Summary
レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。
Abstract
急性骨髄性白血病(AML)患者の耐性を回避し、生存率を改善する方法を解明するためには、後天性化学抵抗性の臨床的に関連するドライバーメカニズムを理解することが不可欠です。化学療法を生き延びた白血病細胞のごく一部は、化学療法的侮辱に耐えうるエピジェネティックな状態にある。化学療法へのさらなる曝露は、これらの薬物持続細胞が固定エピジェネティック状態を達成することを可能にし、これは遺伝子発現の変化をもたらし、これらの薬物耐性集団の増殖をもたらし、最終的には再発または難治性疾患をもたらす。したがって、薬剤耐性白血病細胞の生存を必要とするエピジェネティックな変調を同定することは極めて重要である。我々は、ヌクレオシド類似体シタラビン(AraC)に対する耐性を媒介するエピジェネティックモジュレーターを同定するためのプロトコルを、獲得シタラビン耐性AML細胞株におけるプールされたshRNAライブラリースクリーニングを用いて詳述する。このライブラリーは、407のヒトエピジェネティック因子を標的とする5,485のshRNAコンストラクトで構成されており、ハイスループットのエピジェネティック因子スクリーニングを可能にします。
Introduction
急性骨髄性白血病(AML)の治療選択肢は、シタラビン(AraC)とアントラサイクリンをこの疾患を治療するための礎石として、過去50年近く変わっていません。AML療法の成功に対する課題の1つは、化学療法に対する白血病幹細胞の耐性であり、疾患の再発につながる1,2。エピジェネティックな調節は、がんの病因および薬剤耐性において重要な役割を果たしており、いくつかのエピジェネティックな因子が有望な治療標的として浮上している3,4,5。エピジェネティックな調節機構は、化学療法薬への継続的な曝露下での増殖および生存に影響を及ぼす。非血液学的悪性腫瘍における研究は、薬物効果を克服する細胞のごく一部が様々なエピジェネティクス修飾を受け、それらの細胞の生存をもたらすことを報告している6,7。しかしながら、AMLにおけるシタラビンに対する後天性耐性を媒介するエピジェネティック因子の役割は、探求されていない。
ハイスループットスクリーニングは、時間の経過とともに世界的に重要性を増してきた創薬へのアプローチであり、細胞メカニズム、経路プロファイリング、および分子レベルで潜在的な標的を同定するためのさまざまな側面で標準的な方法となっています8,9。合成致死性の概念は、どちらかの遺伝子のみの摂動が実行可能であるが、両方の遺伝子の同時実行可能性の喪失をもたらす2つの遺伝子間の相互作用を含む10。がん治療における合成致死性を利用することは、堅牢な合成致死的遺伝的相互作用を特定し、機械的に特徴付けるのに役立つ可能性がある11。我々は、AMLにおける後天性シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子を同定するために、合成致死性を有するハイスループットshRNAスクリーニングのコンビナトリアルアプローチを採用した。
混合系統白血病遺伝子(MLL または KMT2A)の染色体転座によって引き起こされる急性白血病は、患者の生存率の低下と関連していることが知られている。得られたMLL遺伝子再構成のキメラ産物、すなわちMLL融合タンパク質( MLL-FP )は、造血幹/前駆細胞(HSPC)を複数のエピジェネティック因子の関与により白血病芽細胞に変換することができる。これらのエピジェネティックな調節因子は、白血病プログラムの維持を指示する複雑なネットワークを構成し、したがって、潜在的な治療標的を形成する可能性がある。この文脈で、我々はMV4-11細胞株(FLT3-ITD変異を有するMLL融合遺伝子MLL-AF4を保有し、MV4-11Pと称される)を用いて、MV4-11 AraC Rとして知られる後天性シタラビン耐性細胞株を開発した。細胞株は、薬物の休日として知られている薬物治療からの断続的な回復を伴うシタラビンの用量の増加に曝露された。半最大阻害濃度(IC50)を インビトロ 細胞傷害性アッセイにより評価した。
我々は、pZIPレンチウイルス骨格を有するhEF1aプロモーターによって駆動されるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリー( 材料表を参照)を使用した。このライブラリーは、407のエピジェネティック因子を標的とするshRNAを含む。各因子には5~24個のshRNAがあり、5個の非標的対照shRNAを含む合計5,485個のshRNAがあります。修飾された「UltrmiR」miR−30スキャフォールドは、効率的な一次shRNA生合成および発現12、13のために最適化されている。
この実験の概要を 図1Aに示します。現在のプロトコルは、浮遊細胞株であるMV4-11 AraC R細胞株(図1B)におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てています。このプロトコルは、任意の薬剤耐性細胞株中の任意の標的ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。形質導入プロトコルは、接着細胞について異なるであろうことに留意されたい。
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Protocol
インスティテューショナルバイオセーフティ委員会(IBSC)のガイドラインに従い、レンチウイルス(BSL-2)を処理するために適切な施設を使用してください。担当者は、レンチウイルスの取り扱いと処分について適切な訓練を受けるべきです。このプロトコルは、クリスチャン医科大学、ヴェローレのバイオセーフティガイドラインに従います。
1. shRNAの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択
注:蛍光タンパク質を発現する異なるプロモーターを有するレンチウイルスベクターを用いて形質導入実験を行い、実験用に選択された細胞株においてshRNAsの安定的かつ長期発現を提供するプロモーターを同定することが不可欠である。この目的のために最も一般的に使用されるプロモーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するhEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、およびSSFV(脾臓焦点形成ウイルス)プロモーターである(図2A)。
- トリパンブルー排除法を用いて細胞数を行う。MV4-11 AraC R細胞を、8μg/mLポリブレンを含む10%RPMI培地(100U/mLペニシリンおよび100U/mLストレプトマイシンを添加した10%FBSを含むRPMI)に懸濁する。6 ウェルプレートの1.5mL培地/ウェルに1 x 106個の細胞を3連でシードする。
- 異なる量の濃縮レンチウイルス(例えば、レンチウイルスの力価に応じて10 μL、20 μL、および40 μL)を各ウェルに加える。プレートを静かに回転させて内容物を混ぜます。
- 920 x g 、37°Cで90分間遠心分離による散液を行う。
- 直ちにプレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)でインキュベートする。
- 蛍光顕微鏡下で48時間後のGFP発現を観察し、形質導入の成功を確実にした。
- 72時間後にフローサイトメトリーによりGFP発現を定量し、形質導入効率を評価した。
- 細胞を合計2週間培養し、フローサイトメトリーによってGFP発現を定期的にモニターした。平均蛍光強度およびGFP+細胞の割合によって測定されたGFP発現の減少は、プロモーターサイレンシングを示す。
- 10日目にGFP+細胞を選別し、選別後1週間培養した。培養中にGFP発現を定期的に確認する。
- 形質導入されていない細胞を使用してゲートを設定します。x 軸の右側に向かって 1 x10 1 スケールを超える母集団は、GFP の正の母集団と見なされます。
- 細胞の長期培養においてGFPの持続的な発現を示すプロモーターを選択する。
2. プールされたレンチウイルスヒトエピジェネティック因子shRNAライブラリーの作製
- 各プレートに8mLの10%DMEM培地(100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンを含む10%FBSを含むDMEM)を用いて、3つの10cm細胞培養皿で293T細胞を(低い継代数で良好な増殖速度で)培養した。
- 細胞が60%のコンフルエント性に達したら、培地を完全な培地と交換する。
- 無血清培地、レンチウイルスパッケージング(psPAX2)およびエンベローププラスミド(pMD2.G)、プールされたライブラリープラスミド、最後にトランスフェクション試薬を含むトランスフェクションミックス( 表1に概説)を準備します。
- 混合物をタップしてよく混合し、室温で15分間インキュベートする。
- トランスフェクション混合物を293T細胞に加え、プレートを旋回させて穏やかに混合する。プレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)でインキュベートする。24時間後に培地を交換してください。
- 48時間後、蛍光顕微鏡下でGFP発現をチェックし、293T細胞において高いトランスフェクション効率を確保した。
- 48時間、60時間、および72時間後にウイルス上清を収集し、4°Cで保存する。 ウイルスを回収した後の各時点で新鮮な培地(8mL)を加える。
- ウイルスの上清をプールします。プールされたウイルスの総量は、〜8 mL /プレート x 3 コレクション= 〜24 mL /プレートになります。〜24 mL/プレート x 3 プレート = 3 プレートから〜 72 mL。
- プールされたウイルスを 0.4 μm フィルターでフィルター処理します。
- ウイルスの高力価を得るためには、プールされたウイルスを超遠心分離により濃縮する。ろ過したウイルス上清を2本の70Tiチューブ(32mL/チューブ)に移し、18,000x g でゆっくりと加速および減速しながら2時間遠心分離します。ローターを使用し、遠心分離機を4°Cに予冷した。
- 遠心分離機からチューブを静かに取り出し、上清を完全に取り除きます。
- マイクロピペットを使用して、ペレットを400μLのDMEM(FBSおよび抗生物質なし)に穏やかに再懸濁する。氷上で1時間インキュベートし、両方のチューブからペレットを混合する。
- ウイルスをアリコートし、−80°Cで凍結する。
注: チューブとウイルスは、手順 2.10.-2.13 の間、氷の上に保管する必要があります。プレーン培地でウイルスを再懸濁させている間は泡立ちを避けてください。培地は4°Cに維持する必要があります。 - 以下のようにウイルスの濃度(x)を計算します。
濃縮前の総容量 = 72 mL (72,000 μL)
濃縮後の容量 = 400 μL
濃度 = 72,000/400 = 180x
3. レンチウイルスの形質導入効率の推定
- 濃縮ウイルスを異なる容量(2 μL、4 μL、8 μL)で293T細胞に形質導入し、レンチウイルスの調製が成功したことを確認します。
注:濃縮ウイルスが少量(1〜2μL)で高い形質導入効率(>50%)を示す場合、濃縮ウイルスを所望の量(100倍〜75倍)で希釈することをお勧めします。 - 濃縮したウイルスをDMEM(FBSおよび抗生物質なし)で100倍に希釈し、MV4-11 AraC R細胞株で滴定実験を行った。
- 6ウェルプレートの1ウェルに1 x106 細胞(8 μg/mLポリブレンを含む1.5 mLの10%RPMI培地中のMV4-11 AraC R細胞株)をシードした。異なる量のウイルスと形質転換するための4つのウェルを準備します。
- 4 つの異なる容量 (1 μL、1.5 μL、2 μL、および 2.5 μL) の 100 倍のウイルスを追加します。
- プレートを920 x g で37°Cで90分間遠心分離して製糸を行う。
- 72時間後、GFP+細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。
- ウイルスの体積を決定し、30%の形質導入効率を得る。この低い形質導入効率は、細胞当たり単一のshRNA組み込みを確実にするためである。
4. 薬剤耐性細胞株におけるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリーの形質導入
- 標的細胞株MV4-11 AraC Rを0.5 x106 細胞/mLの密度に維持する。細胞が培養中の指数関数的な成長段階にあることを確認します。
- ウイルス組積物の数に基づいて、以下のように実験のために採取する細胞数を計算する。
形質導入に必要な細胞数 = 5,485 (shRNA の数) × 500 (shRNA 表現の倍) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 106 細胞 - 16 mLの10%RPMI培地に1.1 x107 細胞を再懸濁する。
- ポリブレン(8μg/mL)を加え、よく混ぜる。次に、必要な量のウイルスを追加して、前のセクションで計算した 30% の形質導入効率を得ます。
- すべての細胞を 6 ウェルプレート上に、1 x106 細胞/1.5 mL の密度の 10% RPMI 培地で播種します。
- プレートを37°Cで920 x g で90分間遠心分離します。
- プレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)中で一晩インキュベートする。
- 24時間後、培地を交換し、形質導入細胞をT−75フラスコに移した。
- 48時間後、蛍光顕微鏡下でGFPをチェックし、形質導入が成功したことを確認します。
- 72時間後、フローサイトメトリーによりGFP+細胞の割合を定量する。
5. GFP陽性細胞の濃縮
注: 形質導入細胞を 0.5 x106 cells/mL の密度で 5 ~ 7 日間培養して、細胞を展開します。これらの細胞は、形質導入と形質導入されていないものの混合集団であり、次のステップで述べたように、ソートによってGFPに基づいて選択される。
- GFP+ 形質導入細胞のフローソーティングは、フローソーティング設定を高純度および低収率に設定して実行します。形質導入されていない細胞を使用してゲートを設定します。右側の 1 x 102 を超える母集団は、陽性集団と見なされます。
- 選別した細胞を5% RPMI(100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加した5% FBSを含むRPMI)で収集する。
- 選別した細胞を10%RPMI培地で培養する。
- 72時間後、GFP+細胞の割合のソート後推定を行い、>95%のソーティング効率を確保します。
注:shRNAライブラリーの450倍〜〜500倍の表現を得るために、選別後に〜3〜5 x106 個のGFP陽性細胞を得るようにしてください。
6. 薬剤耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング
- shRNAライブラリー形質導入細胞を10%RPMIで最大5日間培養する。必要に応じて、薬物処理の前に、将来の実験のために形質導入細胞を凍結保存する。
- 1 x107 個の細胞を280 x gで25°Cで5分間複製して遠心分離する。 上澄み液を捨て、ペレットを−80°Cで保存する。 これらのサンプルは、エピジェネティックなshRNAライブラリーのベースラインリファレンスとして役立つでしょう。
- 残りの形質導入細胞を複製物(R1およびR2)として培養し、それぞれがライブラリーの500倍表現を提供する細胞数で維持する。
- 重複の一方を薬物(10μMシタラビン)(R2)で治療し、もう一方を薬物治療(R1)なしで治療する。
- フラスコの培地を72時間ごとに薬物の有無にかかわらず交換する。9日間の累積薬物曝露について培地交換を3回繰り返す。
- 薬物処理の9日後、トリパンブルー排除法により細胞の生存率を確認する。
- 残りの細胞を280 x g で室温で5分間遠心分離する。細胞を滅菌PBSに再懸濁し、細胞を洗浄する。室温で280 x g で5分間遠心分離機。
- 上清を捨て、ペレットを−80°Cで保存してDNA抽出する。
7. PCRによる集積shRNAの増幅
- 形質導入ベースライン細胞(T)からDNAを抽出し(ステップ6.2)、薬物で処理した細胞(R2)および薬物で処理していない細胞(R1)を抽出する。
- 蛍光光度計を用いて試料の濃度を確認する。
- PCRに必要なDNAの量を以下のように計算します。
5,485 (いいえ。shRNA の) × 500 (shRNA 表現) × 1 x 6.6−12 (g/二倍体ゲノム) = 15 μg の DNA - サンプルをPCRの第1ラウンドに供する。
注:PCR反応混合物をサーマルサイクラー条件下で 表2 に示します。プライマーの詳細は、 補足表1に提供される。 - チューブあたり 850 ng の DNA を含む複数の反応を設定します (合計 43 回の反応)。
注: PCR の第 1 ラウンドでは、shRNA の隣接する領域が増幅され、アンプリコンサイズは 397 bp になります。 - PCR 産物をプールし、標準ゲル/PCR 精製キットの 3 ~ 4 カラムを使用して PCR 産物を精製します。
メモ: 詳細については、 表 3 を参照してください。 - 各カラムから 50 μL のバッファーで生成物を溶出し、溶出液をプールします。
- DNAを定量し、-20°Cで保存する。
注:試薬は、サーマルサイクラー条件とともに 表4 に表されています。第 2 ラウンド PCR では、シングルフロー細胞内の NGS での多重化に必要な INDEX 配列を持つプライマーを利用します。したがって、各サンプルには異なるインデックスを付ける必要があります。プライマー配列は、 補足表1に提供される。 - 各サンプルおよび陰性対照について、500 ng の一次 PCR 産物を総反応量 50 μL で 4 つの反応をセットアップします。
- 2%TBEアガロースゲルを用いて電気泳動のために製品全体をロードし、1kb分子ラダーを用いてバンドサイズを確認した。アンプリコンのサイズは399bpである。
- ゲル文書化システム上のPCR産物を視覚化します。
- 特定のバンドを切除し、ゲル精製キットを用いて精製する。
注: キットを使用した精製の計算は、 表 3 に示されています。 - 溶出バッファーの最終容量 30 μL で溶出します。各溶離液のおおよその濃度は、総容量30μLで約80〜90ng/μLです。
8. 次世代シーケンシングとデータ解析
- ゲル精製物をステップ7.13から配列決定する。次世代シーケンサー(例えば、イルミナ)上で、枯渇したshRNAの読み取りカウントを取得する。
- 生成された FastQ 読み取りのアダプター シーケンスを、Fastx ツール キット (バージョン 0.7) を使用してトリミングします。
- フィルター処理された読み取り値を、2 つの不一致を許可するパラメーターを持つボウタイ アライナーを使用して参照シーケンスに揃えます。アダプターのトリミング後の読み取り長さが約 21 bp であることを確認します。
- Samtools (バージョン 1.9) プログラムを使用してファイルをロードします。Flagstat オプションを使用して、配置の要約を計算します。
- トリミングしたfastQファイルをCRISPRCloud2(CC2)ソフトウェア(https://crispr.nrihub.org/)に参照shRNA配列とともにFASTAファイルの形式でロードし、指示に従って解析を実行します。
- CC2の [分析の開始] リンクをクリックします。
- 画面タイプを「サバイバル画面」画面および「ドロップアウト画面」として選択します。グループ数を設定し、各グループの名前を入力します。
- 参照ライブラリを FASTA ファイル形式でアップロードします。アップロードされたデータが処理されます。出力URLをクリックして結果を取得します。
注:このソフトウェアは、修正されたスチューデントのt検定によるβ二項モデルを使用してsgRNA/shRNAレベルの差を測定し、続いてフィッシャーの複合確率検定を使用して遺伝子レベルの有意性を推定します。これは、処理済み(濃縮/枯渇)と未処理サンプル(ベースライン)の間のエピジェネティック因子について、shRNAの推定総log2倍変化(Log2Fc)を「p値」および「FDR値」で計算します。
- FDR 値がドロップアウト画面では「ネガティブ」、サバイバルスクリーンでは「ポジティブ」であることを確認します。
注:CC2は、読み取りをカウントし、サンプル間のshRNAのフォールド表現(濃縮または枯渇)を計算するための分析プラットフォームです。 - CC2の結果から有意に濃縮および枯渇したshRNA(FDR <0.05)を同定する。
注:各因子に対して5〜24個のshRNAがあります。各 shRNA の FDR 値を確認します。<0.01であるFDRを考え、選択されたshRNAの平均を取る。トップ40のヒットを考えてみましょう。選択した因子のグラフを、Log2FcまたはFDRの負の値に基づいてプロットします。非標的化shRNAが制御shRNAとして機能するようにデータの信頼性を確保するために、有意なFDR値も有していることを確認してください。
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Representative Results
スクリーニングワークフロー全体を図1Aに示します。MV4−11 AraC Rのインビトロ細胞傷害性(48時間)は、MV4−11 AraC R中のシタラビンに対するIC50がMV4−11 Pよりも高いことを明らかにした(図1B)。この細胞株を、シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子をスクリーニングするためのモデルとして研究に使用した。
図2A は、hEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、SSFV(脾臓焦点形成ウイルス)の3つの異なるプロモーターを用いた線状化pZIPベクターマップを示し、UltramiR配列内にスクランブルされたshRNAを有する。 図2B は、ライブラリ実験で用いたpZIPベクターマップと、hEF1aプロモーターによって駆動される選択マーカーとしてZsgreenおよびピューロマイシンを有するエピジェネティック因子を標的とするshRNAを示す。これらのベクターを、最も強力なプロモーターの選択実験に使用した。
標的細胞において一貫性のある長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択を 図3に例示する。MFIにより測定されたGFPの定量は、3つのプロモーター全てについてMV4−11 AraC Rにおいて72時間の終わりに90%以上の形質導入効率を示した。GFP発現のヒストグラムは、hCMVの不均一な集団を示すが、形質導入の3日目におけるhEF1aおよびSFFVの場合、均質な集団を示す(図3A)。棒グラフは、MV4-11 AraC Rにおける形質導入の3日目における3つの異なるプロモーター(hEF1α、hCMV、およびSFFV)によって駆動されるGFP発現を示す(図3B)。SFFV駆動GFPは、形質導入の5日目にMFIの減少を示した(図3C)。hEF1a駆動GFP形質導入MV4−11親系統選別後においてMFIの低下は観察されなかった。したがって、hEF1aプロモーターは、細胞株に好適なプロモーターとして同定された(図3D)。
図4A は、トランスフェクションの48時間後の293T細胞におけるプールされたshRNAライブラリープラスミドのトランスフェクション効率を示す。GFP発現は明るく、良好なトランスフェクション効率を示した。ウイルス採取後、調製したプールウイルスの形質導入効率を、3つの異なる濃度(2μL、4μL、および8μL)の293T細胞においてチェックした。2 μLのウイルスでも8 μLのウイルスと同等の効率が得られることが観察され、高いウイルス力価が確認されました(図4B)。
図5 は、MV4−11 AraC R細胞株におけるプールされたライブラリー形質導入およびレンチウイルス力価の決定を示す。プールされたshRNAライブラリーレンチウイルスを100倍希釈し、次いでMV4-11 AraC R細胞株に異なる容量(1 μL、1.5 μL、2 μL、および2.5 μL)で添加した。効率は72時間の終わりにチェックされた。形質導入効率は2~2.5 μLのウイルスに対して30%であり、細胞あたり1つのshRNA統合が確認された(図5A)。1.1 x107 MV4-11 AraC R細胞における2.5μlのプールされたライブラリーウイルスによる形質導入は、30%の形質導入効率をもたらした。GFP陽性細胞を選別し、プールされたshRNAライブラリーを表す(図5B)。
MV4-11 AraC R細胞株にプールされたshRNAエピジェネティックレンチウイルスの形質導入後、GFP陽性細胞を5日目または7日目に選別した(図6)。これらの選別された細胞を、シタラビンへの9日間の長期曝露に供した。9日目に生存率をチェックし、細胞をDNAについて回収した。(図6A)。棒グラフは、シタラビンの存在下での形質導入細胞の増殖速度の低下を示す(図6B)。
試料から抽出したDNAを2ラウンドのPCRに供し、NGSにより定量した濃縮shRNAsを表す最終ゲル溶出産物とした。図7Aは、PCRの第1ラウンドおよび第2ラウンドで使用したプライマーの結合領域を示し、第1ラウンドのプライマーは集積shRNAの隣接領域に結合し、第2ラウンドのフォワードプライマーはループ配列に結合する。リバースプライマーは、PCRの第1ラウンドで増幅されたベクターの領域に結合する。図7Bおよび図7Cは、ゲル溶出、精製、およびNGS分析のために提出された第1ラウンド(397bp)および第2ラウンドPCR(399bp)の終了時のPCR産物のバンドサイズを示す。
DNAを標準的な品質管理手順に供した後、サンプルをNGS分析のために処理した。私たちは、プールされたshRNAスクリーニングで濃縮および枯渇したshRNAを同定するために、ユーザーフレンドリーなクラウドベースの分析プラットフォームであるCRISPRCloud2を使用しました。 図8 は、AMLにおけるシタラビン耐性を媒介する可能性のあるエピジェネティック因子を標的とする濃縮または枯渇shRNAの表現を示す。
図1:研究の概要とモデル。(A)ワークフローの概要図。(b)増加したシタラビン濃度(0.1 μM〜1000 μM)で処理したMV4-11親およびAraC耐性細胞をMTTアッセイによって生存率評価した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.線形化されたベクトルの図。 (a)3つの異なるプロモーター、hEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、およびSSFV(脾臓焦点形成ウイルス)の3つの異なるプロモーターを用いて、UltramiR配列内のスクランブルshRNAでマッピングする。(b)選択マーカーとしてzsgreenとピューロマイシンを用いたhEF1αプロモーターとエピジェネティック因子を標的としたshRNAを用いたライブラリー実験で用いたベクターマップの説明図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:shRNAの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択 。 (A)hEF1a、hCMV、およびSFFVプロモーターについて72時間の終わりにフローサイトメトリーによって定量されたGFPの代表的なフロープロット。hCMVは不均一なピークを示し、一方hEF1aおよびSFFVは単一の均質なピークを示す。(b)MV4-11 AraC R細胞株におけるプロモーター効率。(c)SFFV駆動GFPは、長期培養におけるGFPのサイレンシングを示す。(d)hEF1a駆動GFP細胞は、細胞の選別後に持続的な発現を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)蛍光顕微鏡画像は、10倍の倍率を用いて48時間の終わりに293TにトランスフェクトされたプールされたshRNAライブラリーのトランスフェクション効率を示す。(b)プールされたウイルスの形質導入効率を、10倍の倍率を用いて、様々なウイルス量(2μL、4μL、および8μL)を有する293T細胞において評価した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:標的細胞株におけるプールされたライブラリー形質導入およびレンチウイルス力価の測定。 (A)MV4-11 AraC R細胞株を様々な量のウイルス(1μL、1.5μL、2μL、および2.5μL)で形質導入した。(B)1 x 107 MV4-11 AraC R細胞におけるプールされたライブラリーウイルスの形質導入により、30%の形質導入効率を達成し、次いでGFP陽性細胞を選別した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:薬剤耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング。ライブラリー感染細胞を9日間延長シタラビン曝露に供し、続いて生存率を確認し、DNA抽出のために細胞を回収した。(B)耐性細胞株における長期シタラビン曝露に対する生存率の低下。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)第1ラウンドおよび第2ラウンドのPCRで用いたプライマーの結合領域は、第1ラウンドのプライマーが組み込み型shRNAの隣接領域に結合し、第2ラウンドのフォワードプライマーがループ配列に結合する。その逆は、1回目のPCRで増幅されたベクター領域の領域に結合する。(b)第1ラウンドPCR終了時のPCR産物のバンドサイズ(397bp)の説明図。(c)第2ラウンドPCR産物(399bp)をゲル溶出させ、精製し、NGSについて与えた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:AML細胞株(MV-4-11 Ara-C R細胞株)におけるスクリーニング結果。 DNAを標準的な品質管理手順に供した後、サンプルをNGS分析のために処理した。ユーザーフレンドリーなクラウドベースの解析プラットフォームであるCRISPRCloud2を使用して、プールされたshRNAスクリーニングで濃縮および枯渇したshRNAを同定しました。 この図は、AMLにおけるシタラビン耐性を媒介する可能性のあるエピジェネティック因子を標的とする濃縮または枯渇したshRNAを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:トランスフェクションプラスミドミックスの調製(10cmプレートの計算) この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
表2:第1ラウンドPCRのPCR反応混合物 この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
表3:PCRの第1の産物の精製のための計算は、この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
表4:第2ラウンドのPCR反応混合物 この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
RNA干渉(RNAi)は、siRNAおよびshRNAスクリーニングを含む機能ゲノミクス研究に広く使用されている。shRNAの利点は、それらをプラスミドベクターに組み込んでゲノムDNAに組み込むことができ、安定した発現をもたらし、したがって標的mRNAのより長期のノックダウンをもたらすことである。プールされたshRNAライブラリースクリーニングは、従来のアレイスクリーニング(siRNA)と比較して堅牢で費用対効果が高い。ゲノムワイドスクリーンで特定のクラスのタンパク質の本質を特定することは、面倒な作業です。標的スクリーニングアプローチは、特定のクラス内の癌細胞の生存または薬剤耐性に対する個々のタンパク質の本質的な性質を、ノイズを低減して明らかにすることができる。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調べるためのエピジェネティック因子のRNAiスクリーニングを強調し、AML薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にする機能的プラットフォームとしてのこのアプローチの使用を実証する。
この強力な技術は、実験の設計と実行において一定の予防措置を必要とします。第1は、shRNAの発現が標的遺伝子のノックダウンに重要であるため、細胞培養中に有意なサイレンシングを受けないプロモーターの選択である。第二に、shRNA表現(各shRNAで形質導入された細胞の数)の維持は特に重要である。shRNAスクリーニング全体を通して、shRNA構築物あたり>500細胞の平均表現は、表現型効果を引き起こすshRNAを同定する可能性を増強する。
RNAiスクリーニング戦略は、競争力のある成長スクリーニングです。したがって、標的細胞が対数増殖段階にあり、画面中に過剰にコンフルエントでないことを確認することは、制限された増殖によって引き起こされる表現の損失を最小限に抑えるために重要です。実験的な変動を最小限に抑えるために、細胞を50%〜70%の合流点に維持することが理想的です。実験のばらつきを減らすために、すべてのスクリーン複製について、一貫した多くの培地、血清、ウイルス上清、薬物、および組織培養プラスチック製品を維持することを推奨します。
レンチウイルスの形質導入効率を最適化するためのパイロット実験を行い、細胞ごとにshRNAの1つの統合を達成するために必要なウイルスの量を計算することをお勧めします。細胞ごとに1つのshRNAのこの統合を達成するためには、形質導入効率は30%未満でなければならない。その量としては、30%の形質導入細胞を得るためのウイルスの量は、実験に用いた細胞株間で異なる場合があり、細胞株ごとに標準化実験が必要となる。形質導入効率は、細胞培養条件および細胞増殖速度によっても影響され得る。したがって、機能的力価は、スクリーニング実験で用いたのと同じ条件を使用してパイロット実験で決定する必要があります。統計的に有意なヒットを得るためには、3~6回の反復を維持することが常に推奨されます。
shRNAスクリーニングアプローチの2つの主要な関心事は、shRNAのオフターゲット効果と可変ノックダウン効率である16。これらは、各遺伝子の複数のshRNAを用いることによって克服することができる。哺乳動物細胞に原核生物免疫系CRISPR-Cas9を適応させることで、培養ヒト細胞における容易で効率的かつ費用対効果の高いゲノム編集が可能になりました。このシステムは、shRNAを用いて行われるものと同様のゲノムワイド遺伝子スクリーニングを行うために広く利用されてきた。特定のシングルガイドRNA(sgRNA)配列を保持する細胞の運命は、ディープシーケンシングを使用して監視することができます。ここで概説した実験セットアップは、CRISPRスクリーニングにも使用できます。
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Disclosures
著者には利益相反はなく、開示するものもありません。
Acknowledgments
この研究は、バイオテクノロジー省の助成金BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013からSRVへの資金提供を受けています。インドバイオテクノロジー省BT/COE/34/SP13432/2015およびインド科学技術省:EMR/2017/003880からP.B. RVSおよびP.B.は、それぞれWellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118およびIA/S/15/1/501842によってサポートされています。S.D.はCSIR-UGCフェローシップによって支援され、S.I.はICMRシニアリサーチフェローシップによってサポートされています。Abhirup Bagchi、Sandya Rani、CSCR Flow Cytometry Core Facilityのスタッフの協力に感謝します。また、ハイスループットシーケンシングとデータ解析を支援してくれたMedGenome Inc.にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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