Summary
RNAi-screening (High-throughput RNA interference) ved hjelp av et basseng med lentivirale shRNAer kan være et verktøy for å oppdage terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyr en samlet shRNA screening tilnærming for å undersøke epigenetiske effektorer i akutt myeloid leukemi (AML).
Abstract
Å forstå klinisk relevante førermekanismer for ervervet kjemoresistens er avgjørende for å belyse måter å omgå resistens og forbedre overlevelsen hos pasienter med akutt myeloid leukemi (AML). En liten brøkdel av leukemiske celler som overlever kjemoterapi har en klar epigenetisk tilstand for å tolerere kjemoterapeutisk fornærmelse. Ytterligere eksponering for kjemoterapi gjør at disse stoffets utholdenhetsceller oppnår en fast epigenetisk tilstand, noe som fører til endret genuttrykk, noe som resulterer i spredning av disse legemiddelresistente populasjonene og til slutt tilbakefall eller refraktær sykdom. Derfor er det viktig å identifisere epigenetiske moduler som nødvendiggjør overlevelsen av legemiddelresistente leukemiske celler. Vi beskriver en protokoll for å identifisere epigenetiske modulatorer som formidler motstand mot nukleoside analog cytarabin (AraC) ved hjelp av samlet shRNA-bibliotekscreening i en ervervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består av 5485 shRNA-konstruksjoner rettet mot 407 humane epigenetiske faktorer, noe som muliggjør epigenetisk faktorscreening med høy gjennomstrømning.
Introduction
Terapeutiske alternativer i akutt myeloid leukemi (AML) har vært uendret i nesten de siste fem tiårene, med cytarabin (AraC) og antracykliner som hjørnestein for behandling av sykdommen. En av utfordringene med suksessen med AML-terapi er motstanden av leukemiske stamceller mot kjemoterapi, noe som fører til tilbakefall av sykdommer 1,2. Epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i kreftpatogenese og legemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har dukket opp som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske regulatoriske mekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kjemoterapeutiske legemidler. Studier på ikke-hematologiske maligniteter har rapportert at en liten brøkdel av cellene som overvinner legemiddeleffekten gjennomgår ulike epigenetiske modifikasjoner, noe som resulterer i disse cellenes overlevelse 6,7. Imidlertid har rollen som epigenetiske faktorer i mediering oppnådd motstand mot cytarabin i AML ikke blitt utforsket.
Screening med høy gjennomstrømning er en tilnærming til narkotikaoppdagelse som har fått global betydning over tid og har blitt en standardmetode i ulike aspekter for å identifisere potensielle mål i cellulære mekanismer, for veiprofilering og på molekylært nivå 8,9. Det syntetiske dødelighetskonseptet innebærer samspillet mellom to gener der perturbasjonen av et av genene alene er levedyktig, men av begge genene resulterer samtidig i tap av levedyktighet10. Utnyttelse av syntetisk dødelighet i kreftbehandling kan bidra til å identifisere og mekanistisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaksjoner11. Vi har tatt i bruk en kombinatorisk tilnærming til shRNA-screening med høy gjennomstrømning med syntetisk dødelighet for å identifisere de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for ervervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukemier drevet av kromosomal translokasjon av det blandede slekts leukemigenet (MLL eller KMT2A) er kjent for å være forbundet med dårlig overlevelse hos pasienter. De resulterende chimeriske produktene av MLL-genomorganiseringer, det vil si MLL-fusjonsproteiner (MLL-FPs), kan forvandle hematopoietiske stamceller / stamceller (HSPCer) til leukemiske eksplosjoner med involvering av flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorene utgjør et komplisert nettverk som dikterer vedlikehold av leukemiprogrammet og derfor kan danne potensielle terapeutiske mål. I denne sammenhengen brukte vi MV4-11-cellelinjen (som huser MLL-fusjonsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutasjonen; betegnet som MV4-11 P) for å utvikle den oppkjøpte cytarabineresistente cellelinjen, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen ble utsatt for økende doser cytarabin med periodisk utvinning fra medikamentbehandlingen, kjent som en narkotikaferie. Den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen (IC50) ble vurdert ved in vitro cytotoksisitetsanalyse.
Vi brukte det samlede epigenetiske shRNA-biblioteket (se Materialtabell) drevet av hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral ryggrad. Dette biblioteket består av shRNAer rettet mot 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNAer, med totalt 5485 shRNAer, inkludert fem ikke-målrettede kontroll shRNAer. Det modifiserte "UltrmiR" miR-30 stillaset er optimalisert for effektiv primær shRNA biogenese og uttrykk12,13.
Omrisset av dette eksperimentet er illustrert i figur 1A. Den nåværende protokollen fokuserer på RNAi-screening ved hjelp av det epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i cellelinjen MV4-11 AraC R (figur 1B), en fjæringscellelinje. Denne protokollen kan brukes til å screene ethvert målrettet bibliotek i en hvilken som helst stoffresistent cellelinje etter eget valg. Det skal bemerkes at transduksjonsprotokollen vil være forskjellig for tilhengerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følg retningslinjene fra Institutional Biosafety Committee (IBSC) og bruk riktig anlegg til å håndtere lentivirus (BSL-2). Personell bør være tilstrekkelig opplært i håndtering og avhending av lentivirus. Denne protokollen følger biosikkerhetsretningslinjene til Christian Medical College, Vellore.
1. Valg av den mest potente promotoren for å oppnå vedvarende og langvarig uttrykk for shRNAene
MERK: Det er viktig å utføre et transduksjonseksperiment ved hjelp av lentivirale vektorer med forskjellige promotorer som uttrykker fluorescensproteiner for å identifisere promotoren som gir et stabilt og langsiktig uttrykk for shRNAer i cellelinjen som er valgt for eksperimentet. De mest brukte promotorene for dette formålet er hEF1α (human forlengelsesfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus) som uttrykker grønt fluorescensprotein (GFP) (figur 2A).
- Utfør celleantallet ved hjelp av utelukkelsesmetoden trypanblå. Suspender MV4-11 AraC R-cellene i 10 % RPMI-medium (RPMI med 10 % FBS supplert med 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomycin) som inneholder 8 μg/ml polybren. Frø 1 x 106 celler i 1,5 ml middels/brønn av en seksbrønnsplate i triplikater.
- Tilsett forskjellige mengder konsentrerte lentivirus (for eksempel 10 μL, 20 μL og 40 μL avhengig av titeret til lentivirusene) til hver brønn. Virvle platen forsiktig for å blande innholdet.
- Utfør spinfeksjon ved sentrifugering ved 920 x g ved 37 °C i 90 minutter.
- Inkuber straks platene i en CO 2-inkubator (5 % CO2 ved 37 °C).
- Vær oppmerksom på GFP-uttrykket etter 48 timer under et fluorescensmikroskop for å sikre vellykket transduksjon.
- Kvantifisere GFP-uttrykket ved strømningscytometri etter 72 timer for å evaluere transduksjonseffektiviteten.
- Kultur cellene i totalt 2 uker og overvåke GFP uttrykk periodisk ved strømning cytometri. Reduksjonen i GFP-uttrykk målt ved gjennomsnittlig fluorescensintensitet og prosentandelen av GFP+-celler indikerer promotoraktivering.
- Sorter GFP+-cellene den tiende dagen, og kulturer cellene i 1 uke etter sortering. Kontroller GFP-uttrykket med jevne mellomrom under kulturen.
- Bruk de utransduserte cellene til å angi porten. En populasjon utenfor skalaen 1 x10 1 mot høyre på x-aksen regnes som en positiv populasjon for GFP.
- Velg promotoren som viser et vedvarende uttrykk for GFP i cellenes langvarige kultur.
2. Utarbeidelse av samlet lentiviral menneskelig epigenetisk faktor shRNA bibliotek
- Kultur 293T celler (ved et lavt passasjenummer med god spredningshastighet) i tre 10 cm cellekulturretter med 8 ml 10% DMEM medium (DMEM med 10% FBS som inneholder 100 U / ml penicillin og 100 U / ml streptomycin) i hver tallerken.
- Når cellene oppnår 60% samløp, erstatt mediet med et komplett medium.
- Forbered transfeksjonsblandingen (som beskrevet i tabell 1) som inneholder serumfritt medium, lentiviral emballasje (psPAX2) og konvoluttplasmid (pMD2.G), samlet bibliotekplasmider, og til slutt transfeksjonsreagensen.
- Trykk på blandingen for å blande den godt og inkubere ved romtemperatur i 15 min.
- Tilsett transfeksjonsblandingen i 293T-cellene og bland forsiktig ved å virvle platene. Inkuber platene i en CO 2-inkubator (5 % CO2 ved 37 °C). Bytt medium etter 24 timer.
- Etter 48 timer, se etter GFP-uttrykk under et fluorescensmikroskop for å sikre høy transfeksjonseffektivitet i 293T-cellene.
- Samle viruset supernatants etter 48 h, 60 h, og 72 h og lagre dem ved 4 °C. Tilsett friskt medium (8 ml) ved hvert tidspunkt etter at du har samlet viruset.
- Samle viruset supernatanter. Det totale volumet av de samlede virusene vil være: ~ 8 ml / plate x 3 samlinger = ~ 24 ml / plate; ~24 ml/plate x 3 plater = ~72 ml fra 3 plater.
- Filtrer de samlede virusene med 0,4 μm-filteret.
- For å få et høyt titer av virus, konsentrer de samlede virusene ved ultracentrifugation. Overfør det filtrerte viruset supernatant til to 70 Ti rør (32 ml / rør) og sentrifuge ved 18,000x g i 2 timer med langsom akselerasjon og retardasjon. Bruk en rotor og sentrifuge forkjølet til 4 °C.
- Ta ut rørene fra sentrifugen forsiktig og fjern supernatanten helt.
- Bruk en mikropipette, forsiktig resuspender pellet i 400 μL DMEM (uten FBS og antibiotika). Inkuber på isen i 1 time og bland pelletsene fra begge rørene.
- Aliquot virusene og fryse ved -80 °C.
MERK: Rørene og virusene må holdes på is i trinn 2.10.-2.13. Unngå skumming mens du resuspenderer viruset med det vanlige mediet. Mediet skal opprettholdes ved 4 °C. - Beregn konsentrasjonen (x) av virus som nedenfor:
Totalt volum før konsentrasjon = 72 ml (72 000 μL)
Volum etter konsentrerende = 400 μL
Konsentrasjonen = 72 000/400= 180x
3. Estimering av transduksjonseffektiviteten til lentivirus
- Transduser 293T celler med det konsentrerte viruset i forskjellige volumer (2 μL, 4 μL, 8 μL) for å bekrefte vellykket fremstilling av lentivirus.
MERK: Hvis konsentrerte virus viser høy transduksjonseffektivitet (>50%) i små volumer (1-2 μL), anbefales det å fortynne det konsentrerte viruset i de ønskede mengdene (100x til 75x). - Fortynn det konsentrerte viruset til 100x med DMEM (uten FBS og antibiotika) for å utføre titreringseksperimenter i cellelinjen MV4-11 AraC R.
- Frø 1 x 106 celler (MV4-11 AraC R celle linje i 1,5 ml av 10% RPMI medium som inneholder 8 μg / ml polybrene) i en brønn av en seks-brønns plate. Forbered fire brønner for transdusering med forskjellige mengder virus.
- Legg til fire forskjellige volumer (for eksempel 1 μL, 1,5 μL, 2 μL og 2,5 μL) av 100x virus.
- Utfør spinfeksjon ved sentrifugering av platen ved 920 x g i 90 min ved 37 °C.
- Etter 72 timer måler du prosentandelen av GFP+-celler etter strømningscytometri.
- Bestem volumet av virusene for å oppnå 30% transduksjonseffektivitet. Denne lave transduksjonseffektiviteten er å sikre enkel shRNA-integrasjon per celle.
4. Transduksjon av samlet epigenetisk shRNA-bibliotek i den legemiddelresistente cellelinjen
- Oppretthold målcellelinjen MV4-11 AraC R med en tetthet på 0,5 x 106 celler/ml. Sørg for at cellene er i den eksponentielle vekstfasen i kulturen.
- Beregn antall celler som skal tas for eksperimentet som nedenfor, basert på antall virale integranter.
Antall celler som kreves for transduksjon = 5 485 (antall shRNAer) × 500 (fold shRNA-representasjon) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~11 x 106 celler - Resuspend 1,1 x 107 celler i 16 ml 10 % RPMI-medium.
- Tilsett polybrene (8 μg/ml) og bland godt. Deretter legger du til det nødvendige volumet av virus for å oppnå 30% transduksjonseffektivitet som beregnet i forrige avsnitt.
- Frø alle cellene på en seks-brønns plate med en tetthet på 1 x 106 celler / 1,5 ml 10% RPMI medium per brønn.
- Sentrifuger platen i 90 min ved 920 x g ved 37 °C.
- Inkuber platen over natten i en CO 2-inkubator (5 % CO2 ved 37 °C).
- Etter 24 timer, bytt medium og overfør de transinduserte cellene til en T-75 kolbe.
- Etter 48 timer, kontroller GFP under et fluorescensmikroskop for å sikre vellykket transduksjon.
- Etter 72 timer kvanterer du prosentandelen av GFP+-celler etter strømningscytometri.
5. Berikelse av GFP positive celler
MERK: Utvid de transinduserte cellene ved å dyrke dem med en tetthet på 0,5 x 106 celler/ml i 5-7 dager. Disse cellene er en blandet populasjon av transdusert og utransdusert, valgt basert på GFP ved sortering, som nevnt i neste trinn.
- Utfør flytsortering av GFP+-transinduserte celler med innstillingene for flytsortering angitt som høy renhet og lavt utbytte. Bruk de utransduserte cellene til å angi porten. En befolkning utover 1 x 102 mot høyre regnes som en positiv befolkning.
- Samle de sorterte cellene i 5% RPMI (RPMI med 5% FBS supplert med 100 U / ml penicillin og 100 U / ml streptomycin).
- Kultur de sorterte cellene i et 10% RPMI-medium.
- Etter 72 timer utfører du ettersorteringsestimering av prosentandelen av GFP+-celler for å sikre >95 % sorteringseffektivitet.
MERK: Sørg for å få ~ 3-5 x 106 GFP positive celler etter sortering for å oppnå 450x til ~ 500x representasjon av shRNA biblioteket.
6. Frafallsscreening for å identifisere epigenetiske faktorer som formidler narkotikaresistens
- Kultur shRNA biblioteket transduced celler i 10% RPMI i opptil 5 dager. Kryopreservere de transinduserte cellene for fremtidige eksperimenter, om nødvendig, før legemiddelbehandlingen.
- Sentrifuger 1 x 107 celler i duplikater ved 280 x g i 5 minutter ved 25 °C. Kast supernatanten og oppbevar pelletsene ved −80 °C. Disse eksemplene vil fungere som basisreferanse for det epigenetiske shRNA-biblioteket.
- Kultur De gjenværende transinduserte cellene som duplikater (R1 og R2), hver opprettholdt ved et celleantall som gir en 500x representasjon av biblioteket.
- Behandle en av duplikatene med stoffet (10 μM cytarabine) (R2) og den andre uten legemiddelbehandling (R1).
- Bytt medium for kolber med og uten stoffet hver 72 h. Gjenta middels endring 3x for en kumulativ legemiddeleksponering på 9 dager.
- Etter 9 dager med narkotikabehandling, sjekk levedyktigheten til cellene ved trypan blå eksklusjonsmetoden.
- Sentrifuger de resterende cellene ved 280 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend cellene i steril PBS og vask cellene. Sentrifuge ved 280 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og oppbevar pelletsene ved −80 °C for DNA-ekstraksjon.
7. Forsterkning av de integrerte shRNAene av PCR
- Trekk ut DNA fra de transinduserte baselinecellene (T) (trinn 6.2.) og cellene som behandles med stoffet (R2) og ubehandlet med stoffet (R1).
- Kontroller konsentrasjonen av prøven ved hjelp av et fluorometer.
- Beregn mengden DNA som kreves for PCR som nedenfor:
5485 (nr. shRNAer) × 500 (shRNA-representasjon) × 1 x 6,6-12 (g/diploidgenom) = 15 μg DNA - Utsett prøvene i første runde av PCR.
MERK: PCR-reaksjonsblandingen er avbildet i tabell 2 med de termiske syklusforholdene. Du finner mer informasjon om primerne i supplerende tabell 1. - Sett opp flere reaksjoner som inneholder 850 ng DNA per rør (for totalt 43 reaksjoner).
MERK: Den første runden med PCR forsterker flankeområdene i shRNA, noe som resulterer i en amplikonstørrelse på 397 bp. - Samle PCR-produktene og rens PCR-produktene ved hjelp av 3-4 kolonner av et standard gel / PCR-rensesett.
MERK: Detaljer er oppgitt i tabell 3. - Elute produktet i 50 μL buffer fra hver kolonne og pool elutes.
- Kvantifisere DNA-et og oppbevar det ved -20 °C.
MERK: Reagensene er tabulert i tabell 4 med de termiske syklusforholdene. PcR i andre runde bruker primerne med INDEX-sekvensen som kreves for multipleksing i NGS i en enkeltflytcelle. Så hvert eksempel bør kodes med en annen indeks. Primersekvenser finnes i supplerende tabell 1. - Sett opp fire reaksjoner med 500 ng av det primære PCR-produktet i et totalt reaksjonsvolum på 50 μL for hver prøve og den negative kontrollen.
- Last hele produktet for elektroforese ved hjelp av 2% TBE agarose gel og bekreft båndstørrelsen ved hjelp av en 1 kb molekylær stige. Størrelsen på amfinen er 399 bp.
- Visualiser PCR-produktene på geldokumentasjonssystemet.
- Excise det spesifikke båndet og rense ved hjelp av en gel rensing kit.
MERK: Beregninger for rensing med settet er gitt i tabell 3. - Elute i et endelig volum på 30 μL elutionbuffer. Den omtrentlige konsentrasjonen av hver eluent vil være rundt 80-90 ng / μL med et totalt volum på 30 μL.
8. Neste generasjons sekvensering og dataanalyse
- Sekvenser det gelrensede produktet fra trinn 7.13. neste generasjons sequencer (f.eks. Illumina) for å få lesetallet for de utarmede shRNAene.
- Trim adaptersekvensene til de genererte FastQ-lesingene ved hjelp av Fastx-verktøysettet (versjon 0.7).
- Juster de filtrerte avlesningene til referansesekvenser ved hjelp av en Bowtie-justering med parameteren for å tillate to uoverensstemmelser. Kontroller at leselengden etter at adaptertrimmingen er rundt 21 bp.
- Last inn filene ved hjelp av Samtools (versjon 1.9)-programmet. Bruk alternativet Flagstat og beregn justeringssammendraget.
- Last de trimmede fastQ-filene i CRISPRCloud2 (CC2) programvare (https://crispr.nrihub.org/) sammen med referanse shRNA-sekvensene i form av FASTA-filer og utfør analysen i henhold til instruksjonene.
- Klikk på Start analyse-koblingen i CC2.
- Velg skjermtype som Overlevelses- og frafallsskjermbilder. Angi antall grupper, og skriv inn navnet på hver gruppe.
- Last opp referansebiblioteket i FASTA-filformat. Dataene som lastes opp, behandles. Klikk på utgangsadressen for å få resultatene.
MERK: Denne programvaren bruker en beta-binomisk modell med en modifisert Student t-test for å måle forskjeller i sgRNA / shRNA nivåer, etterfulgt av Fishers kombinerte sannsynlighetstest for å estimere gennivå signifikansen. Den beregner estimerte generelle logg2-fold endringer (Log2Fc) av shRNAer for epigenetiske faktorer mellom behandlet (beriket / utarmet) og ubehandlede prøver (baseline) med "p-verdier" og "FDR verdier."
- Kontroller at FDR-verdien er "Negativ" for en dropout-skjerm og "Positiv" for en Overlevelse-skjerm.
MERK: CC2 er en analyseplattform for å telle lesningene og beregne foldrepresentasjonen (berikelse eller uttømming) av shRNAer mellom prøver. - Identifiser de betydelig berikede og utarmede shRNAene (FDR <0,05) fra CC2-resultatene.
MERK: Det er 5-24 shRNAer mot hver faktor. Kontroller FDR-verdiene for hver av shRNAene. vurdere FDR, som er <0,01, og ta et gjennomsnitt for de valgte shRNAene. Vurder de 40 beste treffene. Tegn grafen for de valgte faktorene basert på Negative verdier for Log2Fc eller FDR. Kontroller at de ikke-målrettede shRNAene også har betydelige FDR-verdier for å sikre ektheten av dataene når de fungerer som kontroll-shRNAer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den totale screeningarbeidsflyten er avbildet i figur 1A. In vitro cytotoksisitet av MV4-11 AraC R (48 h) avslørte at IC50 til cytarabin i MV4-11 AraC R var høyere enn MV4-11 P (figur 1B). Denne cellelinjen ble brukt i studien som modell for screening av de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for cytarabinresistens.
Figur 2A viser de lineariserte pZIP-vektorkartene med tre forskjellige promotorer: hEF1α (human forlengelsesfaktor 1α), hCMV (human cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus), med den krypterte shRNA i UltramiR-sekvensen. Figur 2B illustrerer pZIP-vektorkartet som brukes i bibliotekeksperimentet, og shRNA rettet mot den epigenetiske faktoren med Zsgreen og puromycin som den valgbare markøren drevet av hEF1a-promotoren. Disse vektorene ble brukt i valget av det mest potente promotoreksperimentet.
Valget av den mest potente promotoren for å få et konsistent og langvarig uttrykk i målcellene er illustrert i figur 3. Kvantifiseringen av GFP målt ved MFI viste mer enn 90% transduksjonseffektivitet ved utgangen av 72 timer i MV4-11 AraC R for alle tre promotørene. Histogrammet for GFP-uttrykk viser en heterogen populasjon for hCMV, men en homogen i tilfelle hEF1a og SFFV på dag 3 av transduksjon (figur 3A). Stolpediagrammet viser GFP-uttrykket drevet av tre forskjellige promotorer (hEF1α, hCMV og SFFV) på dag 3 av transduksjon i MV4-11 AraC R (figur 3B). SFFV-drevet GFP viste en reduksjon i MFI på dag 5 av transduksjon (figur 3C). Ingen reduksjon i MFI ble observert i den hEF1a-drevne GFP-transdusert MV4-11 foreldrelinjepostsortering. Dermed ble hEF1a-promotoren identifisert som en passende promotor for cellelinjen (figur 3D).
Figur 4A illustrerer transfeksjonseffektiviteten til de samlede shRNA-bibliotekplasmidene i 293T-celler etter 48 timers transfeksjon. GFP-uttrykket var lyst, noe som indikerer god transfeksjonseffektivitet. Etter virussamling ble transduksjonseffektiviteten til det forberedte samlede viruset sjekket i 293T-celler i tre forskjellige konsentrasjoner (2 μL, 4 μL og 8 μL). Vi observerte at selv 2 μL virus resulterte i samme effektivitet som for 8 μL virus, og dermed bekrefte den høye virale titer (figur 4B).
Figur 5 illustrerer den samlede bibliotektransduksjonen i cellelinjen MV4-11 AraC R og fastsettelse av lentiviral titer. Det samlede shRNA-biblioteket lentivirus ble fortynnet 100x og deretter lagt til MV4-11 AraC R-cellelinjen i forskjellige volumer (1 μL, 1,5 μL, 2 μL og 2,5 μL). Effektiviteten ble kontrollert i slutten av 72 timer. Transduksjonseffektiviteten var 30% for 2-2,5 μL av viruset, noe som bekrefter en shRNA-integrasjon per celle (figur 5A). Transduksjon med 2,5 μl samlet bibliotekvirus i 1,1 x 107 MV4-11 AraC R-celler resulterte i 30% transduksjonseffektivitet. GFP-positive celler ble sortert, som representerer det samlede shRNA-biblioteket (figur 5B).
Etter transduksjonen av samlet shRNA epigenetisk lentivirus i cellelinjen MV4-11 AraC R ble GFP-positive celler sortert på dag 5 eller dag 7 (figur 6). Disse sorterte cellene ble utsatt for langvarig eksponering for cytarabin i 9 dager. Levedyktigheten ble kontrollert den 9. (figur 6A). Stolpediagrammet viser reduksjonen i spredningshastigheten til de transinduserte cellene i nærvær av cytarabin (figur 6B).
Det ekstraherte DNA-et fra prøvene ble utsatt for to runder med PCR, og det endelige gel-eluterte produktet representerte de berikede shRNAene kvantifisert av NGS. Figur 7A viser bindingsområdene til primeren som brukes i første og andre runde av PCR, der 1. runde primere binder seg til flankeområdene til den integrerte shRNA, og den andre fremoverprimeren binder seg til løkkesekvensen. Den omvendte primeren binder seg til en region av den forsterkede vektoren i første runde av PCR. Figur 7B og figur 7C illustrerer båndstørrelsen på PCR-produktet ved utgangen av første (397 bp) og andre runde PCR (399 bp), som ble gel-eluted, renset og sendt inn for NGS-analyse.
Etter å ha utsatt DNA-et for en standard kvalitetskontrollprosedyre, ble prøvene behandlet for NGS-analyse. Vi brukte CRISPRCloud2, en brukervennlig, skybasert analyseplattform for å identifisere berikede og utarmede shRNAer i den samlede shRNA-screeningen. Figur 8 illustrerer representasjonen av berikede eller utarmede shRNAer rettet mot epigenetiske faktorer som kan formidle cytarabinresistens i AML.
Figur 1: Oversikt og modell for studien. (A) Illustrasjon av oversikten over arbeidsflyten. (B) MV4-11 foreldre- og AraC-resistente celler behandlet med økende cytarabinkonsentrasjoner (0,1 μM til 1000 μM) og levedyktighetsvurdert av MTT-analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Illustrasjon av de lineariserte vektorene. (A) De tre vektorkartene med tre forskjellige promotorer, hEF1α (human forlengelsesfaktor 1α), hCMV (human cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus), med den krypterte shRNA i UltramiR-sekvensen. (B) Illustrasjon av vektorkartet som brukes i bibliotekeksperimentet med hEF1α-promotoren og shRNA rettet mot den epigenetiske faktoren med Zsgreen og puromycin som valgbar markør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Valg av den mest potente promotoren for å oppnå vedvarende og langvarig uttrykk for shRNAene. (A) Representative strømningsplott for GFP kvantifisert ved strømningscytometri ved utgangen av 72 timer for hEF1a-, hCMV- og SFFV-promotorer. hCMV viser en heterogen topp, mens hEF1a og SFFV viser en enkelt homogen topp. (B) Promotoreffektivitet i cellelinjen MV4-11 AraC R. (C) SFFV-drevet GFP viser silencing av GFP i langvarig kultur. (D) hEF1a-drevne GFP-celler viser vedvarende uttrykkspostsortering av cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kontroll av effektiviteten til det preparerte samlede shRNA lentiviruset. (A) Fluorescensmikroskopibilder viser transfeksjonseffektiviteten til det samlede shRNA-biblioteket som ble transfektet i 293T ved slutten av 48 timer ved hjelp av 10x forstørrelse. (B) Transduksjonseffektiviteten til det samlede viruset ble vurdert i 293T-celler med varierende virusvolum (2μL, 4μL og 8μL) ved hjelp av 10x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Samlet bibliotektransduksjon i målcellelinjen og bestemmelse av lentiviral titer. (A) MV4-11 AraC R cellelinje transdusert med varierende mengder virus (1μL, 1,5μL, 2μL og 2,5μL). Effektiviteten ble kontrollert ved slutten av 72 h. (B) Transduksjon av samlet bibliotekvirus i 1 x 107 MV4-11 AraC R-celler for å oppnå 30% transduksjonseffektivitet, og deretter sortering av GFP-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Frafallsscreening for å identifisere epigenetiske faktorer som formidler narkotikaresistens. (A) Skjematisk illustrasjon av legemiddelbehandling for berikelse av resistente celler. Bibliotekinfiserte celler ble utsatt for langvarig cytarabineksponering i 9 dager, etterfulgt av å sjekke levedyktigheten og samle cellene for DNA-ekstraksjon. (B) Redusert levedyktighet for langvarig cytarabineksponering i resistente cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Klargjøring av amfilonene som representerer den integrerte shRNA. (A) Bindingsområdene til primeren som brukes i første og andre runde av PCR, der 1. runde primere binder seg til flankeområdene til den integrerte shRNA og den andre fremre primeren binder seg til løkkesekvensen. Det motsatte binder seg til en region i det forsterkede vektorområdet i første PCR. (B) Illustrasjon av båndstørrelsen på PCR-produktet på slutten av første runde PCR (397 bp). (C) Det andre runde PCR-produktet (399bp) ble gel-eluted, renset og gitt for NGS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Screeningresultater i AML-cellelinjen (cellelinjen MV-4-11 Ara-C R). Etter å ha utsatt DNA-et for en standard kvalitetskontrollprosedyre, ble prøvene behandlet for NGS-analyse. Vi brukte CRISPRCloud2, en brukervennlig, skybasert analyseplattform, for å identifisere berikede og utarmede shRNAer i den samlede shRNA-screeningen. Figuren representerer berikede eller utarmede shRNAer rettet mot epigenetiske faktorer som kan formidle cytarabinresistens i AML. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Forberedelse av transfeksjon Plasmid Mix (Beregning for 10cm plate) Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: PCR reaksjonsblanding for 1m Rund PCR Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Beregninger for rensing av produktene fra første PCR Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: PCR reaksjonsblanding for andre runde av PCR Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-interferens (RNAi) brukes mye til funksjonelle genomikkstudier, som inkluderer siRNA- og shRNA-screening. Fordelen med shRNA er at de kan innlemmes i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, noe som resulterer i stabilt uttrykk og dermed mer langvarig nedslag av målet mRNA. En samlet shRNA-bibliotekscreening er robust og kostnadseffektiv sammenlignet med de konvensjonelle arrayed-skjermene (siRNA). Å identifisere nødvendigheten av en bestemt klasse proteiner i en genom-bred skjerm kan være tungvint. Målrettede screeningtilnærminger kan avsløre nødvendigheten av individuelle proteiner for kreftcelleoverlevelse eller legemiddelresistens i den spesifikke klassen med redusert støy. Denne protokollen fremhever RNAi-skjermen med epigenetiske faktorer for å forhøre både essensielle og ikke-essensielle gener systematisk, og den demonstrerer bruken av denne tilnærmingen som en funksjonell plattform som tillater identifisering av mål som er ansvarlige for AML-legemiddelresistens.
Denne kraftige teknologien krever visse forholdsregler i utformingen og utførelsen av forsøkene. Den første er valget av promotører som ikke gjennomgår betydelig silencing under cellekulturen for uttrykket av shRNAer, da deres robuste uttrykk er avgjørende for nedslag av målgener. For det andre er vedlikehold av shRNA-representasjon (antall celler transdusert med hver shRNA) av særlig betydning. Gjennom shRNA-skjermen øker en gjennomsnittlig representasjon av >500 celler per shRNA-konstruksjon potensialet for å identifisere shRNAene som forårsaker fenotypiske effekter.
RNAi-screeningstrategien er en konkurransedyktig vekstskjerm; Derfor er det viktig å sikre at målcellene er i den logaritmiske vekstfasen og ikke overkonfluenenser under skjermen for å minimere tap av representasjon forårsaket av begrenset vekst. Det er ideelt å opprettholde cellene ved 50% -70% samløp for å minimere eksperimentelle variasjoner. Vi anbefaler å opprettholde konsistente mange medier, sera, virale supernatanter, narkotika og vev kultur plasticware for alle skjermen replikerer for å redusere eksperimentell variasjon.
Det anbefales å utføre piloteksperimenter for å optimalisere transduksjonseffektiviteten til lentiviruset for å beregne volumet av virus som kreves for å oppnå en integrasjon av shRNA per celle. For å oppnå denne integrasjonen av en shRNA per celle, bør transduksjonseffektiviteten være mindre enn 30%. Av virus for å få 30 % transinduserte celler kan variere mellom cellelinjene som brukes til eksperimentene, kreves det et standardiseringseksperiment for hver cellelinje. Transduksjonseffektivitet kan også påvirkes av cellekulturforhold og frekvensen av celleproliferasjon. Derfor bør funksjonelle titere bestemmes i piloteksperimentet ved hjelp av de samme forholdene som brukes i screeningeksperimentet. Å opprettholde 3-6 replikeringer er alltid tilrådelig å få statistisk signifikante treff.
De to største bekymringene for shRNA-screening-tilnærmingen er off-target-effektene og den variable knockdown-effektiviteten til shRNAs16. Disse kan overvinnes ved å bruke flere shRNAer av hvert gen. Tilpasning av det prokaryote immunforsvaret CRISPR-Cas9 i pattedyrceller har gjort det mulig med enkel, effektiv og kostnadseffektiv genomredigering i dyrkede menneskeceller. Dette systemet har blitt utnyttet mye for å utføre genom-brede genetiske skjermer som ligner de som utføres ved hjelp av shRNA. Skjebnen til celler som har en bestemt enkeltguide RNA (sgRNA) sekvens kan overvåkes ved hjelp av dyp sekvensering. Det eksperimentelle oppsettet som er skissert her, kan også brukes til CRISPR-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter og ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien er delvis finansiert av et Institutt for bioteknologistipend BT/PR8742/AGR/36/773/2013 til SRV; og Institutt for bioteknologi India BT/COE/34/SP13432/2015 og Institutt for vitenskap og teknologi, India: EMR/2017/003880 til P.B. RVS og P.B. støttes av Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 og IA/S/15/1/501842. S.D. støttes av CSIR-UGC-stipendet, og S.I. støttes av et ICMR seniorstipendiat. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility ansatte for deres hjelp. Vi takker også MedGenome Inc. for å ha hjulpet til med sekvensering og dataanalyse med høy gjennomstrømning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
