Summary
Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).
Abstract
Das Verständnis klinisch relevanter Treibermechanismen der erworbenen Chemoresistenz ist entscheidend für die Aufklärung von Möglichkeiten zur Umgehung von Resistenzen und zur Verbesserung des Überlebens bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Ein kleiner Teil der leukämischen Zellen, die eine Chemotherapie überleben, haben einen ausgeglichenen epigenetischen Zustand, um chemotherapeutische Beleidigungen zu tolerieren. Eine weitere Exposition gegenüber einer Chemotherapie ermöglicht es diesen Wirkstoffpersisterzellen, einen festen epigenetischen Zustand zu erreichen, der zu einer veränderten Genexpression führt, was zur Proliferation dieser arzneimittelresistenten Populationen und schließlich zu einem Rückfall oder einer refraktären Erkrankung führt. Daher ist die Identifizierung epigenetischer Modulationen, die das Überleben arzneimittelresistenter leukämischer Zellen erfordern, von entscheidender Bedeutung. Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung epigenetischer Modulatoren, die die Resistenz gegen das Nukleosidanalog-Cytarabin (AraC) vermitteln, indem wir ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening in einer erworbenen Cytarabin-resistenten AML-Zelllinie verwenden. Die Bibliothek besteht aus 5.485 shRNA-Konstrukten, die auf 407 humane epigenetische Faktoren abzielen, was ein epigenetisches Faktor-Screening mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Introduction
Die therapeutischen Optionen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) sind in den letzten fünf Jahrzehnten unverändert geblieben, wobei Cytarabin (AraC) und Anthrazykline die Eckpfeiler für die Behandlung der Krankheit sind. Eine der Herausforderungen für den Erfolg der AML-Therapie ist die Resistenz von leukämischen Stammzellen gegen Chemotherapie, was zu einem Krankheitsrückfall führt 1,2. Die epigenetische Regulation spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebspathogenese und Arzneimittelresistenz, und mehrere epigenetische Faktoren haben sich als vielversprechende therapeutische Zieleherauskristallisiert 3,4,5. Epigenetische Regulationsmechanismen beeinflussen die Proliferation und das Überleben unter kontinuierlicher Exposition gegenüber Chemotherapeutika. Studien zu nicht-hämatologischen Malignomen haben berichtet, dass ein kleiner Teil der Zellen, die die Arzneimittelwirkung überwinden, verschiedene epigenetische Modifikationen erfahren, was zum Überleben dieser Zellen führt 6,7. Die Rolle epigenetischer Faktoren bei der Vermittlung erworbener Resistenzen gegen Cytarabin bei AML wurde jedoch nicht untersucht.
Hochdurchsatz-Screening ist ein Ansatz zur Wirkstoffforschung, der im Laufe der Zeit an globaler Bedeutung gewonnen hat und in verschiedenen Aspekten zu einer Standardmethode geworden ist, um potenzielle Ziele in zellulären Mechanismen, für die Signalwegprofilierung und auf molekularer Ebenezu identifizieren 8,9. Das Konzept der synthetischen Letalität beinhaltet die Interaktion zwischen zwei Genen, bei denen die Störung eines der beiden Gene allein lebensfähig ist, aber von beiden Genen gleichzeitig zum Verlust der Lebensfähigkeitführt 10. Die Nutzung der synthetischen Letalität in der Krebsbehandlung könnte dazu beitragen, robuste synthetische letale genetische Interaktionen zu identifizieren und mechanistisch zu charakterisieren11. Wir haben einen kombinatorischen Ansatz des Hochdurchsatz-shRNA-Screenings mit synthetischer Letalität gewählt, um die epigenetischen Faktoren zu identifizieren, die für die erworbene Cytarabinresistenz bei AML verantwortlich sind.
Es ist bekannt, dass akute Leukämien, die durch chromosomale Translokation des Mixed-Lineage-Leukämiegens (MLL oder KMT2A) verursacht werden, bei Patienten mit einem schlechten Überleben verbunden sind. Die resultierenden chimären Produkte von MLL-Genumlagerungen, d.h. MLL-Fusionsproteine (MLL-FPs), können hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) unter Beteiligung mehrerer epigenetischer Faktoren in leukämische Blasten umwandeln. Diese epigenetischen Regulatoren bilden ein kompliziertes Netzwerk, das die Aufrechterhaltung des Leukämieprogramms diktiert und daher potenzielle therapeutische Ziele bilden könnte. In diesem Zusammenhang verwendeten wir die MV4-11-Zelllinie (die das MLL-Fusionsgen MLL-AF4 mit der FLT3-ITD-Mutation beherbergt; als MV4-11 P bezeichnet), um die erworbene Cytarabin-resistente Zelllinie zu entwickeln, die als MV4-11 AraC R bezeichnet wird. Die Zelllinie wurde steigenden Dosen von Cytarabin mit intermittierender Erholung von der medikamentösen Behandlung, bekannt als Drogenurlaub, ausgesetzt. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde mittels In-vitro-Zytotoxizitätstest bewertet.
Wir verwendeten die gepoolte epigenetische shRNA-Bibliothek (siehe Materialverzeichnis), die vom hEF1a-Promotor mit einem lentiviralen pZIP-Backbone gesteuert wurde. Diese Bibliothek umfasst shRNAs, die auf 407 epigenetische Faktoren abzielen. Jeder Faktor hat 5-24 shRNAs, mit insgesamt 5.485 shRNAs, einschließlich fünf Nicht-Targeting-Kontroll-shRNAs. Das modifizierte miR-30-Gerüst "UltrmiR" wurde für eine effiziente primäre shRNA-Biogenese und -Expressionoptimiert 12,13.
Der Umriss dieses Experiments ist in Abbildung 1A dargestellt. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das RNAi-Screening unter Verwendung der epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek in der MV4-11 AraC R-Zelllinie (Abbildung 1B), einer Suspensionszelllinie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jede Zielbibliothek in jeder arzneimittelresistenten Zelllinie der eigenen Wahl zu überprüfen. Es sollte beachtet werden, dass das Transduktionsprotokoll für adhärente Zellen unterschiedlich sein wird.
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Protocol
Befolgen Sie die Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBSC) und nutzen Sie die richtige Einrichtung, um mit Lentivirus (BSL-2) umzugehen. Das Personal sollte in angemessener Weise im Umgang mit und der Entsorgung von Lentiviren geschult werden. Dieses Protokoll folgt den Biosicherheitsrichtlinien des Christian Medical College, Vellore.
1. Auswahl des potentesten Promotors, um eine persistente und verlängerte Expression der shRNAs zu erhalten
HINWEIS: Es ist wichtig, ein Transduktionsexperiment mit lentiviralen Vektoren mit verschiedenen Promotoren durchzuführen, die Fluoreszenzproteine exprimieren, um den Promotor zu identifizieren, der eine stabile und langfristige Expression von shRNAs in der für das Experiment ausgewählten Zelllinie bietet. Die am häufigsten verwendeten Promotoren für diesen Zweck sind hEF1α (humaner Dehnungsfaktor 1α), hCMV (humanes Cytomegalovirus) und SSFV (Milzfokus-bildendes Virus), die grünes Fluoreszenzprotein (GFP) exprimieren (Abbildung 2A).
- Führen Sie die Zellenzählung mit der trypan blue-Ausschlussmethode durch. Suspendieren Sie die MV4-11 AraC R-Zellen in 10% RPMI-Medium (RPMI mit 10% FBS ergänzt mit 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin), das 8 μg/ml Polybren enthält. Samen Sie 1 x 106 Zellen in 1,5 ml Medium / Well einer Sechs-Well-Platte in Verdreifachungen.
- Fügen Sie zu jeder Vertiefung unterschiedliche Volumina konzentrierter Lentiviren hinzu (z. B. 10 μL, 20 μL und 40 μL, abhängig vom Titer der Lentiviren). Schwenken Sie den Teller vorsichtig, um den Inhalt zu mischen.
- Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation bei 920 x g bei 37 °C für 90 min durch.
- Die Platten werden sofort in einem CO 2 -Inkubator (5 % CO2 bei 37 °C) inkubiert.
- Beobachten Sie die GFP-Expression nach 48 h unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine erfolgreiche Transduktion zu gewährleisten.
- Quantifizieren Sie die GFP-Expression durch Durchflusszytometrie nach 72 h, um die Transduktionseffizienz zu bewerten.
- Kultivieren Sie die Zellen für insgesamt 2 Wochen und überwachen Sie die GFP-Expression regelmäßig durch Durchflusszytometrie. Die Verringerung der GFP-Expression, gemessen an der mittleren Fluoreszenzintensität und dem Prozentsatz der GFP+-Zellen, deutet auf ein Promotor-Silencing hin.
- Sortieren Sie die GFP+-Zellen am 10. Tag und kultivieren Sie die Zellen nach dem Sortieren für 1 Woche. Überprüfen Sie den GFP-Ausdruck regelmäßig während der Kultur.
- Verwenden Sie die nicht transduzierten Zellen, um das Tor zu setzen. Eine Population jenseits der Skala von 1 x 101 rechts auf der x-Achse gilt als positive Population für GFP.
- Wählen Sie den Promotor, der eine persistente Expression von GFP in der verlängerten Kultur der Zellen zeigt.
2. Vorbereitung der gepoolten lentiviralen humanen epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek
- Kultur 293T-Zellen (bei niedriger Passagezahl mit guter Proliferationsrate) in drei 10 cm Zellkulturschalen mit 8 ml 10% DMEM-Medium (DMEM mit 10% FBS mit 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin) in jeder Platte.
- Sobald die Zellen eine Konfluenz von 60% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch ein vollständiges Medium.
- Es ist die Transfektionsmischung (wie in Tabelle 1 beschrieben) vorzubereiten, die serumfreies Medium, lentivirale Verpackungen (psPAX2) und Hüllplasmid (pMD2.G), gepoolte Bibliotheksplasmide und schließlich das Transfektionsreagenz enthält.
- Klopfen Sie die Mischung, um sie gut zu mischen und bei Raumtemperatur für 15 Minuten zu inkubieren.
- Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den 293T-Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Wirbeln der Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem CO 2 -Inkubator (5% CO2 bei 37 °C). Wechseln Sie das Medium nach 24 h.
- Nach 48 h ist die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop zu überprüfen, um eine hohe Transfektionseffizienz in den 293T-Zellen sicherzustellen.
- Sammeln Sie die Virusüberstände nach 48 h, 60 h und 72 h ein und lagern Sie sie bei 4 °C. Fügen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Sammeln des Virus frisches Medium (8 ml) hinzu.
- Poolen Sie die Virusüberstände. Das Gesamtvolumen der gepoolten Viren beträgt: ~8 ml/Platte x 3 Sammlungen = ~24 mL/Platte; ~24 mL/Platte x 3 Platten = ~72 mL aus 3 Platten.
- Filtern Sie die gepoolten Viren mit dem 0,4-μm-Filter.
- Um einen hohen Titer von Viren zu erhalten, konzentrieren Sie die gepoolten Viren durch Ultrazentrifugation. Übertragen Sie den gefilterten Virusüberstand auf zwei 70 Ti-Röhrchen (32 ml/Röhrchen) und zentrifugieren Sie bei 18.000x g für 2 h mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung. Verwenden Sie einen Rotor und eine Zentrifuge, die auf 4 °C vorgekühlt sind.
- Nehmen Sie die Schläuche vorsichtig aus der Zentrifuge und entfernen Sie den Überstand vollständig.
- Mit einer Mikropipette das Pellet vorsichtig in 400 μL DMEM (ohne FBS und Antibiotika) resuspendieren. 1 h auf dem Eis inkubieren und die Pellets aus beiden Röhrchen vermischen.
- Aliquot die Viren und frieren bei −80 °C ein.
HINWEIS: Die Röhren und Viren müssen während der Schritte 2.10.-2.13 auf Eis gehalten werden. Vermeiden Sie Schaum, während Sie das Virus mit dem einfachen Medium aussetzen. Das Medium sollte bei 4 °C gehalten werden. - Berechnen Sie die Konzentration (x) des Virus wie folgt:
Gesamtvolumen vor Konzentration = 72 mL (72.000 μL)
Volumen nach Konzentration = 400 μL
Die Konzentration = 72.000/400= 180x
3. Abschätzung der Transduktionseffizienz von Lentiviren
- Transduzieren Sie 293T-Zellen mit dem konzentrierten Virus in verschiedenen Volumina (2 μL, 4 μL, 8 μL), um die erfolgreiche Präparation von Lentiviren zu bestätigen.
HINWEIS: Wenn konzentrierte Viren hohe Transduktionseffizienzen (>50%) in kleinen Volumina (1-2 μL) aufweisen, ist es ratsam, das konzentrierte Virus in den gewünschten Mengen (100x bis 75x) zu verdünnen. - Verdünnen Sie das konzentrierte Virus mit DMEM (ohne FBS und Antibiotika) auf das 100-fache, um Titrationsexperimente in der MV4-11 AraC R-Zelllinie durchzuführen.
- Saatgut 1 x 106 Zellen (MV4-11 AraC R Zelllinie in 1,5 ml 10% RPMI-Medium mit 8 μg/ml Polybren) in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Bereiten Sie vier Vertiefungen für die Übertragung mit unterschiedlichen Mengen von Viren vor.
- Fügen Sie vier verschiedene Volumina (z. B. 1 μL, 1,5 μL, 2 μL und 2,5 μL) von 100x Viren hinzu.
- Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation der Platte bei 920 x g für 90 min bei 37 °C durch.
- Messen Sie nach 72 h den Prozentsatz der GFP+-Zellen anhand der Durchflusszytometrie.
- Bestimmen Sie das Volumen der Viren, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erhalten. Diese geringe Transduktionseffizienz soll eine einzelne shRNA-Integration pro Zelle gewährleisten.
4. Transduktion der gepoolten epigenetischen shRNA-Bibliothek in der arzneimittelresistenten Zelllinie
- Halten Sie die Zielzelllinie MV4-11 AraC R bei einer Dichte von 0,5 x 106 Zellen/ml. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase in der Kultur befinden.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für das Experiment wie folgt entnommen werden sollen, basierend auf der Anzahl der viralen Integrantien.
Anzahl der für die Transduktion benötigten Zellen = 5.485 (Anzahl der shRNAs) × 500 (falte shRNA-Repräsentation) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 106 Zellen - Resuspendieren Sie 1,1 x 107 Zellen in 16 ml 10% RPMI-Medium.
- Polybren (8 μg/ml) hinzufügen und gut mischen. Addieren Sie dann das erforderliche Volumen an Viren, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erhalten, wie im vorherigen Abschnitt berechnet.
- Samen Sie alle Zellen auf einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen / 1,5 ml 10% RPMI-Medium pro Well.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 90 min bei 920 x g bei 37 °C.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem CO 2 -Inkubator (5% CO2 bei 37 °C).
- Nach 24 h wechseln Sie das Medium und übertragen die transduzierten Zellen in einen T-75-Kolben.
- Nach 48 h überprüfen Sie das GFP unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine erfolgreiche Transduktion sicherzustellen.
- Quantifizieren Sie nach 72 h den Prozentsatz der GFP+-Zellen durch Durchflusszytometrie.
5. Anreicherung von GFP-positiven Zellen
HINWEIS: Erweitern Sie die transduzierten Zellen, indem Sie sie mit einer Dichte von 0,5 x 106 Zellen / ml für 5-7 Tage kultivieren. Diese Zellen sind eine gemischte Population von transduzierten und nicht transduzierten, die basierend auf GFP durch Sortierung ausgewählt werden, wie im nächsten Schritt erwähnt.
- Führen Sie eine Flusssortierung von GFP+-transduzierten Zellen durch, wobei die Flusssortiereinstellungen als hohe Reinheit und geringe Ausbeute festgelegt sind. Verwenden Sie die nicht transduzierten Zellen, um das Tor zu setzen. Eine Population über 1 x 10 2 nach rechts gilt als positive Population.
- Sammeln Sie die sortierten Zellen in 5% RPMI (RPMI mit 5% FBS ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin).
- Kultivieren Sie die sortierten Zellen in einem 10% RPMI-Medium.
- Führen Sie nach 72 h die Schätzung des Prozentsatzes der GFP+-Zellen nach der Sortierung durch, um eine Sortiereffizienz von >95 % sicherzustellen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie nach dem Sortieren ~ 3-5 x 106 GFP-positive Zellen erhalten, um eine 450x bis ~ 500x Darstellung der shRNA-Bibliothek zu erhalten.
6. Dropout-Screening zur Identifizierung epigenetischer Faktoren, die eine Arzneimittelresistenz vermitteln
- Kultivieren Sie die transduzierten shRNA-Zellen in 10% RPMI für bis zu 5 Tage. Kryokonservieren Sie die transduzierten Zellen für zukünftige Experimente, falls erforderlich, vor der medikamentösen Behandlung.
- Zentrifuge 1 x 107 Zellen in Duplikaten bei 280 x g für 5 min bei 25 °C. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei −80 °C. Diese Proben dienen als Basisreferenz für die epigenetische shRNA-Bibliothek.
- Kultivieren Sie die verbleibenden transduzierten Zellen als Duplikate (R1 und R2), die jeweils mit einer Zellzahl beibehalten werden, die eine 500-fache Darstellung der Bibliothek bietet.
- Behandeln Sie eines der Duplikate mit dem Medikament (10 μM Cytarabin) (Beleg2) und das andere ohne die medikamentöse Behandlung (Beleg1).
- Wechseln Sie das Medium für die Kolben mit und ohne Medikament alle 72 h. Wiederholen Sie den Mediumswechsel 3x für eine kumulative Arzneimittelexposition von 9 Tagen.
- Überprüfen Sie nach 9 Tagen medikamentöser Behandlung die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.
- Die verbleibenden Zellen bei 280 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Suspendieren Sie die Zellen in sterilem PBS und waschen Sie die Zellen. Zentrifuge bei 280 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Verwerfen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei −80 °C zur DNA-Extraktion.
7. Amplifikation der integrierten shRNAs durch PCR
- Extrahieren Sie DNA aus den transduzierten Basiszellen (T) (Schritt 6.2.) und den Zellen, die mit dem Arzneimittel (R2) behandelt und mit dem Arzneimittel unbehandelt wurden (Beleg1).
- Überprüfen Sie die Konzentration der Probe mit einem Fluorometer.
- Berechnen Sie die Menge an DNA, die für die PCR benötigt wird, wie folgt:
5.485 (Nr. von shRNAs) × 500 (shRNA-Repräsentation) × 1 x 6,6−12 (g/diploides Genom) = 15 μg DNA - Setzen Sie die Proben der ersten Runde der PCR aus.
HINWEIS: Das PCR-Reaktionsgemisch ist in Tabelle 2 mit den thermischen Cyclerbedingungen dargestellt. Einzelheiten zu den Primern sind der Ergänzenden Tabelle 1 zu entnehmen. - Richten Sie mehrere Reaktionen mit 850 ng DNA pro Röhrchen ein (für insgesamt 43 Reaktionen).
HINWEIS: Die erste Runde der PCR verstärkt die flankierenden Bereiche der shRNA, was zu einer Amplikongröße von 397 bp führt. - Poolen Sie die PCR-Produkte und reinigen Sie die PCR-Produkte mit 3-4 Säulen eines Standard-Gel/PCR-Reinigungskits.
HINWEIS: Einzelheiten sind in Tabelle 3 enthalten. - Eluieren Sie das Produkt in 50 μL Puffer aus jeder Säule und bündeln Sie die Eluten.
- Quantifizieren Sie die DNA und lagern Sie sie bei −20 °C.
HINWEIS: Die Reagenzien sind in Tabelle 4 mit den Bedingungen des Thermocyclers tabellarisch aufgeführt. Die Zweitrunden-PCR verwendet die Primer mit der INDEX-Sequenz, die für das Multiplexing in NGS in einer Singleflow-Zelle erforderlich ist. Daher sollte jede Probe mit einem anderen Index gekennzeichnet werden. Primersequenzen sind in der Ergänzenden Tabelle 1 enthalten. - Richten Sie vier Reaktionen mit 500 ng des primären PCR-Produkts in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL für jede Probe und die Negativkontrolle ein.
- Laden Sie das gesamte Produkt für die Elektrophorese mit 2% TBE-Agarosegel und bestätigen Sie die Bandgröße mit einer 1 kb Molekularleiter. Die Größe des Amplikons beträgt 399 bp.
- Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf dem Gel-Dokumentationssystem.
- Entfernen Sie das spezifische Band und reinigen Sie es mit einem Gelreinigungskit.
HINWEIS: Berechnungen für die Reinigung mit dem Kit sind in Tabelle 3 enthalten. - Elutie in einem Endvolumen von 30 μL Elutionspuffer. Die ungefähre Konzentration jedes Elutionsmittels beträgt etwa 80-90 ng / μL mit einem Gesamtvolumen von 30 μL.
8. Next-Generation-Sequencing und Datenanalyse
- Sequenzieren Sie das gelgereinigte Produkt aus Schritt 7.13. auf einem Next-Generation-Sequenzer (z. B. Illumina), um die Lesezahl für die erschöpften shRNAs zu erhalten.
- Kürzen Sie die Adaptersequenzen der generierten FastQ-Lesevorgänge mit dem Fastx-Toolkit (Version 0.7).
- Richten Sie die gefilterten Lesevorgänge mit einem Bowtie-Aligner an Referenzsequenzen aus, wobei der Parameter zwei Nichtübereinstimmungen zulässt. Stellen Sie sicher, dass die Leselänge nach dem Trimmen des Adapters etwa 21 bp beträgt.
- Laden Sie die Dateien mit dem Programm Samtools (Version 1.9). Verwenden Sie die Option Flagstat und berechnen Sie die Ausrichtungszusammenfassung.
- Laden Sie die getrimmten fastQ-Dateien in die CRISPRCloud2 (CC2) Software (https://crispr.nrihub.org/) zusammen mit den Referenz-shRNA-Sequenzen in Form von FASTA-Dateien und führen Sie die Analyse gemäß den Anweisungen durch.
- Klicken Sie im CC2 auf den Link Analyse starten .
- Wählen Sie den Bildschirmtyp als Überlebens- und Ausstiegsbildschirme aus. Legen Sie die Anzahl der Gruppen fest und geben Sie den Namen für jede Gruppe ein.
- Laden Sie die Referenzbibliothek im FASTA-Dateiformat hoch. Die hochgeladenen Daten werden verarbeitet. Klicken Sie auf die Ausgabe-URL, um die Ergebnisse zu erhalten.
HINWEIS: Diese Software verwendet ein Beta-Binomialmodell mit einem modifizierten Student's t-Test, um Unterschiede in den sgRNA / shRNA-Spiegeln zu messen, gefolgt von Fishers kombiniertem Wahrscheinlichkeitstest zur Abschätzung der Bedeutung auf Genebene. Es berechnet geschätzte logarithmische2-fache Veränderungen (Log2Fc) von shRNAs für die epigenetischen Faktoren zwischen den behandelten (angereicherten / erschöpften) und den unbehandelten Proben (Baseline) mit "p-Werten" und "FDR-Werten".
- Stellen Sie sicher, dass der FDR-Wert für einen Dropout-Bildschirm "negativ" und für einen Survival-Bildschirm "positiv" ist.
HINWEIS: CC2 ist eine Analyseplattform zum Zählen der Lesevorgänge und zur Berechnung der Faltendarstellung (Anreicherung oder Erschöpfung) von shRNAs zwischen den Proben. - Identifizieren Sie die signifikant angereicherten und erschöpften shRNAs (FDR <0,05) aus den CC2-Ergebnissen.
HINWEIS: Es gibt 5-24 shRNAs gegen jeden Faktor. Überprüfen Sie die FDR-Werte für jede der shRNAs; Betrachten Sie die FDR, die <0,01 beträgt, und nehmen Sie einen Durchschnitt für die ausgewählten shRNAs. Betrachten Sie die Top 40 Treffer. Zeichnen Sie das Diagramm für die ausgewählten Faktoren basierend auf Log2Fc oder FDR negativen Werten. Stellen Sie sicher, dass die Nicht-Targeting-shRNAs auch signifikante FDR-Werte aufweisen, um die Authentizität der Daten sicherzustellen, da sie als Kontroll-shRNAs dienen.
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Representative Results
Der gesamte Screening-Workflow ist in Abbildung 1A dargestellt. Die In-vitro-Zytotoxizität des MV4-11 AraC R (48 h) zeigte, dass der IC50 zu Cytarabin im MV4-11 AraC R höher war als der MV4-11 P (Abbildung 1B). Diese Zelllinie wurde in der Studie als Modell für das Screening der epigenetischen Faktoren verwendet, die für die Cytarabinresistenz verantwortlich sind.
Abbildung 2A zeigt die linearisierten pZIP-Vektorabbildungen mit drei verschiedenen Promotoren: hEF1α (humaner Dehnungsfaktor 1α), hCMV (humanes Cytomegalovirus) und SSFV (Milzfokus-bildendes Virus) mit der verschlüsselten shRNA innerhalb der UltramiR-Sequenz. Abbildung 2B zeigt die im Bibliotheksexperiment verwendete pZIP-Vektorkarte und die shRNA, die auf den epigenetischen Faktor mit Zsgreen und Puromycin als wählbarem Marker abzielt, der vom hEF1a-Promotor gesteuert wird. Diese Vektoren wurden bei der Auswahl des potentesten Promotorexperiments verwendet.
Die Auswahl des stärksten Promotors, um eine konsistente und verlängerte Expression in den Zielzellen zu erhalten, ist in Abbildung 3 dargestellt. Die von MFI gemessene Quantifizierung von GFP ergab eine Transduktionseffizienz von mehr als 90% am Ende von 72 h in MV4-11 AraC R für alle drei Promotoren. Das Histogramm für die GFP-Expression zeigt eine heterogene Population für hCMV, aber eine homogene im Fall von hEF1a und SFFV am Tag 3 der Transduktion (Abbildung 3A). Das Balkendiagramm zeigt den GFP-Ausdruck, der von drei verschiedenen Promotoren (hEF1α, hCMV und SFFV) an Tag 3 der Transduktion in MV4-11 AraC R gesteuert wird (Abbildung 3B). SFFV-getriebene GFP zeigten eine Reduktion des MFI am Tag 5 der Transduktion (Abbildung 3C). Bei der hEF1a-gesteuerten GFP-transduzierten MV4-11-Elternliniensortierung wurde kein Rückgang des MFI beobachtet. So wurde der hEF1a-Promotor als geeigneter Promotor für die Zelllinie identifiziert (Abbildung 3D).
Abbildung 4A zeigt die Transfektionseffizienz der gepoolten shRNA-Bibliotheksplasmide in 293T-Zellen nach 48 h Transfektion. Der GFP-Ausdruck war hell, was auf eine gute Transfektionseffizienz hinweist. Nach der Virussammlung wurde die Transduktionseffizienz des vorbereiteten gepoolten Virus in 293T-Zellen in drei verschiedenen Konzentrationen (2 μL, 4 μL und 8 μL) überprüft. Wir beobachteten, dass selbst das 2-μL-Virus zu der gleichen Effizienz wie das 8-μL-Virus führte, was den hohen Virustiter bestätigte (Abbildung 4B).
Abbildung 5 zeigt die gepoolte Bibliothekstransduktion in der MV4-11 AraC R-Zelllinie und die Bestimmung des lentiviralen Titers. Das gepoolte shRNA-Bibliotheks-Lentivirus wurde 100x verdünnt und dann in verschiedenen Volumina (1 μL, 1,5 μL, 2 μL und 2,5 μL) in die MV4-11 AraC R-Zelllinie gegeben. Die Effizienz wurde am Ende von 72 h überprüft. Die Transduktionseffizienz betrug 30% für 2-2,5 μL des Virus, was eine shRNA-Integration pro Zelle bestätigt (Abbildung 5A). Die Transduktion mit 2,5 μl gepooltem Bibliotheksvirus in 1,1 x 107 MV4-11 AraC R-Zellen führte zu einer Transduktionseffizienz von 30%. GFP-positive Zellen wurden sortiert, wobei die gepoolte shRNA-Bibliothek dargestellt wurde (Abbildung 5B).
Nach der Transduktion des gepoolten epigenetischen lentivirus shRNA in die MV4-11 AraC R-Zelllinie wurden die GFP-positiven Zellen am Tag 5 oder Tag 7 sortiert (Abbildung 6). Diese sortierten Zellen wurden 9 Tage lang einer längeren Exposition gegenüber Cytarabin ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit wurde am 9. Tag überprüft und die Zellen wurden für DNA gesammelt. (Abbildung 6A). Das Balkendiagramm zeigt die Verringerung der Proliferationsrate der transduzierten Zellen in Gegenwart von Cytarabin (Abbildung 6B).
Die extrahierte DNA aus den Proben wurde zwei Runden PCR unterzogen, und das endgültige geleluierte Produkt repräsentierte die angereicherten shRNAs, die durch NGS quantifiziert wurden. Abbildung 7A zeigt die Bindungsbereiche des Primers, die in der 1. und 2. Runde der PCR verwendet werden, wobei die Primer der 1. Runde an die flankierenden Bereiche der integrierten shRNA binden und der 2. Vorwärtsprimer an die Schleifensequenz bindet. Der Reverse-Primer bindet an einen Bereich des amplifizierten Vektors in der 1. Runde der PCR. Abbildung 7B und Abbildung 7C veranschaulichen die Bandengröße des PCR-Produkts am Ende der 1. (397 bp) und der 2. Runde der PCR (399 bp), die gel-eluiert, gereinigt und zur NGS-Analyse eingereicht wurde.
Nachdem die DNA einem Standard-Qualitätskontrollverfahren unterzogen wurde, wurden die Proben für die NGS-Analyse verarbeitet. Wir verwendeten CRISPRCloud2, eine benutzerfreundliche, cloudbasierte Analyseplattform zur Identifizierung angereicherter und erschöpfter shRNAs im gepoolten shRNA-Screening. Abbildung 8 veranschaulicht die Darstellung von angereicherten oder erschöpften shRNAs, die auf epigenetische Faktoren abzielen, die Cytarabinresistenz bei AML vermitteln könnten.
Abbildung 1: Gliederung und Modell der Studie . (A) Darstellung der Übersicht über den Arbeitsablauf. (B) MV4-11 Eltern- und AraC-resistente Zellen, die mit steigenden Cytarabinkonzentrationen (0,1 μM bis 1000 μM) behandelt und mit MTT-Assay bewertet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Abbildung der linearisierten Vektoren. (A) Die drei Vektorabbildungen mit drei verschiedenen Promotoren, hEF1α (humaner Dehnungsfaktor 1α), hCMV (humanes Cytomegalovirus) und SSFV (Milzfokus-bildendes Virus), mit der verschlüsselten shRNA innerhalb der UltramiR-Sequenz. (B) Illustration der im Bibliotheksexperiment verwendeten Vektorkarte mit hEF1α-Promotor und der shRNA, die auf den epigenetischen Faktor mit Zsgreen und Puromycin als wählbarem Marker abzielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Auswahl des potentesten Promotors zur Erzielung einer persistenten und verlängerten Expression der shRNAs. (A) Repräsentative Flussdiagramme für GFP, quantifiziert durch Durchflusszytometrie am Ende von 72 h für hEF1a-, hCMV- und SFFV-Promotoren. hCMV zeigt einen heterogenen Peak, während hEF1a und SFFV einen einzigen homogenen Peak zeigen. (B) Promotoreffizienz in der MV4-11 AraC R-Zelllinie. (C) SFFV-gesteuertes GFP zeigt das Schweigen von GFP in längerer Kultur. (D) hEF1a-gesteuerte GFP-Zellen zeigen eine anhaltende Expression nach der Sortierung der Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Überprüfung der Effizienz des präparierten gepoolten shRNA-Lentivirus . (A) Fluoreszenzmikroskopie-Bilder zeigen die Transfektionseffizienz der gepoolten shRNA-Bibliothek, die in 293T am Ende von 48 h mit 10-facher Vergrößerung transfiziert wurde. (B) Die Transduktionseffizienz des gepoolten Virus wurde in 293T-Zellen mit unterschiedlichen Virusvolumina (2μL, 4μL und 8μL) mit 10-facher Vergrößerung bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Gepoolte Bibliothekstransduktion in der Zielzelllinie und Bestimmung des lentiviralen Titers. (A) MV4-11 AraC R-Zelllinie, transduziert mit unterschiedlichen Virusvolumina (1μL, 1,5μL, 2μL und 2,5μL). Die Effizienz wurde am Ende von 72 h überprüft. (B) Transduktion von gepoolten Bibliotheksviren in 1 x 107 MV4-11 AraC R-Zellen, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erreichen, dann Sortierung von GFP-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Dropout-Screening zur Identifizierung epigenetischer Faktoren, die eine Arzneimittelresistenz vermitteln. (A) Schematische Darstellung der medikamentösen Behandlung zur Anreicherung resistenter Zellen. Bibliotheksinfizierte Zellen wurden 9 Tage lang einer längeren Cytarabin-Exposition ausgesetzt, gefolgt von der Überprüfung der Lebensfähigkeit und dem Sammeln der Zellen für die DNA-Extraktion. (B) Verringerung der Lebensfähigkeit gegenüber längerer Cytarabin-Exposition in resistenten Zelllinien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Vorbereitung der Amplikonen , die die integrierte shRNA darstellen. (A) Die Bindungsbereiche des Primers, die in der 1. und 2. Runde der PCR verwendet werden, wobei die Primer der 1. Runde an die flankierenden Bereiche der integrierten shRNA binden und der zweite Vorwärtsprimer an die Schleifensequenz bindet. Die Umkehrung bindet an einen Bereich des amplifizierten Vektorbereichs in der 1. PCR. (B) Abbildung der Bandengröße des PCR-Produkts am Ende der 1. Runde der PCR (397 bp). (C) Das PCR-Produkt der 2. Runde (399 bp) wurde geleluiert, gereinigt und für NGS verabreicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Screening-Ergebnisse in der AML-Zelllinie (MV-4-11 Ara-C R-Zelllinie). Nachdem die DNA einem Standard-Qualitätskontrollverfahren unterzogen wurde, wurden die Proben für die NGS-Analyse verarbeitet. Wir haben CRISPRCloud2, eine benutzerfreundliche, cloudbasierte Analyseplattform, verwendet, um angereicherte und erschöpfte shRNAs im gepoolten shRNA-Screening zu identifizieren. Die Abbildung stellt angereicherte oder abgereicherte shRNAs dar, die auf epigenetische Faktoren abzielen, die eine Cytarabinresistenz bei AML vermitteln könnten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Herstellung der Transfektionsplasmidmischung (Berechnung für 10cm Platte) Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: PCR-Reaktionsgemisch für die 1. Runde der PCR Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Berechnungen zur Reinigung der Produkte der 1. PCR Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: PCR-Reaktionsgemisch für die 2. Runde der PCR Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
RNA-Interferenz (RNAi) wird in großem Umfang für funktionelle Genomik-Studien verwendet, die siRNA- und shRNA-Screening umfassen. Der Vorteil von shRNA besteht darin, dass sie in Plasmidvektoren eingebaut und in genomische DNA integriert werden können, was zu einer stabilen Expression und damit zu einem längeren Knockdown der Ziel-mRNA führt. Ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening ist im Vergleich zu den herkömmlichen Array-Screens (siRNA) robust und kostengünstig. Die Identifizierung der Wesentlichkeit einer bestimmten Klasse von Proteinen in einem genomweiten Bildschirm kann umständlich sein. Gezielte Screening-Ansätze können die Wesentlichkeit einzelner Proteine für das Überleben von Krebszellen oder die Arzneimittelresistenz innerhalb der spezifischen Klasse mit reduziertem Rauschen aufdecken. Dieses Protokoll hebt den RNAi-Screen epigenetischer Faktoren hervor, um sowohl essentielle als auch nicht-essentielle Gene systematisch abzufragen, und es demonstriert die Verwendung dieses Ansatzes als funktionelle Plattform, die die Identifizierung von Zielen ermöglicht, die für AML-Arzneimittelresistenz verantwortlich sind.
Diese leistungsstarke Technologie erfordert bestimmte Vorsichtsmaßnahmen bei der Planung und Durchführung der Experimente. Die erste ist die Wahl von Promotoren, die während der Zellkultur kein signifikantes Silencing für die Expression von shRNAs durchlaufen, da ihre robuste Expression für den Knockdown von Zielgenen entscheidend ist. Zweitens ist die Aufrechterhaltung der shRNA-Repräsentation (die Anzahl der mit jeder shRNA transduzierten Zellen) von besonderer Bedeutung. Während des gesamten shRNA-Screens erhöht eine durchschnittliche Darstellung von >500 Zellen pro shRNA-Konstrukt das Potenzial zur Identifizierung der shRNAs, die phänotypische Effekte verursachen.
Die RNAi-Screening-Strategie ist ein wettbewerbsfähiger Wachstumsscreen; Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Zielzellen in der logarithmischen Wachstumsphase befinden und während des Screenings nicht übermäßig konfluieren, um den durch eingeschränktes Wachstum verursachten Repräsentationsverlust zu minimieren. Es ist ideal, die Zellen bei einem Zusammenfluss von 50% -70% zu halten, um experimentelle Variationen zu minimieren. Wir empfehlen, konsistente Mengen an Medien, Sera, viralen Überständen, Medikamenten und Gewebekultur-Plastikwaren für alle Bildschirmreplikate beizubehalten, um experimentelle Variationen zu reduzieren.
Es ist ratsam, Pilotexperimente durchzuführen, um die Transduktionseffizienz des Lentivirus zu optimieren, um das Volumen der Viren zu berechnen, die erforderlich sind, um eine Integration von shRNA pro Zelle zu erreichen. Um diese Integration von einer shRNA pro Zelle zu erreichen, sollte die Transduktionseffizienz weniger als 30% betragen. Da die Anzahl der Viren, die 30% transduzierte Zellen erhalten, zwischen den für die Experimente verwendeten Zelllinien variieren kann, ist ein Standardisierungsexperiment für jede Zelllinie erforderlich. Die Transduktionseffizienz kann auch durch die Zellkulturbedingungen und die Zellproliferationsrate beeinflusst werden. Daher sollten funktionelle Titer im Pilotversuch unter den gleichen Bedingungen bestimmt werden, die im Screening-Experiment verwendet wurden. Die Pflege von 3-6 Replikaten ist immer ratsam, um statistisch signifikante Treffer zu erzielen.
Die beiden Hauptanliegen des shRNA-Screening-Ansatzes sind die Off-Target-Effekte und die variablen Knockdown-Wirkungsgrade von shRNAs16. Diese können durch die Verwendung mehrerer shRNAs jedes Gens überwunden werden. Die Anpassung des prokaryotischen Immunsystems CRISPR-Cas9 in Säugetierzellen hat eine einfache, effiziente und kostengünstige Genom-Editierung in kultivierten menschlichen Zellen ermöglicht. Dieses System wurde umfassend genutzt, um genomweite genetische Screens durchzuführen, die denen ähneln, die mit shRNA durchgeführt werden. Das Schicksal von Zellen, die eine bestimmte Single-Guide-RNA (sgRNA)-Sequenz beherbergen, kann mittels Tiefensequenzierung überwacht werden. Der hier skizzierte Versuchsaufbau kann auch für das CRISPR-Screening verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wird zum Teil durch einen Zuschuss des Department of Biotechnology BT/PR8742/AGR/36/773/2013 an SRV finanziert; und Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 und Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 bis P.B. RVS und P.B. werden von Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 bzw. IA/S/15/1/501842 unterstützt. S.D. wird durch das CSIR-UGC-Stipendium unterstützt, und S.I. wird durch ein ICMR-Senior-Forschungsstipendium unterstützt. Wir danken Abhirup Bagchi, Sandya Rani und den Mitarbeitern der CSCR Flow Cytometry Core Facility für ihre Hilfe. Wir danken MedGenome Inc. auch für die Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung und Datenanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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