Summary
La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .
Abstract
La cromatina es una estructura de orden superior que empaqueta el ADN eucariota. La cromatina sufre alteraciones dinámicas según la fase del ciclo celular y en respuesta a estímulos ambientales. Estos cambios son esenciales para la integridad genómica, la regulación epigenética y las reacciones metabólicas del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. El ensamblaje de la cromatina es crucial para la dinámica de la cromatina y es catalizado por las chaperonas de histonas. A pesar de los extensos estudios, los mecanismos por los cuales las chaperonas de histonas permiten el ensamblaje de la cromatina siguen siendo esquivos. Además, las características globales de los nucleosomas organizados por las chaperonas de histonas son poco conocidas. Para abordar estos problemas, este trabajo describe una técnica única de imagen de una sola molécula llamada cortina de ADN, que facilita la investigación de los detalles moleculares del ensamblaje de nucleosomas por parte de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN es una técnica híbrida que combina la fluidez lipídica, la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para proporcionar una plataforma universal para la obtención de imágenes en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. Utilizando la cortina de ADN, se investiga la función de la chaperona de histonas de Abo1, la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de Schizosaccharomyces pombe , y se revela el mecanismo molecular subyacente al ensamblaje de histonas de Abo1. La cortina de ADN proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la cromatina.
Introduction
El ADN eucariota está empaquetado en una estructura de orden superior conocida como cromatina 1,2. El nucleosoma es la unidad fundamental de la cromatina, que consiste en aproximadamente 147 pb de ADN envuelto alrededor de las histonas del núcleo octamérico 3,4. La cromatina desempeña un papel fundamental en las células eucariotas; por ejemplo, la estructura compacta protege el ADN de factores endógenos y amenazas exógenas5. La estructura de la cromatina cambia dinámicamente de acuerdo con la fase del ciclo celular y los estímulos ambientales, y estos cambios controlan el acceso a las proteínas durante las transacciones del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación6. La dinámica de la cromatina también es importante para la estabilidad genómica y la información epigenética.
La cromatina está regulada dinámicamente por varios factores, incluidas las modificaciones de la cola de las histonas y los organizadores de la cromatina, como los remodeladores de la cromatina, las proteínas del grupo polycomb y las chaperonas de histonas7. Las chaperonas de histonas coordinan el ensamblaje y desensamblaje de nucleosomas a través de la deposición o desprendimiento de histonas centrales 8,9. Los defectos en las chaperonas de histonas inducen inestabilidad genómica y causan trastornos del desarrollo y cáncer 9,10. Varias chaperonas de histonas no necesitan consumo de energía química como la hidrólisis de ATP para ensamblar o desensamblar nucleosomas 9,11,12,13. Recientemente, los investigadores informaron que las ATPasas AAA+ (ATPasa asociadas con diversas actividades celulares) que contienen bromodominios desempeñan un papel en la dinámica de la cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. La ATAD2 humana (proteína 2 que contiene el dominio AAA de la familia ATPasa) promueve la accesibilidad de la cromatina para mejorar la expresión génica18. Como co-regulador transcripcional, ATAD2 regula la cromatina de los factores transcripcionales oncogénicos14, y la sobreexpresión de ATAD2 se relaciona con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer19. Yta7, el homólogo de ATAD2 por Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), disminuye la densidad de nucleosomas en la cromatina15. Por el contrario, Abo1, el homólogo de ATAD2 de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), aumenta la densidad de nucleosomas16. Utilizando una técnica única de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN, se aborda si Abo1 contribuye al ensamblaje o desensamblaje de nucleosomas17,20.
Tradicionalmente, las propiedades bioquímicas de las biomoléculas han sido examinadas mediante experimentos masivos como el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) o la coinmunoprecipitación (co-IP), en los que se sondean un gran número de moléculas y se caracterizan sus propiedades medias21,22. En los experimentos a granel, los subestados moleculares están velados por el efecto conjunto-promedio, y el sondeo de las interacciones biomoleculares está restringido. Por el contrario, las técnicas de una sola molécula eluden las limitaciones de los experimentos masivos y permiten la caracterización detallada de las interacciones biomoleculares. En particular, las técnicas de imagen de molécula única se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína23. Una de estas técnicas es la cortina de ADN, una técnica única de imagen de molécula única basada en la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM)24,25. En una cortina de ADN, cientos de moléculas individuales de ADN están ancladas a la bicapa lipídica, lo que permite el movimiento bidimensional de las moléculas de ADN debido a la fluidez lipídica. Cuando se aplica el flujo hidrodinámico, las moléculas de ADN se mueven a lo largo del flujo en la bicapa y se atascan en una barrera de difusión, donde se alinean y se estiran. Mientras el ADN se tiñe con agentes intercalantes, se inyectan proteínas marcadas con fluorescencia y se utiliza TIRFM para visualizar las interacciones proteína-ADN en tiempo real a nivel de una sola molécula23. La plataforma de cortina de ADN facilita la observación de los movimientos de las proteínas, como la difusión, la translocación y la colisión 26,27,28. Además, la cortina de ADN se puede utilizar para el mapeo de proteínas en el ADN con posiciones, orientaciones y topologías definidas o se puede aplicar al estudio de la separación de fases de proteínas y ácidos nucleicos 29,30,31.
En este trabajo, se utiliza la técnica de cortina de ADN para proporcionar evidencia de la función de las chaperonas a través de la visualización directa de proteínas específicas. Además, debido a que DNA Curtain es una plataforma de alto rendimiento, facilita un grado de recopilación de datos suficiente para la confiabilidad estadística. Aquí, se describe cómo realizar el ensayo de cortina de ADN en detalle para investigar el papel molecular de la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de S. pombe Abo1.
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Protocol
1. Preparación de la celda de flujo
- Prepare un portaobjetos de sílice fundida limpio que contenga patrones de nanozanjas siguiendo el informe publicado anteriormente25.
- Taladre dos orificios de 1 mm de diámetro en un portaobjetos de sílice fundida limpio (Figura 1A) con una broca recubierta de diamante (consulte la Tabla de materiales).
- Deposite 250 nm de aluminio grueso (Al) en el portaobjetos utilizando pulverización catódicade CC 32 (ver Tabla de Materiales) con 10 mTorr de gas argón.
- Aplicar una capa de 310 nm de espesor de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) al 4% de 950K (ver Tabla de Materiales) a 4.000 rpm durante 1 min y hornear en una placa caliente a 180 °C durante 3 min.
- Dibuje los patrones de nanozanja en la capa de PMMA entre los dos orificios utilizando litografía de haz de electrones (ebeam)33 con una corriente de 0,724 nA a 80 kV.
NOTA: La arquitectura y las dimensiones de los patrones de nanozanjas se muestran en la Figura 1A. - Retire el PMMA expuesto al haz de agua sumergiendo los portaobjetos en la solución de revelado (proporción 1:3 de metil isobutil cetona e isopropanol, consulte la Tabla de materiales) durante 2 min.
- Grabe capas de Al con grabado iónico reactivo por plasma acoplado inductivamente (ICP-RIE) utilizando gases cloro (Cl2) y tricloruro de boro (BCl3).
NOTA: Estos dos gases pueden eliminar el Al de las áreas expuestas al haz de e. - Talle nanozanjas en los portaobjetos utilizando gases tetrafluoruro de azufre (SF4), tetrafluorometano (CF4) y oxígeno (O2) (ver Tabla de Materiales).
- Retire la capa de Al restante sumergiendo los portaobjetos en un grabador de Al (revelador AZ 300 MIF, consulte la Tabla de materiales) durante 10 min.
- Después de la fabricación, enjuague los portaobjetos con agua desionizada y sonique en acetona durante 30 minutos con un sonicador tipo baño.
- Limpie los portaobjetos en una solución Hellmanex III al 2% (consulte la tabla de materiales) durante al menos 1 día con agitación magnética.
- Sonicar los portaobjetos en acetona durante 30 min y 1 M de NaOH durante 30 min sucesivamente.
- Enjuague los portaobjetos con agua desionizada y séquelos con un gas nitrógeno (N2).
- Coloque un papel limpio (5 mm x 35 mm) en el centro de la cinta adhesiva de doble cara. Pega la cinta adhesiva sobre el portaobjetos para cubrir los dos agujeros y los nanopatrones con el papel.
- Elimine el papel con una cuchilla limpia (Figura 1A).
- Coloque un cubreobjetos de vidrio encima de la cinta adhesiva de doble cara y frote el cubreobjetos con la punta de una pipeta para formar una cámara microfluídica (Figura 1A).
- Coloque la celda de flujo ensamblada entre dos portaobjetos de microscopio y sujételos.
- Hornee la celda de flujo en un horno al vacío a 120 °C durante 45 min.
- Conecte el conector de fluido (Nanoport) para los análisis basados en chips (consulte la Tabla de materiales) a cada orificio abierto con una pistola de pegamento caliente y conecte las dos líneas de tubería de bloqueo Luer.
- Conecte una jeringa Luer lock que contenga 3 ml de agua desionizada y lave la cámara.
- Lave la cámara con 3 ml de tampón lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 y 100 mM de NaCl) a través de la conexión gota a gota .
NOTA: La conexión gota a gota conecta todas las jeringas a la celda de flujo para evitar inyectar burbujas de aire en la cámara. - Inyecte 1 ml de lípido biotinilado 0,04x en tampón lipídico en la cámara en dos tomas con 5 minutos de incubación por toma.
NOTA: La preparación de 1x caldo lipídico biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34. - Lavar la cámara con 3 ml de tampón lipídico e incubar durante 20 min para que la bicapa lipídica madure en la superficie del portaobjetos.
- Agregue 1 mL de tampón BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 y 0.2 mg/mL de BSA) e incube durante 5 min para pasivar la superficie del portaobjetos.
NOTA: Este paso puede reducir la unión inespecífica de proteínas a la superficie del portaobjetos. - Inyecte 0,025 mg/ml de estreptavidina en 1 ml de tampón BSA con dos inyecciones y 10 minutos de incubación por inyección.
- Lave la estreptavidina residual con 3 ml de tampón BSA.
- Inyecte ~300 pM (30 μL) de ADN de fagos lambda biotinilados en 1 mL de tampón BSA en la cámara con dos disparos y 10 minutos de incubación por disparo.
NOTA: La preparación de ADN lambda biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34.
2. Conectar la celda de flujo al sistema microfluídico y cargarla en el microscopio
- Prepare el tampón de imagen Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl2, 1.6% de glucosa y 0.1x de gloxy, ver Tabla de Materiales).
NOTA: Gloxy es un sistema de eliminación de oxígeno que reduce el fotoblanqueo de los tintes fluorescentes. La preparación de 100x gloxi stock con glucosa oxidasa y catalasa se describe en la Referencia35. - Conecte una jeringa que contenga 10 ml de tampón de diagnóstico por imágenes a una bomba de jeringa y elimine las burbujas en todas las líneas de tubería del sistema microfluídico.
- Acople la celda de flujo preparada con el sistema microfluídico a través de una conexión gota a gota para evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo (Figura 1B).
- Ensamble la celda de flujo y los soportes de la celda de flujo y monte el ensamblaje en un microscopio TIRF hecho a medida (Figura 1C).
PRECAUCIÓN: Cuando la celda de flujo se coloca bajo el microscopio, ajuste cuidadosamente la altura de la lente del objetivo. La celda de flujo no debe tocar la lente del objetivo. Esto puede dañar la lente. - Deje caer el aceite correspondiente al índice en el centro de la celda de flujo y coloque un prisma de paloma hecho a medida (consulte la Tabla de materiales) en la gota de aceite.
3. Ensamblaje de histonas por Abo1 usando cortina de ADN
- Mezclar 5 nM de Abo1 y 12,5 nM de dímero de histonas H3-H4 marcado con Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabla de Materiales) en 150 μL de tampón de imagen. Todas las proteínas se prepararon siguiendo el informe previamente publicado17.
- Incuba la mezcla en hielo durante 15 min.
NOTA: Para evitar el fotoblanqueo de Cy5, la incubación debe realizarse en la oscuridad. - Inyecte ~20 pM (2 μL) de colorante YOYO-1 en tampón de imagen a través de un bucle de muestra de 100 μL para teñir las moléculas de ADN lambda.
- Ejecute un software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y encienda el láser de 488 nm para verificar si las cortinas de ADN están bien formadas.
NOTA: Si las cortinas de ADN están bien formadas, las moléculas de ADN, que se tiñen con YOYO-1, se muestran como líneas alineadas en una barrera en presencia de flujo. Las líneas estiradas retroceden y se difunden lejos de la barrera cuando se cierra el flujo. - Inyecte 2 mL de tampón con alto contenido de sal (200 mM de NaCl y 40 mM de MgCl2) para eliminar el colorante YOYO-1 del ADN.
- Después de eliminar el colorante YOYO-1, inyecte la muestra de proteína preincubada.
- Cuando las proteínas lleguen a la cortina de ADN, apague la bomba de jeringa, cierre la válvula de cierre e incube 15 minutos para la carga de histonas por Abo1.
- Lave las proteínas Abo1 e histonas no unidas durante 5 min.
- Abra la válvula de cierre y reanude la inyección de flujo.
- Encienda el láser de 637 nm y obtenga imágenes de las proteínas fluorescentes mientras el flujo del tampón está activado.
- Apague transitoriamente el flujo tampón para verificar si las proteínas histonas están cargadas en el ADN (Figura 2C).
- Recolectar imágenes de cortinas de ADN con un programa de adquisición de imágenes (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Cuando el flujo de tampón se detiene transitoriamente, el ADN retrocede fuera del campo evanescente de reflexión interna total, y las proteínas marcadas con fluorescencia unidas al ADN desaparecen.
4. Análisis de datos
- Transforme las imágenes tomadas por el programa de adquisición de imágenes en formato TIFF como secuencias de imágenes.
NOTA: Todos los datos se analizaron utilizando la Imagen J (NIH) como se describe en la Referencia20. - Elige una sola molécula de ADN de las secuencias de imágenes y dibuja un quimógrafo.
NOTA: El quimógrafo puede mostrar el cambio en la intensidad de fluorescencia de cada proteína histona unida a una sola molécula de ADN en función del tiempo. - Cree el perfil de intensidad de fluorescencia a partir del cimógrafo y ajústelo con múltiples funciones gaussianas.
- Recopile las coordenadas centrales de los picos del perfil de intensidad de fluorescencia. En este paso, se puede obtener la intensidad mínima de fluorescencia de histonas.
- Divida todas las intensidades máximas recogidas de los perfiles por la intensidad mínima. En este paso se estima el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN.
- Realice los pasos 4.2-4.5 para otras moléculas de ADN.
- Cree un histograma para la distribución de enlace de dímeros H3-H4 con un tamaño de intervalo de 1 kbp. El número de moléculas analizadas es de al menos 300.
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Representative Results
Este trabajo describe el procedimiento para la preparación de la celda de flujo para el ensayo de cortina de ADN (Figura 1A). El ensayo de cortina de ADN facilitó el estudio del ensamblaje del dímero de la histona H3-H4 en el ADN por Abo1. En primer lugar, se comprobó la formación de la cortina de ADN tiñendo las moléculas de ADN con YOYO-1, un colorante intercalante. Se mostraron líneas verdes en matrices paralelas, lo que indica que YOYO-1 se intercaló en moléculas de ADN, que estaban bien alineadas y estiradas en una barrera de difusión bajo flujo hidrodinámico (Figura 2A). Para excluir la posibilidad de que YOYO-1 dificultara la interacción del ADN y las proteínas histonas, YOYO-1 se eliminó del ADN con un tampón alto en sal antes de agregar proteínas histonas. Cuando se inyectaron dímeros Cy5-H3-H4 en la cortina de ADN en ausencia de Abo1, Cy5-H3-H4 no se unió al ADN, lo que indica una falta de unión espontánea de los dímeros H3-H4 al ADN (Figura 2B). Cuando Cy5-H3-H4 se inyectó con Abo1, se observaron puntos fluorescentes rojos en las moléculas de ADN, lo que sugiere que Abo1 carga dímeros H3-H4 en el ADN (Figura 2C). El flujo del tampón se desconectó transitoriamente para garantizar que los dímeros Cy5-H3-H4 no se unieran a la superficie del portaobjetos mientras se unían al ADN. Cuando se cortó el flujo, las proteínas marcadas con fluorescencia unidas al ADN desaparecieron porque las moléculas de ADN retrocedieron fuera del campo evanescente. Por el contrario, las proteínas adsorbidas a la superficie permanecieron igual. Las señales fluorescentes desaparecieron en ausencia de flujo y reaparecieron cuando se reanudó el flujo, lo que sugiere que los dímeros H3-H4 se unen al ADN (Figura 2C). La unión de los dímeros H3-H4 al ADN también fue confirmada por el quimógrafo, en el que las señales de fluorescencia desaparecían cada vez que se cortaba el flujo (Figura 2D). Debido a que Abo1 es una ATPasa AAA+, se examinó el efecto de la hidrólisis de ATP sobre la actividad de carga de histonas de Abo116. Aparecieron pocos puntos fluorescentes en la cortina de ADN, ya sea en ausencia de nucleótido (Apo) o en presencia de ADP (Figura 2E), lo que indica que los dímeros H3-H4 rara vez se unen al ADN, ya sea en el estado Apo o en presencia de ADP. La Figura 2F muestra análisis cuantitativos de la Figura 2B, C y Figura 2E, mostrando que el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN aumenta en presencia de ATP. Los resultados sugieren que la hidrólisis de ATP es esencial para la carga de H3-H4 en el ADN por parte de Abo1 (Figura 2E, F).
A continuación, se probó si Abo1 carga preferentemente histonas a la secuencia Widom 601, que tiene una afinidad de unión a las histonas diez veces mayor que las secuencias aleatorias in vitro, a pesar de que los nucleosomas no tienen especificidad para la secuencia Widom 601 in vivo 36,37,38,39,40. La cortina de ADN se formó con ADN lambda que contiene repeticiones Widom 601 en un extremo o internamente (Figura 3A, B). Se obtuvo el paisaje de unión de los dímeros H3-H4 en cada construcción de ADN (Figura 3C,D). La ubicación de unión de Cy5-H3-H4 se estimó a partir de la posición central del ajuste gaussiano 2D para cada punctum fluorescente17,41. Si la actividad de carga H3-H4 de Abo1 depende de la secuencia de ADN, entonces la distribución de unión estaría sesgada hacia la secuencia Widom 601. La Figura 3C, D muestra los histogramas de distribución de unión de dímeros H3-H4 por Abo1 en ADN lambda que contiene repeticiones Widom 601 al final (diez repeticiones) e internamente (cinco repeticiones), respectivamente. No hubo unión preferencial a las múltiples repeticiones de Widom 601, y la distribución de unión fue aleatoria, lo que sugiere que Abo1 no tiene ninguna preferencia por la secuencia de Widom 601, sino que carga H3-H4 en el ADN de una manera independiente de la secuencia (Figura 3C, D).
Figura 1: Preparación de la celda de flujo. (A) Esquemas del ensamblaje de la celda de flujo y el sistema de cortina de ADN. La cámara microfluídica se puede formar entre un portaobjetos de sílice fundida y un cubreobjetos de vidrio pegados con cinta adhesiva de doble cara. Bajo el flujo hidrodinámico en la cámara, una gran cantidad de moléculas de ADN lambda se alinean en una barrera de difusión (una nano-trinchera aquí) debido a la fluidez de la bicapa lipídica y se estiran como una cortina. En la vista ampliada de la barrera de difusión, la nanozanja tiene patrones de dientes de sierra con un paso de 1,5 μm, un ancho de 350 nm y una profundidad de 1,4 μm. (B) Fotografía del sistema microfluídico que consta de una bomba de jeringa, una válvula de cierre y una válvula de inyección de muestra de 6 vías con un bucle de muestra. (C) Imágenes de los componentes del portaobjetos (izquierda), el conjunto de los soportes y la celda de flujo (centro) y la celda de flujo completamente ensamblada montada en un microscopio TIRF hecho a medida (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización de la carga de histonas por Abo1 utilizando una cortina de ADN de una sola molécula. (A) Imagen de la cortina de ADN, donde las moléculas de ADN teñidas con YOYO-1 (verde) están bien alineadas en una barrera de difusión. (B) Imágenes de Cy5-H3-H4 (rojo) sin Abo1. (C) Imágenes de Cy5-H3-H4 (rojo) cargado por Abo1 en presencia (arriba) y ausencia (abajo) de flujo de tampón. (D) Quimógrafo extraído de una sola molécula de ADN de (C). Cuando el flujo se apaga transitoriamente, las señales de fluorescencia Cy5 desaparecen, lo que indica que Cy5-H3-H4 se une al ADN pero no a la superficie del portaobjetos. (E) Imagen de Cy5-H3-H4 cargado por Abo1 sin nucleótido (Apo) (arriba). Imagen de Cy5-H3-H4 cargada por Abo1 en presencia de ADP (abajo). (F) Cuantificación de Cy5-H3-H4 cargado por Abo1 según nucleótidos. Las barras de error representan la desviación estándar por triplicado. Cada experimento implicó el análisis de 100-200 moléculas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Carga independiente de la secuencia de H3-H4 por Abo1. (A) Un extremo del ADN lambda está anclado a un lípido biotinilado a través de la estreptavidina, y el otro extremo contiene diez repeticiones de la secuencia Widom 601 (arriba). El otro ADN lambda contiene cinco repeticiones de la secuencia Widom 601 dentro del ADN lambda (abajo). (B) Esquema del ensayo de cortina de ADN con ADN lambda que contiene repeticiones Widom 601. (C,D) Histogramas de distribución de unión de Cy5-H3-H4 en ADN lambda que contienen repeticiones Widom 601 al final (C) e internamente (D). No hay especificidad de secuencia para el ADN cuando H3-H4 es ensamblado por Abo1. Las barras de error se obtienen mediante el arranquede 42 con un intervalo de confianza del 70%. El total de eventos es 312 y 252 para (C) y (D), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como técnica de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN se ha utilizado ampliamente para sondear las reacciones metabólicas del ADN43. La cortina de ADN es un sistema híbrido que concatena la fluidez lipídica, la microfluídica y el TIRFM. A diferencia de otras técnicas de una sola molécula, la cortina de ADN permite la visualización en tiempo real de alto rendimiento de las interacciones proteína-ADN. Por lo tanto, la técnica de cortina de ADN es adecuada para sondear el mecanismo detrás de las interacciones moleculares, incluida la asociación específica de secuencia, el movimiento de proteínas junto con el ADN y la colisión proteína-proteína en el ADN 17,20,26. Además, la naturaleza de alto rendimiento de la cortina de ADN permite la recopilación de datos suficientes para garantizar la fiabilidad estadística. La cortina de ADN facilita la investigación de las propiedades biofisicoquímicas de las proteínas, incluidos los parámetros cinéticos, el coeficiente de difusión, la velocidad y la procesividad 17,26,27,30. Es importante destacar que la cortina de ADN se puede utilizar para determinar el panorama de unión de la deposición de nucleosomas, lo que indica la preferencia de secuencia intrínseca de los nucleosomas30.
Es necesario tener en cuenta varios puntos para obtener datos de alta calidad del ensayo de cortina de ADN. Primero, la bicapa lipídica debe formarse adecuadamente en la superficie del portaobjetos. La fluidez de la bicapa lipídica permite que las moléculas de ADN se muevan en el portaobjetos y se alineen en una barrera de difusión en presencia de flujo hidrodinámico. La bicapa lipídica también pasiva la superficie de la cámara microfluídica para evitar la adsorción inespecífica de proteínas a la superficie. Debido a que la pasivación por la bicapa lipídica no es completa, las proteínas marcadas con fluorescencia se adsorben de forma no específica a la superficie, lo que lleva a una interpretación incorrecta de los resultados. Sin embargo, las proteínas adheridas a la superficie se pueden distinguir de las unidas al ADN activando y desactivando el flujo transitorio porque las proteínas unidas al ADN desaparecen cuando el flujo se detiene. En segundo lugar, es necesario suprimir el fotoblanqueo de los fluoróforos. Muchos métodos de obtención de imágenes de fluorescencia de una sola molécula adoptan un sistema de eliminación de oxígeno para reducir el fotoblanqueo. Se han desarrollado varios sistemas de eliminación de oxígeno, el más popular de los cuales es gloxy. Gloxy, que consiste en glucosa oxidasa y catalasa, reduce enzimáticamente los oxígenos moleculares en solución, pero disminuye el pH 44,45,46. Un pH bajo no es compatible con las condiciones fisiológicas y reduce la fluidez lipídica. Para retrasar la disminución del pH, (1) el tampón de imagen debe prepararse con agua desionizada desgasificada, (2) el tampón debe usarse inmediatamente y (3) el tampón debe sellarse y almacenarse en hielo hasta su uso.
Se desarrolló una plataforma única para mejorar el sistema de cortinas de ADN en el que las nanozanjas talladas sirven como barreras de difusión en lugar de nanopatrones de cromo25. Dado que estas nanozanjas son más robustas en condiciones de limpieza adversas con disolventes fuertes, permiten obtener imágenes más claras y repetibles. Sin embargo, la técnica de la cortina de ADN tiene varias limitaciones. Bajo iluminación láser continua, los fluoróforos que marcan las proteínas se fotoblanquean, lo que dificulta las mediciones a largo plazo. La cortina de ADN no funciona a pH bajo (inferior a ~6) porque la bicapa lipídica no es fluídica. Además, el fondo de fluorescencia y la unión inespecífica de las proteínas a la superficie del portaobjetos perturban las imágenes de una sola molécula cuando la concentración de proteínas es alta. Otro inconveniente de la cortina de ADN es que la resolución espacial de la cortina de ADN es de ~1 kbp/píxel, por lo que no se puede observar el movimiento de las proteínas a menos de 1 kbp. Además, la cortina de ADN aplica continuamente fuerza hidrodinámica a las proteínas del ADN. Pero la fuerza por flujo es débil (menos de 1 pN) y, por lo tanto, es difícil que las histonas o los nucleosomas se muevan a lo largo del ADN en la cortina. También se informó que los nucleosomas rara vez se deslizan a lo largo del ADN sin remodeladores de la cromatina47. Si las histonas o los nucleosomas se deslizan a lo largo del ADN, la mayoría de ellos permanecerán en la región final del ADN en la cortina. Sin embargo, no observamos la distribución sesgada. Por otro lado, si las histonas o los nucleosomas se escurrieran desde el extremo del ADN, se agotarían al final del ADN. Tampoco lo observamos.
Este trabajo demuestra que el ensayo de cortina de ADN es una plataforma de imágenes de una sola molécula ideal para investigar la dinámica de la cromatina. La cortina de ADN se puede aplicar para estudiar el proceso por el cual las chaperonas de histonas, como las ATPasas AAA+ que contienen bromodominios, ensamblan la cromatina. La función biológica de las ATPasas AAA+ que contienen bromodominios es controvertida. La falta de ATAD2 humano o S. cerevisiae Yta7 regula a la baja la expresión génica a través de la condensación de la cromatina18. Por el contrario, S. pombe Abo1 aumenta la densidad de nucleosomas16. Los estudios de una sola molécula muestran que Abo1 cataliza la carga de histonas H3-H4 en el ADN. Se muestra que la actividad de carga de histonas de Abo1 depende de la hidrólisis de ATP (Figura 2C, E, F). Además, la distribución de unión de los dímeros H3-H4 muestra que los dímeros H3-H4 son cargados en el ADN por Abo1 de una manera independiente de la secuencia (Figura 3). En conclusión, la cortina de ADN se puede utilizar para desentrañar el papel biológico de Abo1 como chaperona de histonas en el ensamblaje de histonas. Utilizando la técnica de cortina de ADN, en el futuro se estudiará la formación de nucleosomas por Abo1 y otras chaperonas de histonas como CAF-1 y FACT.
Sobre la base de este protocolo, el ensayo de cortina de ADN se puede utilizar para observar la reorganización de la cromatina mediante la remodelación de complejos que translocan y reorganizan nucleosomas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el amable apoyo a Abo1 y Cy5-H3-H4 por parte del profesor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., y Juwon Jang, Ph.D., en KAIST, Corea del Sur. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Beca de la Fundación Nacional de Investigación (NRF-2020R1A2B5B01001792), el fondo de investigación intramuros (1.210115.01) del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Ulsan y el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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