Summary
このプロトコルでは、膵島は、専用のマルチプラットフォームアプリケーションに実装された計算アルゴリズムを使用して再構築および分析されます。
Abstract
膵島の構造特性は、電気、パラクリン、およびオートクリンシグナル伝達を 介 した膵島内通信におけるそれらの意味合いのために、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン分泌細胞の機能的応答にとって重要である。このプロトコルでは、膵島の3次元アーキテクチャは、まず、新しい計算アルゴリズムを使用して実験データから再構築されます。次に、再構成された膵島の形態学的および接続性特性、例えば、異なるタイプの細胞の数およびパーセンテージ、細胞体積、および細胞間接触が得られる。次に、ネットワーク理論を使用して、平均次数、クラスタリング係数、密度、直径、効率などのネットワーク派生メトリックを通じて、膵島の接続特性を記述します。最後に、これらすべての特性は、結合発振器のモデルを使用した計算シミュレーションによって機能的に評価されます。全体として、ここでは、膵島の研究とシミュレーションのために特別に開発されたマルチプラットフォームアプリケーションであるIsletLabに実装されたステップバイステップのワークフローを説明し、実験作業を補完するものとして膵島を特徴付けて分析するための新しい計算方法論を適用します。
Introduction
膵臓は、頭、首、体、尾と呼ばれる領域に分割され、それぞれが異なる構造、機能、および解剖学的位置1,2を有する。機能的観点からは、膵臓は内分泌系と外分泌系に分けることができ、前者はグルコース恒常性の調節に決定的に関与するホルモンの分泌に関与し、後者は十二指腸への酵素の分泌を介して食物消化に寄与する1。膵島は膵臓の内分泌組織を構成し、それぞれɑ、β、およびδ細胞から分泌されるグルカゴン、インスリン、およびソマトスタチンの分泌に関与している3。それらの固有の調節機構に加えて、これらの細胞は、直接の電気通信(β細胞と、おそらくβ細胞およびδ細胞との間の)を介して、またパラクリンおよびオートクリンシグナル伝達によって調節される4,5,6。どちらのメカニズムも、膵島のアーキテクチャ(すなわち、膵島内の異なるタイプの細胞の組成および組織)に大きく依存している7,8。重要なことに、膵島構造は糖尿病の存在下で変化し、結果として膵島内通信を妨害する可能性が最も高い9、10。
膵島の研究には、幅広い実験方法論が含まれます。これらの中で、膵島内の異なる細胞の数、位置、およびタイプを決定するための蛍光技術の使用は、膵島11、12、13の構造的および形態学的特性を研究し、健康および疾患における機能的影響のより良い理解を得ることを可能にした。補完として、膵臓細胞14、15、16、およびより最近では、膵島12、17、18、19の計算モデルは、実験的に対処することが困難または不可能でさえある側面を評価するために過去数十年間に使用されてきた。
このプロトコルでは、膵島構造を再構築し、定量的メトリックを通じて形態学的および接続性特性を分析し、膵島特性の機能的影響を評価するための基本的なシミュレーションを実行する方法論を概説することによって、実験と計算作業の間のギャップを埋めることを目指しています。
以下に説明するプロトコルは、膵島の研究のために特別に設計された計算アルゴリズムに基づいています。要約すると、プロトコルの最初のステップでは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色によって得られた核位置と免疫蛍光によって同定された細胞型(Hoang et al.11,12によって詳細に記載されているように)のFélix-Martínezらによって最近提案されたアルゴリズムを使用して、膵島構造が実験データから再構築される。) は反復最適化プロシージャーで処理されます。これにより、各セルの最適なサイズと位置が決定され、重複しないセルで構成される膵島が得られます。第2に、再構成されたアーキテクチャに基づいて、セル間接触が識別され、接続特性を決定し、対応する膵島ネットワークを生成するために、ユーザが膵島アーキテクチャをさらに記述するための定量的メトリクスを得ることができる(再構成アルゴリズムに関する詳細は、主題19に関する元の研究において参照することができる)。最後に、Hoangら12によって提案されたモデリングアプローチを用いて基本的な機能シミュレーションが行われ、実験的に観察されたホルモン分泌の拍動性の性質に基づいて20,21、各細胞が発振器として扱われ、したがって膵島は再構成された膵島の接続特性に続く結合振動子のネットワークとして表される。
このプロトコルで使用されるアルゴリズムの計算上の複雑さを考えると、関連するすべてのステップは、特殊なソフトウェアまたはプログラミング言語の使用における経験のレベルにかかわらず、関心のあるすべての読者にこれらの計算ツールにアプローチすることを主な目的として、スタンドアロンアプリケーション22 に実装されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
メモ: プロトコルの概略図を 図 1 に示します。ステップバイステップの説明は次のとおりです(プロトコルの各ステップで使用されるコントロールパネルの詳細については 、補足ファイル1 を参照してください)。
図1:フロー図 IsletLab で実装されているプロトコルの順序を説明するフロー図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. IsletLab を Linux にインストールする
メモ: 補足ファイル 2 のセクション 2 と 3 に記載されている手順に従って、IsletLab を Windows または macOS にインストールします。
- インターネットブラウザを開き、https://github.com/gjfelix/IsletLab に移動します。IsletLab リポジトリ ファイルをダウンロードして解凍します。
注: 補足ファイル 3 には、このプロトコルで使用されているバージョンの IsletLab のコピーが含まれています。 - gcc コンパイラと nvcc コンパイラがインストールされていることを確認します。ターミナルを開き、次のコマンドを入力します。
gcc --バージョン
nvcc --version
補足ファイル 2 のセクション 1 にリストされている指示に従って、これらのコマンドのいずれかがシステムによって認識されない場合。 - データ サイエンス プラットフォームをダウンロードしてインストールします (資料表を参照)。ターミナルを開き、IsletLab フォルダーに移動します。
- ターミナルで次のコマンドを入力して、新しい環境を作成します。
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - 次のように入力して、新しい環境をアクティブ化します。
コンダはisletlab_v1.0をアクティブにします - ターミナルで次のコマンドを入力して IsletLab アプリケーションを起動します (メイン ウィンドウの説明については、 図 2 を参照してください)。
パイソンisletlabgui_v1.0.py
図 2: IsletLab のユーザー インターフェイス インターフェースは、構成 (1)、統計 (2)、およびグラフィックス (3) パネルの 3 つのメイン・パネルで構成されています。グラフィックツールバー (4) は、グラフィックパネルの下部にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 島再建
- 入力データを準備します。入力膵島データ (つまり、セル・タイプと 3 次元 (3D) 座標) を 4 列ファイルに編成し、列 1 にはセル・タイプ (11: ɑ-cell、12: β-cell、13: δ セルとしてコード化されます) が含まれ、列 2 から 4 にはそれぞれ x、y、z 座標が含まれます ( 補足ファイル 2 のセクション 5 の入力ファイルの抜粋、または IsletLab リポジトリに含まれている入力テスト・ファイルを参照)。
- 入力ファイルに列ヘッダーが含まれていないことを確認してください。IsletLab リポジトリに含まれているサンプル入力ファイルを使用して、必要に応じてプロトコルに従います (Input_Islet_test.txt)。
注:IsletLabに実装されたアルゴリズムを開発するために使用された入力データは、核位置を決定するためにDAPI染色を使用し、細胞型を同定するための免疫蛍光を用いてHoangら11,12によって詳細に説明されるように実験的に得られた。 - 「 初期膵島をロード」(Load InitialIslet ) ボタンをクリックし、入力データを含むファイルを選択して、初期膵島、3D 表現、および対応する統計量を生成します。エラーが発生した場合は、「島ファイルの読み込み中にエラーが発生しました」というメッセージが表示されます。これを修正するには、手順 2.1 を繰り返します。
- 再構築プロセスを構成します。「再構成設定」ボタンをクリックし、最適化パラメーターを変更します (アルゴリズムと 再構成設定 ウィンドウに表示されるパラメーターの簡単な説明については、 補足ファイル 2 のセクション 4 および 5 を参照してください)。
- 初期温度 = 1、反復係数 = 1、および許容係数 = 1 を設定します。「 OK」 ボタンをクリックして、パラメータ値を保存します。
注:経験則として、温度パラメータ、反復および受容係数の増加は、計算時間の増加を犠牲にして、再構成された膵島に含まれる実験細胞に関してより良い再構成結果をもたらすであろう。 - 「島の再構築」ボタンをクリックして、再構築ログウィンドウを開きます( 再構築 ログに提供される情報の説明については、 補足ファイル 2 のセクション 6 を参照してください)。
- 「実行」ボタンをクリックして、再構築プロセスを開始します。「続行するにはこのウィンドウを閉じてください」というメッセージが表示されるまで、最適化プロセスを監視します。再構成ログウィンドウを閉じて、再構築された島を視覚的に表現し、関連する統計を計算します(図3A-Cの左側の列を参照)。
- 統計パネルの最後の膵島タブに表示される最適化統計を分析することによって、再構成プロセスの結果を評価します。特に、再構成された膵島に含まれる実験細胞の割合(実験の%)を最大化すること、または同等に、オーバーラップの数を最小限に抑えることに焦点を当てる(収束プロット、 図3A〜Cの右側の列にもグラフィカルに示されている)。
- ユーザーの目的に応じて実験統計量の%が低いと考えられる場合は、ステップ9.1の説明に従ってIsletLabを再起動し、再構成設定の初期温度、反復係数、および受け入れ係数を上げ、満足のいく結果が得られるまでステップ2.1-2.4を繰り返します(実験細胞の95%を>)。再構成プロセスおよび関連する結果の詳細については、 補足ファイル 2 のセクション 5 から 7 を参照してください。
3. 細胞間接触の識別
- 「 再構成設定」(Reconstruction Settings ) ボタンをクリックし、「接触公差」(Contact Tolerance) パラメータを設定してセル間接触公差を定義し、「 OK」 をクリックしてパラメータ値を保存します。
メモ: 接触許容値パラメータは、接触していると見なされるセル間の最大距離を表します。 - [セル間連絡先] ボタンをクリックして、密接に接触しているセルを識別します。連絡先タブで、グラフィックパネルにグラフィカルに表示されている接触セル(黒い線)と、対応する統計(合計、ホモタイプおよびヘテロタイβ接触、および統計パネルに表示されているβ δ、δ-β、ɑ-δ、ɑ-β、δ- 連絡先)を確認します(図4A-Cの左の列を参照)。
- 接触許容値パラメータを増加 (減少) させて、セル間接触の数を増加 (減少) させます。セル間接触の識別および関連する結果の詳細については、 補足ファイル 2 のセクション 8 を参照してください。
4. 島ネットワークの構築
- [ネットワークの構築] ボタンをクリックして、島ネットワークを生成し、関連するネットワーク メトリックを計算します (図 4A-C の右側の列を参照)。
メモ: 生成された島ネットワークに関連する結果の詳細については、 補足ファイル 2 のセクション 9 を参照してください。
5. 再建された島の機能シミュレーション
- インタフェースの設定パネルの [シミュレーション]タブ に切り替えます(図5)。
- 希望する固有周波数のモード(定数またはランダム)を選択し、固有周波数の設定ボタンをクリックして発振器周波数(Hz単位)を定義します。ランダムな固有周波数が選択されている場合は、平均と偏差(Hz単位)を定義して正規分布のランダム周波数を生成します(シミュレーションパラメータの説明については、補足ファイル2のセクション11を参照してください)。
- 初期フェーズの目的のモード - 定数 または ランダム - を選択します。定数初期位相が選択されている場合は、初期位相を設定ボタンをクリックして、オシレーターの 位相を ラジアン単位で定義します。ランダムな初期位相が選択されている場合、システムはすべての発振器に0〜2πのランダムな位相を割り当てます。
メモ: 一定の初期位相が選択されている場合、すべての発振器は位相で初期化されます。 - 「相互作用 の構成」 ボタンをクリックして、相互作用の強さウィンドウで細胞間の相互作用パラメータを定義します。相互作用パラメータの説明については、 補足ファイル 2 のセクション 11 を参照してください。
- シミュレーションを構成するには、合計シミュレーション時間 (単位)、時間ステップ (単位)、および保存係数 (保存されたデータ ポイント間のステップ数) を定義します。 図 5 に示すシミュレーションでは、合計時間は 20000 秒で、時間ステップは 0.1 秒、保存係数は 500 秒でした。
- シミュレーションの実行に使用できるブロック、スレッド、およびコンピューティング プラットフォーム機能の数を定義します。これらのパラメーターは、使用可能なグラフィックス処理装置 (GPU) の特定の特性に従って定義します。
注: 図 5 に示す例では、マルチプロセッサあたり 36 個のマルチプロセッサと 64 個のコンピューティング プラットフォーム コアを備えた GPU が使用されていたため、ブロックあたり 36 個のブロックと 64 個のスレッド (2304 個のコンピューティング プラットフォーム コア) が使用されました。ハードウェア・コンピューティング・プラットフォーム機能が 7.5 であったため、使用されたコンピューティング・プラットフォーム機能パラメーターの値は 75 でした (これらのパラメーターの詳細については、 補足ファイル 2 のセクション 10 を参照してください)。 - 「シミュレーション の実行」 ボタンをクリックして、シミュレーション・ログ・ウィンドウを開きます。[ 実行 ]ボタンをクリックしてシミュレーションを開始し、「続行するにはウィンドウを閉じてください」と表示されるまでプロセスを監視します。シミュレーション・ログの詳細については、 補足ファイル 2 のセクション 12 を参照してください。
- シミュレーション・ログ・ウィンドウを閉じて、シミュレーション結果を確認します ( 図 5 を参照)。シミュレーション結果の詳細については、 補足ファイル2のセクション13を参照してください。
6. プロジェクトを保存する (オプション)
- メニューバー >「ファイルをエクスポート 」をクリックします。プロジェクトファイルを保存するディレクトリを選択し、「 OK」 ボタンをクリックします。
メモ: プロジェクトファイルの名前は、初期データファイルの名前に基づいて自動的に決定されます。プロジェクトが保存されていない場合、すべての結果と関連ファイルが自動的に削除されます。 - エクスポートしたプロジェクトをロードするには、「 ファイル」>「プロジェクトのロード」をクリックします。
7. 数字の保存(オプション)
- プロットツールバーにある [プロットの保存] アイコン をクリックして、現在のビジュアライゼーションを画像ファイルに保存します。プロトコル全体で作成されたすべての数値について、この手順を繰り返します。
メモ: プロットと島島のビジュアライゼーションは、グラフィックパネルのプロットツールバーにあるアイコンを使用して変更できます。
8. プロジェクトの読み込み (オプション)
- メインメニュー の「ファイル」>「プロジェクトのロード 」をクリックし、手順 6.1 ~ 6.2 の説明に従って以前に保存したプロジェクトファイルを選択します。
メモ: プロジェクトファイルが外部で変更されている場合、プロジェクトは正しく読み込まれません。プロジェクトが正常に読み込まれると、シミュレーション機能のみが使用可能になります。
9. 再構築プロセスと分析の再開 (オプション)
- ユーザーはいつでも [ファイル] > [ 再起動] を選択して、すべての結果を破棄し、新しい再構築と分析を開始できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Félix-Martínez et al.19によって提案された方法論を用いた膵島の再構成は、最適化アルゴリズム(再構成設定で定義される)に与えられたパラメータに大きく依存する。この例を図 3 に視覚的に示し、異なるパラメータ セットを使用して得られた再構築された膵島を示します。まず、図3Aに、初期データに含まれるセルの86.6%を含む再構成が示されている(588個のセルのうち509個、初期温度=1、反復因子=1、受容因子=1)。初期温度と反復および受容因子が増加すると(初期温度=10、反復因子=5、および受容因子=5、図3B)、初期細胞のより高い割合(93.37%)が再構成された膵島に含まれた(すなわち、588細胞中549個)。図3C(初期温度= 10、反復係数= 1000、受け入れ係数= 500)に示すように、再構成された膵島が初期細胞の99.15%(588細胞のうち583個)で構成されるように、特に反復係数および受容因子について、はるかに高い値を使用すると、さらに良好な結果が得られる。温度の関数として重なり合ったセルの進化を示す収束プロット(図3A-Cの右列)を評価して、パラメータが最適化プロセスにどのように影響するかを判断する必要があります。経験則として、再構成された膵島が初期細胞の割合が低い場合、相互作用および受容因子を増加させなければならない。その結果、これらの要因は評価される反復回数を直接増加させるため、計算時間は必然的に増加します。例えば、上述の最初の再構成の計算時間は6秒であった。対照的に、第2および第3再構成の計算時間は、それぞれ21秒および24分6秒であった。
図3:再構成設定における最適でないパラメータセットを使用した膵 島再構成 最適でないパラメータセットの使用は、再構成された膵島における実験細胞の割合が低いことにつながる可能性がある。(a)左:実験細胞の86.6%が再構成された膵島に含まれていた(初期温度=1、反復因子=1、受容因子=1、計算時間=6秒)。右:再構成プロセスの収束プロット。(b)左:実験細胞の93.4%が再構成膵島に含まれていた(初期温度=10、反復因子=10、受容因子=5、計算時間=21秒)。右:再構成プロセスの収束プロット。(c)左:実験細胞の99.15%が再構成された膵島に含まれていた(初期温度=10、反復因子=1000、受容因子=500、計算時間=24分、8秒)。右:再構成プロセスの収束プロット。収束プロットの矢印は、再構成プロセスの初期セルと最終数(再構成アルゴリズムの後処理フェーズの前)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
再構成された膵島からの細胞間接触の識別は、図4A−Cに図示されるように接触許容パラメータ(再構成設定で定義される)の値に依存し、ここで、図3A−Cに示される再構成アーキテクチャから識別される細胞間接触(黒線で表わされる)が提示される。たとえば、図4Aのように1μmの接触公差が定義されている場合、290個のセル間接触のみが識別されます。対照的に、図4B、Cのように接触公差を2μmに増加させると、同定された接触の総数はそれぞれ636および731に増加した(図4A-Cの統計パネルを参照)。これらの違いは、接触許容値のより高い値が使用されるにつれて細胞間の接触の数が明らかに増加するので、図4A−Cの左列に示されている細胞間接触の視覚的表現においても気づくことができる。接触の数は、再構成された膵島に含まれるセルの数にも依存し、したがって、温度パラメータ、反復および受容係数、ならびに接触許容度の組み合わせが、最終的に、形成された膵島ネットワークおよび対応するネットワークメトリックに反映される再構成された膵島の接続性を決定すること、 図4A-Cの右側の列に示すように。ネットワークプロットにより、ユーザーはさまざまなセルがどのように接続されているかを視覚化できます。定量的には、膵島の接続特性は、平均度、密度、平均クラスタリング係数、効率、および直径のネットワークメトリックの観点から記述されます(これらのメトリックの詳細については、補足ファイル2のセクション9を参照できます)。
図4:細胞間接触の識別における接触許容パラメータの効果。 (A-C) 左: 図 3A-C に示す再構成された膵島から識別された細胞間接触 (パネル A、B、および C における合計接触数はそれぞれ 290、636、および 731)。接触公差パラメータに使用された値は、1 μm(A)および2 μm(BおよびC)であった。再構成された膵島に含まれる細胞の数は、同定された細胞間接触の数にも影響することに注意してください。右: セル間接点から生成されたネットワークは、対応する左側の列に表示されます。接続がネットワーク・メトリックに与える影響が統計パネルで強調表示されていることに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
最後に、膵島が再構築され、セル間接触が特定されたら、機能シミュレーションを実行できます(互換性のあるGPUが利用可能な場合のみ)。さまざまな細胞集団(ɑ、β、およびδ細胞)と膵島全体(図5のグラフィックパネルの上段のプロット)の振動の合計を含む、典型的なシミュレーション結果を図5に示します。この図は、接続性および相互作用特性の結果としての異なる細胞集団間の経時的な位相差を示し、ユーザは、膵島全体の振動挙動(黒線)に対する各細胞集団(赤、緑、および青の線)の寄与を決定することを可能にする。例えば、図5の上段のパネルは、集団レベルでは、ɑ細胞とβ細胞は完全に位相がずれて振動し、δ細胞はɑとβ細胞と位相がずれて振動することを示唆しています。さらに、シミュレーションによると、膵島の振動挙動はɑ細胞の振動によって支配されているが、他の細胞集団の影響も注目することができる。すべての膵島セルの振動信号はデータファイルに自動的に保存されるため(補足ファイル2の表1とセクション13を参照)、ユーザーはシミュレーション結果の詳細な解析を実行できます。補完として、振動の位相コヒーレンスを反映する膵島同期指数も計算され、表示されます(図5のグラフィックパネルの下部プロット)。同期インデックスの範囲は 0 ~ 1 で、0 と 1 はそれぞれ、膵島内のすべてのセル間の null と完全な同期を示します。したがって、同期インデックスプロットは、再構築された膵島の接続性および相互作用特性の結果として、膵島細胞間の同期性が経時的にどのように変化するかの視覚化として解釈することができる。実行されるシミュレーションは、結合発振器12の考えに基づいており、再構成された膵島の接続性に大きく依存するので、機能シミュレーションを実行する前に、許容可能な膵島再構成およびセル間接続性に到達することが鍵となる。
図5:シミュレーションパラメータは、[シミュレーション]タブの設定パネルで定義されています。 シミュレーションの結果は、グラフィックパネルのシミュレーションタブに表示され、さまざまなセル集団(ɑ、β、およびδ)と島全体の合計振動挙動が表示されます(上)。膵島細胞間の位相コヒーレンスの尺度である同期指数も示されている(下図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
プロセスのほぼすべてのステップで、データファイルが生成されることに言及する価値があります。生成されるデータ・ファイルの説明は、 表 1 および 補足ファイル 2 全体にあります。
| ファイル | 形容 |
| IsletFileName | 入力データ (ユーザーによって与えられたもの) |
| IsletFileName_initial.txt | アルゴリズムによって提案された初期膵島アーキテクチャを再構成の初期ステップとして |
| IsletFileName_reconstructed.txt | 再建された島(仮定されていない) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | 最終的に再建された島と後膵島 |
| IsletFileName_processlog.txt | 再構成ログ(最適化アルゴリズム) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | 再構築プロセスの終了時に重なったセル (後処理) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | すべての連絡先の隣接行列 |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | ɑ-ɑ 接触の隣接行列 |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | ɑ-β 接触の隣接行列 |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | ɑ-δ 接触の隣接行列 |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | β β 連絡先とβ δ連絡先の隣接行列 |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | β βの連絡先の隣接行列 |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | β δ連絡先の隣接行列 |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | δ δ連絡先の隣接行列 |
| IsletFileName_Kmat.txt | シミュレーションで使用される相互作用行列 |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | 倉本シミュレーションの結果 |
表 1: プロジェクト ファイルの一部として保存されたファイルの説明。 プロジェクトファイルの保存に使用されるファイル名は、ユーザーが選択した初期データファイルによって自動的に定義されることに注意してください。
補足ファイル1: IsletLabのコントロールパネルを使用したプロトコルのグラフィカルな説明。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2: IsletLab のドキュメント。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3: IsletLab のインストールに必要なすべてのファイルが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記のプロトコルは、新しい計算アルゴリズムを使用して膵島アーキテクチャを再構築および分析するための実用的なアプローチを概説しています。この研究の主な目的は、膵島研究コミュニティが膵島アーキテクチャの形態学的および接続性特性を特徴付けるための定量的測定基準を導き出し、計算シミュレーション を介して そのような特性の可能な機能的影響を評価できるようにすることである。
このプロトコルで採用されたアルゴリズムは以前に詳細に説明されているが12,19、直接的でユーザーフレンドリーな実装は、その相対的な複雑さのために欠けていたため、実験的および理論的研究を補完するツールとしての使用を制限した。
第一に、Félix-Martínez et al.19 によって提案された最近のアルゴリズムは、実験データ(例えば、核座標および細胞型)から島構造を再構築するために使用される。その結果、ユーザは、報告された実験分布に従って半径が自動的に割り当てられた重なり合っていない球状セルからなる膵島アーキテクチャを得る。実際には、再構成アルゴリズムは反復的な最適化手順であり、膵島内の細胞数が増加するにつれて計算上高価になる。このため、このプロトコルで説明されているアルゴリズムの並列処理実装を利用するために、マルチプロセッサシステムを使用することを強くお勧めします。上述のように、再構成プロセスのための重要なステップは、使用される並列プロセスの数(すなわち、再構成設定におけるスレッドパラメータ)に加えて、計算時間が実行された反復の数に直接関係するので、関連するパラメータ(すなわち、反復、受容因子、および初期温度)のための適切な値を定義することである。計算時間が問題でない場合は、反復の実行回数を増やすために、反復係数と許容係数に可能な限り高い値を使用することを強くお勧めします。
プロトコルの次のステップは、セル間接触の識別と膵島ネットワークの生成です。両方のステップは再構成プロセスに直接関係しているため、再構成された膵島に含まれる細胞の数(したがって、関連するパラメータ)、および使用される接触公差の値は、可能な限り最良の結果を得るための鍵となります。
最後に、ユーザが望むならば、Hoangら12 によって提案された結合発振器のモデルの実装を通して、振動システムを構成する再構成プロセスから導出された接続性ネットワークを用いて、機能シミュレーションを実行することができる。シミュレーションプロセスが数百または数千の連成微分方程式(膵島内の各セルに1つ)のシステムを解くことを含むことを考えると、GPUを使用して並列計算を実行する可能性を利用してシミュレーションアルゴリズムが実装されているため、ユーザーは比較的短い計算時間でかなりの長いシミュレーションをシミュレートすることができます。プロトコルのシミュレーション段階における重要なステップは、シミュレーションパネルのコンピューティングプラットフォーム設定セクションで使用可能なブロックとスレッドの適切な数を決定することであり、これは使用されるハードウェアの特性に直接関連する側面です。関連する他のパラメータ(シミュレーションパネルの固有周波数、初期位相、および相互作用の強さ)は、シミュレーション結果に関連していますが、主に調査中の問題に関連しており、所望のシミュレーションシナリオを表すために、慎重に検討した後にユーザーが定義する必要があります。
プロトコルによって提供される利点にもかかわらず、いくつかの制限を認める必要があります。第1に、再構成プロセスおよび細胞間接触の識別に関連するパラメータは一意ではなく、ケースごとに異なる可能性がある。このため、経験則を使用して必要なパラメータの値を決定することはできますが、試行錯誤のアプローチは依然として避けられません。プロトコルの適用性を制限する可能性のあるもう1つの側面は、特にプロトコルの再構築およびシミュレーション段階に必要な計算リソースです。これらの制限にもかかわらず、プロトコルの実装にプログラミングの知識が必要ないという事実は、多様な背景を持つ研究者が、そうでなければ専門外のユーザーにとって不明瞭なままになる提案されたアルゴリズムを容易に利用することを可能にする。
提案されたプロトコルの潜在的な用途には、実験データの視覚化、正常および変化した膵島の比較分析(例えば、1型または2型糖尿病の存在下で)、または定量的形態学的、構造的、およびネットワークベースの測定基準を用いた異なる種からの膵島間の比較が含まれる23。さらに、ここで概説したプロトコルを用いた再構成膵島は、再構成アルゴリズムによって決定された連結性および細胞サイズを膵臓細胞の詳細な電気生理学的モデルで補完し、再構成された膵島内の細胞間通信の機能的意味を解明する詳細な機能的数学的モデルを生成するために容易に使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínezは、このプロジェクトへの支援に対して、CONACYT(Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología、メキシコ)とUniversidad Autónoma Metropolitana(メキシコ市)の電気工学科に感謝します。Danh-Tai Hoang博士、原真奈美博士、Jo Junghyo Dr. Dr. の傑出した仕事と、この作業を可能にした島の建築を研究コミュニティと共有してくれた寛大さに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
