Summary
في هذا البروتوكول ، يتم إعادة بناء جزر البنكرياس وتحليلها باستخدام خوارزميات حسابية يتم تنفيذها في تطبيق مخصص متعدد المنصات.
Abstract
الخصائص الهيكلية لجزر البنكرياس هي المفتاح للاستجابة الوظيفية للأنسولين والجلوكاجون والخلايا المفرزة للسوماتوستاتين ، بسبب آثارها في الاتصالات داخل الجزيرة عبر الإشارات الكهربائية والباراكرين والأوتوكرين. في هذا البروتوكول ، يتم أولا إعادة بناء البنية ثلاثية الأبعاد لجزيرة البنكرياس من البيانات التجريبية باستخدام خوارزمية حسابية جديدة. بعد ذلك ، يتم الحصول على الخصائص المورفولوجية والاتصالية للجزيرة المعاد بناؤها ، مثل عدد ونسب الأنواع المختلفة من الخلايا ، والحجم الخلوي ، وجهات الاتصال من خلية إلى خلية. بعد ذلك ، يتم استخدام نظرية الشبكة لوصف خصائص الاتصال للجزيرة من خلال مقاييس مشتقة من الشبكة مثل متوسط الدرجة ومعامل التجميع والكثافة والقطر والكفاءة. وأخيرا ، يتم تقييم كل هذه الخصائص وظيفيا من خلال المحاكاة الحسابية باستخدام نموذج من مؤشرات التذبذب المقترنة. بشكل عام ، نصف هنا سير عمل خطوة بخطوة ، تم تنفيذه في IsletLab ، وهو تطبيق متعدد المنصات تم تطويره خصيصا لدراسة ومحاكاة جزر البنكرياس ، لتطبيق منهجية حسابية جديدة لتوصيف وتحليل جزر البنكرياس كمكمل للعمل التجريبي.
Introduction
ينقسم البنكرياس إلى مناطق يشار إليها باسم الرأس والرقبة والجسم والذيل ، ولكل منها هياكل ووظائف ومواقع تشريحية مختلفة 1,2. من وجهة نظر وظيفية ، يمكن تقسيم البنكرياس إلى أنظمة الغدد الصماء والإفرازات الخارجية مع الأول المسؤول عن إفراز الهرمونات المشاركة بشكل حاسم في تنظيم توازن الجلوكوز ، في حين أن الأخير يساهم في هضم الطعام عن طريق إفراز الإنزيمات في الاثني عشر1. تشكل جزر البنكرياس أنسجة الغدد الصماء في البنكرياس وهي مسؤولة عن إفراز الجلوكاجون والأنسولين والسوماتوستاتين ، التي تفرز من الخلايا β δ ، على التوالي3. بالإضافة إلى آلياتها التنظيمية الجوهرية ، يتم تنظيم هذه الخلايا عن طريق الاتصال الكهربائي المباشر (بين الخلايا β والخلايا β المحتملة δ) ، وكذلك عن طريق إشارات paracrine و autocrine 4,5,6. تعتمد كلتا الآليتين اعتمادا كبيرا على بنية الجزيرة (أي تكوين وتنظيم الأنواع المختلفة من الخلايا داخل الجزيرة)7,8. الأهم من ذلك ، يتم تغيير بنية الجزيرة في وجود مرض السكري ، على الأرجح إزعاج التواصل داخل الجزيرة نتيجةلذلك 9,10.
تتضمن دراسة جزر البنكرياس مجموعة واسعة من المنهجيات التجريبية. من بين هذه ، سمح استخدام تقنيات التألق لتحديد عدد وموقع ونوع الخلايا المختلفة في الجزيرة بدراسة الخصائص الهيكلية والمورفولوجية لجزر البنكرياس 11،12،13 واكتساب فهم أفضل للآثار الوظيفية في الصحة والمرض. كمكمل ، تم استخدام النماذج الحسابية لخلايا البنكرياس 14،15،16 ، ومؤخرا ، جزر البنكرياس 12،17،18،19 في العقود الأخيرة لتقييم الجوانب التي يصعب أو حتى من المستحيل معالجتها تجريبيا.
في هذا البروتوكول ، نهدف إلى سد الفجوة بين العمل التجريبي والحسابي من خلال تحديد منهجية لإعادة بناء معماريات الجزر ، وتحليل خصائصها المورفولوجية والاتصالية من خلال المقاييس الكمية ، وإجراء عمليات محاكاة أساسية لتقييم الآثار الوظيفية لخصائص الجزر.
يعتمد البروتوكول الموضح أدناه على خوارزميات حسابية مصممة خصيصا لدراسة جزر البنكرياس. باختصار ، في الخطوة الأولى من البروتوكول ، يتم إعادة بناء بنية الجزيرة من البيانات التجريبية باستخدام الخوارزمية التي اقترحها مؤخرا فيليكس مارتينيز وآخرون.19 حيث يتم الحصول على المواقع النووية من خلال تلطيخ 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) والأنواع الخلوية التي تم تحديدها من خلال التألق المناعي (كما هو موضح بالتفصيل من قبل Hoang et al.11,12 ) في إجراء التحسين التكراري. هذا يؤدي إلى تحديد الحجم والموضع الأمثل لكل خلية والحصول على جزيرة تتكون من خلايا غير متداخلة. ثانيا ، استنادا إلى البنية المعاد بناؤها ، يتم تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية لتحديد خصائص الاتصال وإنشاء شبكة الجزر المقابلة التي تسمح للمستخدم بالحصول على مقاييس كمية لمزيد من الوصف لبنية الجزيرة (يمكن الرجوع إلى تفاصيل حول خوارزمية إعادة الإعمار في العمل الأصلي حول الموضوع19). وأخيرا، يتم إجراء المحاكاة الوظيفية الأساسية باستخدام نهج النمذجة الذي اقترحه هوانغ وآخرون.12 والذي يتم فيه التعامل مع كل خلية على أنها مذبذب استنادا إلى الطبيعة النابضة لإفراز الهرمونات التي لوحظت تجريبيا20,21، وبالتالي يتم تمثيل الجزيرة كشبكة من مؤشرات التذبذب المقترنة بعد خصائص الاتصال للجزيرة المعاد بناؤها.
نظرا للتعقيد الحسابي للخوارزميات المستخدمة في هذا البروتوكول ، تم تنفيذ جميع الخطوات المعنية في تطبيق مستقل22 بهدف رئيسي هو الاقتراب من هذه الأدوات الحسابية لجميع القراء المهتمين بغض النظر عن مستوى خبرتهم في استخدام البرامج المتخصصة أو لغات البرمجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يظهر مخطط تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. يتم إعطاء وصف خطوة بخطوة على النحو التالي (انظر الملف التكميلي 1 للحصول على تفاصيل حول لوحات التحكم المستخدمة في كل خطوة من خطوات البروتوكول).
الشكل 1: مخطط التدفق. مخطط تدفق يصف الترتيب التسلسلي للبروتوكول كما هو مطبق في IsletLab. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. تثبيت IsletLab في لينكس
ملاحظة: اتبع الإرشادات الواردة في القسمين 2 و3 من الملف التكميلي 2 لتثبيت IsletLab في Windows أو macOS.
- افتح متصفح إنترنت وانتقل إلى https://github.com/gjfelix/IsletLab. قم بتنزيل ملفات مستودع IsletLab واستخراجها.
ملاحظة: يتضمن الملف التكميلي 3 نسخة من إصدار IsletLab المستخدم في هذا البروتوكول. - تحقق من تثبيت برامج التحويل البرمجي لدول مجلس التعاون الخليجي و nvcc. افتح محطة طرفية واكتب الأوامر التالية:
دول مجلس التعاون الخليجي --الإصدار
nvcc --الإصدار
اتبع الإرشادات الواردة في القسم 1 من الملف التكميلي 2 إذا لم يتم التعرف على أي من هذه الأوامر من قبل النظام. - قم بتنزيل وتثبيت منصة علوم البيانات (انظر جدول المواد). افتح محطة طرفية وانتقل إلى مجلد IsletLab.
- إنشاء بيئة جديدة عن طريق كتابة الأمر التالي في المحطة الطرفية:
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - قم بتنشيط البيئة الجديدة عن طريق كتابة:
كوندا تنشيط isletlab_v1.0 - قم بتشغيل تطبيق IsletLab عن طريق كتابة الأمر التالي في المحطة الطرفية (انظر الشكل 2 للحصول على وصف للنافذة الرئيسية):
الثعبان isletlabgui_v1.0.py
الشكل 2: واجهة مستخدم IsletLab. تتكون الواجهة من ثلاث لوحات رئيسية: التكوين (1) ، والإحصاءات (2) ، والرسومات (3) لوحات. يوجد شريط أدوات الرسومات (4) في أسفل لوحة الرسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. إعادة بناء الجزيرة
- إعداد بيانات الإدخال. قم بتنظيم بيانات جزيرة الإدخال (أي أنواع الخلايا وإحداثيات ثلاثية الأبعاد (3D) ) في ملف مكون من أربعة أعمدة يحتوي فيه العمود 1 على نوع الخلية (مشفرة على أنها 11: ɑ-cell و 12: β-cell و 13: δ-cell) وتحتوي الأعمدة من 2 إلى 4 على إحداثيات x و y و z ، على التوالي (انظر مقتطفا من ملف إدخال في القسم 5 من الملف التكميلي 2 أو ملف اختبار الإدخال المضمن في مستودع IsletLab).
- تأكد من أن ملف الإدخال لا يتضمن رؤوس الأعمدة. استخدم مثال ملف الإدخال المضمن في مستودع IsletLab لاتباع البروتوكول إذا لزم الأمر (Input_Islet_test.txt).
ملاحظة: تم الحصول على بيانات الإدخال المستخدمة لتطوير الخوارزميات المنفذة في IsletLab تجريبيا كما هو موضح بالتفصيل من قبل Hoang et al.11,12 باستخدام تلطيخ DAPI لتحديد المواقع النووية والتألق المناعي لتحديد الأنواع الخلوية. - انقر فوق الزر تحميل جزيرة أولية وحدد الملف الذي يحتوي على بيانات الإدخال لإنشاء جزيرة أولية وتمثيل 3D والإحصاءات المقابلة. في حالة حدوث خطأ ، سيتم عرض الرسالة التالية: "خطأ في تحميل ملف islet". لتصحيح ذلك، كرر الخطوة 2.1.
- تكوين عملية إعادة الإعمار. انقر فوق الزر إعدادات إعادة الإعمار وقم بتعديل معلمات التحسين (راجع القسمين 4 و 5 من الملف التكميلي 2 للحصول على وصف موجز للخوارزمية والمعلمات الموضحة في نافذة إعدادات إعادة التعمير).
- اضبط درجة الحرارة الأولية = 1 ، وعامل التكرار = 1 ، وعامل القبول = 1. انقر فوق الزر موافق ( OK ) لحفظ قيم المعلمات.
ملاحظة: كقاعدة عامة، فإن الزيادة في معلمة درجة الحرارة، وكذلك في عوامل التكرار والقبول، ستسفر عن نتائج إعادة بناء أفضل من حيث الخلايا التجريبية المدرجة في الجزيرة المعاد بناؤها على حساب زيادة في وقت الحوسبة. - انقر فوق الزر إعادة بناء جزيرة لفتح نافذة سجل إعادة الإعمار (انظر القسم 6 من الملف التكميلي 2 للحصول على وصف للمعلومات المقدمة في سجل إعادة الإعمار).
- انقر فوق الزر تشغيل لبدء عملية إعادة الإعمار. راقب عملية التحسين حتى يتم عرض الرسالة: "يرجى إغلاق هذه النافذة للمتابعة". أغلق نافذة سجل إعادة الإعمار لإنشاء التمثيل المرئي للجزيرة المعاد بناؤها ولحساب الإحصاءات ذات الصلة (انظر العمود الأيسر في الشكل 3A-C).
- تقييم نتائج عملية إعادة الإعمار من خلال تحليل إحصاءات التحسين الموضحة في علامة التبويب الأخيرة في لوحة الإحصاءات. على وجه الخصوص ، ركز على زيادة النسبة المئوية للخلايا التجريبية المدرجة في الجزر المعاد بناؤها (٪ من التجريبية) أو ما يعادلها ، على تقليل عدد التداخلات (كما هو موضح بيانيا في مخطط التقارب ، العمود الأيمن في الشكل 3A-C).
- إذا اعتبرت النسبة المئوية للإحصاء التجريبي منخفضة وفقا لأهداف المستخدم ، فأعد تشغيل IsletLab كما هو موضح في الخطوة 9.1 ، وقم بزيادة درجة الحرارة الأولية وعامل التكرار وعامل القبول في إعدادات إعادة الإعمار وكرر الخطوات 2.1-2.4 حتى يتم الحصول على نتائج مرضية (> 95٪ من الخلايا التجريبية). انظر الأقسام 5-7 من الملف التكميلي 2 للحصول على مزيد من الوصف لعملية إعادة الإعمار والنتائج ذات الصلة.
3. تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية
- انقر فوق الزر إعدادات إعادة البناء وقم بتعيين معلمة تفاوت جهات الاتصال لتحديد تفاوت جهات الاتصال من خلية إلى خلية وانقر فوق موافق لحفظ قيم المعلمات.
ملاحظة: تمثل معلمة تفاوت الاتصال المسافة القصوى بين الخلايا لكي يتم اعتبارها على أنها على اتصال. - انقر فوق الزر جهات اتصال من خلية إلى خلية لتحديد الخلايا الموجودة على اتصال وثيق. في علامة التبويب جهات الاتصال، تحقق من وجود خلايا ملامسة معروضة بيانيا (خطوط سوداء) في لوحة الرسومات والإحصاءات المقابلة (أي جهات الاتصال الإجمالية والمتجانسة وغير المتجانسة وجهات الاتصال ɑ-ɑ و β-β δ-δ و ɑ-β و ɑ-δ β-δ) الموضحة في لوحة الإحصاءات (انظر العمود الأيسر من الشكل 4A-C).
- زيادة (تقليل) معلمة التسامح مع جهات الاتصال لزيادة (تقليل) عدد جهات الاتصال من خلية إلى أخرى. راجع القسم 8 من الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل حول تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية والنتائج المرتبطة بها.
4. بناء شبكة الجزر
- انقر فوق الزر إنشاء شبكة لإنشاء شبكة الجزيرة وحساب مقاييس الشبكة المرتبطة بها (انظر العمود الأيمن في الشكل 4A-C).
ملاحظة: يرد وصف إضافي للنتائج المتعلقة بشبكة الجزر التي تم إنشاؤها في القسم 9 من الملف التكميلي 2.
5. محاكاة وظيفية للجزيرة المعاد بناؤها
- قم بالتبديل إلى علامة تبويب المحاكاة في لوحة التكوين الخاصة بالواجهة (الشكل 5).
- حدد الوضع المطلوب للتردد الجوهري - ثابت أو عشوائي - وانقر فوق الزر تكوين التردد الجوهري لتحديد تردد مؤشرات التذبذب (بالهرتز). إذا تم اختيار تردد جوهري عشوائي، فحدد المتوسط والانحراف (بالهرتز) لتوليد ترددات عشوائية موزعة بشكل طبيعي (انظر القسم 11 من الملف التكميلي 2 للحصول على وصف لمعلمات المحاكاة).
- حدد الوضع المطلوب للمرحلة الأولية - ثابت أو عشوائي. إذا تم تحديد مرحلة أولية ثابتة، فانقر فوق الزر تكوين المرحلة الأولية لتحديد طور مؤشرات التذبذب (بالراديان). إذا تم تحديد مرحلة أولية عشوائية ، فسيقوم النظام بتعيين مراحل عشوائية بين 0 و 2π لجميع مؤشرات التذبذب.
ملاحظة: إذا تم تحديد مرحلة أولية ثابتة، تهيئة جميع مؤشرات التذبذب في المرحلة. - انقر فوق الزر تكوين التفاعلات لتحديد معلمات التفاعل من خلية إلى خلية في نافذة قوة التفاعل. للحصول على وصف لمعلمات التفاعل، راجع القسم 11 من الملف التكميلي 2.
- قم بتكوين المحاكاة عن طريق تحديد إجمالي وقت المحاكاة (ب s) والخطوة الزمنية (ب s) وعامل الحفظ (عدد الخطوات بين نقاط البيانات المحفوظة). في المحاكاة الموضحة في الشكل 5 ، كان الوقت الإجمالي 20000 ثانية ، مع خطوة زمنية قدرها 0.1 ثانية وعامل توفير قدره 500.
- حدد عدد الكتل ومؤشرات الترابط وقدرة النظام الأساسي للحوسبة المتاحة لإجراء المحاكاة. حدد هذه المعلمات وفقا للخصائص المحددة لوحدة معالجة الرسومات (GPU) المتوفرة.
ملاحظة: في المثال الموضح في الشكل 5، تم استخدام 36 كتلة و64 خيطا لكل كتلة (2304 نواة منصة حوسبة) منذ استخدام وحدة معالجة رسومات تحتوي على 36 معالجا متعدد المعالجات و64 نواة منصة حوسبة لكل معالجات متعددة. كانت قيمة معلمة قدرة منصة الحوسبة المستخدمة 75 لأن قدرة منصة حوسبة الأجهزة كانت 7.5 (انظر القسم 10 من الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل حول هذه المعلمات). - انقر فوق الزر تشغيل محاكاة لفتح نافذة سجل المحاكاة. انقر فوق الزر تشغيل لبدء المحاكاة ومراقبة العملية حتى يتم عرض وسيلة الإيضاح: "يرجى إغلاق النافذة للمتابعة". راجع القسم 12 من الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل حول سجل المحاكاة.
- أغلق نافذة سجل المحاكاة لمراقبة نتائج المحاكاة (انظر الشكل 5). وترد تفاصيل نتائج المحاكاة في القسم 13 من الملف التكميلي 2.
6. حفظ المشروع (اختياري)
- انقر فوق ملف > تصدير المشروع في شريط القوائم. حدد الدليل الذي سيتم حفظ ملف المشروع فيه وانقر فوق الزر موافق ( OK ) .
ملاحظة: يتم تحديد اسم ملف المشروع تلقائيا استنادا إلى اسم ملف البيانات الأولي. إذا لم يتم حفظ المشروع ، حذف جميع النتائج والملفات ذات الصلة تلقائيا. - قم بتحميل مشروع تم تصديره بالنقر فوق ملف > تحميل المشروع.
7. حفظ الأرقام (اختياري)
- انقر فوق أيقونة حفظ المؤامرة الموجودة في شريط أدوات الرسم لحفظ المرئيات الحالية في ملف صورة. كرر هذه الخطوة لكافة الأرقام التي تم إنشاؤها عبر البروتوكول.
ملاحظة: يمكن تعديل مخططات الأراضي وتصورات الجزر باستخدام الرموز المتوفرة في شريط أدوات الرسم في لوحة الرسومات.
8. تحميل المشروع (اختياري)
- انقر فوق ملف > تحميل المشروع في القائمة الرئيسية وحدد ملف مشروع تم حفظه مسبقا كما هو موضح في الخطوات 6.1-6.2.
ملاحظة: لن يتم تحميل مشروع بشكل صحيح إذا تم تعديل ملف المشروع خارجيا. إذا تم تحميل مشروع بنجاح، فلن تتوفر سوى قدرات المحاكاة.
9. إعادة تشغيل عملية إعادة الإعمار والتحليل (اختياري)
- في أي وقت يمكن للمستخدم تحديد ملف > إعادة التشغيل لتجاهل جميع النتائج وبدء إعادة بناء وتحليل جديدين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعتمد إعادة بناء جزر البنكرياس باستخدام المنهجية التي اقترحها فيليكس مارتينيز وآخرون.19 اعتمادا كبيرا على المعلمات المعطاة لخوارزمية التحسين (المحددة في إعدادات إعادة الإعمار). ويظهر مثال على ذلك بصريا في الشكل 3 حيث تظهر الجزر المعاد بناؤها التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعات مختلفة من المعلمات. أولا ، في الشكل 3A ، تظهر إعادة بناء شملت 86.6٪ من الخلايا المدرجة في البيانات الأولية (509 من أصل 588 خلية ، درجة الحرارة الأولية = 1 ، عامل التكرار = 1 ، عامل القبول = 1). عندما يتم زيادة درجة الحرارة الأولية وعوامل التكرار والقبول (درجة الحرارة الأولية = 10 ، عامل التكرار = 5 ، وعامل القبول = 5 ، الشكل 3B) ، تم تضمين نسبة أعلى (93.37٪) من الخلايا الأولية في الجزر المعاد بناؤها (أي 549 من أصل 588 خلية). ويمكن الحصول على نتائج أفضل إذا استخدمت قيم أعلى بكثير، لا سيما بالنسبة لعوامل التكرار والقبول، كما هو موضح في الشكل 3C (درجة الحرارة الأولية = 10، عامل التكرار = 1000، عامل القبول = 500)، حيث تتكون الجزيرة المعاد بناؤها من 99.15٪ من الخلايا الأولية (583 من أصل 588 خلية). يجب تقييم مخططات التقارب (العمود الأيمن في الشكل 3A-C) ، والتي توضح تطور الخلايا المتداخلة كدالة لدرجة الحرارة ، لتحديد كيفية تأثير المعلمات على عملية التحسين. كقاعدة عامة ، يجب زيادة عوامل التفاعل والقبول عندما تتضمن الجزيرة المعاد بناؤها نسبة مئوية منخفضة من الخلايا الأولية. وبالتالي ، فإن وقت الحوسبة سيزداد حتما ، لأن هذه العوامل تزيد بشكل مباشر من عدد التكرارات التي تم تقييمها. على سبيل المثال ، كان وقت الحوسبة لأول عملية إعادة بناء موصوفة أعلاه هو 6 ثوان. في المقابل، كانت أوقات الحوسبة لعمليات إعادة الإعمار الثانية والثالثة 21 ثانية و 24 دقيقة 6 ثوان على التوالي.
الشكل 3: إعادة بناء الجزر باستخدام مجموعات دون المستوى الأمثل من المعلمات في إعدادات إعادة الإعمار باستخدام مجموعات دون المستوى الأمثل من المعلمات يمكن أن يؤدي إلى انخفاض نسبة الخلايا التجريبية في الجزر المعاد بناؤها. (أ) اليسار: تم تضمين 86.6٪ من الخلايا التجريبية في الجزيرة المعاد بناؤها (درجة الحرارة الأولية = 1 ، عامل التكرار = 1 ، عامل القبول = 1 ، وقت الحوسبة = 6 ثانية). على اليمين: مؤامرة التقارب في عملية إعادة الإعمار. (ب) اليسار: تم تضمين 93.4٪ من الخلايا التجريبية في الجزيرة المعاد بناؤها (درجة الحرارة الأولية = 10 ، عامل التكرار = 10 ، عامل القبول = 5 ، وقت الحوسبة = 21 ثانية). على اليمين: مؤامرة التقارب في عملية إعادة الإعمار. (ج) اليسار: تم تضمين 99.15٪ من الخلايا التجريبية في الجزيرة المعاد بناؤها (درجة الحرارة الأولية = 10 ، عامل التكرار = 1000 ، عامل القبول = 500 ، وقت الحوسبة = 24 دقيقة ، 8 ثوان). على اليمين: مؤامرة التقارب في عملية إعادة الإعمار. تشير الأسهم الموجودة في مخططات التقارب إلى الخلايا المتداخلة في العدد الأولي والنهائي لعملية إعادة الإعمار (قبل مرحلة ما بعد المعالجة لخوارزمية إعادة الإعمار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يعتمد تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية من الجزيرة المعاد بناؤها على قيمة معلمة تحمل الاتصال (المحددة في إعدادات إعادة البناء) كما هو موضح في الشكل 4A-C ، حيث يتم عرض جهات الاتصال من خلية إلى خلية (ممثلة بخطوط سوداء) ، والتي تم تحديدها من المعماريات المعاد بناؤها الموضحة في الشكل 3A-C. على سبيل المثال ، إذا تم تعريف تسامح الاتصال البالغ 1 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 4A ، يتم تحديد 290 جهة اتصال فقط من خلية إلى خلية. وعلى النقيض من ذلك، إذا زاد التسامح مع الاتصال إلى 2 ميكرومتر، كما في الشكل 4 باء، جيم، فإن مجموع المخالطين الذين تم تحديدهم يرتفع إلى 636 و731 على التوالي (انظر لوحة الإحصاءات في الشكل 4 ألف إلى جيم). ويمكن أيضا ملاحظة هذه الاختلافات في التمثيل المرئي لجهات الاتصال من خلية إلى خلية الموضحة في العمود الأيسر من الشكل 4A-C، حيث يزداد عدد جهات الاتصال بين الخلايا بوضوح مع استخدام قيمة أعلى لتسامح جهات الاتصال. تجدر الإشارة إلى أن عدد جهات الاتصال يعتمد أيضا على عدد الخلايا المدرجة في الجزر المعاد بناؤها ، وبالتالي ، فإن الجمع بين معلمة درجة الحرارة والتكرارات وعوامل القبول ، وتحمل الاتصال يحدد في النهاية اتصال الجزيرة المعاد بناؤها ، والذي ينعكس على شبكات الجزر التي تم تشكيلها ومقاييس الشبكة المقابلة ، كما هو موضح في العمود الأيمن من الشكل 4A-C. يسمح مخطط الشبكة للمستخدم بتصور كيفية اتصال الخلايا المختلفة. من الناحية الكمية، يتم وصف خصائص الاتصال للجزيرة من حيث مقاييس الشبكة التالية: متوسط الدرجة والكثافة ومتوسط معامل التجميع والكفاءة والقطر (يمكن الرجوع إلى تفاصيل حول هذه المقاييس في القسم 9 من الملف التكميلي 2).
الشكل 4: تأثير معلمة تحمل الاتصال في تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية. (A-C) اليسار: جهات الاتصال من خلية إلى خلية تم تحديدها من الجزر المعاد بناؤها الموضحة في الشكل 3A-C (290 و 636 و 731 إجمالي جهات الاتصال في اللوحات A و B و C ، على التوالي). وكانت القيم المستخدمة لمعلمة التسامح مع الاتصال 1 ميكرومتر (A) و 2 ميكرومتر (B و C). لاحظ أن عدد الخلايا المدرجة في الجزر المعاد بناؤها يؤثر أيضا على عدد جهات الاتصال التي تم تحديدها من خلية إلى أخرى. على اليمين: يتم عرض الشبكات التي تم إنشاؤها من جهات الاتصال من خلية إلى خلية في العمود الأيسر المقابل. لاحظ أنه يتم تمييز تأثير الاتصال على مقاييس الشبكة في لوحة الإحصاءات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وأخيرا، بمجرد إعادة بناء الجزيرة وتحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية، يمكن إجراء محاكاة وظيفية (فقط عند توفر وحدة معالجة رسومات متوافقة). تظهر نتائج المحاكاة النموذجية في الشكل 5 ، بما في ذلك التذبذبات المجمعة لمجموعات الخلايا المختلفة (ɑ و β و δ الخلايا) والجزيرة بأكملها (المخطط العلوي للوحة الرسومات في الشكل 5). يوضح هذا الشكل اختلافات الطور بمرور الوقت بين مجموعات الخلايا المختلفة نتيجة لخصائص الاتصال والتفاعل ويسمح للمستخدم بتحديد مساهمة كل مجموعة خلايا (خطوط حمراء وخضراء وزرقاء) في السلوك المتذبذب للجزيرة بأكملها (الخط الأسود). على سبيل المثال، تشير اللوحة العليا من الشكل 5 إلى أنه على مستوى السكان، تتأرجح الخلايا ɑ والخلايا β تماما خارج الطور، بينما تتأرجح الخلايا δ خارج الطور مع الخلايا ɑ والخلايا β. علاوة على ذلك ، وفقا للمحاكاة ، يهيمن على السلوك المتذبذب للجزيرة تذبذبات الخلايا ɑ ، على الرغم من أنه يمكن أيضا ملاحظة تأثير مجموعات الخلايا الأخرى. لاحظ أن الإشارات المتذبذبة لجميع الخلايا الجزرية يتم حفظها تلقائيا في ملف بيانات (انظر الجدول 1 والقسم 13 في الملف التكميلي 2) ، مما يسمح للمستخدم بإجراء تحليل مفصل لنتائج المحاكاة. واستكمالا لذلك، يتم أيضا حساب وعرض مؤشر تزامن الجزر، الذي يعكس تماسك مراحل التذبذبات، (المخطط السفلي للوحة الرسومات في الشكل 5). لاحظ أن مؤشر المزامنة يتراوح من 0 إلى 1 ، حيث يشير 0 و 1 إلى مزامنة فارغة وكاملة بين جميع الخلايا في الجزيرة ، على التوالي. وبالتالي يمكن تفسير مخطط مؤشر التزامن على أنه تصور لكيفية اختلاف التزامن بين الخلايا الجزرية بمرور الوقت نتيجة لخصائص الاتصال والتفاعل للجزيرة المعاد بناؤها. نظرا لأن المحاكاة التي يتم إجراؤها تستند إلى فكرة مؤشرات التذبذب المقترنة12 وتعتمد بشكل كبير على اتصال الجزيرة التي أعيد بناؤها ، فمن المهم الوصول إلى إعادة بناء جزيرة مقبولة واتصال من خلية إلى خلية قبل إجراء محاكاة وظيفية.
الشكل 5: يتم تعريف معلمات المحاكاة في لوحة التكوين الخاصة بعلامة تبويب المحاكاة. تظهر نتائج المحاكاة في علامة تبويب المحاكاة في لوحة الرسومات حيث يتم عرض السلوك المتذبذب الموجز لمجموعات الخلايا المختلفة (ɑ و β و δ) والجزيرة بأكملها (أعلى). كما يظهر مؤشر التزامن ، وهو مقياس لتماسك الطور بين خلايا الجزيرة ، (أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تجدر الإشارة إلى أنه عمليا في كل خطوة من خطوات العملية ، يتم إنشاء ملفات البيانات. ويمكن الاطلاع على وصف لملفات البيانات التي تم إنشاؤها في الجدول 1 وفي جميع أنحاء الملف التكميلي 2.
| ملف | وصف |
| IsletFileName | إدخال البيانات (التي يقدمها المستخدم) |
| IsletFileName_initial.txt | بنية الجزيرة الأولية التي اقترحتها الخوارزمية كخطوة أولية لإعادة الإعمار |
| IsletFileName_reconstructed.txt | جزيرة أعيد بناؤها (غير posptrocessed) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | الجزيرة النهائية التي أعيد بناؤها والجزيرة الخلفية |
| IsletFileName_processlog.txt | سجل إعادة الإعمار (خوارزمية التحسين) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | الخلايا المتداخلة في نهاية عملية إعادة الإعمار (مرحلة ما بعد المعالجة) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | مصفوفة المرافقة لجميع جهات الاتصال |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | مصفوفة مجاورة لجهات الاتصال ɑ-ɑ |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | مصفوفة مجاورة لجهات الاتصال ɑ-β |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | مصفوفة مجاورة لجهات الاتصال ɑ-δ |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | مصفوفة المرافقة لجهات الاتصال β β β δ |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | مصفوفة المرافقة لجهات الاتصال β β |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | مصفوفة المرافقة لجهات الاتصال β δ |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | مصفوفة المرافقة لجهات الاتصال δ δ |
| IsletFileName_Kmat.txt | مصفوفة التفاعل المستخدمة في المحاكاة |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | نتائج محاكاة كوراموتو |
الجدول 1: وصف الملفات المحفوظة كجزء من ملف المشروع. لاحظ أنه يتم تعريف اسم الملف المستخدم لحفظ ملفات المشروع تلقائيا بواسطة ملف البيانات الأولي الذي حدده المستخدم.
الملف التكميلي 1: وصف رسومي للبروتوكول باستخدام لوحات التحكم في IsletLab. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: وثائق IsletLab. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: يتضمن جميع الملفات اللازمة لتثبيت IsletLab. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد البروتوكول أعلاه نهجا عمليا لإعادة بناء وتحليل معماريات جزر البنكرياس باستخدام خوارزميات حسابية جديدة. الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تمكين مجتمع أبحاث الجزيرة من اشتقاق مقاييس كمية لتوصيف الخصائص المورفولوجية والاتصالية لمعماريات جزر البنكرياس وتقييم الآثار الوظيفية المحتملة لهذه الخصائص عن طريق المحاكاة الحسابية.
في حين أن الخوارزميات المعتمدة في هذا البروتوكول قد تم وصفها مسبقا بالتفصيل12,19 ، إلا أنه لم يكن هناك تنفيذ مباشر وسهل الاستخدام بسبب تعقيدها النسبي ، مما حد من استخدامها كأداة مكملة للعمل التجريبي والنظري.
أولا، تستخدم خوارزمية حديثة اقترحها فيليكس مارتينيز وآخرون 19 لإعادة بناء معماريات الجزر من البيانات التجريبية (مثل الإحداثيات النووية ونوع الخلية). ونتيجة لذلك، يحصل المستخدم على بنية جزيرة تتكون من خلايا كروية غير متداخلة مع نصف قطر معين تلقائيا وفقا للتوزيعات التجريبية المبلغ عنها. في الممارسة العملية ، خوارزمية إعادة الإعمار هي إجراء تحسين تكراري يصبح مكلفا من وجهة النظر الحسابية مع زيادة عدد الخلايا في الجزيرة. لهذا السبب ، يوصى بشدة باستخدام نظام متعدد المعالجات للاستفادة من تنفيذ المعالجة المتوازية للخوارزمية الموضحة في هذا البروتوكول. كما هو موضح أعلاه ، تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية لعملية إعادة البناء في تحديد القيم المناسبة للمعلمات المعنية (أي التكرارات وعوامل القبول ودرجة الحرارة الأولية) ، نظرا لأن وقت الحوسبة سيكون مرتبطا مباشرة بعدد التكرارات التي تم إجراؤها ، بالإضافة إلى عدد العمليات المتوازية المستخدمة (أي معلمة مؤشرات الترابط في إعدادات إعادة الإعمار). إذا لم يكن وقت حساب مشكلة ، فإننا نوصي بشدة باستخدام أعلى القيم الممكنة للتكرارات وعوامل القبول من أجل زيادة عدد التكرارات التي تم إجراؤها.
وتتمثل الخطوات التالية للبروتوكول في تحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية وتوليد شبكة الجزر. ترتبط كلتا الخطوتين ارتباطا مباشرا بعملية إعادة الإعمار ، وعلى هذا النحو ، فإن عدد الخلايا المدرجة في الجزر المعاد بناؤها (وبالتالي المعلمات المعنية) ، وكذلك قيمة التسامح مع الاتصال المستخدم ، هو المفتاح للحصول على أفضل النتائج الممكنة.
وأخيرا، إذا رغب المستخدم في ذلك، يمكن إجراء عمليات محاكاة وظيفية من خلال تنفيذ نموذج مؤشرات التذبذب المقترنة الذي اقترحه هوانغ وآخرون.12 باستخدام شبكة الاتصال المستمدة من عملية إعادة الإعمار لتكوين النظام المتذبذب. بالنظر إلى أن عملية المحاكاة تنطوي على حل نظام من مئات أو آلاف المعادلات التفاضلية المقترنة (واحدة لكل خلية في الجزيرة) ، فقد تم تنفيذ خوارزمية المحاكاة مع الاستفادة من إمكانية إجراء حسابات متوازية باستخدام وحدة معالجة الرسومات ، مما يسمح للمستخدم بمحاكاة عمليات محاكاة طويلة كبيرة في وقت حوسبة قصير نسبيا. تتمثل الخطوات الرئيسية في مرحلة محاكاة البروتوكول في تحديد العدد المناسب من الكتل ومؤشرات الترابط المتاحة في قسم إعدادات منصة الحوسبة في لوحة المحاكاة ، وهو جانب يرتبط ارتباطا مباشرا بخصائص الأجهزة المستخدمة. المعلمات الأخرى المعنية (التردد الجوهري ، المرحلة الأولية ، وقوة التفاعل في لوحة المحاكاة) ، على الرغم من أنها ذات صلة بنتائج المحاكاة ، ترتبط بشكل أساسي بالمشكلة قيد التحقيق ويجب تحديدها من قبل المستخدم بعد النظر فيها بعناية من أجل تمثيل سيناريو المحاكاة المطلوب.
وعلى الرغم من المزايا التي يوفرها البروتوكول، يجب الاعتراف ببعض القيود. أولا، إن البارامترات المتصلة بعملية إعادة الإعمار وتحديد جهات الاتصال من خلية إلى خلية ليست فريدة من نوعها وقد تختلف من حالة إلى أخرى. لهذا السبب ، على الرغم من أنه يمكن استخدام قاعدة أساسية لتحديد قيمة المعلمات المطلوبة ، إلا أنه لا يزال من المستحيل تجنب نهج التجربة والخطأ. وثمة جانب آخر يمكن أن يحد من إمكانية تطبيق البروتوكول وهو الموارد الحسابية اللازمة، ولا سيما لمراحل إعادة الإعمار والمحاكاة في البروتوكول. وعلى الرغم من هذه القيود، فإن حقيقة أن المعرفة البرمجية ليست ضرورية لتنفيذ البروتوكول تسمح للباحثين من خلفيات متنوعة بالاستفادة بسهولة من الخوارزميات المقترحة التي لولا ذلك لظلت غامضة بالنسبة للمستخدم غير المتخصص.
تشمل الاستخدامات المحتملة للبروتوكول المقترح تصور البيانات التجريبية ، والتحليل المقارن للجزر العادية والمتغيرة (على سبيل المثال ، في وجود مرض السكري من النوع 1 أو 2) ، أو حتى المقارنة بين الجزر من الأنواع المختلفة باستخدام المقاييس المورفولوجية والهيكلية والقائمة على الشبكةالكمية 23. علاوة على ذلك ، يمكن بسهولة استخدام الجزر المعاد بناؤها باستخدام البروتوكول الموضح هنا لإنشاء نماذج رياضية وظيفية مفصلة يتم فيها استكمال الاتصال وأحجام الخلايا التي تحددها خوارزمية إعادة البناء بنماذج كهروفسيولوجية مفصلة لخلايا البنكرياس لتوضيح الآثار الوظيفية للاتصال بين الخلايا داخل الجزر المعاد بناؤها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
فيليكس مارتينيز يشكر المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك وقسم الهندسة الكهربائية في الجامعة الحضرية المستقلة (مكسيكو سيتي) على الدعم المقدم لهذا المشروع. نشكر الدكتور دانه تاي هوانغ والدكتور مانامي هارا والدكتور جونغيو جو على عملهم المتميز وكرمهم في مشاركة معماريات الجزر التي جعلت هذا العمل ممكنا مع مجتمع البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
