Summary
המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי. לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.
Abstract
המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים ורגולטוריים מרכזיים הקובעים את אספקת האנרגיה, כמו גם את הבריאות הכללית של התא. בשריר השלד, המיטוכונדריה קיימת בסדרה של מורפולוגיות מורכבות, החל מאברונים אליפטיים קטנים ועד לרשת רחבה דמוית רשת רטיקולום. הבנת האופן שבו הרשתית המיטוכונדריאלית מתרחבת ומתפתחת בתגובה לגירויים מגוונים כגון שינויים בביקוש לאנרגיה כבר מזמן נושא למחקר. היבט מרכזי של גידול זה, או ביוגנזה, הוא ייבוא של חלבונים קודמים, המקודדים במקור על ידי הגנום הגרעיני, מסונתזים בציטוסול, והועברו לתאי משנה מיטוכונדריאליים שונים. המיטוכונדריה פיתחה מנגנון מתוחכם לתהליך יבוא זה, הכולל ערוצי ממברנה פנימיים וחיצוניים סלקטיביים רבים, המכונים מכונות ייבוא החלבון (PIM). הייבוא לתוך המיטוכונדריון תלוי בפוטנציאל הממברנה המעשית ובזמינות של ATP שמקורו באברונים באמצעות זרחן חמצוני. לכן המדידה שלה יכולה לשמש מידה של בריאות האברונים. ה- PIM מציג גם רמה גבוהה של פלסטיות אדפטיבית בשריר השלד המצמידה בחוזקה למצב האנרגיה של התא. לדוגמה, אימון תרגיל הוכח כדי להגדיל את יכולת הייבוא, בעוד שימוש בשרירים מפחית אותו, בקנה אחד עם שינויים סמנים של תוכן מיטוכונדריאלי. למרות ייבוא חלבון הוא צעד קריטי ביוגנזה והתרחבות של המיטוכונדריה, התהליך אינו נחקר באופן נרחב בשריר השלד. לכן, מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במיטוכונדריה מבודדת ותפקודית מלאה משריר השלד כדי למדוד את יכולת ייבוא החלבון על מנת לקדם הבנה טובה יותר של השיטות המעורבות והערכה של חשיבות המסלול למחזור האברונים בפעילות גופנית, בריאות ומחלות.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים הקיימים במורפולוגיות מורכבות בסוגי תאים שונים ומוכרים כבעלי מערך הולך וגדל של פונקציות קריטיות לבריאות התא. ככאלה, הם כבר לא יכולים להיות מגולפים רק לאברונים המייצרים אנרגיה. המיטוכונדריה הם רגולטורים מטבוליים מרכזיים, דטרמיננטים של גורל התא, ורכזות איתות, הפונקציות של אשר יכול לשמש אינדיקטורים שימושיים של בריאות הסלולר הכללית. בתאי שריר השלד, מחקרי מיקרוסקופיה אלקטרונים חושפים את נוכחותם של תת-עכבישים מובהקים מבחינה גיאוגרפית (SS) ומיטוכונדריה בין-מיומיופיברילר (IMF), המציגים מידה מסוימת של קישוריות1,2,3,3,4 המוכרת כיום כדינמית מאוד ומסתגלת לשינויים ברמות פעילות שרירי השלד, כמו גם עם גיל ומחלות. תוכן מיטוכונדריאלי ותפקוד בשרירים ניתן להעריך בדרכים רבות5,6, ושיטות מסורתיות של בידוד אברונים הוחלו כדי להבין טוב יותר את היכולות הנשימתיות והאנזימטיות (Vmax) של המיטוכונדריה השונה מהשפעת המילייה התאי7,8. בפרט, שיטות מסורתיות אלה חשפו הבחנות ביוכימיות עדינות בין המיטוכונדריה המבודדת מאזורים תת-קרקעיים ואינטרמיופיברילרים, תוך הסתמכות על השלכות תפקודיות אפשריות על חילוף החומרים באזורים תת-תאיים אלה8,9,10,10,11.
הביוגנזה של המיטוכונדריה ייחודית בדרישה לתרומתם של מוצרי גנים הן מהדנ"א הגרעיני והן מהדנ"א המיטוכונדריאלי. עם זאת, הרוב המכריע של אלה נגזרים מהגרעין מאז שעתוק mtDNA רק מוביל לסינתזה של 13 חלבונים. מאז המיטוכונדריה בדרך כלל מורכבים >1000 חלבונים המעורבים במסלולים מטבוליים מגוונים, biogenesis של האברונית דורש אמצעי מוסדר היטב של ייבוא והרכבה של חלבונים מבשר מן הציטוסול לתוך תת-תאים מיטוכונדריאליים שונים כדי לשמור על stoichiometry תקין ותפקוד12,13. חלבונים המקודדים בגרעין המיועדים למיטוכונדריה נושאים בדרך כלל רצף מיקוד מיטוכונדריאלי (MTS) המכוון אותם לאברון ומאפשר את הלוקליזציה התת-מידורית שלהם. רוב החלבונים הקשורים למטריקס מכילים MTS N-terminal ניתן לסדוק, ואילו אלה המיועדים לקרום המיטוכונדריאלי החיצוני או הפנימי בדרך כלל יש תחומי מיקוד פנימיים14. תהליך הייבוא מתבצע על ידי קבוצה של ערוצים מגוונים המספקים אפיקים מרובים לכניסה לאברוגל13. הטרנסלוקאז של הממברנה החיצונית (TOM) מבשרי מבשרי מבשרי מהציטוסול לחלל הבין-קרקעי, שם הם מוכרים על ידי הטרנסלוקאז של קומפלקס הממברנה הפנימית (TIM). קומפלקס זה אחראי לייבוא מבשרי המקודדים בגרעין לתוך המטריצה, שם פרוטאזים מבקעים את מסוף N-terminal מיקוד presequence. חלבונים המיועדים לקרום החיצוני ניתן להכניס ישירות לתוך קרום זה דרך קומפלקס TOM, בעוד אלה המיועדים הממברנה הפנימית מוכנסים על ידי חלבון TIM, במיוחד TIM22. לאחר היבוא שלהם, חלבונים מעובדים עוד יותר על ידי פרוטאזים מקומיים ומלווים ולעתים קרובות לשלב כדי ליצור מתחמים גדולים יותר, כגון אלה שנמצאו בשרשרת הובלת האלקטרונים.
ייבוא חלבון מיטוכונדריאלי עצמו משמש גם כמדידה של בריאות המיטוכונדריה, שכן תהליך זה מסתמך על נוכחות של פוטנציאל ממברנה ומקור אנרגיה בצורה של ATP15. לדוגמה, כאשר פוטנציאל הממברנה מתפוגג, חלבון קינאז PINK1 לא יכול להילקח על ידי האברונית, וזה מוביל לאותות זרחן המפעילים את הופעת השפלה של האברונית דרך מסלול שנקרא mitophagy16,17. בנסיבות דומות, כאשר הייבוא מונע, החלבון ATF5 אינו יכול להיכנס לאברוגל, ולאחר מכן הוא עובר לגרעין, שם הוא משמש כגורם שעתוק לרגולציה של ביטוי הגנים UPR18,19. לפיכך, מדידת יעילות יבוא החלבון יכולה לספק תובנה מקיפה על בריאות האברונים, בעוד שניתן להשתמש בתגובת ביטוי הגנים כדי לציין את מידת האיתות המדרדר לגרעין.
למרות חשיבותו הברורה לביוגנזה של המיטוכונדריה ולבריאות התאים בכלל, מסלול היבוא במיטוכונדריה היונקים אינו מוערך להפליא. בדו"ח זה אנו מתארים את הצעדים הספציפיים הכרוכים במדידת ייבוא חלבונים מבשרים למיטוכונדריה של שרירי השלד ומספקים נתונים הממחישים את התגובה האדפטיבית של מערכת היבוא לשינויים בשרירים ובשימוש לרעה, הממחישים את תרומתו של יבוא החלבון לפלסטיות האדפטיבית של שרירי השלד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים המשמשים בניסויים אלה מתוחזקים במתקן לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יורק. הניסויים נערכים בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים באישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יורק (היתר: 2017-2008).
1. בידוד פונקציונלי של מיטוכונדריה תת-קרקעית ואינטרמיופיברילרית משריר השלד
- הכנה ריאגנט:
- הכן את כל המאגרים והמדיה כאמור בטבלה 1.
- הגדר את המאגרים ל- pH 7.4 ואחסן בטמפרטורה של 4 °C (עד שבועיים), למעט פרוטאז נגרז.
- הכינו פרוטאז נאגרס טרי (טבלה 1) בכל פעם.
- הסרת רקמות וכרייה
הערה: תרשים זרימה של השלבים שלהלן לבידוד המיטוכונדריה מסופק באיור 1.- מלא בקבוקון ניצוץ זכוכית עם ~ 20 מ"ל של חוצץ 1 (טבלה 1) ומניחים אותו על קרח.
- בעוד העכבר נמצא תחת הרדמה, שרירי השלד לקצור (tibialis הקדמי, quadriceps, gastrocnemius וכו '), כ 500-1000 מ"ג, ומניחים את השרירים בקבוקון הנוצץ המכיל חיץ צונן 1.
הערה: איזופלוריין גזי משמש כהרדמה ב 2.5% בקצב זרימה של 0.4 L של O2 / min. מתבצעת בדיקת צביטה כדי לוודא שהחיה אינה מגיבה. - לאחר איסוף רקמות, המתת חסד החיה באמצעות נקע צוואר הרחם.
- לפני לצנן שעון על קרח. הסר כל שומן או רקמת חיבור מהשרירים וטחון את הרקמה על זכוכית השעון עד שהוא תרחיף הומוגני.
- מניחים את הרקמה הטחונה בצינור צנטריפוגה מפלסטיק מצונן מראש של 50 מ"ל (ראו טבלת חומרים) ומתעדים את המשקל המדויק.
- לדלל את הרקמה הטחונה פי 10 עם חוצץ 1 + ATP (טבלה 1).
- הומוגניזציה של דגימת השריר באמצעות הומוגניזר בעל להב כפול בקוטר 8 מ"מ (ראה טבלת חומרים) בתפוקת הספק של 9.8 הרץ למשך 10 שניות, מה שמבטיח שלא יישארו נתחי שריר נראים לעין.
- צנטריפוגה הדגימות ב 800 x g במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה (ראה טבלת חומרים).
הערה: מטרת שלב זה היא להפריד בין שברים מיטוכונדריאליים של SS וקרן המטבע הבינלאומית. הסופרנאט מכיל מיטוכונדריה של האס.אס, ואילו הכדור מכיל מיטוכונדריה של קרן המטבע הבינלאומית.
- בידוד מיטוכונדריאלי של האס.אס
- לסנן את supernate דרך שכבה אחת של מטלית גבינה לתוך קבוצה אחרת של צינורות צנטריפוגה פלסטיק 50 מ"ל כדי להסיר כל פסולת גדולה או מזהמים.
- צנטריפוגה supernate ב 9,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F) באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- להשליך את supernate ו resuspend את הכדור ב 3.5 מ"ל של מאגר 1 + ATP.
הערה: בצעו שימוש חוזר עם P1000 ועשו זאת בזהירות. המיטוכונדריה הם אברונים שבירים. בצע בעדינות ולהימנע מלגעת בכדור עם קצה פיפטה. - צנטריפוגה המדגם ב 9,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F) באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- השלך את supernate אלא אם כן עיבוד נוסף כדי לבודד שבר ציטוסולי נטול גרעינים, מיטוכונדריה, ואברונים אחרים הוא הרצוי. resuspend את הכדור בזהירות בערך 95 μL של מדיום resuspension (טבלה 1) באמצעות פיפטה P200.
הערה: בדומה לשלב 1.3.3, הימנעו מלגעת בכדור עם קצה הפיפטה. נפח של מדיום resuspension ניתן לשנות בהתאם לגודל של הכדור. זהו שבר המיטוכונדריה של האס.אס, שניתן לאחסן על קרח עד ששבר קרן המטבע הבינלאומית מבודד. אם תרצה, השבר הציטוסולי, נטול אברונים, יכול להיות מבודד על ידי צנטריפוגה supernate ב 100,000 x g ב ultracentrifuge (ראה טבלת חומרים) ולאחר מכן להשליך את הכדור.
- בידוד מיטוכונדריאלי של קרן המטבע הבינלאומית
- לדלל את הכדור משלב 1.2.8 על ידי פי 10 חוצץ 1 + ATP. resuspend באמצעות עלה טפלון על ידי ערבוב עדין של הכדור ולחוצץ יחד עד המדגם עקבי.
- הומוגניזציה של המדגם באמצעות הומוגניזר בעל להב כפול 8 מ"מ (ראה טבלת חומרים) בתפוקת הספק של 9.8 הרץ עבור 10 שניות.
- צנטריפוגה המדגם ב 800 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- השלך את supernate ודלל את גלולה מיטוכונדריאלית IMF 10-פי 10 באמצעות Buffer 2 ו resuspend באמצעות עלה טפלון על ידי ערבוב עדין עד שהוא הומוגני.
- מוסיפים 25 μL / g של רקמה ל 10 מ"ג / מ"ל פרוטאז nagarse (טבלה 1) ומניחים את צינור צנטריפוגציה על צידו על קרח, בעדינות ערבוב כל דקה על ידי נדנדת הצינור מצד לצד.
הערה: התוספת של nagarse מסייעת לשחרר את המיטוכונדריה של קרן המטבע הבינלאומית על ידי ביצוע עיכול מוגבל של myofibrils. - לאחר 5 דקות, להוסיף 20 מ"ל של חוצץ 2 (טבלה 1) כדי לדלל את פרוטאז nagarse עד כדי חוסר פעילות ולעצור את העיכול.
- מיד צנטריפוגה המדגם ב 5,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F) באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- יש להשליך את הסופר-נינט ולדלל את הכדור פי 10 באמצעות Buffer 2 ולנצל מחדש באמצעות עלה טפלון על ידי ערבוב עדין.
- צנטריפוגה המדגם ב 800 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (50 °F) כדי גלולה את החומר הסיבי.
- יוצקים את supernate בסט חדש של צינורות צנטריפוגה פלסטיק 50 מ"ל, נזהר לא לשבש את הכדור, אשר ניתן להשליך.
- צנטריפוגה המדגם ב 9,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F) כמו בשלב 1.4.7.
- יש להשליך את הסופר-צינור, להוסיף 3.5 מ"ל של Buffer 2 ולחדש בעדינות את הכדור באמצעות פיפטה P1000.
- צנטריפוגה המדגם ב 9,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F) כמו בשלב 1.4.7.
- להשליך את supernate ו resuspend את הכדור בעדינות עם בערך 180 μL של מדיום resuspension באמצעות פיפטה P200.
הערה: ניתן לשנות את הנפח של מדיום resuspension בהתאם לגודל הגלולה. זהו שבר המיטוכונדריאלי של קרן המטבע הבינלאומית, אשר ניתן לאחסן על קרח עד שהוא ישמש בבדיקת הייבוא.
2. יבוא חלבון מיטוכונדריאלי
- In vitro שעתוק
הערה: השלבים הבאים מתארים כיצד להכין חלבון עם פעמון רדיו לייבוא. מסלול הייבוא הנחקר עשוי להכתיב את הבחירה של חלבון היעד, למשל, כדי להעריך את הייבוא לתוך מטריצת המיטוכונדריה, אורניתין קרבאמיל transferase, OCT, ו malate dehydrogenase, MDH, נמצאים בשימוש נפוץ, בעוד Tom40 משמש בדרך כלל כאינדיקציה לייבוא לתוך הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. עבור השלבים הבאים, פלסמיד DNA קידוד החלבון של בחירה נדרש. שעתוק של DNA פלסמיד יכול להיעשות לפני הבידוד המיטוכונדריאלי ביום נפרד, ואת mRNA שנאסף מניסוי זה ניתן לאחסן ולהשתמש בניסויי תרגום וייבוא עתידיים.- ליניאריזציה של ה- DNA: לשלב 40 μL של DNA פלסמיד (5 מיקרוגרם / μL), 5 μL של מאגר אנזים 10x ו 5 μL של אנזים הגבלה ודגרה ב 37 °C (37 °C ( 30 ° C ( 30 דקות ).
הערה: אנזימי ההגבלה המשמשים עשויים להשתנות בהתאם לפלסמיד, אשר עשוי לדרוש מאגר אנזימים שונה, וניתן להשתמש בדנ"א של תנאי הניסוי בכל כמות/נפח, שכן ניתן לשנות את קנה המידה של התבנית למעלה או למטה. - לטהר ולזרז את ה- DNA הליניארי באמצעות פנול ואתנול. בצע את כל השלבים הבאים (2.1.3-2.1.15) בצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל, והשתמש בצנטריפוגה שולחנית (ראה טבלת חומרים) לשלבי הצנטריפוגה.
- הוסף את הנפח המתאים של H2O סטרילי כך שהנפח הסופי שווה ל- 400 μL. לאחר מכן, להוסיף 400 μL של פנול.
- מערבבים במרץ על ידי היפוך עבור ~ 10 s, וצנטריפוגה ב 17,000 x g במשך 1 דקה ב 4 °C (65 °F). לסגת ולשמור את השלב העליון.
- הוסף 400 μL של פנול:כלורופורם:isoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
- מערבבים במרץ על ידי היפוך ~ 10 s, וצנטריפוגה ב 17,000 גרם במשך 1 דקה ב 4 °C (4 °F). לסגת ולשמור את השלב העליון.
- הוסף 400 μL של כלורופורם:isoamylalcohol (24:1, v:v).
- מערבבים במרץ על ידי היפוך ~ 10 s, וצנטריפוגה ב 17,000 גרם במשך 1 דקה ב 4 °C (4 °F). לסגת ולשמור את השלב העליון.
- מוסיפים 40 μL של 3M נתרן אצטט (pH 7.0), ולהוסיף 1 מ"ל של 95% אתנול.
- מניחים צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל במקפיא של 80 מעלות צלזיוס על צדם למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה הדגימות ב 17,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F ).
- להשליך את supernate ולשטוף את הכדור עם 300 μL של 80% אתנול.
- צנטריפוגה הדגימות ב 17,000 x g במשך 2 דקות ב 4 °C (4 °F).
- השליכו את הסופרנאט וייבשו את הכדור באוויר. ברגע שהכדור יבש, זה צריך להיות ברור.
- Resuspend את הכדור ב 20 μL של H2O סטרילי
- מדוד את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים) וודא שיחס A260:280 הוא מעל 1.8.
- לדלל את ה- DNA לריכוז של 0.8 מיקרוגרם / μL ב H2O סטרילי.
- לתמלל את ה- DNA: לשלב פלסמיד (0.8 מיקרוגרם / μL, 60.8 μL), H2O סטרילי (8.4 μL), 10 mM NTP (5.2 μL), 10 mM ATP ( 10.0 μL), 1 מ"מ M-7-G (11.6 μL), התערובת כאמור שלב 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) ו RNA פולימראז מתאים (4.8 μL) כדי ליצור "תערובת תגובה אחת" (נפח כולל = 121.6 μL) ודירה במשך 90 דקות בטמפרטורה האופטימלית עבור פולימראז (37 °C עבור T7 פולימראז; 40 °C (40 °F) עבור SP6 פולימראז)
- כדי להכין את התערובת להוסיף 200 μL של 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL של 1 M MgAc2, 500 μL של 4 M KAc, 100 μL של 20 mM spermidine, 100 μL של 0.5 M DTT, ו 200 μL של H20 סטרילי.
הערה: ניתן לשנות את קנה המידה של התגובה למעלה או למטה בנפח כל עוד הפרופורציות המסופקות של ריאגנטים נשמרות. פולימראז RNA בשימוש מוכתב על ידי רצף מקדם חיידקים בתוך הפלסמיד המשמש. - לאחר מכן, לטהר ולזרז את mRNA באמצעות פנול ואתנול כמו בשלבים 2.1.2-2.1.15. להביא את עוצמת הקול עד 400 μL עם H2O סטרילי (להוסיף 280 μL) ולהמשיך כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.15. Resuspend הכדור הסופי ב 20 μL של H2O סטרילי.
- למדוד את הריכוז של mRNA באמצעות spectrophotometer, להבטיח כי יחס A260:280 הוא ~ 2.0.
- לדלל את mRNA ל 2.8 מיקרוגרם / μL ב H2O סטרילי, ולאחסן ב -20 °C (50 °F) ב 50 μL aliquots.
- ליניאריזציה של ה- DNA: לשלב 40 μL של DNA פלסמיד (5 מיקרוגרם / μL), 5 μL של מאגר אנזים 10x ו 5 μL של אנזים הגבלה ודגרה ב 37 °C (37 °C ( 30 ° C ( 30 דקות ).
- תרגום במבחנה
הערה: התרגום של ה- DNA הרצוי חייב להתבצע באותו יום של ניסוי הייבוא. ניסוי זה דורש שימוש בחומצות אמינו בעלות תווית רדיו, ולכן על המשתמש להיות בעל היתר לשימוש ברדיואיזוטופים, וכל הטיפול וההשלכה חייבים להיות בהתאם למדיניות /דרישות המוסד. צעדים הקשורים לאמצעי בטיחות רדיואיזוטופים הושמטו או תוארו בקצרה, שכן סביר להניח שאלה יהיו שונים בהתבסס על המוסד.- הכן מספיק תערובת תגובת תרגום (טבלה 2) כדי לספק ~ 20 μL לכל מדגם של המיטוכונדריה לשימוש בניסוי הייבוא ולכלול את אותו אמצעי אחסון עבור נתיב תרגום.
- לדגור את התגובה במשך 30 דקות ב 30 °C (30 °C (הזמן עשוי להשתנות עם mRNA, 25-60 דקות).
- הקליטו את השימוש ב-35S-מתיונין בהתאם לדרישות הבטיחות הרדיואקטיביות של המוסד והשליכו מכל מה שבא במגע עם הרדיואיזוטופ בהתאם להנחיות המוסד.
- יבוא חלבונים
הערה: המיטוכונדריה המבודדת טרייה נדרשת לשלבים הבאים. עיין בפרוטוקול הבידוד המיטוכונדריאלי. שיטות בידוד אחרות ניתן להשתמש כל עוד המיטוכונדריה הם קיימא ופונקציונלי. עבור השלבים הבאים, הדגימות המיטוכונדריאליות המיטוכונדריאליות המנוצלות מופנות מחדש במאגר resuspension כמתואר לעיל (טבלה 1). ריכוז החלבון של המדגם המיטוכונדריאלי חייב להימדד גם לפני תחילת בדיקת הייבוא.- בערך 15 דקות לאחר תחילת תגובת התרגום, aliquot 90 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל מראש דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך כ 10 דקות.
הערה: Aliquot יותר מיטוכונדריה ממה שישמש בפועל בניסוי; רק 75 מיקרוגרם ישמשו בפועל. עם זאת, aliquoting עודף אינו דרישה. - בסט טרי של צינורות סטריליים 1.5 מ"ל, לשלב 75 מיקרוגרם של מיטוכונדריה עם 18 μL של תגובת התרגום ודגר ב 30 °C (50 °F) לזמן הרצוי.
- שמור את הנפח הנותר של תגובת התרגום על קרח; זה ינוצל מאוחר יותר.
הערה: ייבוא הוא תהליך תלוי זמן, ולכן זה עשוי להיות זהיר להתחיל עם ניסוי קורס זמן החל זמני דגירה בין 1-60 דקות. זמן תגובה טיפוסי הוא 30 דקות. - במהלך תקופה זו, להכין את כרית סוכרוז על ידי שילוב 1 גרם של סוכרוז, 200 μL של 2.5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL של 1 M HEPES (pH 7.4), ולהביא את הנפח ל 5 מ"ל באמצעות H2O סטרילי.
- הכן קבוצה חדשה של צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל המתאימים לכל צינור בתגובת הייבוא. Aliquot 600 μL של כרית סוכרוז לתוך כל צינור ולשמור על קרח עד תגובת הייבוא נגמרת.
- כדי לסיים את תגובת הייבוא לאחר זמן הדגירה המתאים, להסיר את הצינור מ 30 °C (50 °F), למקם אותו על קרח ולאחר מכן להעביר בזהירות את תגובת הייבוא על גבי הצינור עם כרית סוכרוז.
הערה: שלב זה צריך להיעשות לאט מאוד כדי להבטיח כי המיטוכונדריה לא ניזוק / קרע. כרית הסוכרוז מסייעת להאט את נדידת המיטוכונדריה ו"מרפדת " את ירידתה לתחתית הצינור במהלך שלב הצנטריפוגה שלאחר מכן. - צנטריפוגה הדגימות + כרית סוכרוז ב 17,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (4 °F).
- הכן את חיץ שבירה על ידי שילוב של 25 מ"ל של 2.4 M סורביטול, 2 מ"ל של 1 M HEPES (pH 7.4), ו 72 מ"ל של H2O מזוקק כפול.
- הכן מאגר תמוגה עבור אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE: לשלב 50 מ"ל של גליצרול מחומם, 11.5 גרם של SDS, 31.25 מ"ל של 1 M Tris (pH 6.8) ולהביא את נפח ל 500 מ"ל עם H2O מזוקק כפול.
- להכנת מדגם, לערבב 475 μL של מאגר תמוגה עם 25 μL של β-mercaptoethanol לשמש בשלב מאוחר יותר.
הערה: ניתן ליצור מאגר תמוגה מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר; עם זאת, התוספת של β-mercaptoethanol היא להיעשות טרי. - באמצעות פיפטה P1000, להסיר בזהירות את supernate ולא להפריע את הכדור. השלך את supernate במיכל פסולת רדיואקטיבית מתאימה.
- לייבוא לתוך הממברנה החיצונית, לבצע את זה באמצעות Tom40, resuspend את הכדור ב 50 μL של טרי מוכן 0.1 M נתרן קרבונט (pH 11.5) ודגור על קרח במשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה, צנטריפוגה המדגם 14,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). שלב זה נעשה רק עבור תגובות ייבוא ממברנה חיצונית.
- כדי להכין את הדגימות עבור אלקטרופורזה SDS-PAGE, להוסיף 20 μL של חיץ שבירה, 20 μL של מאגר תמוגה, ו β-mercaptoethanol ו resuspend היטב. הוסף 5 μL של צבע מדגם.
- הכן את נתיב הבקרה/ התרגום על ידי שילוב של 3 μL של תגובת התרגום הנותרת משלב 2.3.3 עם 37 μL של מאגר תמוגה ו 5 μL של צבע מדגם. מערבבים היטב.
- מרתיחים את הדגימות במשך 5 דקות ב 95 °C (55 °F) ומסתובבים בעדינות במהירות נמוכה, כדי למנוע מיטוכונדריה גלולה.
- החל את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS.
הערה: אחוז הג'ל וזמן הריצה שלאחר מכן יהיו תלויים בחלבון שיובא. לדוגמה, OCT הוא 37 kDa, והלהקה המעובדת הבוגרת שלו קטנה מעט יותר; לכן, ג'ל 12% מאפשר הפרדה טובה של רצועות אלה. - לאחר אלקטרופורזה הושלמה, להסיר את הג'ל ומניחים אותו H2O מזוקק כפול.
- מרתיחים את הג'ל ב 5% TCA במכסה המנוע אדים במשך 5 דקות, ערבוב מתמיד / הזזת הג'ל כדי למנוע פיצוח.
הערה: TCA עוזר לחזק את הג'ל להדמיה חזותית; זה יכול להיעשות במגש מתכת מעל מבער בונזן. השתמש מספיק TCA כדי לכסות בנדיבות את הג'ל, ~ 1/2 מלא. - מוציאים את הג'ל ומחזירים אותו ל-H2O מזוקק כפול. מרתיחים אותו על צלחת מסתובבת למשך דקה אחת במהירות של כ-50 סל"ד.
- לשטוף את הג'ל ב 10 mM Tris על צלחת מסתובבת במשך 5 דקות ב ~ 50 סל"ד, שוב באמצעות מספיק כדי לכסות בנדיבות את הג'ל, ~ 1/2 של המיכל.
- לזרז את החלבון על ידי שטיפת הג'ל ב 1 M חומצה סליציקלית על צלחת מסתובבת במשך 30 דקות, שוב באמצעות מספיק חומצה סליציקלית כדי לכסות בנדיבות את הג'ל, ~ 1/2 של המיכל בשימוש.
- ייבש את הג'ל כמתואר בשלבים 2.3.24-2.3.31.
הערה: ניתן לעשות זאת במספר דרכים. מייבש ג'ל (ראה טבלת חומרים) מספק אפשרות חסכונית בזמן (המתוארת להלן); עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות/ערכות זמינות מסחרית אחרות שעשויות להיות חסכוניות יותר אך גוזלות זמן רב יותר. ערכות ייבוש ג'ל ניתן להשתמש כחלופה שאינה דורשת יישום של חום או שאיבה, אלא מאפשרת את הג'ל להתייבש באוויר בין יריעות צלופן כדי למנוע עיוות. - מניחים סדין גדול של נייר סופג על המיטה הנקבובית של מייבש הג'ל. מניחים גיליון אחד של מגבת נייר באזור שבו הג'ל יוחל.
- חותכים פיסת נייר סופגת בגודל 15 ס"מ על 20 ס"מ ומניחים אותה על מגבת הנייר.
- מוציאים את הג'ל מהמכל בעזרת חתיכה שנייה של נייר סופג בגודל 15 ס"מ על 20 ס"מ ומניחים אותו שטוח על גבי החלק הראשון.
- חותכים חתיכה מעט גדולה יותר של ניילון נצמד, ~ 20 ס"מ x 25 ס"מ, ומניחים אותו על ג'ל, להבטיח ללא קמטים או בועות מתחת לעטוף.
הערה: זה עשוי לקחת כמה ניסיונות, אבל זה הכרחי כי אין כיסי אוויר לכודים. - הניחו בעדינות את כיסוי הפלסטיק של מייבש הג'ל מעל העטיפה, והבטיחו שוב שאין בועות או קמטים.
- הפעילו את המשאבה/ואקום וודאו שכיסוי הפלסטיק יצר חותם. בדוק את החותם על ידי הרמת פינה של כיסוי הפלסטיק ולחכות לו לאטום מחדש.
- סגור את מייבש הג'ל ולרוץ במשך 90 דקות. הגדר את הטמפרטורה להתחיל ב 30 °C (50 °F), בהדרגה להגיע 80 °C (80 °F) ולאחר מכן לחזור 30 °C (50 °F) בסוף הריצה.
- לאחר התייבשות, הג'ל יתמצק וירגיש דק בנייר. עוטפים את הג'ל בניילון נצמד המשמש בתהליך הייבוש.
- מניחים את הג'ל המיובש בקלטת סרט עם סרט זרחן (ראה שולחן חומרים), כאשר הצד הלבן פונה לג'ל. זמני החשיפה משתנים אך יכולים להיות 24-48 שעות להדמיה של רצועות.
- דמיינו באמצעות אוטורדיוגרפיה באמצעות כל תמונה מתאימה המסוגלת להדמיית זרחן.
- בערך 15 דקות לאחר תחילת תגובת התרגום, aliquot 90 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל מראש דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך כ 10 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הוכחנו בהרחבה כי פרוטוקול זה הוא בדיקה תקפה לקביעת קצב הייבוא למיטוכונדריה שרירי שלד מבודדת פונקציונלית ושלמה. בהשוואה לתנאים שאינם מטופלים, ייבוא של חלבונים קודמים טיפוסיים כגון מלאט דהידרוגנאז (MDH) לתוך המטריצה רגיש לפוטנציאל הממברנה מכיוון שהוא יכול להיות מעוכב על ידי ואלינומיצין, גוף נשימה (איור 2A). ייבוא הוא גם מעוכב כאשר ממברנות פנימיות וחיצוניות מיטוכונדריאלי הם solubilized בנוכחות חומר הניקוי טריטון X-100. תהליך הייבוא רגיש לנוכחות של ATP חיצוני, אשר משמש לפתח חלבונים מבשרים עבור translocation על פני הממברנות, והוא נשלט היטב על ידי קצב הנשימה ואספקת ATP (נתונים שאינם מוצגים20). הבדלים ברורים ביבוא נצפים גם בין שברים מיטוכונדריאליים בין-מיופוביברילריים לבין שברים מיטוכונדריאליים תת-קרקעיים, בין היתר בשל שינויים בביטוי מכונות ייבוא החלבון, כמו גם קצב הנשימה בין המיטוכונדריה (איור 2B).
המיטוכונדריה בשריר השלד הם אברונים דינמיים מאוד המגיבים בקלות לשינויים בביקוש לאנרגיה. התוכן המיטוכונדריאלי בשריר עולה לאחר תקופות של פעילות גופנית כרונית או בתגובה לפעילות התכווצות הנגרמת על ידי גירוי חשמלי (ראה לסקירה21). לדוגמה, 7 ימים של פעילות התכווצות כרונית של שריר השלד החולדה משפרים את הייבוא לתוך ה- OM והמטריצה פי 1.6 ופי 1.4, בהתאמה22 (איור 3A, 3B). שינויים אלה בתוכן המיטוכונדריאלי נגרמים, בין השאר, על ידי שינויים ביכולת של מערכת ייבוא החלבון המיטוכונדריאלי. אכן, ניתן להמחיש קשר הדוק בין קצב היבוא של חלבונים קודמים לבין הערכה טובה של תכולת המיטוכונדריה, כפי שהיא נמדדת על ידי סמן IV המורכב ציטוכרום אוקסידאז תחת שליטה או תנאים מפורקים, ניתן להמחיש23(איור 3C).
הסתגלות מערכת הייבוא בשריר לשינויים בפעילות התכווצות מצביעה על כך שפעילות גופנית יכולה לשמש כטיפול לפתרון פגמים במסלול הייבוא אם זוהו. במהלך החקירה של אפופטוזיס בתיווך המיטוכונדרי באמצעות חיות נוקאאוט כפולות של Bax-Bak, שמנו לב כי התוכן המיטוכונדריאלי המופחת בשרירים של בעלי חיים ניסיוניים אלה לווה בירידה ביבוא של חלבונים קודמים לתוך המטריצה. לאחר מכן בדקנו את האפשרות שפעילות גופנית יכולה לשחזר את יכולת הייבוא הזו. ואכן, לאחר 6 שבועות של אימוני ריצת גלגל מרצון, יבוא החלבון שוחזר כדי לשלוט ברמות בחיות הנוקאאוט24, מה שממחיש את הפלסטיות האדפטיבית של מסלול הייבוא להצלת תוכן ותפקוד מיטוכונדריאלי (איור 4).
איור 1: סכמטי של זרימת העבודה לבידוד המיטוכונדריה של האס.אס וקרן המטבע הבינלאומית משרירי השלד בהתבסס על העבודה הקודמת8. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של המיטוכונדריה התפקודית בהתבסס על מיקומם הגיאוגרפי בתוך שריר השלד. המיטוכונדריה של האס.אס משוחררת במהירות ובקלות רבה יותר, בעוד המיטוכונדריה של קרן המטבע דורשת צעד עיכול נוסף עם פרוטאז כדי להתיר אותם מהמיופיברילים. שים לב כי הבידוד של שברי משנה אלה יכול להיעשות יחד. הליך דומה ומעודכן פורסם לאחרונה25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייבוא חלבונים לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית. (A) שיעורי יבוא רגילים עבור MDH מוצגים במיטוכונדריה של SS וקרן המטבע הבינלאומית (נתיבים 4 ו-7) ובמוצר התרגום של MDH (נתיב 1). הרצועה התחתונה מייצגת את ה- MDH הבוגר המיובא. תוספת של valinomycin מעכבת את ייבוא חלבון MDH לתוך המטריצה של מיטוכונדריה SS וקרן המטבע הבינלאומית, כמו זה uncoupler מפזרת את פוטנציאל הממברנה (נתיבים 2 ו 5). טריטון-X הוא חומר ניקוי המפחית את הממברנה הפנימית, ובכך מעכב את יבוא MDH לתוך תת-שבירות אלה (נתיבים 3 ו -6). יבוא חלבונים בוצע להגדלת משך הזמן, 4 דקות, 7 דקות, 10 דקות, 15 דקות ו-30 דקות. נתונים אלה ממחישים כי ייבוא הוא תהליך תלוי זמן וכן כי למיטוכונדריה של SS וקרן המטבע הבינלאומית יש שיעורים או יכולות ייבוא שונים (B). TL, נתיב תרגום; VAL, ואלינומיצין; TRI, טריטון-X; CTL, שליטה; אס.אס, תת-קרקעי; קרן המטבע הבינלאומית, אינטרמיופיברילר. נתון זה שונה מ- Takahashi M & Hood DA20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יבוא חלבונים ניתן להתאמה וקשור קשר הדוק להערכות של תוכן מיטוכונדריאלי. חולדות ספראג דולי היו נתונות לגירוי חשמלי כדי לגרום לפעילות התכווצות, מודל של אימון גופני. (A) ייבוא Tom40 לתוך OM היה גבוה פי 1.6 בשרירים מבעלי חיים מגורה כרונית בהשוואה לבקרות בכל נקודת זמן נתונה. (B) ייבוא OCT לתוך מטריצת המיטוכונדריה הוגדל בכל נקודת זמן של דגירה, ובסך הכל, זה הביא לעלייה של פי 1.4 במיטוכונדריה משריר מגורה כרונית. (ג) הייבוא מתואם באופן חיובי עם אינדקס של תוכן מיטוכונדריאלי, כפי שהוערך על-ידי פעילות COX, r = 0.69. מדידות אלה נלקחו מבעלי חיים שהיו נתונים denervation, אשר הוכח להפחית את התוכן המיטוכונדריאלי ואת קצב הייבוא. קון, שליטה; דן, denervated; Stim, מגורה; TL, נתיב תרגום; * p < 0.05. איורים 3A ו-3B עובדו מג'וזף A-M & Hood DA22 ו-3C מ-Singh B & Hood DA23. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ההכשרה מצילה פגמי יבוא ב-vivo. חיות נוקאאוט כפולות של Bax/Bak מציגות יבוא חלבון מופחת למטריקס המיטוכונדריה ב-37%. שישה שבועות של ריצה מרצון גלגל הצילו את פגם הייבוא כדי לשלוט ברמות. WT, wildtype; DKO, נוקאאוט כפול; TL, נתיב תרגום; * p < 0.05 ההשפעה העיקרית של גנוטיפ; ♪ p < 0.05 ההשפעה העיקרית של אימון. נתון זה הותאם מג'אנג Y ואח ' 24. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאגר 1: | מאגר 1 + ATP: | מאגר 2: | מדיום resuspension: | Nagarse protease |
| 100 מ"מ KCl | 100 מ"מ KCl | 100 מ"מ KCl | 100 מ"מ KCl | 10 מ"ג/מ"ל במאגר 2 |
| 5 מ"מ מ"מ MgSO4 | 5 מ"מ מ"מ MgSO4 | 5 מ"מ מ"מ MgSO4 | 10 מ"מ מגבים | הערה: להכין טרי ולשמור על קרח |
| 5 מ"מM EDTA | 5 מ"מM EDTA | 5 מ"מ EGTA | 0.2% BSA | |
| 50 מ"מ טריס | 50 מ"מ טריס | 50 מ"מ טריס | ||
| כספומט 1 מ"מ | כספומט 1m |
טבלה 1: מאגרים ומדיית החידוש.
| % מאמצעי האחסון של התגובה | 1 תערובת תגובה | |
| Reticulocyte Lysate | 64.10% | 11.8 μL |
| חומצות אמינו (מתיונין) | 2.20% | 0.4 μL |
| H2O סטרילי | 21.60% | 3.97 μL |
| 35 ס-מתיונין | 7.20% | 1.33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1.0 μL |
| סה"כ אמצעי אחסון | 18.5 μL | |
| הערה: | ||
| 1) להוסיף 35S-מתיונין אחרון; | ||
| 2) להפשיר את lysate לאט על קרח, ולהגביל את מחזורי הקפאה / להפשיר לשניים. מומלץ להצטייד בליסט עם ההגעה | ||
| 3) ניתן לכוונן את נפח ה- mRNA כדי לייעל את היעילות התרגומית על ידי שינוי נפח H2O הסטרילי בהתאם. | ||
טבלה 2: תמהיל תגובת תרגום
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המיטוכונדריה תלויה באופן ייחודי בביטוי ובתיאום של הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי לסינתזה ולהתרחבות שלהם בתוך התאים. עם זאת, הגנום הגרעיני מקודד את הרוב המכריע (99%) של הפרוטאום המיטוכונדריאלי, וזה מדגיש את החשיבות של מכונות ייבוא החלבון בתמיכה ביוגנזה מיטוכונדריאלית. הייבוא משמש גם כאירוע איתות חשוב, שכן אי ייבוא יכול לקדם את תחילת תגובת החלבון שנפתחה ו/או המיטופגיה15,16,26. מאז הייבוא מסתמך על הביטוי של ערוצים פונקציונליים מרובים מלווים, פוטנציאל קרום שלם, כמו גם את הזמינות של ATP, ההערכה של יבוא חלבון מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה רבת ערך על מצב הבריאות והאנרגיה של האברונים.
ההערכה של יכולת ייבוא חלבון למיטוכונדריה דורשת בידוד של האברונית מהרקמה שמסביב באמצעות טכניקות צנטריפוגה דיפרנציאליות סטנדרטיות. הייבוא מוערך באותו אופן שבו ניתן היה להעריך את ה- Vmax של פעילויות האנזים המיטוכונדריאלי, באופן מבוקר מאוד התלוי בריכוז הזמן והמצע וללא תלות בהשפעות ציטוטוסוליות תאיות. שיטת הבידוד המוצגת כאן, או עיבודים דומים שלה, שימשו במשך שנים רבות להערכת נשימה מיטוכונדריאלית ופעילויות אנזימים8,9,10,10,11. טכניקה זו אינה נטולת מגבלותיה, שכן היא משבשת את המורפולוגיה הרגילה של המיטוכונדריה כפי שהם קיימים במקום 27, אשר בשריר השלד הוא מורכב מאוד, החל מבנים כדוריים קטנים, לרשת רשת רשתית מסועפת מאוד3, בהתאם למיקום תת-קרקעי או intermyofibrillar שלהם בתוך תא השריר. בנוסף, השימוש בפרוטאז נגרסה עבר בדיקה קפדנית 3,28. עדכון לשיטה זו, באמצעות טריפסין במקום nagarse, פורסם לאחרונה25, טריפסין שימש על ידי אחרים כדי לבודד את השריר המיטוכונדריה29. ואכן, ניתן להשתמש בכל שיטת בידוד חלופית המניבה מיטוכונדריה שלמה מבחינה תפקודית, כולל טכניקות שאינן משתמשות בפרוטאזים30 או כאלה המיועדות לדגימות קטנות בגודל ביופסיה משריר האדם31. השיטה המוצגת כאן יש את היתרון של בידוד המיטוכונדריה SS במהירות ובקלות, אבל תשואה גדולה יותר וטוהר של המיטוכונדריה ניתן להשיג באמצעות בידוד של תת קרקעית קרן המטבע הבינלאומית. אם נעשה בזהירות, פרוטוקול בידוד זה יכול לגרום אברונים שלמים מבחינה תפקודית עם יחס שליטה בדרכי הנשימה גבוה, המציין את השיעורים המתאימים של מצב 3 ו 4 נשימה8.
זה גם הכרחי למדידת יבוא חלבון מיטוכונדריאלי כי אברונים אלה לשמור על פוטנציאל הממברנה שלהם, כמו ייבוא על פני הממברנה הפנימית תלוי כוח מניע פרוטונים אלקטרופורטי זה, אשר משמש כדי למשוך רצפים קודמים טעונים חיובית ולעזור לתווך את ההובלה של המבשר לחלל מטריצה טעון שלילית. בתנאים כאלה, השוואות של תפקוד מיטוכונדריאלי וייבוא ניתן להעריך בין מצבים ניסיוניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כגון פעילות גופנית, הזדקנות, ושימוש לרעה בשרירים, למשל. מבחינה זו, עבודה קודמת הראתה כי ייבוא הוא מסלול הסתגלותי מאוד המגיב למצבים משתנים של שימוש בשרירים ושימוש לרעה והוא רגיש לעיכוב באמצעות פליטת ROS מופרזת10,22,22,23,32. פלסטיות זו נובעת, בין השאר, משינויים אדפטיביים בביטוי רכיבי מכונות יבוא החלבון. מכיוון שטכניקה זו מסתמכת על בידוד המיטוכונדריה, כל תקנה על מסלול הייבוא שעשויה לנבוע מגורמים ציטוסוליים או שיחה צולבת בין-אברונלית מוסרת מהפרשנות של הניסוי. זוהי גם מגבלה וגם כוח של הטכניקה, שכן ניתן להסיק מסקנות מקיבולת מסלול הייבוא עצמו (בדומה ל- Vmax של פעילות האנזים), אך אותות ארעיים או חיצוניים שעלולים להתרחש עם המודל הניסיוני עלולים ללכת לאיבוד. כדי לעקוף זאת, ניתן לדגור על תגובת הייבוא עם מדגם של השבר הציטוסולי, מבודד כמתואר לעיל, על מנת להעריך שינויים בסביבה הציטוטוסולית שעשויים להשפיע על שיעורי היבוא, כפי שנעשה בעבר22. בנוסף, רכיבי מכונות ייבוא כפופים לשינויים חריפים, לאחר תרגום שיכולים לשנות את הפונקציות שלהם. עבודה אחרונה הראתה כי זרחן של קולטני ייבוא TOM ספציפיים ניתן לקשר למיטופגי33. ואכן, תחום מחקר המצדיק תשומת לב רבה יותר הוא אפנון חריף של תהליך הייבוא באמצעות מסלולי איתות פנימיים בתיווך ROS או על ידי שינוי קוולנטי של קולטני יבוא ומלווים, כפי שתועד בשמרים ואורגניזמים נמוכים אחרים34,35.
ייבוא חלבון למיטוכונדריה מהווה שער לצמיחת אברונים אדפטיבית ומהווה אינדיקטור רגיש לבריאות המיטוכונדריה. הבנת האופן שבו תהליך זה מוסדר יכולה לשפוך אור על הרגולציה של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, איתות UPR וייזום המיטופגיה. יבוא חלבון מיטוכונדריאלי אינו תהליך שנחקר באופן נרחב במודלים ניסיוניים של יונקים, ופיתוח הפוטנציאל העצום של המחקר בתחום זה יכול לעזור לנו להשיג הבנה גדולה יותר של מחלות שבהן תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ניכר או מייצג מטרה טיפולית אטרקטיבית לקידום בריאות המיטוכונדריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים, כספיים או אחרים, מוכרזים על ידי המחברים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר ג.C שור מאוניברסיטת מקגיל, ד"ר א. שטראוס מבית הספר לרפואה של וושינגטון, וד"ר .M.ט. ריאן מאוניברסיטת לה טרובה על התרומות המקוריות של פלסמידים ביטוי ששימשו למחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) לD. A. Hood. ד.א. הוד הוא גם בעלים של יו"ר מחקר קנדה בפיזיולוגיה של התא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O.
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
