Summary
El kit de herramientas genómicas funcionales para los nematodos parásitos Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti incluye transgénesis, mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9 y ARNi. Este protocolo demostrará cómo utilizar la microinyección intragonadal para introducir transgenes y componentes CRISPR en S. stercoralis y S. ratti.
Abstract
El género Strongyloides consiste en múltiples especies de nematodos penetrantes en la piel con diferentes rangos de huéspedes, incluyendo Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti. S. stercoralis es un nematodo parásito de la piel que penetra en la piel y que infecta a aproximadamente 610 millones de personas, mientras que el parásito de la rata S. ratti está estrechamente relacionado con S. stercoralis y se usa a menudo como modelo de laboratorio para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis como S. ratti son fácilmente susceptibles a la generación de transgénicos y knockouts a través de la técnica de administración de ácido nucleico exógeno de microinyección intragonadal, y como tales, han surgido como sistemas modelo para otros helmintos parásitos que aún no son susceptibles a esta técnica.
Los adultos parásitos de Strongyloides habitan en el intestino delgado de su huésped y liberan progenie en el medio ambiente a través de las heces. Una vez en el medio ambiente, las larvas se convierten en adultos de vida libre, que viven en heces y producen progenie que debe encontrar e invadir un nuevo huésped. Esta generación ambiental es exclusiva de la especie Strongyloides y lo suficientemente similar en morfología al nematodo modelo de vida libre Caenorhabditis elegans que las técnicas desarrolladas para C. elegans se pueden adaptar para su uso con estos nematodos parásitos, incluida la microinyección intragonadal. Usando microinyección intragonadal, se puede introducir una amplia variedad de transgenes en Strongyloides. Los componentes CRISPR/Cas9 también pueden ser microinyectados para crear larvas mutantes de Strongyloides . Aquí, se describe la técnica de microinyección intragonadal en Strongyloides, incluida la preparación de adultos de vida libre, el procedimiento de inyección y la selección de la progenie transgénica. Se incluyen imágenes de larvas transgénicas de Strongyloides creadas mediante mutagénesis CRISPR/Cas9. El objetivo de este artículo es permitir a otros investigadores utilizar la microinyección para crear Strongyloides transgénicos y mutantes.
Introduction
Strongyloides stercoralis se ha pasado por alto durante mucho tiempo como un patógeno humano importante en comparación con los anquilostomas más ampliamente reconocidos y el gusano redondo Ascaris lumbricoides1. Los estudios previos sobre la carga de gusanos a menudo subestimaron gravemente la prevalencia de S. stercoralis debido a la baja sensibilidad de los métodos de diagnóstico comunes para S. stercoralis2. En los últimos años, estudios epidemiológicos basados en herramientas diagnósticas mejoradas han estimado que la verdadera prevalencia de infecciones por S. stercoralis es mucho mayor que la reportada anteriormente, aproximadamente 610 millones de personas en todo el mundo2.
Tanto S. stercoralis como otras especies de Strongyloides, incluido el parásito de rata estrechamente relacionado y el modelo de laboratorio común S. ratti, tienen un ciclo de vida inusual que es ventajoso para los estudios genómicos experimentales porque consiste en generaciones parásitas y de vida libre (ambientales)3 (Figura 1). Específicamente, tanto S. stercoralis como S. ratti pueden pasar por una sola generación de vida libre. La generación de vida libre consiste en larvas post-parásitas que se convierten en machos y hembras adultos de vida libre; toda la progenie de los adultos de vida libre se convierte en larvas infecciosas, que deben infectar a un huésped para continuar el ciclo de vida. Además, esta generación ambiental o de vida libre puede ser manipulada experimentalmente en el laboratorio. Debido a que los adultos de Strongyloides de vida libre y los adultos de C. elegans comparten una morfología similar, las técnicas como la microinyección intragonadal que se desarrollaron originalmente para C. elegans se pueden adaptar para su uso con Strongyloides adultos de vida libre 4,5. Mientras que el ADN generalmente se introduce en hembras adultas de vida libre, tanto los machos como las hembras de Strongyloides pueden ser microinyectados6. Por lo tanto, las herramientas genómicas funcionales están disponibles para interrogar muchos aspectos de la biología de Strongyloides. Otros nematodos parásitos carecen de una generación de vida libre y, como resultado, no son tan fácilmente susceptibles a las técnicas genómicas funcionales3.
Figura 1: El ciclo de vida de Strongyloides stercoralis. Las hembras parásitas de S. stercoralis habitan el intestino delgado de sus huéspedes mamíferos (humanos, primates no humanos, perros). Las hembras parásitas se reproducen por partenogénesis y ponen huevos dentro del intestino delgado. Los huevos eclosionan mientras aún están dentro del huésped en larvas post-parásitas, que luego se pasan al medio ambiente con heces. Si las larvas postparasitarias son machos, se convierten en machos adultos de vida libre. Si las larvas postparasitarias son hembras, pueden convertirse en hembras adultas de vida libre (desarrollo indirecto) o larvas infecciosas de tercera etapa (iL3s; desarrollo directo). Los machos y hembras de vida libre se reproducen sexualmente para crear progenie que se ve limitada a convertirse en iL3s. Bajo ciertas condiciones, S. stercoralis también puede someterse a una autoinfección, en la que algunas de las larvas postparasitarias permanecen dentro del intestino del huésped en lugar de pasar al medio ambiente en las heces. Estas larvas pueden convertirse en larvas autoinfectivas (L3a) dentro del huésped, penetrar a través de la pared intestinal, migrar a través del cuerpo y, finalmente, regresar al intestino para convertirse en adultos reproductivos. El ciclo de vida de S. ratti es similar, excepto que S. ratti infecta a las ratas y no tiene un ciclo autoinfectivo. La generación ambiental es clave para el uso de especies de Strongyloides para estudios genéticos. Las hembras adultas de vida libre (P0) pueden ser microinyectadas; su progenie, que se convertirá en iL3, son los potenciales transgénicos F1. Esta figura ha sido modificada a partir de Castelletto et al. 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
S. stercoralis comparte muchos aspectos de su biología con otros nematodos parásitos humanos gastrointestinales, incluida la invasión del huésped y la modulación inmune del huésped. Por ejemplo, los anquilostomas parásitos humanos en los géneros Necator y Ancylostoma también infectan por penetración en la piel, navegan de manera similar a través del cuerpo y, en última instancia, residen como adultos parásitos en el intestino delgado7. Por lo tanto, muchos nematodos gastrointestinales probablemente usan comportamientos sensoriales comunes y técnicas de evasión inmune. Como resultado, el conocimiento obtenido de Strongyloides complementará los hallazgos en otros nematodos menos tratables genéticamente y conducirá a una comprensión más completa de estos parásitos complejos e importantes.
Este protocolo de microinyección describe el método para introducir ADN en hembras adultas de vida libre de Strongyloides para producir progenie transgénica y mutante. Se describen los requisitos de mantenimiento de la cepa, incluido el momento de desarrollo de los gusanos adultos para microinyecciones y la recolección de progenie transgénica. Se incluyen protocolos y una demostración de la técnica completa de microinyección, junto con protocolos para el cultivo y detección de progenie transgénica, junto con una lista de todos los equipos y consumibles necesarios.
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Protocol
NOTA: Los jerbos se usaban para pasar S. stercoralis, y las ratas se usaban para pasar S. ratti. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Oficina de Supervisión de Investigación Animal de UCLA (Protocolo No. 2011-060-21A), que se adhiere a los estándares AAALAC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las siguientes tareas deben completarse al menos un día antes de la microinyección: cultivo de gusanos, preparación de almohadillas de microinyección, creación de construcciones para la mezcla de microinyección y propagación de bacterias (E. coli HB101) en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) de 6 cm8. Las hembras de vida libre requieren un mínimo de 24 h de recolección post-fecal a 25 ° C para convertirse en adultos jóvenes antes de que puedan ser microinyectadas. Las almohadillas de microinyección deben estar completamente secas. Las placas bacterianas deben secarse y establecer un césped pequeño.
1. Preparación de portaobjetos de microinyección: al menos un día antes de la inyección
NOTA: Los gusanos se montan en fundas de microinyección con almohadillas de agar secas para inyección.
- Ajuste un bloque de calor a 90 °C.
- Agregue 5 ml de ddH2O, luego 100 mg de agarosa a un tubo de vidrio de borosilicato.
- Caliente la mezcla de agarosa en el tubo sobre una llama hasta que la agarosa se disuelva.
- Coloque el tubo en un bloque de calor a 90 °C para mantener la agarosa en estado líquido.
- Deje caer ~ 180 μL de la solución de agarosa en un trozo de cubierta usando una pipeta Pasteur de vidrio o una pipeta con una punta de plástico. Inmediatamente deje caer una segunda funda en la parte superior para aplanar la agarosa en una almohadilla delgada.
- Después de 5-10 s, retire la cubierta superior deslizando los dos separados. Determine en qué diapositiva está la almohadilla de agar y colóquela boca arriba.
- Seleccione un pequeño trozo de fragmento de vidrio de un trozo de cubierta roto y presiónelo suavemente en el agar cerca del borde superior de la almohadilla con fórceps (Figura suplementaria S1).
- Continúe haciendo almohadillas de microinyección con la solución de agarosa.
- Seque las almohadillas de agarosa durante la noche en el banco o en un horno. Conservar en la caja de la funda.
NOTA: Las almohadillas de agarosa se pueden usar hasta por 2 meses, pero solo se usan para una inyección.
2. Cultivo de Strongyloides para obtener gusanos para microinyección: 1 - 2 días antes de la inyección
NOTA: Se puede encontrar un protocolo de mantenimiento de cepas en el Material Suplementario, que incluye una descripción detallada de cómo infectar jerbos y ratas con nematodos y cosechar nematodos de las heces de animales infectados.
- Dos días antes del día de la inyección, coloque a los animalesinfectados 9,10 en jaulas de recolección durante la noche.
- A la mañana siguiente, recoja las heces infestadas y haga placas de carbón fecal 9,10.
- Coloque un plato a 25 ° C durante 24 h para permitir que los gusanos de vida libre se conviertan en adultos jóvenes.
- La noche antes del día de la inyección, coloque a los animales huéspedes no infectados en jaulas de recolección.
- El día de la inyección, recoja las heces no infestadas para el cultivo posterior a la inyección.
3. Hacer la mezcla de microinyección: antes o el día de la inyección
NOTA: La mezcla de microinyección consiste en los plásmidos de interés diluidos a la concentración deseada en solución salina tamponada por gusano (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Determinar la concentración de las cepas de plásmidos y la concentración deseada en la mezcla de microinyección (Tabla 1).
| Mezcla de microinyección: construcción del reportero | |||
| Componente | Concentración de existencias | Importe | Concentración final |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | Na | 8,3 μL | Na |
| total | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Mezcla de microinyección: mutagénesis CRISPR/Cas9 | |||
| Componente | Concentración de existencias | Importe | Concentración final |
| pMLC47 tax-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Plásmido Ss-tax-4 HDR | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| Plásmido pPV540 strCas9 | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 4,2 μL | Na |
| total | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mezcla de microinyección: integración de piggyBac | |||
| Componente | Concentración de existencias | Importe | Concentración final |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| Plásmido de transposasa pPV402 | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 7,1 μL | Na |
| total | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabla 1: Ejemplos de mezclas de microinyección. Los plásmidos y las concentraciones para tres mezclas de microinyección de ejemplo: una para un gpa-3::GFP reporter construct10, una para la interrupción mediada por CRISPR/Cas9 del locus Ss-tax-4 14,15, y otra para la integración mediada por piggyBac de una construcción Ss-gpa-3::GFP construct 13,17,18. strCas9 denota el gen Cas9 optimizado para codones Strongyloides. Las concentraciones finales enumeradas se utilizan comúnmente en mezclas de microinyección de Strongyloides.
- Diluya los plásmidos en BU a un volumen total de 10-20 μL.
- Gire la mezcla a través de una columna de filtro a 5.000 × g durante 1-2 min.
- Utilice la mezcla de microinyección inmediatamente o guárdela a -20 °C para su uso futuro.
4. Recolecte Strongyloides adulto joven para microinyección: mañana del día de la inyección
- Configure el aparato de Baermann con 1 placa fecal-carbón de Strongyloides adulto joven (Figura 2).
NOTA: La placa fecal-carbón vegetal puede contener algunas larvas infecciosas. El equipo de protección personal consiste en una bata de laboratorio, guantes y protección ocular. No se debe exponer ninguna piel entre el guante y la manga de la bata de laboratorio.
Figura 2: El aparato de Baermann utilizado para recolectar gusanos parásitos de cultivos10. El contenido de una placa de carbón fecal se coloca en la parte superior de una columna de agua tibia. Los gusanos migran al agua y se acumulan en la parte inferior del embudo. (A) Para configurar el aparato de Baermann, el soporte para el embudo de Baermann se sujeta al banco con una abrazadera en C. Un tubo de goma unido al extremo del embudo se cierra con abrazaderas de pellizco, y se coloca un cubo de captura debajo del tubo para goteos. Se agrega agua tibia al embudo de vidrio. (B) El soporte de anillo de plástico para la mezcla fecal-carbón vegetal se recubre con 3 piezas de tejidos de laboratorio (izquierda). Se utiliza un palo de madera o un depresor de lengua (centro) para transferir el contenido de una placa de carbón fecal (derecha) al soporte del anillo de plástico. (C) Un primer plano de la parte inferior del soporte del anillo de plástico para la mezcla fecal-carbón, que muestre la doble capa de tul de nylon que recubre la parte inferior del soporte. (D) El soporte de carbón fecal se coloca en la parte superior del embudo de vidrio. (E) El tejido de laboratorio se humedece con agua y se cierra sobre la mezcla fecal-carbón. Se agrega más agua tibia para sumergir principalmente el carbón fecal. (F) La configuración completa de Baermann, con el cultivo fecal-carbón sumergido bajo agua tibia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Instale un embudo de vidrio con tubos de recolección de goma en un soporte de anillo con una junta tórica y asegúrelo con una abrazadera. Cierre el tubo de recogida con 2 abrazaderas de pellizco (Figura 2A).
- Coloque un cubo de captura debajo del embudo para atrapar goteos.
- Agregue agua tibia (aproximadamente 40 °C) al embudo a 5 cm por debajo del borde. Verifique que el sistema no tenga fugas.
- Forre el soporte Baermann, un tamiz hecho de 2 anillos de plástico con 2 capas de redes de tul de nylon aseguradas entre ellas, con 3 piezas superpuestas de tejido de laboratorio. Agregue la mezcla fecal-carbón vegetal al soporte de Baermann (Figura 2B, C).
- Coloque el soporte baermann con la mezcla fecal-carbón en el embudo. Doble los tejidos alrededor de la mezcla fecal-carbón y agregue suficiente agua para sumergir la mayor parte del carbón fecal. No llene por encima de 2 cm del borde del embudo (Figura 2D, E).
- Cubra el embudo con una tapa de placa de Petri de plástico de 15 cm para contener el olor. Etiquete el embudo según sea necesario (Figura 2F).
- Espere de 30 minutos a 1 h para recoger los gusanos del aparato de Baermann.
- Sostenga un tubo de centrífuga de 50 ml debajo del tubo de goma en la parte inferior del embudo. Abra cuidadosamente las abrazaderas en la parte inferior para dispensar 30-40 ml de agua que contiene gusanos en el tubo de 50 ml.
- Transfiera 15 ml del agua de Baermann que contiene los gusanos a un tubo centrífugo de 15 ml. Gire el tubo centrífugo de 15 ml durante 1 minuto a ~ 750 × g (lento). Alternativamente, permita que los gusanos se asienten por gravedad durante 10-15 minutos.
- Retire el sobrenadante a ~ 2 ml y deseche el sobrenadante en un recipiente líquido de desecho con yodo para matar cualquier gusano.
- Agregue más agua baermann al tubo de recolección de 15 ml y repita el giro. Retire el sobrenadante a ~2 ml y deséchelo como en el paso 4.11.
- Repita los pasos 4.11 y 4.12 hasta que todos los gusanos se recojan en el tubo centrífugo de 15 ml. Después del giro final, retire la mayor cantidad de agua posible.
- Inspeccione el pellet de gusanos (40-100 μL) en la parte inferior del tubo. Si no hay gusanos visibles, espere otras 1-2 h e intente recolectar más gusanos del aparato de Baermann.
- Transfiera los gusanos en la menor cantidad de agua posible a una placa NGM de 6 cm al 2% con un césped de E. coli HB101. Utilice esta placa como placa fuente para la microinyección.
- Deseche la mezcla fecal-carbón tratándola con yodo diluido (una dilución del 50% del yodo de Lugol en agua), envolviéndola en una película plástica para atrapar goteos y colocándola en un recipiente de desechos de riesgo biológico.
- Agregue 10 ml de yodo diluido al cubo de captura y drene el exceso de agua del Baermann en él.
- Lave los componentes reutilizables (el embudo, el cubo de captura, el soporte de plástico con tul, la tapa de plástico y las abrazaderas) con lejía al 10% y enjuague bien.
5. Tirar y cargar agujas de microinyección: justo antes de la inyección
- Prepare agujas de microinyección tirando de tubos capilares de vidrio con un extractor de agujas.
NOTA: Los ajustes de ejemplo para un extractor de agujas comercial equipado con un filamento de platino/iridio de 3 mm son Heat = 810-820, Pull = 800-820, micrometer = 2.5. - Vea las puntas bajo un microscopio de disección. Si las agujas tienen la forma deseada (Figura 3A-F), tire de 4-6 agujas (2-3 tubos capilares). Para lograr la forma adecuada de la aguja, cambie la configuración según sea necesario: ajuste la configuración de calor o tracción en 10 y tire de las agujas nuevas hasta que la forma del cónico y el eje sean más apropiados.
Figura 3: Agujas de microinyección y una hembra adulta de Strongyloides stercoralis con sitios óptimos para la microinyección identificados. (A-F) Imágenes de agujas de microinyección. (A-B) El eje se estrecha (A) y la punta (B) de una aguja que tiene la forma correcta para la microinyección. La punta es lo suficientemente afilada como para perforar la cutícula y lo suficientemente estrecha como para no causar daños excesivos. (C-D) El eje se estrecha (C) y la punta (D) de una aguja de microinyección que tiene una forma incorrecta para la microinyección. La punta es demasiado roma y ancha, y causará un daño excesivo al gusano. (E-F) El eje se estrecha (E) y la punta (F) de una aguja que es probable que sea demasiado larga y delgada para funcionar para la microinyección. La punta en F es muy similar a la punta en D. Sin embargo, el eje es más estrecho y demasiado flexible para perforar efectivamente la cutícula. Además, las agujas muy delgadas se obstruyen fácilmente. (G) Una imagen de todo el gusano correctamente posicionado para la microinyección, asumiendo que la aguja está entrando desde la derecha. Anterior está hacia abajo y hacia la izquierda; la vulva está indicada por la punta de flecha. La gónada es visible a lo largo del lado derecho de la hembra. Esta hembra tiene un solo óvulo en su útero (indicado por el asterisco). (H, I) Vistas ampliadas de los sitios de microinyección. El ángulo de la flecha se aproxima al ángulo de la aguja de inyección. La vulva se puede utilizar como un punto de referencia; está en el lado opuesto del gusano de los brazos de la gónada. Los brazos de la gónada se curvan alrededor del intestino, y los extremos con los núcleos divisorios están opuestos a la vulva. (H) El brazo posterior de la gónada; (I) el brazo anterior. Se puede inyectar uno o ambos brazos. Para H, I, las convenciones son como en G. Barras de escala = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Guarde las agujas tiradas en una placa de Petri de plástico de 15 cm con un trozo de cinta enrollada para asegurar las agujas y evitar la acumulación de polvo en las puntas.
- Coloque una gota de 0,7 μL de la mezcla de microinyección en el extremo abierto del eje. Cuelgue la aguja perpendicular a un estante con un trozo de cinta enrollada para llenar el eje cónico con la mezcla dentro de los 10 minutos. Prepare 2 agujas a la vez en caso de que la primera no funcione.
6. Preparar el microscopio y romper la aguja
NOTA: La microinyección utiliza un microscopio invertido con objetivos de 5x y 40x equipado con una configuración de microinyector para controlar el movimiento de la aguja. El microscopio invertido debe colocarse sobre una mesa pesada o una mesa de aire antivibración para reducir el ruido vibratorio. El soporte de la aguja del microinyector está conectado al gas nitrógeno que aplica la presión necesaria para administrar la mezcla de microinyección. Se utiliza un microscopio de disección más pequeño cerca para transferir los gusanos.
- Ajuste la presión del tanque de gas a ~ 40-60 psi para romper la aguja y a ~ 30-50 psi para la microinyección, dependiendo del flujo de líquido.
- En el microscopio de disección, cubra el fragmento de vidrio en la cubierta de la almohadilla de microinyección con aceite de halocarbono utilizando una selección de gusano de platino estándar.
- Coloque la cubierta de la almohadilla de microinyección en el endoscopio de microinyección y ubique el fragmento de vidrio cubierto de aceite. Alinee el fragmento de vidrio de tal manera que un borde sea perpendicular a la dirección de la aguja para que sirva como la superficie utilizada para romper la aguja.
- Verifique que la aguja no tenga burbujas o desechos en el eje cónico con el microscopio de disección. Luego, asegure la aguja 1-1.5 cm en el soporte presurizado.
- Coloque la punta de la aguja en el centro del campo de visión del microscopio a ojo. Luego, bajo un aumento bajo, coloque la punta de la aguja en el campo de visión, perpendicular al lado del fragmento de vidrio.
- Cambie a alta potencia y alinee la punta de la aguja con el borde del vidrio, cerca pero sin tocarlo.
NOTA: Cuando se tiran, las agujas se fusionan y se cierran. - Para romper la punta de la aguja y permitir el flujo de líquido, tóquela suavemente en el costado de la pieza de vidrio mientras aplica presión continua del gas (Figura suplementaria S1). Una vez que el líquido comience a fluir, verifique la forma de la punta y asegúrese de que esté afilado con líquido que fluya fácilmente.
NOTA: Si el líquido fluye demasiado rápido o el extremo es demasiado romo, los gusanos se dañarán durante la microinyección (Video 1 y Figura 3A-F). - Cuando el líquido fluya bien de la aguja, mueva el portaobjetos de microinyección al endoscopio de disección y coloque gotas de aceite de halocarbono de 1-2 μL en la almohadilla de agar para la colocación de los gusanos.
- Transfiera 20-30 Strongyloides adultos jóvenes a una placa NGM al 2% sin bacterias durante al menos 5 minutos para eliminar el exceso de bacterias superficiales y seleccionar gusanos individuales para la microinyección. Agregue más gusanos a la placa NGM según sea necesario mientras inyecta.
7. Microinyecting Strongyloides
- Use una pequeña cantidad de aceite de halocarbono en una selección de gusanos para seleccionar una hembra adulta joven de Strongyloides con 1-4 huevos en su gónada de la placa NGM al 2% sin bacterias.
- Transfiera el gusano a una pequeña gota de aceite en la almohadilla de agar. Usando el pico de gusano, coloque suavemente el gusano para que no esté enrollado y la gónada sea visible y de fácil acceso. Observe la dirección de la gónada (Figura 3G).
- Coloque el gusano en el campo de visión del microscopio de microinyección. Asegúrese de que la gónada esté en el mismo lado que la aguja y colocada de modo que la aguja entre en contacto con la gónada en un ligero ángulo (Figura 3H, I).
- Lleve la punta de la aguja al lado del gusano en el mismo plano focal. Apunta al brazo de la gónada cerca de la mitad del gusano. Use el microinyector para insertar la aguja suavemente en la gónada (Video 2).
- Aplique inmediatamente presión a la aguja para llenar suavemente todo el brazo de la gónada con la solución de ADN. Determinar a ojo cuándo se ha inyectado suficiente líquido (Video 2).
NOTA: Puede tomar hasta 2 s para llenar la gónada. - Retire la aguja y verifique que la herida se cierre.
NOTA: El gusano está demasiado dañado para producir progenie si la gónada sobresale a través de la pared del cuerpo (Video suplementario S1). - Repetir con el otro brazo de la gónada si es visible.
- Cuando termine de inyectar, verifique rápidamente que la aguja no esté obstruida aplicando presión con la punta de la aguja en la almohadilla de agar. Transfiera la diapositiva con el gusano inyectado al microscopio de disección.
- Para recuperar el gusano inyectado, primero coloque unas gotas de BU en el gusano para flotarlo fuera de la almohadilla de agar.
- Recolecte una pequeña cantidad de bacterias HB101 en una selección de gusanos. Toque el gusano con las bacterias adherentes en el pico del gusano para eliminarlo del líquido.
- Transfiera suavemente el gusano a la placa de recuperación , una placa NGM al 2% que contiene un césped HB101.
NOTA: El gusano debería comenzar a gatear en cuestión de minutos. - Después de que se hayan inyectado algunas hembras, agregue algunos machos no inyectados de la placa de origen.
NOTA: Un mínimo de un macho por cinco hembras es una buena línea de base; se prefiere un exceso de machos. - Repita todos los pasos hasta que se hayan inyectado suficientes hembras para el experimento.
- Deje a los adultos en la placa de recuperación durante al menos 1 h después de la inyección para permitir que los gusanos se recuperen y se apareen.
8. Recuperación y cultivo de Strongyloides inyectados
- Recolecte heces durante la noche de animales huéspedes no infectados, utilizando el mismo protocolo que para los animales infectados.
- Mezcle las heces no infestadas con una pequeña cantidad de carbón (proporción de heces a carbón de aproximadamente 2 a 1 para estas placas).
- Vierta una pequeña cantidad de la mezcla fecal-carbón en una placa de Petri de 6 cm forrada con papel de filtro húmedo. Asegúrese de que la mezcla no toque la tapa del plato.
- Inunde la placa de recuperación con BU. Usando un juego de pipetas a 3 μL, transfiera los gusanos a las heces en la placa fecal-carbón. Coloque los gusanos directamente sobre las heces, no sobre el carbón.
- Verifique que los adultos estén en la placa fecal-carbón con un endoscopio de disección.
- Para cultivar los gusanos, coloque la placa en una cámara humidificada, es decir, una caja de plástico con una tapa ajustada forrada con toallas de papel húmedas.
NOTA: Después de 2 días, habrá una mezcla de etapas larvales. Después de 5 días, la mayoría de las larvas se habrán convertido en iL3; quedarán algunas larvas más jóvenes. Después de 7 días, todas las larvas deben ser iL3s.
9. Recolección y cribado de larvas F 1 para recuperar transgénicos/knockouts
- Usando una configuración de Baermann, recoja las larvas de las placas de cultivo de carbón fecal a pequeña escala posteriores a la inyección. Para obtener tantas larvas como sea posible, espere al menos 2 h antes de recuperar los gusanos del aparato de Baermann.
- Concentre las larvas en un tubo de centrífuga de 15 ml como en los pasos 4.10-4.14 y transfiera las larvas a un pequeño vaso de reloj con BU.
- Si las larvas se utilizarán para experimentos de comportamiento, use placas NGM al 2% con un césped grueso de HB101 para la detección.
- Transfiera 20-30 larvas al césped HB101.
NOTA: Las bacterias ralentizarán el movimiento de las larvas. - Bajo un microscopio de disección de fluorescencia, identifique las larvas que expresan el transgén de interés. Use una púa de gusano para seleccionar las larvas transgénicas y muévalas a un pequeño vaso de reloj con BU.
- Use una nueva placa HB101 para examinar otro pequeño lote de larvas. Cuando se hayan recolectado suficientes larvas para uso experimental, trate las placas HB101 y el exceso de gusanos con yodo diluido (50% de yodo de Lugol diluido en agua) y deséchelos como desechos de riesgo biológico. Alternativamente, mate el exceso de gusanos usando un limpiador de perrera concentrado que contenga cloruros de alquil bencil amonio.
- Use los gusanos inmediatamente o déjelos en un vidrio de reloj poco profundo en una pequeña cantidad de BU durante la noche.
NOTA: Los gusanos pueden volverse hipóxicos si el líquido es demasiado profundo. Es posible que dejar larvas en BU durante la noche pueda afectar ciertos comportamientos; por lo tanto, use larvas para experimentos de comportamiento dentro de las 6 h.
- Transfiera 20-30 larvas al césped HB101.
- Si las larvas se utilizarán para microscopía y no para ensayos de comportamiento, inmovilice los gusanos mediante parálisis de nicotina de forma reversible para la detección.
- Usando una cuchilla de afeitar, puntúe una rejilla en la parte inferior de plástico de una placa de quimiotaxisde 10 cm 12 para que sea más fácil realizar un seguimiento de la ubicación de los gusanos en la placa.
- Deje caer ~ 3 μL de larvas en BU en un cuadrado en la cuadrícula. Llene tantos cuadrados como sea necesario. No use los que están cerca de los bordes de la placa, ya que las larvas pueden arrastrarse a los lados de la placa.
- Agregue gotas de 15-20 μL de nicotina al 1% en agua a las gotas de gusano.
NOTA: Después de 4 minutos, los gusanos se paralizarán. - Examine los gusanos con un microscopio de disección de fluorescencia.
- Use un pico de gusano para transferir las larvas transgénicas a un pequeño vaso de reloj con 1-2 ml de BU.
NOTA: Las larvas estarán paralizadas durante varias horas y se pueden montar fácilmente en portaobjetos de microscopio para microscopía. Si se dejan durante la noche en BU, los iL3 se recuperarán y pueden usarse para algunos ensayos o infección del huésped mamífero. Sin embargo, la parálisis de la nicotina y la incubación nocturna en BU pueden afectar ciertos comportamientos.
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Representative Results
Si el experimento tuvo éxito, las larvas de F1 expresarán el fenotipo transgén y/o mutante de interés (Figura 4). Sin embargo, las tasas de transformación son muy variables y dependen de las construcciones, la salud de los gusanos, las condiciones de cultivo posteriores a la inyección y la habilidad del experimentador. En general, un experimento exitoso producirá larvas de >15 F1 por hembra inyectada y una tasa de transformación del >3% para los marcadores fluorescentes. Si el número total de progenie viva promedia menos de 10 larvas / hembra, entonces es posible que la construcción sea tóxica y que las larvas transformadas no sobrevivan. Encontrar un gran número de huevos fluorescentes pero no larvas fluorescentes es otra indicación de que la mezcla de inyección puede ser tóxica. Al aprender la técnica por primera vez, se recomienda utilizar un constructo que se exprese bien, como act-2::mRFPmars, que impulsa la expresión robusta en el músculo de la pared corporal13 (Figura 4).
Cuando se generan mutantes por mutagénesis dirigida mediada por CRISPR/Cas9, se recomienda el uso de una plantilla de reparación que contenga un act-2::mRFPmars o act-2::GFP transgene13 para que se puedan identificar mutantes potenciales basados en la fluorescencia 9,14,15. Es importante tener en cuenta que debido a que Strongyloides expresa transgenes de matrices extracromosómicas, la progenie fluorescente F1 puede expresar mRFPmars o GFP solo desde la matriz o expresar mRFPmars o GFP tanto de la matriz como de un transgén integrado 3,9,16. Es posible identificar larvas que tienen más probabilidades de tener transgenes integrados en función del patrón de expresión fluorescente: la expresión "irregular" en el músculo de la pared del cuerpo (Figura 4A) es más común cuando el transgén no está integrado en el genoma, mientras que la expresión consistente en todo el músculo de la pared del cuerpo (Figura 4B ) a menudo, pero no siempre, indica que el transgén se ha integrado en el genoma. Sin embargo, los patrones de expresión por sí solos no se pueden usar para identificar de manera concluyente a los mutantes: algunos gusanos con expresión consistente en todo el músculo de la pared del cuerpo pueden no tener eventos de integración. Además, los patrones de expresión no pueden distinguir los mutantes que son homocigotos de los que son heterocigotos o mosaicos. Así, cada gusano debe ser genotipado por PCR 9,14,15. Al alterar genes que producen fenotipos fácilmente visibles, puede que no sea necesario usar una plantilla de reparación. Por ejemplo, la interrupción del gen Strongyloides unc-22 da como resultado un fenotipo dominante de "contracción", con tasas de interrupciones heterocigotas u homocigotas superiores al 10%9.
Figura 4: Larvas transgénicas de Strongyloides stercoralis. (A, B) Larvas de S. stercoralis que expresan un transgén act-2::mRFPmars, que se expresa en el músculo de la pared corporal13. El transgén se incorporó a una plantilla de reparación para la interrupción mediada por CRISPR / Cas9 del locus9 Ss-unc-22. (A) Una larva de S. stercoralis con un patrón de expresión de act-2::mRFPmars incompleto o "irregular" que puede indicar la expresión de una matriz extracromosómica. (B) Un S. stercoralis iL3 que expresa el patrón de expresión act-2::mRFPmars más completo que puede indicar interrupción genética e integración de la plantilla de reparación. Para A, B, los paneles muestran imágenes diferenciales de contraste de interferencia (izquierda), fluorescente (centro) y combinadas (derecha). Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Demostración del proceso de rotura de agujas para hacer una aguja utilizable. La punta de la aguja se golpea contra el borde de un fragmento de vidrio (objeto en el extremo izquierdo). Cuando emerge líquido, la aguja se tira hacia atrás y se mueve hacia abajo sobre el agar. La punta de la aguja llega a un punto afilado y el líquido fluye moderadamente rápido. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Demostración de una inyección exitosa. El brazo posterior de la gónada es visible como una estructura gris claro a la derecha. La punta de la aguja y la gónada deben estar en el mismo plano focal. Si la aguja se desliza sobre o debajo del gusano o a lo largo del cuerpo sin atrapar, ajuste la posición. La punta de la aguja sangrará ligeramente la pared del cuerpo. Un toque rápido en el soporte de la aguja conectado al micromanipulador empujará suavemente la punta a través de la pared del cuerpo y hacia la gónada. Una vez que la aguja esté dentro de la gónada, aplique presión e inyecte la solución de ADN. El líquido debe inundar visiblemente la gónada. Si la herida se cierra cuando se retira la punta de la aguja, es probable que el gusano sobreviva. Haga clic aquí para descargar este video.
Material suplementario: Mantenimiento de la tensión Strongyloides. Este protocolo describe el procedimiento de mantenimiento para S. stercoralis en jerbos y S. ratti en ratas. Incluye la dosis infecciosa utilizada para cada nematodo y huésped. Los huéspedes se infectan a través de inyecciones subcutáneas bajo anestesia. La progresión de las infecciones desde la permeabilidad hasta el pico de producción larvaria y la pérdida de permeabilidad se describe para cada combinación nematodo-huésped. También se describe el protocolo utilizado para recolectar heces infestadas y hacer las placas de cultivo de carbón fecal. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S1: Imagen de un portaobjetos de microinyección que consiste en una almohadilla de agar seca en un cobertor con un pequeño fragmento de vidrio para romper la aguja de microinyección. El contorno de agar y el contorno de fragmento se agregan aquí para mayor claridad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película suplementaria S1: Demostración de una inyección que resulta en una gónada dañada. El brazo anterior de la gónada está enfocado. La aplicación de una ligera presión muestra que la solución en la aguja todavía fluye libremente. La punta de la aguja está en el mismo plano focal que la gónada y está dirigida a un ligero ángulo. Una vez que se inserta la punta de la aguja, la solución se inyecta en el gusano y llena la gónada. Sin embargo, cuando se retira la aguja, un pedazo de la gónada sobresale a través de la herida en la cutícula. El material fluye visiblemente. Es poco probable que este gusano sobreviva. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo de microinyección detalla los métodos para introducir constructos para la transgénesis y la mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 en S. stercoralis y S. ratti. Tanto para S. stercoralis como para S. ratti, la supervivencia posterior a la inyección y la tasa de transgénesis o mutagénesis están sujetas a varias variables que pueden ajustarse.
La primera consideración crítica para una transgénesis exitosa es cómo se construyen los transgenes plásmidos. Estudios previos han encontrado que la expresión de transgenes exógenos en Strongyloides requiere el uso de promotores de Strongyloides 5' y 3' elementos UTR 3,13,19. Similar a las construcciones de C. elegans, las construcciones de Strongyloides generalmente usan un promotor específico del gen y una UTR común de 3', como la del gen Ss-era-1 13. La optimización del codón de la región codificante también puede ser importante para la expresión en Strongyloides. Recientemente, se desarrolló el Wild Worm Codon Adaptor, una aplicación basada en la web que optimiza las secuencias de codificación de codones para Strongyloides y otros nematodos20. Finalmente, aunque no se ha probado rigurosamente en Strongyloides, se ha demostrado que los intrones aumentan la expresión de transgenes exógenos tanto en C. elegans21 como en el nematodo asociado a insectos Pristionchus pacificus22 y se presume que también aumentan la expresión en Strongyloides. El wild Worm Codon Adaptor tiene opciones para incluir hasta tres intrones en la secuencia modificada20.
La composición y la entrega de la mezcla de microinyección afectan la tasa de transgénesis y la supervivencia de la progenie F1 . La solución salina BU se usa rutinariamente como diluyente para mezclas, aunque el uso de ddH2O también es una opción. Las concentraciones y/o la proporción de componentes en la mezcla se pueden ajustar para mejorar la tasa de transformación. Las concentraciones más altas de los plásmidos de interés pueden aumentar la tasa de transgénesis, pero a menudo resultan en menos progenie total. Si no se observa expresión de transgenes o solo se encuentran huevos transgénicos muertos, es posible que los transgenes sean tóxicos o que algo en las reservas de plásmidos esté causando la muerte de los transgénicos. En este último caso, la fabricación de nuevas existencias de plásmidos utilizando un método diferente (por ejemplo, utilizando un kit de miniprep diferente) puede ser suficiente para obtener transgénicos. La adición de lipofectamina a la mezcla de microinyección también puede mejorar la tasa de transgénesis23.
La forma de la aguja de microinyección que administra la mezcla también afecta las tasas de supervivencia y transgénesis (Figura 3A-F, Video 1, Video 2 y Video Suplementario S1). La aguja debe ser lo suficientemente afilada como para penetrar en la cutícula y lo suficientemente estrecha como para no provocar daños excesivos. Se recomienda tirar de las agujas justo antes de su uso, ya que las agujas almacenadas durante más de un día pueden acumular desechos y obstruirse durante las microinyecciones. La recuperación de las hembras inyectadas de la almohadilla de microinyección sin dañarlas se puede lograr con algunos métodos diferentes. Una técnica es hacer flotar los gusanos de la almohadilla de inyección en una gota de BU, y luego usar HB101 en una selección de gusanos para recolectar los gusanos. Otras técnicas para la recuperación incluyen flotar los gusanos en BU y recolectarlos usando una punta de pipeta o un pincel pequeño o simplemente usando una púa de gusano sola para mover los gusanos a una placa de recuperación.
Si no se obtuvo progenie de las hembras microinyectadas, esto sugiere que las hembras inyectadas fueron dañadas en el proceso de microinyección o las condiciones de cultivo posteriores a la inyección fueron subóptimas. Hay una serie de diferentes condiciones de cultivo posteriores a la inyección que se pueden probar. Los cultivos de carbón fecal a pequeña escala descritos anteriormente generalmente apoyan una mejor supervivencia del gusano que las placas NGM con HB101. Sin embargo, puede ser difícil seguir la supervivencia de los gusanos inyectados y el desarrollo de las larvas F1 en placas fecales-carbón, y los huevos no son visibles en estas placas. Una ventaja de cultivar gusanos en placas NGM con HB101 en lugar de placas fecales-carbón es permitir una observación cuidadosa de la puesta de huevos y el desarrollo larvario, lo que puede ser útil para la solución de problemas. Las placas V12 con HB101 también se pueden utilizar para aumentar la supervivencia24. Finalmente, se puede usar una placa de quimiotaxis12 con un solo gránulo fecal de rata para el cultivo posterior a la inyección de S. ratti . Los machos y las hembras inyectadas se transfieren directamente a la bolita fecal de rata. En 5-7 días, los gusanos se recogen del agar y las heces utilizando un aparato de Baermann, como se describió anteriormente.
Para obtener Strongyloides adultos para microinyección, las placas fecales-carbónicas recién preparadas se pueden incubar a 25 °C durante 24 h o 20 °C durante 48 h. Los adultos strongyloides criados a 25 °C durante 24 h son lo suficientemente jóvenes como para producir un gran número de progenie25. Sin embargo, si las hembras son demasiado jóvenes, es posible que no sobrevivan al proceso de microinyección. Los adultos recolectados de placas fecales-carbón que se han incubado a 20 ° C durante ~ 48 h tienen más probabilidades de tolerar el proceso de microinyección. Sin embargo, debido a que estos adultos son mayores que los adultos obtenidos de una incubación de 24 h a 25 °C, no son tan fecundos y pueden tener una tasa de transformación más baja. Los novatos pueden preferir comenzar con adultos mayores y luego cambiar a adultos ligeramente más jóvenes a medida que mejoran las habilidades.
Al igual que C. elegans, las especies de Strongyloides pueden expresar transgenes de matrices extracromosómicas y construcciones integradas en el genoma en la generación F1 . A diferencia de C. elegans, las especies de Strongyloides solo expresarán transgenes integrados en el genoma en F2 y generaciones posteriores, aunque las matrices extracromosómicas aún sean detectables por PCR13. Las larvas transgénicas F1 que expresan matrices extracromosómicas se pueden utilizar para experimentos que no requieren integración del genoma o un gran número de gusanos transgénicos. La integración del genoma puede ser necesaria para experimentos que requieren etiquetar genes endógenos o probar un gran número de gusanos en ensayos basados en la población. Existen dos métodos para la integración del genoma de los transgenes en Strongyloides: la integración mediada por transposones piggyBac17 y la integración mediada por CRISPR/Cas99. La integración mediada por transposones de piggyBac utiliza la transposasa piggyBac para dirigir la carga a los sitios TTAA en el genoma26. Debido a que el motivo TTAA es bastante común en el genoma rico en AT de las especies de Strongyloides, la integración es a menudo en más de un sitio en el genoma. Por el contrario, la integración mediada por CRISPR/Cas9 se puede utilizar para integrar transgenes en un locus objetivo específico9.
El sistema CRISPR/Cas9 también se puede utilizar para generar knockouts genéticos dirigidos 9,27. Debido a la riqueza en AT del genoma de Strongyloides, encontrar sitios objetivo Cas9 utilizables que contengan la secuencia óptima de 5'-N18GGNGG-3' para nematodos28 es un desafío. Con frecuencia, solo hay uno o dos sitios en un gen para la orientación. El método preferido implica la integración de una plantilla de reparación que contiene un transgén con un marcador fluorescente por reparación dirigida por homología en el locus genómico, lo que resulta en una interrupción completa del gen. Los knockouts potenciales pueden ser identificados por la expresión del transgén 9,14,15,29. Sin embargo, la expresión transgénica por sí sola no es indicativa de genotipo, ya que la expresión de matrices frente a transgenes integrados a menudo es indistinguible. Así, las larvas transgénicas F1 requieren genotipado post-hoc para identificar knockouts homocigotos9. En ausencia de una plantilla de reparación, la mutagénesis del locus objetivo ocurre a alta frecuencia, pero puede resultar en grandes deleciones9.
Aunque la generación de larvas F1 transgénicas o mutantes es relativamente sencilla en S. stercoralis, la generación de líneas estables es extremadamente difícil debido a la necesidad de paso del huésped. En el laboratorio, el jerbo mongol es un huésped permisivo para S. stercoralis pero requiere una alta dosis de gusanos para establecer una infección capaz de producir suficientes larvas F2 para establecer la línea30. Solo aproximadamente el 6% de las larvas infecciosas se convierten en hembras parásitas30. Además, si las larvas transgénicas tienen expresión de matriz sin integración del genoma, no producirán la progenie que expresa transgenes requerida para infectar a un segundo huésped jerbo. Para aumentar las posibilidades de que un número suficiente de larvas integradas en el genoma se conviertan en adultos parásitos reproductivos, se recomienda un mínimo de 400-500 larvas transgénicas en el inóculo inicial. Puede ser posible reducir el número de larvas necesarias para establecer una infección patente mediante el tratamiento de los jerbos con prednisona30. Sin embargo, es probable que sea difícil acumular suficientes gusanos transgénicos o mutantes integrados para establecer con éxito una línea estable de S. stercoralis. Sin embargo, generalmente es factible acumular un número suficiente de larvas transgénicas de S. stercoralis F1 para ensayos de un solo gusano14,15.
Strongyloides ratti tiene la clara ventaja de la mayor factibilidad de generar líneas transgénicas o knockout estables17,31. Las hembras adultas de vida libre de S. ratti son menos tolerantes al proceso de microinyección que las hembras adultas de vida libre de S. stercoralis; Las hembras de S. ratti generalmente producen menos larvas en general que las hembras de S. stercoralis, y la tasa de transformación también es menor31. Sin embargo, solo se requieren unas pocas larvas F1 transgénicas o knockout para establecer una línea estable de S. ratti. Como S. ratti es un parásito natural de las ratas, solo unas pocas larvas infecciosas de S. ratti son suficientes para establecer una infección patente32. Por lo tanto, generalmente es posible acumular un número suficiente de larvas transgénicas o mutantes para establecer una línea estable. Debido a que las especies de Strongyloides no expresarán matrices extracromosómicas más allá de la generación F1, solo las larvas F1 integradas en el genoma pueden producir una línea transgénica estable13. En general, es imposible identificar gusanos con transgenes integrados antes del genotipado, por lo que el protocolo es recolectar todas las larvas transgénicas de F1 e inyectarlas en una rata. Un pequeño porcentaje de estas larvas tendrá el evento de integración deseado; estas larvas formarán la base de la línea estable. Como el método piggyBac a menudo resulta en más de un evento de integración en cualquier gusano individual, se puede lograr casi el 100% de transmisión del transgén después de unas pocas rondas de larvas transgénicas de paso a través de una rata17.
En resumen, la técnica aquí descrita puede ser utilizada para generar transgénicos o knockout S. stercoralis y S. ratti. Esto permite una amplia gama de experimentos potenciales, que incluyen, entre otros, la expresión de transgenes específicos de la célula, la generación de mutantes y el marcado endógeno de proteínas para determinar las funciones espaciales y temporales 14,15,29,33,34,35. A largo plazo, el conocimiento obtenido del uso de Strongyloides transgénicos se puede utilizar para desarrollar nuevas estrategias para combatir las infecciones humanas con S. stercoralis y otros nematodos parásitos intestinales.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
pPV540 y pPV402 fueron amables regalos del Dr. James Lok de la Universidad de Pensilvania. Agradecemos a Astra Bryant por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por un Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, un Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award y National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
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