Summary
I denne protokollen rekonstrueres og analyseres bukspyttkjertel holmer ved hjelp av beregningsalgoritmer implementert i et dedikert multiplatform-program.
Abstract
Strukturelle egenskaper til bukspyttkjertel holmer er nøkkelen for funksjonell respons av insulin, glukagon og somatostatin-utskillende celler, på grunn av deres implikasjoner i intraislet kommunikasjon via elektrisk, parakriminell og autocrine signalering. I denne protokollen rekonstrueres den tredimensjonale arkitekturen til en bukspyttkjertel holme først fra eksperimentelle data ved hjelp av en ny beregningsalgoritme. Deretter oppnås de morfologiske egenskapene og tilkoblingsegenskapene til den rekonstruerte holmen, for eksempel antall og prosentdeler av de forskjellige typene celler, cellulært volum og celle-til-celle-kontakter. Deretter brukes nettverksteori for å beskrive tilkoblingsegenskapene til holmen gjennom nettverksavledede beregninger som gjennomsnittsgrad, klyngekoeffisient, tetthet, diameter og effektivitet. Til slutt blir alle disse egenskapene funksjonelt evaluert gjennom beregningssimuleringer ved hjelp av en modell av koblede oscillatorer. Totalt sett beskriver vi en trinnvis arbeidsflyt, implementert i IsletLab, en multiplatform-applikasjon utviklet spesielt for studie og simulering av bukspyttkjertel holmer, for å bruke en ny beregningsmetodikk for å karakterisere og analysere bukspyttkjertel holmer som et supplement til det eksperimentelle arbeidet.
Introduction
Bukspyttkjertelen er delt inn i regioner referert til som hode, nakke, kropp og hale, som hver har forskjellige strukturer, funksjoner og anatomisk posisjon 1,2. Fra et funksjonelt synspunkt kan bukspyttkjertelen deles inn i endokrine og eksokrine systemer med førstnevnte ansvarlig for sekresjon av hormoner som er kritisk involvert i reguleringen av glukose homeostase, mens sistnevnte bidrar til mat fordøyelse via sekresjon av enzymer i tolvfingertarmen1. Bukspyttkjertel holmer utgjør det endokrine vevet i bukspyttkjertelen og er ansvarlig for sekresjon av glukagon, insulin og somatostatin, utskilt fra henholdsvis ɑ, β og δ-celler, henholdsvis3. I tillegg til deres iboende regulatoriske mekanismer, er disse cellene regulert via direkte elektrisk kommunikasjon (mellom β celler og sannsynligvis β og δ celler), og også av parakrimin og autocrine som signaliserer 4,5,6. Begge mekanismene er svært avhengige av holmearkitekturen (dvs. sammensetningen og organiseringen av de ulike celletypene i holmen)7,8. Viktigst, holmearkitektur endres i nærvær av diabetes, mest sannsynlig forstyrrende intraisletkommunikasjon som et resultat 9,10.
Studien av bukspyttkjertel holmer innebærer et bredt spekter av eksperimentelle metoder. Blant disse har bruk av fluorescensteknikker for å bestemme antall, plassering og type av de forskjellige cellene i holmen tillatt å studere de strukturelle og morfologiske egenskapene til bukspyttkjertel holmer 11,12,13 og for å få en bedre forståelse av de funksjonelle implikasjonene i helse og sykdom. Som et supplement har beregningsmodeller av bukspyttkjertelceller 14,15,16 og, mer nylig, bukspyttkjertel holmer 12,17,18,19 blitt brukt de siste tiårene for å evaluere aspekter vanskelig eller til og med umulig å adressere eksperimentelt.
I denne protokollen tar vi sikte på å bygge bro mellom det eksperimentelle og beregningsmessige arbeidet ved å skissere en metodikk for å rekonstruere holmearkitekturer, analysere deres morfologiske egenskaper og tilkoblingsegenskaper gjennom kvantitative beregninger, og å utføre grunnleggende simuleringer for å evaluere de funksjonelle implikasjonene av holmeegenskapene.
Protokollen beskrevet nedenfor er basert på beregningsalgoritmer spesielt designet for studiet av bukspyttkjertel holmer. Oppsummert, i det første trinnet i protokollen, blir holmearkitekturen rekonstruert fra eksperimentelle data ved hjelp av algoritmen som nylig ble foreslått av Félix-Martínez et al.19 der kjernefysiske posisjoner oppnådd gjennom 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) farging og cellulære typer identifisert gjennom immunfluorescence (som beskrevet i detalj av Hoang et al.11,12 ) behandles i en iterativ optimaliseringsprosedyre. Dette fører til å bestemme den optimale størrelsen og plasseringen til hver celle og få en holme sammensatt av ikke-overlappende celler. For det andre, basert på den rekonstruerte arkitekturen, identifiseres celle-til-celle-kontakter for å bestemme tilkoblingsegenskapene og generere det tilsvarende holmenettverket som lar brukeren få kvantitative beregninger for å beskrive holmearkitekturen ytterligere (detaljer om rekonstruksjonsalgoritmen kan konsulteres i det opprinnelige arbeidet om emnet19). Til slutt utføres grunnleggende funksjonelle simuleringer ved hjelp av modelleringsmetoden foreslått av Hoang et al.12 der, basert på den pulsatile naturen av hormonsekresjon observert eksperimentelt 20,21, blir hver celle behandlet som en oscillator, og derfor er holmen representert som et nettverk av koblede oscillatorer etter tilkoblingsegenskapene til den rekonstruerte holmen.
Gitt beregningskompleksiteten til algoritmene som brukes i denne protokollen, har alle trinnene som er involvert blitt implementert i et frittstående program22 med hovedmål å nærme seg disse beregningsverktøyene til alle interesserte lesere uavhengig av deres erfaringsnivå i bruk av spesialisert programvare eller programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Et skjematisk diagram over protokollen vises i figur 1. En trinnvis beskrivelse er gitt som følger (se Tilleggsfil 1 for detaljer om kontrollpanelene som brukes i hvert trinn av protokollen).
Figur 1: Flytskjema. Et flytskjema som beskriver den sekvensielle rekkefølgen til protokollen som implementert i IsletLab. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Installere IsletLab i Linux
MERK: Følg instruksjonene i avsnitt 2 og 3 i tilleggsfilen 2 for å installere IsletLab i Windows eller macOS.
- Åpne en nettleser og gå til https://github.com/gjfelix/IsletLab. Last ned og pakk ut IsletLab-repositoriumsfilene.
MERK: Tilleggsfilen 3 inneholder en kopi av isletlab-versjonen som brukes i denne protokollen. - Kontroller at gcc- og nvcc-kompilatorene er installert. Åpne en terminal, og skriv inn følgende kommandoer:
gcc --versjon
nvcc --versjon
Følg instruksjonene i avsnitt 1 i tilleggsfilen 2 hvis noen av disse kommandoene ikke gjenkjennes av systemet. - Last ned og installer datavitenskapsplattformen (se Materialfortegnelser). Åpne en terminal og gå til IsletLab-mappen.
- Opprett et nytt miljø ved å skrive inn følgende kommando i terminalen:
conda env opprette -f isletlabgui_v1.0.yml - Aktiver det nye miljøet ved å skrive inn:
conda aktivere isletlab_v1.0 - Start IsletLab-programmet ved å skrive inn følgende kommando i terminalen (se figur 2 for en beskrivelse av hovedvinduet):
python isletlabgui_v1,0.py
Figur 2: Brukergrensesnittet til IsletLab. Grensesnittet består av tre hovedpaneler: konfigurasjonspaneler (1), statistikkpaneler (2) og grafikkpaneler (3). Grafikkverktøylinjen (4) er plassert nederst i grafikkpanelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Islet rekonstruksjon
- Klargjør inndatadataene. Organiser inndata holmedataene (dvs. celletyper og tredimensjoners (3D) koordinater) i en firekolonners fil der kolonne 1 inneholder celletypen (kodet som 11: ɑ-celle, 12: β-celle, 13: δ-celle) og kolonne 2 til 4 inneholder henholdsvis x-, y- og z-koordinatene (se et utdrag av en inndatafil i avsnitt 5 i tilleggsfilen 2 eller inndatatestfilen som er inkludert i Islablet-repositoriet).
- Kontroller at inndatafilen ikke inneholder kolonneoverskrifter. Bruk eksempelinndatafilen som er inkludert i IsletLab-repositoriet, til å følge protokollen om nødvendig (Input_Islet_test.txt).
MERK: Inngangsdata som brukes til å utvikle algoritmene implementert i IsletLab ble oppnådd eksperimentelt som beskrevet i detalj av Hoang et al.11,12 ved hjelp av DAPI-farging for å bestemme kjernefysiske posisjoner og immunfluorescens for å identifisere cellulære typer. - Klikk knappen Last inn inn opprinnelig holme , og velg filen som inneholder inndata, for å generere en innledende holme, 3D-representasjonen og den tilsvarende statistikken. Ved feil vises følgende melding: 'Feil ved lasting av holmefil'. Hvis du vil rette opp dette, gjentar du trinn 2.1.
- Konfigurer rekonstruksjonsprosessen. Klikk på Rekonstruksjonsinnstillinger-knappen og endre optimaliseringsparametrene (se avsnitt 4 og 5 i Tilleggsfil 2 for en kort beskrivelse av algoritmen og parametrene som vises i vinduet for rekonstruksjonsinnstillinger).
- Still inn starttemperaturen = 1, gjentakelsesfaktor = 1, og akseptfaktor = 1. Klikk OK for å lagre parameterverdiene.
MERK: Som en tommelfingerregel vil en økning i temperaturparameteren, så vel som i gjentakelser og akseptfaktorer, gi bedre rekonstruksjonsresultater når det gjelder de eksperimentelle cellene som er inkludert i den rekonstruerte holmen på bekostning av en økning i databehandlingstiden. - Klikk rekonstruer holmeknappen for å åpne rekonstruksjonsloggvinduet (se avsnitt 6 i Tilleggsfil 2 for en beskrivelse av informasjonen i rekonstruksjonsloggen).
- Klikk Kjør for å starte rekonstruksjonsprosessen. Overvåk optimaliseringsprosessen til meldingen: 'Lukk dette vinduet for å fortsette' vises. Lukk rekonstruksjonsloggvinduet for å generere den visuelle representasjonen av den rekonstruerte holmen og beregne den relaterte statistikken (se venstre kolonne i figur 3A-C).
- Evaluer resultatene av rekonstruksjonsprosessen ved å analysere optimaliseringsstatistikken som vises i den endelige holmefanen i statistikkpanelet. Fokuser spesielt på å maksimere prosentandelen av eksperimentelle celler som er inkludert i de rekonstruerte holmene (% av eksperimentell) eller tilsvarende, på å minimere antall overlappinger (også vist grafisk i konvergensplottet, høyre kolonne i figur 3A-C).
- Hvis % av eksperimentell statistikk anses som lav i henhold til brukermålene, starter du IsletLab på nytt som beskrevet i trinn 9.1, og øker starttemperaturen, gjentakelsesfaktoren og akseptfaktoren i rekonstruksjonsinnstillingene og gjentar trinn 2.1-2.4 til tilfredsstillende resultater oppnås (> 95% av eksperimentelle celler). Se avsnitt 5-7 i Tilleggsfil 2 for nærmere beskrivelse av rekonstruksjonsprosessen og tilhørende resultater.
3. Identifisere celle-til-celle-kontakter
- Klikk Rekonstruksjonsinnstillinger og angi kontakttoleranseparameteren for å definere kontakttoleransen fra celle til celle, og klikk OK for å lagre parameterverdiene.
MERK: Kontakttoleranseparameteren representerer maksimal avstand mellom celler for å bli ansett som i kontakt. - Klikk Celle-til-celle-kontaktene for å identifisere cellene i nærkontakt. I kontaktfanen ser du etter celler i kontakt som vises grafisk (svarte linjer) i grafikkpanelet og tilsvarende statistikk (dvs. totalt, homotypiske og heterotypiske kontakter og ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ kontakter) som vises i statistikkpanelet (se venstre kolonne i figur 4A-C).
- Øk (reduser) kontakttoleranseparameteren for å øke (redusere) antall celle-til-celle-kontakter. Se avsnitt 8 i Tilleggsfil 2 for detaljer om identifisering av celle-til-celle-kontakter og tilhørende resultater.
4. Bygging av holmenettverket
- Klikk på Bygg nettverk-knappen for å generere holmenettverket og for å beregne de tilknyttede nettverksmålingene (se høyre kolonne i figur 4A-C).
MERK: En nærmere beskrivelse av resultatene knyttet til holmenettverket som genereres er gitt i avsnitt 9 i Tilleggsfil 2.
5. Funksjonell simulering av den rekonstruerte holmen
- Bytt til simuleringsfanen i konfigurasjonspanelet for grensesnittet (figur 5).
- Velg ønsket modus for egenfrekvens - Konstant eller Tilfeldig - og klikk på Konfigurer innebygd frekvens-knappen for å definere oscillatorfrekvensen (i Hz). Hvis en tilfeldig egenfrekvens er valgt, definerer du gjennomsnittet og avviket (i Hz) for å generere normaldelte tilfeldige frekvenser (se avsnitt 11 i tilleggsfilen 2 for en beskrivelse av simuleringsparametrene).
- Velg ønsket modus for den første fasen - Konstant eller Tilfeldig. Hvis en konstant innledende fase er valgt, klikker du knappen Konfigurer innledende fase for å definere fasen til oscillatorene (i radianer). Hvis tilfeldig innledende fase velges, vil systemet tildele tilfeldige faser mellom 0 og 2π til alle oscillatorene.
MERK: Hvis en konstant innledende fase er valgt, initialiseres alle oscillatorene i fase. - Klikk konfigurer samhandlinger for å definere samhandlingsparameterne fra celle til celle i vinduet for samhandlingsstyrke. Hvis du vil ha en beskrivelse av samhandlingsparameterne, kan du se avsnitt 11 i Tilleggsfil 2.
- Konfigurer simuleringen ved å definere den totale simuleringstiden (i s), tidstrinnet (i s) og lagre faktoren (antall trinn mellom lagrede datapunkter). I simuleringen vist i figur 5 var den totale tiden 20 000 s, med et tidstrinn på 0,1 s og en sparefaktor på 500.
- Definer antall blokker, tråder og dataplattformfunksjonalitet som er tilgjengelig for å utføre simuleringen. Definer disse parameterne i samsvar med de spesifikke egenskapene til grafikkbehandlingsenheten (GPU) som er tilgjengelig.
MERK: I eksemplet vist i figur 5 ble det brukt 36 blokker og 64 tråder per blokk (2304 dataplattformkjerner) siden en GPU med 36 flerprosessorer og 64 dataplattformkjerner per flerprosessorer ble brukt. Verdien av dataplattformkapasitetsparameteren som ble brukt, var 75 siden maskinvaredataplattformkapasiteten var 7,5 (se avsnitt 10 i Tilleggsfil 2 hvis du vil ha mer informasjon om disse parameterne). - Klikk kjør simulering for å åpne simuleringsloggvinduet. Klikk på Kjør-knappen for å starte simuleringen og overvåke prosessen til forklaringen: 'Lukk vinduet for å fortsette' vises. Se avsnitt 12 i Tilleggsfil 2 for mer informasjon om simuleringsloggen.
- Lukk vinduet for simuleringslogg for å se simuleringsresultatene (se figur 5). Detaljer om simuleringsresultatene er gitt i avsnitt 13 i Tilleggsfil 2.
6. Lagre prosjektet (valgfritt)
- Klikk Fil > Eksporter prosjekt på menylinjen. Velg mappen der prosjektfilen skal lagres, og klikk OK .
MERK: Navnet på prosjektfilen bestemmes automatisk basert på navnet på den første datafilen. Hvis prosjektet ikke lagres, slettes alle resultatene og relaterte filer automatisk. - Last inn et eksportert prosjekt ved å klikke Fil > Last inn prosjekt.
7. Lagre tall (valgfritt)
- Klikk Lagre tegneikon på tegneverktøylinjen for å lagre gjeldende visualisering i en bildefil. Gjenta dette trinnet for alle tallene som er opprettet i hele protokollen.
MERK: Plott og holmevisualiseringer kan endres ved hjelp av ikonene som er tilgjengelige på tegneverktøylinjen i grafikkpanelet.
8. Last inn prosjekt (valgfritt)
- Klikk Fil > Last inn prosjekt på hovedmenyen, og velg en prosjektfil som er lagret tidligere, som beskrevet i trinn 6.1-6.2.
MERK: Et prosjekt lastes ikke inn på riktig måte hvis prosjektfilen er endret eksternt. Hvis et prosjekt lastes inn på riktig måte, vil bare simuleringsfunksjonene være tilgjengelige.
9. Start rekonstruksjonsprosessen og analysen på nytt (valgfritt)
- Brukeren kan når som helst velge Fil > Start på nytt for å forkaste alle resultatene og starte en ny rekonstruksjon og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekonstruksjonen av bukspyttkjertel holmer ved hjelp av metodikken foreslått av Félix-Martínez et al.19 er svært avhengig av parametrene gitt til optimaliseringsalgoritmen (definert i rekonstruksjonsinnstillingene). Et eksempel på dette vises visuelt i figur 3 der rekonstruerte holmer oppnådd ved hjelp av forskjellige sett med parametere vises. For det første, i figur 3A, vises en rekonstruksjon som inkluderte 86,6% av cellene som er inkludert i de første dataene (509 av 588 celler, starttemperatur = 1, gjentakelsesfaktor = 1, akseptfaktor = 1). Når starttemperaturen og gjentakelses- og akseptfaktorene økes (innledende temperatur = 10, gjentakelsesfaktor = 5, og akseptfaktor = 5, figur 3B), ble en høyere prosentandel (93,37%) av de første cellene inkludert i de rekonstruerte holmene (dvs. 549 av 588 celler). Enda bedre resultater kan oppnås hvis mye høyere verdier brukes, spesielt for gjentakelses- og akseptfaktorene, som illustrert i figur 3C (starttemperatur = 10, gjentakelsesfaktor = 1000, akseptfaktor = 500), der den rekonstruerte holmen består av 99,15% av de første cellene (583 av 588 celler). Konvergensplottene (høyre kolonne i figur 3A-C), som viser utviklingen av overlappende celler som en funksjon av temperaturen, må evalueres for å bestemme hvordan parametrene påvirker optimaliseringsprosessen. Som en tommelfingerregel må interaksjons- og akseptfaktorene økes når den rekonstruerte holmen inneholder en lav prosentandel av startcellene. Følgelig vil databehandlingstiden uunngåelig øke, siden disse faktorene direkte øker antall iterasjoner evaluert. For eksempel var databehandlingstiden for den første rekonstruksjonen beskrevet ovenfor 6 s. I kontrast var databehandlingstidene for andre og tredje rekonstruksjon henholdsvis 21 s og 24 min 6 s.
Figur 3: Islet-rekonstruksjon ved hjelp av suboptimale sett med parametere i rekonstruksjonsinnstillingene Bruk av suboptimale sett med parametere kan føre til en lav prosentandel eksperimentelle celler i de rekonstruerte holmene. (A) Venstre: 86,6% av eksperimentelle celler ble inkludert i den rekonstruerte holmen (starttemperatur = 1, iterasjonsfaktor = 1, akseptfaktor = 1, databehandlingstid = 6 s). Høyre: konvergensplott av rekonstruksjonsprosessen. (B) Venstre: 93,4% av eksperimentelle celler ble inkludert i den rekonstruerte holmen (starttemperatur = 10, iterasjonsfaktor = 10, akseptfaktor = 5, databehandlingstid = 21 s). Høyre: konvergensplott av rekonstruksjonsprosessen. (C) Venstre: 99,15% av eksperimentelle celler ble inkludert i den rekonstruerte holmen (starttemperatur = 10, iterasjonsfaktor = 1000, akseptfaktor = 500, databehandlingstid = 24 min, 8 s). Høyre: konvergensplott av rekonstruksjonsprosessen. Pilene i konvergensplottene angir det første og endelige antallet overlappede celler i rekonstruksjonsprosessen (før etterbehandlingsfasen av rekonstruksjonsalgoritmen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Identifikasjon av celle-til-celle-kontakter fra den rekonstruerte holmen avhenger av verdien av kontakttoleranseparameteren (definert i rekonstruksjonsinnstillingene) som illustrert i figur 4A-C, der celle-til-celle-kontaktene (representert av svarte linjer), identifisert fra de rekonstruerte arkitekturene som vises i figur 3A-C, presenteres. Hvis for eksempel en kontakttoleranse på 1 μm er definert, som i figur 4A, identifiseres bare 290 celle-til-celle-kontakter. Hvis kontakttoleransen derimot økes til 2 μm, som i figur 4B,C, økte de totale kontaktene til henholdsvis 636 og 731 (se statistikkpanelet i figur 4A-C). Disse forskjellene kan også bli lagt merke til i den visuelle representasjonen av celle-til-celle-kontaktene som vises i venstre kolonne i figur 4A-C, ettersom antall kontakter mellom celler tydelig øker etter hvert som en høyere verdi av kontakttoleransen brukes. Det er verdt å markere at antall kontakter også avhenger av antall celler som er inkludert i de rekonstruerte holmene, og derfor bestemmer kombinasjonen av temperaturparameteren, iterasjonene og akseptfaktorene, og kontakttoleransen til slutt tilkoblingen til den rekonstruerte holmen, som reflekteres på holmenettverkene som dannes og de tilsvarende nettverksmålingene, som vist i høyre kolonne i figur 4A-C. Nettverkstegningen lar brukeren visualisere hvordan de forskjellige cellene er koblet sammen. Kvantitativt er tilkoblingsegenskapene til holmen beskrevet i form av følgende nettverksmålinger: gjennomsnittlig grad, tetthet, gjennomsnittlig klyngekoeffisient, effektivitet og diameter (detaljer om disse beregningene kan konsulteres i avsnitt 9 i tilleggsfilen 2).
Figur 4: Effekt av kontakttoleranseparameteren i identifiseringen av celle-til-celle-kontakter. (A-C) Venstre: celle-til-celle-kontakter identifisert fra de rekonstruerte holmene vist i henholdsvis figur 3A-C (290, 636 og 731 totale kontakter i panelene A, B og C). Verdiene som ble brukt for kontakttoleranseparameteren var 1 μm (A) og 2 μm (B og C). Legg merke til at antall celler som er inkludert i de rekonstruerte holmene, også påvirker antall celle-til-celle-kontakter som identifiseres. Høyre: Nettverk generert fra celle-til-celle-kontaktene vises i den tilsvarende venstre kolonnen. Vær oppmerksom på at virkningen av tilkoblingen på nettverksmålingene er uthevet i statistikkpanelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til slutt, når holmen er rekonstruert og celle-til-celle-kontaktene er identifisert, kan en funksjonell simulering utføres (bare når en kompatibel GPU er tilgjengelig). Typiske simuleringsresultater vises i figur 5, inkludert de summerte svingningene i de forskjellige cellepopulasjonene (ɑ, β og δ celler) og hele holmen (øvre plott i grafikkpanelet i figur 5). Denne illustrasjonen viser faseforskjellene over tid mellom de ulike cellepopulasjonene som et resultat av tilkoblings- og samhandlingsegenskapene, og lar brukeren bestemme bidraget fra hver cellepopulasjon (røde, grønne og blå linjer) til oscillatorisk oppførsel for hele holmen (svart linje). For eksempel antyder det øvre panelet i figur 5 at ɑ og β celler svinger helt ut av fase, mens δ celler svinger ut av fase med ɑ og β celler. Videre, ifølge simuleringen, er svingningsadferden til holmen dominert av svingningene i ɑ-cellene, selv om effekten av de andre cellepopulasjonene også kan bli lagt merke til. Vær oppmerksom på at oscillatoriske signaler fra alle holmecellene lagres automatisk i en datafil (se tabell 1 og avsnitt 13 i tilleggsfil 2), slik at brukeren kan utføre en detaljert analyse av simuleringsresultatene. Som et supplement beregnes og vises også holmensynkroniseringsindeksen, som gjenspeiler fasesammenslutningen til svingningene(nederste tegn i grafikkpanelet i figur 5). Legg merke til at synkroniseringsindeksen varierer fra 0 til 1, der 0 og 1 angir en null- og totalsynkronisering mellom alle cellene i holmen. Plottet for synkroniseringsindeksen kan derfor tolkes som en visualisering av hvordan synkroniteten mellom holmeceller varierer over tid som et resultat av tilkoblings- og samhandlingsegenskapene til den rekonstruerte holmen. Siden simuleringen som utføres er basert på ideen om koblede oscillatorer12 og sterkt avhenger av tilkoblingen til den rekonstruerte holmen, er det viktig å nå en akseptabel holmerekonstruksjon og celle-til-celle-tilkobling før du utfører en funksjonell simulering.
Figur 5: Simuleringsparametrene er definert i konfigurasjonspanelet i simuleringsfanen. Resultatene av simuleringen vises i simuleringsfanen til grafikkpanelet der den oppsummerte oscillatoriske oppførselen til de forskjellige populasjonene av celler (ɑ, β og δ) og hele holmen vises (øverst). Synkroniseringsindeksen, et mål på fasesammenslutning mellom holmecellene, vises også (nederst). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det er verdt å nevne at praktisk talt på hvert trinn i prosessen genereres datafiler. En beskrivelse av datafilene som genereres finner du i tabell 1 og gjennom tilleggsfil 2.
| Fil | Beskrivelse |
| IsletFileName | Inndata (gitt av brukeren) |
| IsletFileName_initial.txt | Innledende holmearkitektur foreslått av algoritmen til som første trinn i rekonstruksjonen |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Rekonstruert holme (ikke posptrocessed) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Endelig rekonstruert holme og postrocessed holme |
| IsletFileName_processlog.txt | Rekonstruksjonslogg (optimaliseringsalgoritme) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Overlappede celler på slutten av rekonstruksjonsprosessen (etterbehandling) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Adjancency-matrise for alle kontakter |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | Adjancency matrise av ɑ-ɑ kontakter |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | Adjancency matrise av ɑ-β kontakter |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | Adjancency-matrise med ɑ-δ kontakter |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | Adjancency-matrise med β-β- og β-δ-kontakter |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | Adjancency-matrise med β-β kontakter |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | Adjancency matrise av β-δ kontakter |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | Adjancency-matrise med δ-δ kontakter |
| IsletFileName_Kmat.txt | Samhandlingsmatrise som brukes i simuleringen |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Resultater av Kuramoto-simuleringen |
Tabell 1: Beskrivelse av filer som er lagret som en del av prosjektfilen. Legg merke til at filnavnet som brukes til å lagre prosjektfilene, automatisk defineres av den første datafilen som velges av brukeren.
Tilleggsfil 1: Grafisk beskrivelse av protokollen ved hjelp av kontrollpanelene til IsletLab. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: IsletLab-dokumentasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Inkluderer alle filene som trengs for å installere IsletLab. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen ovenfor skisserer en praktisk tilnærming for å rekonstruere og analysere arkitekturer for bukspyttkjertel holmer ved hjelp av nye beregningsalgoritmer. Hovedmålet med dette arbeidet er å gjøre det mulig for holmeforskningssamfunnet å utlede kvantitative beregninger for å karakterisere de morfologiske og tilkoblingsegenskapene til bukspyttkjertel holmearkitekturer og å evaluere mulige funksjonelle implikasjoner av slike egenskaper via beregningssimuleringer.
Mens algoritmene som er vedtatt i denne protokollen tidligere har blitt beskrevet i detalj12,19, manglet en direkte og brukervennlig implementering på grunn av deres relative kompleksitet, og dermed begrenset bruken som et komplementært verktøy til det eksperimentelle og teoretiske arbeidet.
For det første brukes en nylig algoritme foreslått av Félix-Martínez et al.19 til å rekonstruere holmearkitekturene fra eksperimentelle data (f.eks. kjernefysiske koordinater og celletype). Som et resultat får brukeren en holmearkitektur som består av ikke-overlappende sfæriske celler med radier automatisk tildelt i samsvar med de rapporterte eksperimentelle distribusjonene. I praksis er rekonstruksjonsalgoritmen en iterativ optimaliseringsprosedyre som blir dyr fra beregningssynspunktet etter hvert som antall celler i holmen øker. Av denne grunn anbefales det på det sterkeste å bruke et flerprosessorsystem for å dra nytte av den parallelle behandlingsimplementeringen av algoritmen som er beskrevet i denne protokollen. Som beskrevet ovenfor er et viktig trinn for rekonstrueringsprosessen å definere passende verdier for de involverte parametrene (dvs. gjentakelser, akseptfaktorer og innledende temperatur), siden databehandlingstiden vil være direkte relatert til antall gjentakelser som utføres, i tillegg til antall parallelle prosesser som brukes (dvs. trådparameter i rekonstruksjonsinnstillingene). Hvis databehandlingstid ikke er et problem, anbefaler vi på det sterkeste å bruke de høyeste verdiene som er mulig for gjentakelser og akseptfaktorer for å øke antall gjentakelser som utføres.
De neste trinnene i protokollen er identifikasjonen av celle-til-celle-kontakter og genereringen av holmenettverket. Begge trinnene er direkte relatert til rekonstruksjonsprosessen, og som sådan er antall celler som er inkludert i de rekonstruerte holmene (og derfor parametrene som er involvert), samt verdien av kontakttoleransen som brukes, nøkkelen til å oppnå best mulig resultat.
Til slutt, hvis ønsket av brukeren, kan funksjonelle simuleringer utføres gjennom implementering av modellen av koblede oscillatorer foreslått av Hoang et al.12 ved hjelp av tilkoblingsnettverket avledet fra rekonstruksjonsprosessen for å konfigurere oscillatorisk system. Gitt at simuleringsprosessen innebærer å løse et system med hundrevis eller tusenvis av koblede differensialligninger (en for hver celle i holmen), har simuleringsalgoritmen blitt implementert ved å dra nytte av muligheten for å utføre parallelle beregninger ved hjelp av GPU, slik at brukeren kan simulere betydelige lange simuleringer på relativt kort databehandlingstid. Viktige trinn i simuleringsfasen av protokollen er å bestemme riktig antall blokker og tråder som er tilgjengelige i delen for databehandlingsplattforminnstillinger i simuleringspanelet, et aspekt som er direkte relatert til egenskapene til maskinvaren som brukes. De andre parameterne som er involvert (egenfrekvens, startfase og interaksjonsstyrker i simuleringspanelet), selv om de er relevante for simuleringsresultatene, er hovedsakelig relatert til problemet som undersøkes og må defineres av brukeren etter gjennomtenkt vurdering for å representere ønsket simuleringsscenario.
Til tross for fordelene som tilbys av protokollen, må noen begrensninger anerkjennes. For det første er parametrene knyttet til rekonstruksjonsprosessen og identifikasjonen av celle-til-celle-kontaktene ikke unike og kan variere fra sak til sak. Av denne grunn, selv om en tommelfingerregel kan brukes til å bestemme verdien av de nødvendige parametrene, er en prøve-og-feil-tilnærming fortsatt uunngåelig. Et annet aspekt som kan begrense anvendelsen av protokollen er beregningsressursene som trengs, spesielt for rekonstruksjons- og simuleringsstadiene i protokollen. Til tross for disse begrensningene tillater det faktum at programmeringskunnskap ikke er nødvendig for implementeringen av protokollen forskere fra forskjellige bakgrunner lett å benytte seg av de foreslåtte algoritmene som ellers ville forbli uklare for den ikke-spesialiserte brukeren.
Potensiell bruk av den foreslåtte protokollen inkluderer visualisering av eksperimentelle data, komparativ analyse av normale og endrede holmer (f.eks. i nærvær av type 1 eller 2 diabetes), eller til og med sammenligning mellom holmer fra forskjellige arter ved hjelp av kvantitative morfologiske, strukturelle og nettverksbaserte beregninger23. Videre kan rekonstruerte holmer ved hjelp av protokollen som er skissert her, lett brukes til å generere detaljerte funksjonelle matematiske modeller der tilkoblings- og cellestørrelsene som bestemmes av rekonstruksjonsalgoritmen, suppleres med detaljerte elektrofysiologiske modeller av bukspyttkjertelceller for å belyse de funksjonelle implikasjonene av den intercellulære kommunikasjonen innen rekonstruerte holmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez takker CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) og Institutt for elektroteknikk ved Universidad Autónoma Metropolitana (México City) for støtten som gis til dette prosjektet. Vi takker Dr. Danh-Tai Hoang, Dr. Manami Hara og Dr. Junghyo Jo for deres fremragende arbeid og generøsitet i å dele holmearkitekturene som gjorde dette arbeidet mulig med forskningsmiljøet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
