वीडियो 2, और पूरक वीडियो एस 1) को भी प्रभावित करता है। सुई छल्ली में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त तेज होनी चाहिए और अत्यधिक क्षति के परिणामस्वरूप पर्याप्त संकीर्ण नहीं होनी चाहिए। उपयोग से ठीक पहले सुइयों को खींचने की सिफारिश की जाती है क्योंकि एक दिन से अधिक समय तक संग्रहीत सुइयों से मलबा जमा हो सकता है और माइक्रोइंजेक्शन के दौरान भरा हुआ हो सकता है। उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना माइक्रोइंजेक्शन पैड से इंजेक्शन वाली महिलाओं को पुनर्प्राप्त करना कुछ अलग तरीकों से पूरा किया जा सकता है। एक तकनीक बीयू की एक बूंद में इंजेक्शन पैड से कीड़े फ्लोट करना है, और फिर कीड़े इकट्ठा करने के लिए एक कीड़ा पिक पर एचबी 101 का उपयोग करें। वसूली के लिए अन्य तकनीकों में बीयू में कीड़े तैरना और उन्हें एक पिपेट टिप या एक छोटे से पेंटब्रश का उपयोग करके इकट्ठा करना या कीड़े को रिकवरी प्लेट में ले जाने के लिए अकेले एक कीड़ा पिक का उपयोग करना शामिल है।

यदि माइक्रोइंजेक्टेड मादाओं से कोई संतान प्राप्त नहीं की गई थी, तो इससे पता चलता है कि या तो इंजेक्शन वाली मादाएं माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो गई थीं या पोस्ट-इंजेक्शन संवर्धन की स्थिति उप-इष्टतम थी। कई अलग-अलग पोस्ट-इंजेक्शन संवर्धन स्थितियां हैं जिन्हें आजमाया जा सकता है। ऊपर वर्णित छोटे पैमाने पर फेकल-चारकोल संस्कृतियां आम तौर पर एचबी 101 के साथ एनजीएम प्लेटों की तुलना में बेहतर कृमि अस्तित्व का समर्थन करती हैं। हालांकि, इंजेक्शन वाले कीड़े के अस्तित्व और फेकल-चारकोल प्लेटों पर एफ1 लार्वा के विकास का पालन करना मुश्किल हो सकता है, और अंडे इन प्लेटों पर दिखाई नहीं देते हैं। फेकल-चारकोल प्लेटों के बजाय एचबी 101 के साथ एनजीएम प्लेटों पर कीड़े की खेती का एक फायदा अंडे देने और लार्वा विकास के सावधानीपूर्वक अवलोकन की अनुमति देना है, जो समस्या निवारण के लिए उपयोगी हो सकता है। एचबी 101 के साथ वी 12 प्लेटों का उपयोग अस्तित्व24 को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। अंत में, एक चूहे फेकल गोली के साथ एक केमोटैक्सिस प्लेट12 का उपयोग एस रत्ती पोस्ट-इंजेक्शन संवर्धन के लिए किया जा सकता है। नर और इंजेक्शन मादाओं को सीधे चूहे के फेकल गोली में स्थानांतरित कर दिया जाता है। 5-7 दिनों में, कीड़े को बेर्मन तंत्र का उपयोग करके अगर और मल से एकत्र किया जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है।

माइक्रोइंजेक्शन के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स वयस्कों को प्राप्त करने के लिए, ताजा तैयार फेकल-चारकोल प्लेटों को 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस या 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जा सकताहै। हालांकि, यदि महिलाएं बहुत छोटी हैं, तो वे माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया से बच नहीं सकती हैं। फेकल-चारकोल प्लेटों से एकत्र किए गए वयस्कों को ~ 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया है, माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया को सहन करने की अधिक संभावना है। हालांकि, क्योंकि ये वयस्क 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे इनक्यूबेशन से प्राप्त वयस्कों की तुलना में बड़े हैं, वे फेकंड के रूप में नहीं हैं और कम परिवर्तन दर हो सकती है। नौसिखिया पुराने वयस्कों के साथ शुरू करना पसंद कर सकते हैं और फिर कौशल में सुधार के रूप में थोड़ा छोटे वयस्कों पर स्विच कर सकते हैं।

एलिगेंस की तरह, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियां एफ1 पीढ़ी में एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणियों और जीनोम-एकीकृत निर्माणों से ट्रांसजेन व्यक्त कर सकती हैं। एलिगेंस के विपरीत, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियां केवल एफ 2 और बाद की पीढ़ियों में जीनोम-एकीकृत ट्रांसजीन व्यक्त करेंगी, भले ही एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणियां अभी भी पीसीआर13 द्वारा पता लगाने योग्य हैं। एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणियों को व्यक्त करने वाले एफ1 ट्रांसजेनिक लार्वा का उपयोग उन प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जिन्हें जीनोम एकीकरण या बड़ी संख्या में ट्रांसजेनिक कीड़े की आवश्यकता नहीं होती है। जीनोम एकीकरण उन प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है जिनके लिए अंतर्जात जीन को टैग करने या जनसंख्या-आधारित परखों में बड़ी संख्या में कीड़े का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में ट्रांसजेन के जीनोम एकीकरण के लिए दो तरीके हैं: पिग्गीबैक ट्रांसपोसन-मध्यस्थताएकीकरण 17 और सीआरआईएसपीआर / पिग्गीबैक ट्रांसपोसन-मध्यस्थता एकीकरण जीनोम26 में टीटीएए साइटों पर कार्गो को लक्षित करने के लिए पिग्गीबैक ट्रांसपोसेस का उपयोग करता है। क्योंकि स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों के एटी-समृद्ध जीनोम में टीटीएए आकृति काफी आम है, एकीकरण अक्सर जीनोम में एक से अधिक साइटों पर होता है। इसके विपरीत, सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता एकीकरण का उपयोग एक विशिष्ट लक्ष्य स्थान9 पर ट्रांसजीन को एकीकृत करने के लिए किया जा सकता है।

सीआरआईएसपीआर /सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग लक्षित जीन नॉकआउट 9,27 उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है। स्ट्रॉन्गिलॉइड्स जीनोम की एटी समृद्धि के कारण, नेमाटोड28 के लिए इष्टतम 5 '-एन18जीजीएनजीजी -3' अनुक्रम युक्त प्रयोग करने योग्य कैस 9 लक्ष्य साइटों को ढूंढना एक चुनौती है। अक्सर, लक्ष्यीकरण के लिए एक जीन में केवल एक या दो साइटें होती हैं। पसंदीदा विधि में जीनोमिक लोकस में होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ एक ट्रांसजीन युक्त एक मरम्मत टेम्पलेट का एकीकरण शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप जीन का पूर्ण विघटन होता है। संभावित नॉकआउट को ट्रांसजीन 9,14,15,29 की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना जा सकता है। हालांकि, अकेले ट्रांसजीन अभिव्यक्ति जीनोटाइप का संकेत नहीं है क्योंकि सरणियों बनाम एकीकृत ट्रांसजीन से अभिव्यक्ति अक्सर अप्रभेद्य होती है। इस प्रकार, एफ1 ट्रांसजेनिक लार्वा को समरूप नॉकआउट9 की पहचान करने के लिए पोस्ट-हॉक जीनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है। एक मरम्मत टेम्पलेट की अनुपस्थिति में, लक्ष्य स्थान का उत्परिवर्तन उच्च आवृत्ति पर होता है लेकिन इसके परिणामस्वरूप बड़े विलोपन हो सकते हैं9.

यद्यपि ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती एफ1 लार्वा उत्पन्न करना एस स्टरकोरलिस में अपेक्षाकृत सीधा है, मेजबान मार्ग की आवश्यकता के कारण स्थिर लाइनों को उत्पन्न करना बेहद मुश्किल है। प्रयोगशाला में, मंगोलियाई गेरबिल एस स्टरकोरलिस के लिए एक अनुमेय मेजबान है, लेकिन लाइन30 स्थापित करने के लिए पर्याप्त एफ2 लार्वा का उत्पादन करने में सक्षम संक्रमण स्थापित करने के लिए कीड़े की एक उच्च खुराक की आवश्यकता होती है। संक्रामक लार्वा का केवल 6% परजीवी मादा बन जाता है30. इसके अलावा, यदि ट्रांसजेनिक लार्वा में जीनोम एकीकरण के बिना सरणी अभिव्यक्ति होती है, तो वे दूसरे गेरबिल मेजबान को संक्रमित करने के लिए आवश्यक ट्रांसजीन-व्यक्त संतान का उत्पादन नहीं करेंगे। जीनोम-एकीकृत लार्वा की पर्याप्त संख्या में प्रजनन परजीवी वयस्क बनने की संभावना को बढ़ाने के लिए, प्रारंभिक इनोकुलम में न्यूनतम 400-500 ट्रांसजेनिक लार्वा की सिफारिश की जाती है। प्रेडनिसोन30 के साथ गेरबिल का इलाज करके पेटेंट संक्रमण स्थापित करने के लिए आवश्यक लार्वा की संख्या को कम करना संभव हो सकता है। फिर भी, एस स्टरकोरलिस की एक स्थिर रेखा को सफलतापूर्वक स्थापित करने के लिए पर्याप्त एकीकृत ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती कीड़े एकत्र करना मुश्किल होने की संभावना है। हालांकि, आमतौर पर एकल-कृमि परख14,15 के लिए ट्रांसजेनिक एस स्टरकोरलिस एफ1 लार्वा की पर्याप्त संख्या एकत्र करना संभव है।

स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती में स्थिर ट्रांसजेनिक या नॉकआउट लाइनों17,31 उत्पन्न करने की अधिक व्यवहार्यता का विशिष्ट लाभ है। रत्ती मुक्त रहने वाली वयस्क मादाएं एस स्टरकोरलिस मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं की तुलना में माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के प्रति कम सहिष्णु हैं; रत्ती मादाएं आम तौर पर एस स्टरकोरलिस मादाओं की तुलना में कम समग्र लार्वा का उत्पादन करती हैं, और परिवर्तन दर भी कम31 है। हालांकि, एस रत्ती की एक स्थिर रेखा स्थापित करने के लिए केवल कुछ ट्रांसजेनिक या नॉकआउट एफ1 लार्वा की आवश्यकता होती है। चूंकि एस रत्ती चूहों का एक प्राकृतिक परजीवी है, केवल कुछ एस रत्ती संक्रामक लार्वा पेटेंट संक्रमण स्थापित करने के लिए पर्याप्त हैं32. इस प्रकार, एक स्थिर रेखा स्थापित करने के लिए ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती लार्वा की पर्याप्त संख्या एकत्र करना आम तौर पर संभव है। क्योंकि स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियां एफ1 पीढ़ी से पहले एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणियों को व्यक्त नहीं करेंगी, केवल जीनोम-एकीकृत एफ1 लार्वा एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन13 का उत्पादन कर सकता है। जीनोटाइपिंग से पहले एकीकृत ट्रांसजीन के साथ कीड़े की पहचान करना आम तौर पर असंभव है, इसलिए प्रोटोकॉल सभी ट्रांसजेनिक एफ1 लार्वा एकत्र करना और उन्हें चूहे में इंजेक्ट करना है। इन लार्वा के कुछ छोटे प्रतिशत में वांछित एकीकरण घटना होगी; ये लार्वा स्थिर रेखा के लिए आधार बनाएंगे। चूंकि पिग्गीबैक विधि के परिणामस्वरूप अक्सर किसी भी व्यक्तिगत कीड़े में एक से अधिक एकीकरण घटना होती है, इसलिए चूहे17 के माध्यम से ट्रांसजेनिक लार्वा के कुछ दौर के बाद ट्रांसजीन का लगभग 100% संचरण प्राप्त किया जा सकता है।

संक्षेप में, यहां वर्णित तकनीक का उपयोग ट्रांसजेनिक या नॉकआउट उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है एस। यह संभावित प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम बनाता है, जिसमें स्थानिक और लौकिक कार्यों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसजीन की कोशिका-विशिष्ट अभिव्यक्ति, म्यूटेंट की पीढ़ी और प्रोटीन की अंतर्जात टैगिंग शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है 14,15,29,33,34,35। लंबे समय में, ट्रांसजेनिक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स के उपयोग से प्राप्त ज्ञान का उपयोग एस स्टरकोरलिस और अन्य आंतों के परजीवी नेमाटोड के साथ मानव संक्रमण से निपटने के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

पीपीवी 540 और पीपीवी 402 पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में डॉ जेम्स लोक से दयालु उपहार थे। हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए एस्ट्रा ब्रायंट को धन्यवाद देते हैं। इस काम को रोग के रोगजनन पुरस्कार में बरोज-वेलकम फंड जांचकर्ताओं, हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट फैकल्टी स्कॉलर अवार्ड और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 01 डीसी 017959 (ई.ए.एच.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid Sigma-Aldrich N3876-5ML nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) VWR 470121-790 C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE Phenix RBA-500 agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh Ebonex n/a charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh Reade bonechar10x28 charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator Narishige MMN-1 coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Fisher 07-200-385 microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness Brain Research Lab 4860-1 coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter VWR 82050-918 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod Fisher 12-000-101 stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips VWR 89009-310 for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads Fisher 14-206-62 bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings Fisher 14-050CQ Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe McMaster-Carr 7541A51 glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-50ML halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD McMaster-Carr 3038K24 tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase VWR 89001-414 Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors Fisher 15-235-101 bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence Leica M165 FC GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder Tritech MINJ-4 microinjection needle holder
microINJECTOR system Tritech MINJ-1 microinjection system
Mongolian Gerbils Charles River Laboratories 213-Mongolian Gerbil gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz VWR 11216-776 Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh) Jo-Ann Fabrics zprd_14061949a nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch Thomas Scientific 1233S72 platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) VWR 62505-007 wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley Envigo 002 Hsd:Sprague Dawley SD rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office Depot 452369 plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches Newco 999589 techboard
Stainless steel raised wire floor Ancare R20SSRWF wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 Office Depot 9587303 spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm Carolina (Science) 741012 watch glasses (small, round)
Stereomicroscope Motic K-400 LED dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite Grainger 53GN16 plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller Sutter P-30/P needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses Fisher S34826 watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps Fisher 05-769-2Q funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator Narishige MM0-4 fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps Fisher S99422 Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) Tritech Research T3308P 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers VWR 82003-820 lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in Carolina (Science) 742300 watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter Fisher 09-805B filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter Fisher 09-805D filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in Fisher 50-821-813 glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade Office Depot 238816 X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1 Zeiss n/a inverted microscope

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 176
माइक्रोइंजेक्शन द्वारा <em>स्ट्रॉन्गिलॉइड्स</em> प्रजातियों में ट्रांसजेनिक्स और नॉकआउट उत्पन्न करना
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Castelletto, M. L., Hallem, E. A.… More

Castelletto, M. L., Hallem, E. A. Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection. J. Vis. Exp. (176), e63023, doi:10.3791/63023 (2021).

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